Post on 31-Jan-2017
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
“GRIGORE T. POPA” IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
CERCETĂRI PRIVIND NOI COMPUŞI CU
STRUCTURĂ XANTINICĂ CU POTENŢIAL
BIOLOGIC
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
PROF. DR. Lenuța PROFIRE
DOCTORAND
Florentina Geanina GHEAŢĂ (LUPAŞCU)
Investeşte în oameni ! Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Axa prioritară „Educatia si formarea profesională în sprijinul cresterii economice si dezvoltării societătii bazate pe cunoastere” Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale si post-doctorale în sprijinul cercetării” Titlul proiectului: „Burse doctorale pentru cresterea competitivitatii in domeniul medical si farmaceutic” Numărul de identificare al contractului: POSDRU/88/1.5/S/58965 Beneficiar : Universitatea de Mdicina si Farmacie „Gr. T. Popa” Iasi Partener : Universitatea de Medicina si Farmacie „Iuliu Hatieganu” Cluj Napoca
2013
Componenţa comisiei de doctorat:
PREŞEDINTE: Decan Prof. univ dr. Monica Hânceanu
Universitatea de Medicină şi Farmacie ’’Grigore T. Popa’’, Iaşi
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ dr. LENUŢA PROFIRE
Universitatea de Medicină şi Farmacie ’’Grigore T. Popa’’, Iaşi
REFERENŢI OFICIALI:
Prof. univ dr. Daniela Lucia Muntean
Universitatea de Medicină şi Farmacie Tg. Mureş
Prof. univ dr. Ovidiu Oniga
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca
Prof. univ dr. CĂTĂLINA ELENA LUPUŞORU,
Universitatea de Medicină şi Farmacie ’’Grigore T. Popa’’, Iaşi
1
CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT
CUPRINS i
ABREVIERI v
STADIUL CUNOAŞTERII
CAPITOLUL 1
DIABETUL ZAHARAT 2
1.1. TERMINOLOGIE 3
1.2. FIZIOPATOLOGIE 3
1.3. CLASIFICARE 4
1.3.1. Diabet zaharat tip 1 4 1.3.2. Diabetul zaharat de tip 2 6
1.3.3. Diabet gestational 9
I.4.SIMPTOME 10
I.5. COMPLICAŢII 11
I.5.1. Afecţiuni cardiovasculare 13
I.5.2. Nefropatia diabetică 15
I.5.3. Neuropatia diabetică 17 I.5.4. Retinopatia diabetică 19
I.5.5. Arteriopatia diabetică 21
I.5.6. Piciorul diabetic 22 I.5.7. Cetoacidoza diabetică 23
I.6. INSULINOREZISTENŢA 24
CAPITOLUL 2
TERAPIA DIABETULUI ZAHARAT TIP 2 26
2.1. BIGUANIDE 27
2.2. SULFONILUREE 28
2.3. GLINIDE 30
2.4. INHIBITORI DE ALFA-GLUCOZIDAZĂ 30
2.5.TIAZOLIDINDIONELE 31
2.6. MODULATORI AI INCRETINELOR 33
2.6.1. Analogi sintetici ai GLP-1 34 2.6.2. Inhibitori ai DPP IV 35
2.7. INSULINA 39
CAPITOLUL 3
STRESUL OXIDATIV 41
3.1. STRESUL OXIDATIV CELULAR ŞI DIABETUL ZAHARAT 43
CAPITOLUL 4
BIOPOLIMERI CU APLICABILITATE ÎN TERAPIA DIABETULUI ZAHARAT 46
4.1. CHITOSAN 46
2
CONTRIBUȚII PERSONALE
CAPITOLUL 5
MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE 51
CAPITOLUL 6
SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ A UNOR NOI DERIVAȚI
DE TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU STRUCTURĂ XANTINICĂ
54
6.1. MATERIAL SI METODĂ 54
6.1.1. Procedeu pentru obținerea derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 54 6.1.2. Procedeu pentru obținerea derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetil-hidrazina 55
6.1.3. Procedeu general pentru obținerea derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]-4-(4-R-
fenil)tiosemicarbazida
55
6.1.4. Procedeu general pentru obținerea derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]
hidrazono}-3-(4-R-fenil)tiazolidin-4-ona
55
6.1.5. Procedeu general pentru obținerea derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil] hidrazono}-3-(4-R1-fenil)-5-(4-R2-benziliden)tiazolidin-4-ona
56
6.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII 56
6.2.1. Sinteza derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 57
6.2.2. Sinteza 1,3-dimetilxantin-7-il-acetil hidrazina 58 6.2.3. Sinteza derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]-4-(4-R-fenil) tiosemicarbazida 60
6.2.4. Sinteza derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-R-fenil)
tiazolidin-4-ona
62
6.2.5. Sinteza derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-R1-fenil)-5-(4-
R2-benziliden)tiazolidin-4-ona
64
6.3. CONCLUZII 71
CAPITOLUL 7
CONFIRMAREA STRUCTURII CHIMICE A COMPUŞILOR SINTETIZAŢI
7.1. MATERIAL ȘI METODE 72
7.1.1. Spectroscopia în infraroşu 72
7.1.2. Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară 73
7.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII 73
7.2.1. Spectroscopia în infraroșu 73
7.2.1.1. Spectrul IR al derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 73 7.2.1.2. Spectrul IR al derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetil hidrazina 74
7.2.1.3. Spectrul IR al derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)-acetil]-4-(4-R-fenil)
tiosemicarbazida
75
7.2.1.4. Spectrul IR al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-R-fenil)tiazolidin-4-ona
76
7.2.1.5. Spectrul IR al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-
(4-R1-fenil)-5-(4-R2-benziliden)tiazolidin-4-ona
78
7.2.2. Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară 82
7.2.2.1. Spectrul RMN al derivatului1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 82
7.2.2.2. Spectrul RMN al derivatului1,3-dimetilxantin-7-il-acetil hidrazina 83 7.2.2.3. Spectrul RMN al derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]-4-(4-R-fenil)
tiosemicarbazida
84
7.2.2.4. Spectrul 1H-RMN al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]
hidrazono}-3-(4-R-fenil)tiazolidin-4-ona
85
7.2.2.5. Spectrul RMN al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-il)acetil]hidrazono