Curs genetica I si II

Genetica bacteriana I & II

1. Ereditatea – transmiterea caracterelor specifice speciei la urmasi

2. Variabilitatea – schimbarea unor caractere care sunt mostenite de catre urmasi si aparitia unor caractere diferite de ale genitorilor (diversitate mare intr-un numar mic de generatii)

Organizarea materialului genetic la bacterii

Cromozomul (=genomul) bacterian

• Macromolecula unica de ADN cu greutatea moleculara de 109 daltoni si lungime de 1100-1300 µm, suprahelicata in celula

• Structura moleculei de ADN – 2 catene spiralate complementare si de polaritate inversa (modelul Watson si Crick)

• Contine toata informatia necesara cresterii si replicarii celulei bacteriene

ADN

• 1869 – Frederick Miescher• 1920 – Phoebus A.T. Levine – contine acid

ortofosforic, zaharuri cu 5 atomi de C si baze care contin N

• Ulterior – Rosalind Franklin – structura helicoidala prin cristalografia cu raze X

• 1950 – James Watson si Francis Crick – structura 3D a moleculei de ADN

Structura ADN I

• Lant dublu helicat de nucleotide – “scara in spirala” (cu balustrada) sau “fermoar”

• Unitatea structurala de baza este nucleotida:- 1 molecula acid ortofosforic- 1 zahar cu 5 atomi de C (pentoza) – dezoxiriboza- 1 baza care contine N – poate fi o purina sau o pirimidina

Structura ADN II• Scheletul spiralei (“balustrada” si “lateralele

scarii”) – acid ortofosforic si dezoxiriboza• Bazele azotate reprezinta “caramizile” care

construiesc ADN - purina: 2 inele lipite alcatuite din 9 atomi de C si hidrogen: A si G- pirimidina: 1 inel alcatuit din 6 atomi de C si hidrogen: T si C

• Bazele se leaga complementar (A-T si C-G) prin legaturi de hidrogen

Structura ADN III• cele doua lanturi complementare “merg” in

directie opusa (polaritate inversa)• Informatia continuta in ADN – secventa de

“litere” de-a lungul “scarii”/”fermoarului”• Secventa ACGCT inseamna altceva decat

secventa AGTCC chiar daca contin exact aceleasi litere (vezi “stops” si “spots” sau “posts”) - oamenii – 99,9% sunt identici. In genomul urman: din 3 miliarde de litere - 0,1% se “traduc” prin 3 milioane de aranjari diferite ale bazelor azotate (“literelor”) – aspect important in criminalistica dar si in diagnosticul bacteriologic (genomul bacterian)

Genetica bacteriana si diagnosticul microbiologic I

• Proportia de baze complementare este constanta in cadrul unei specii, raportul A-T/ C-G – criteriu taxonomic de baza in clasificarea moderna a bacteriilor

• Noi teste diagnostice – identificarea unei secvente unice de ADN sau ARN prezenta in fiecare specie bacteriana

• PCR – amplificare a secventelor ADN – detectia bacteriilor in numar foarte mic in prelevatele clinice ( BK in LCR)

• Testele genetice “sar” peste nevoia de a cultiva bacteriile – metoda rapida de diagnostic microbiologic

• Genetica bacteriana – necesara intelegerii aparitiei si transferului rezistentei la antibiotice la microorganisme (mutatii…)

Genetica bacteriana si diagnosticul microbiologic II

Replicarea ADN I

• Structura dublu spiralata permite replicarea lui identica, semiconservativa

• Spirala se “deschide” ca un fermoar la locul initial al replicarii sub actiunea unei ADN-giraze

• Pe fiecare spirala se va sintetiza una noua, complementara, cu participarea ADN-polimerazei (I, II, III) din directia capatului 5’ terminal spre capatul 3’ terminal

• Replicarea cromozomului poate fi uni- sau bidirectionala in functie de conditiile de mediu

• In celula bacteriana pot coexista diferite structuri genetice (cromozom, plasmide, bacteriofag), replicarea lor putand sa aiba loc in acelasi timp.

Replicarea ADN II

Terminologie I• Genotipul unei celule = potentialul genetic al

ADN-ului acelui microorganism- toate caracteristicile care sunt condificate in ADN si care au potentialul de a fi exprimate- unele gene sunt “tacute”, fiind exprimate doar in anumite conditii = INDUCTIBILE- genele care sunt exprimate intotdeauna = CONSTITUTIVE

• Fenotipul unei celule = caracteristicile genetice ale unei celule care sunt exprimate si pot fi observate

• Scopul final al unei celule:- producerea proteinelor (str. si functia celulara)- transmiterea info. pt aceasta si generatiilor urmatoare de celule

• Proteinele = polipeptide alcatuite din amino-acizi (aa)

• Informatia pentru sinteza proteica: in ADN-ul bacterian

Terminologie II

• Sinteza proteica - 2 etape principale: - transcriptia/transcrierea informatiei genetice din ADN intr-un ARNm cu ajutorul ARNpolimerazei si folosind ADN ca matrice/model (ARN – lant unic si scurt si contine ca zahar riboza si U in loc de T)- translatia/traducerea – mesajul ARNm este decodificat la nivelul ribozomilor secventa aa intr-un lant polipeptidic (aa sunt adusi in ribozomi prin transferul moleculelor ARNt care “traduc” codonii; moleculele ARNt se ataseaza temporar de ARNm utilizand regiunile lor complementare, anticodon)

Terminologie III

• Codon = un grup de 3 nucleotide in molecula ARNm care codifica un aa specific

• Anticodon = triplet de baze pe ARNt care se leaga de tripletul de baze de pe ARNm (identifica care aa va fi intr-o locatie specifica in proteina)

• Fluxul informatiei genetice este intotdeauna unidirectional – de la acizii nucleici la proteine

• Numarul si secventa de aa in lantul polipeptidic (si deci structura particulara a acelei proteine) este determinata de secventa de codoni din molecula ARNm

Terminologie IV

• Codul genetic = corespondenta dintre secventa codonilor si cea a aa in cadrul unui polipeptid

• Gena (cistron) – secventa de ADN specifica care codifica un aa dintr-un polipeptid care functioneaza direct sau impreuna cu alte polipeptide ca enzima sau proteina structurala.

Terminologie V

Reglarea activitatii genelor I

• Scop: ajustarea metabolismului la conditiile de mediu – cresterea si multiplicarea in conditii optime

• Mecanismele reglarii negative (prezente doar la procariote):

- Gene structurale – codifica enzime pt o anumita linie metabolica – formeaza o unitate numita operon care este delimitat de secvente de control

(operatorul – receptioneaza semnalele, promotorul – initiaza transcrierea genei structurale si terminatorul – incheie transcriptia)

- Gena reglatoare - conduce activitatea unui operon si codifica sinteza unui represor (care este capabil sa se fixeze pe operator, blocand activitatea ARNm polimerazei)

Reglarea activitatii genelor II

Plasmidele I

• Elemente extracromozomale alcatuite din ADN circular care se replica autonom in celula gazda

• Nu sunt indispensabile vietii celulei • 1952 – Lederberg le-a denumit• 1963 – Watanabe – importanta practica

(transmiterea rezistentei la antibiotice intre bacterii)

• Mici – 10-40 copii in celula• Mari – 1-3 copii• Plasmidele inrudite (mecanism comun de

control al replicarii) sunt incompatibile intr-o celula bacteriana

• Plasmidele neinrudite – sunt compatibile

Plasmidele II

• Pot fi: - conjugative: se pot transfera singure la alte bacterii (plasmidele R)- neconjugative: transfer doar cu ajutorul altei plasmide conjugative sau a unui bacteriofag (BL la S. aureus)- episomi: se pot integra prin recombinare in cromozomul bacterian, pierzandu-si autonomia de replicare (plasmidul F sau factorul de fertilitate)

Plasmidele III

• Pentru medicina – clasificarea1. Plasmide de virulenta – determinanti genetici ai

unor factori de virulenta la bacterii: hemolizina la S. aureus, secretia enterotoxina la E.coli …

2. Plasmide de rezistenta (R): molecule circulare de ADN cu 2 regiuni genetice distincte (“R” si “FTR”): 90% din tulpinile de spital – Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Acinetobacter…

3. Plasmidul F – contine pe langa alti determinanti genetici, genele de transfer tra

Plasmidele IV

• Se poate transmite altor celule bacteriene prin conjugare

• Se poate integra in cromozomul bacterian – transferul de gene cromozomale de la o celula bacteriana donor la cea receptor

• In functie de prezenta factorului F, bacteriile se impart in:

1.Bacterii F- - celule femele – receptoare

Plasmidul F

2. Bacterii F+ - celule masculine – donoare3. Bacterii Hfr – celule masculine, au factorul F

integrat in cromozom4. Bacterii F’ – celule masculine – au factorul F

ca plasmid autonom dupa ce a fost integrat in cromozom si l-a parasit rupand un fragment ADN din cromozom

Plasmidul F – cont.

Bacteriofagii I

• 1915 – Twort si d’Herelle = virusuri care ataca bacterii

• “phage” – gr. “phagein” = a manca• Cei mai studiati – fagii T si Lambda la E.coli• Poarta informatia genetica pentru:

- replicarea ADN propriu- sinteza proteinelor de invelis

Dar nu le pot realiza singuri! – au nevoie de “gazda”

• Structura bacteriofagilor:- cap hexagonal (ADN dublu catenar invelit intr-o proteina care alcatuieste capsida)- coada si structuri adiacente – rol in atasarea fagului la celula bacteriana si transmiterea in siguranta a ADN-ului fagic in celula gazda

Bacteriofagii II

Bacteriofagii III

Cap/Capsida

Teaca contractila

coada

Fibrele cozii

Placa bazala

• 2 tipuri de infectii la bacteriiI - infectii litice (fagi virulenti)II - infectii lizogenice (temperate) - fagi temperati

• Inainte de infectare – bacteria e implicata in replicarea propriului ADN

• Dupa infectare – ADN-ul viral preia “conducerea” celulei gazda – producerea de acizi nucleici si proteine necesare producerii de noi particule virale

Bacteriofagii IV

• Infectia litica (ciclul litic) - atasare, adsorbtie, penetrare, sinteza de proteine timpurii si replicarea ADN viral, sinteza tardiva de proteine si asamblarea particulelor virale – liza celulei cu eliberarea particulelor virale

• Infectia lizogena (ciclul lizogen) - asasare, adsorbtie, penetrare, integrare ADN viral in cromozomul bacterian (profag – o singura gena a fagului este activa, bacterie = lizogenizata), replicare odata cu bacteria, NU distruge bacteria

Bacteriofagii V

Bacteriofagii VIInfectia litica (ciclul litic)

Bacteriofagii VII

• Dificila recunoasterea bacteriei lizogenizate de cea nelizogenizata (apar identice)

• Uneori profagul – noi caractere (nou fenotip) bacteriei lizogenizate = conversie lizogenica

• EX.: - C. diphteriae – fagul beta – toxina - S. pyogenes – lizogenizat- toxina eritrogena - C. botulinum – lizogenizat – unele toxine• Fenomen similar conversiei lizogenice – virusuri

tumorale – unele cancere umane

Bacteriofagii VIII

• Terapia fagica - Utilizarea in terapeutica a bacteriofagilor litici

pentru a trata infectii bacteriene- Alternativa la antibiotice – Estul Europei si SUA- Beneficii: - mult mai specifica

- nu e daunatoare celulelor eucariote supuse tratarii si nu ar trebui sa

afecteze flora normala a gazdei - efecte secundare minime sau absente

- Georgia – tratamentul infectiilor bacteriene care nu raspund la antibioticele conventionale

Bacteriofagii IX

1. Fragmentele de insertie (IS) 2. Transpozonii (Tn) • Fragmente mici ADN cu limite structurale bine

precizate• Se pot integra repetat in mai multe situsuri

dintr-un genom• 1952 – Barbara McClintock – “jumping genes”• 1983 – a primit premiul Nobel

Elementele genetice transpozabile I

Elementele genetice transpozabile II

• Fragmentele de insertie (IS) - 1000 baze, fac parte in mod normal din

cromozom sau plasmide- Prezente in mai multe copii si flancate de

secventa de ADN (pentru codificarea transpozitiei)

- NU confera un caracter nou celulei, DAR dupa insertie pot produce modificari in expresia genelor adiacente inserarii

• Transpozonii (Tn)- Alcatuiti din 2 IS care nu au nevoie de

secventa de ADN pentru codificarea transpozitiei

- Codifica determinanti de rezistenta sau unele caractere care pot apare in fenotipul bacteriei

Elementele genetice transpozabile III

1. Ereditatea – transmiterea caracterelor specifice speciei la urmasi – aparitia de “clone”

2. Variabilitatea – schimbarea unor caractere care sunt mostenite de catre urmasi si aparitia unor caractere diferite de ale genitorilor (diversitate mare intr-un numar mic de generatii)

Variabilitatea

• Mecanisme: 1. Mutatia2. Transferul de material genetic

a. Transformareab. Transductiac. Conjugarea

3. Recombinarea

Mutatia I• Def. = schimbarea unui caracter in mod brusc, cu

frecventa redusa, intamplator, transferabil la descendenti

• Mecanismul mutatiei – schimbarea unei secvente de nucleotide prin:

- substitutie – inlocuirea unei baze azotate cu alta - insertie – adaugarea uneia sau ˃ per. baze - deletie – pierderea uneia sau ˃ per. Baze - inversia – modificarea orientarii unui segment ADN

in raport cu secventele vecine

• Clasificare: 1.Dupa modalitatea de aparitie:

- spontane (naturale) - induse (agenti mutageni: UV, Q, subst. chimice

2.Dupa marime: – punctiforme (afecteaza un singur nucleotid si sunt reversibile)- extinse

Mutatia II

3. Dupa caracterul fenotipic afectat: - morfologice

- biochimice - antigenice- de virulenta- de rezistenta – “one step” – devine R imediat

- “multistep” – R la concentratii crescande de antibiotic

Mutatia III

Variabilitatea



3. Recombinarea

Transferul de material genetic

• Caracteristici generale: 1.Este unidirectional: de la donor la receptor2.Donorul nu transfera intregul cromozom

(transfer incomplet)3.Fragmentul transferat se poate integra in

ADN-ul receptorului sau sa se stabilizeze in celula in stare autonoma

4.Doar intre tulpini ale aceleiasi specii sau intre specii strans inrudite

1. Transformarea I • Transferul donor-receptor sub forma de ADN: -liza celulei donor - extractie chimica • 1928 – experimentul lui Griffith – pneumococ• Factori care influenteaza transformarea: - dimensiunea ADN - starea de competenta a receptorului – permite

inglobarea ADN strain (Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella, Streptococcus..) – Ag special pe suprafata = factor de competenta

– Recombinare

• Semnificatie– Variatii de faza Neiseseria– Tehnologie ADN recombinant (inducere artificiala a starii de competenta)

etapeetape Preluare ADNPreluare ADN

Gram +Gram + Gram -Gram -

1. Transformarea II

2. Transductia I • Transfer genetic de la o bacterie la alta prin

intermediul unui bacteriofag• Aparitia de caractere noi: R la antibiotice, secretie

toxine, enzime, etc • Transductia generalizata:- Bacteriofagii transfera ORICE gena bacteriana - Mediata de fagii litici (virulenti) • Transductia specializata: - Bacteriofagii transfera anumite gene (genele

adiacente locului de insertie a fagului)- Mediata de fagii temperati

2. Transductia II

•Transductia generalizata

3. Conjugarea I

• Transferul de material genetic de la donor la receptor prin contactul direct dintre cele doua celule

• Se pot transmite plasmide si gene cromozomale (prin intermediul factorului F+ )

• Diferit la bacteriile Gram-negative si Gram-pozitive

• Bacterii Gram-negative – prin intermediul plasmidului F, prin contact direct intre cele doua celule

a. Poate fi situat intr-un plasmid – bacterii F+

- Gene de transfer tra – sinteza pilului de sex si transferul plasmidului

b. Poate fi integrat in cromozom – bacterii Hfr - Transferul de gene cromozomale de la o bacterie

la alta- Recombinare gene cromozomale donator-

receptor

3. Conjugarea II

• Transferul genetic prin contactul direct

Donor

Recipient

3. Conjugarea III

Caracteristicile bacteriilor Hfr:

- Bacteria F- rareori devine Hfr, pe cand bacteria Hfr ramane intotdeauna Hfr

- Materialul genetic cromozomal se transfera cu frecventa marita – recombinare gene donor-receptor

F+ Hfr

3. Conjugarea IV

• Mecanism Hfr si F-

Hfr F- Hfr F-

Hfr F-Hfr F-

3. Conjugarea V

Mecanismul F+ si F-

F+ F- F+ F-

F+ F+F+ F+

3. Conjugarea VI

• Bacteriile Gram-pozitive: prin performanta celulei receptoare: produce substante cu afinitate pentru unele substante adezive de pe suprafata receptorului (sexferomon) – punti intercelulare

• Ex.: Streptococcus, Streptomyces ,Clostridium..

3. Conjugarea VII

Variabilitatea



3. Recombinarea

Recombinarea I

• Formarea unui nou genotip prin reasortarea genelor dupa schimbarea de material genetic

• Rezulta din transferul genetic (integrare suplimentara de ADN) si transpozitie (schimb de elemente omologe)

• Transpozitia – segmente de ADN (IS si Tn) se deplaseaza de la un situs la altul in genomul bacteriilor sau al bacteriofagilor

• Recombinare legitima (omologa) – ADN donor inserat la receptor are omologie de baze cu acesta

- Ex.: transformare, unele forme de transductie si conjugare

• Recombinare nelegitima (heterologa) – integrarea de ADN suplimentar intr-un replicon

- Ex.: integrarea plasmidului F, a unor profagi sau transpozitia elementelor genetice mobile

Recombinarea II

• Clonarea genelor – forma deosebita de recombinare nelegitima (in vitro)

• Plasmidele sunt folosite frecvent ca vectori pentru transferul si clonarea de material genetic de la o bacterie la alta sau intre organisme foarte indepartate filogenetic

• Se introduc in genomul bacterian gene care codifica sinteza de IFN, insulina, etc – obtinerea artificiala ar fi imposibila sau foarte costisitoare

Recombinarea III

Bibliografie

• Textbook of Diagnostic Microbiology, Connie R. Mahon et al., third edition Elsevier, 2007, p. 21-26

• Curs genetica bacteriana – Conf. Dr. Alexandru Rafila

• Bacteriologie medicala, O.M. Dorobat, Ed. Printech 1999, p. 37-49

• http://textbookofbacteriology.net/phage.html

http://textbookofbacteriology.net/phage.html

Curs genetica I si II

Documents

Transcript of Curs genetica I si II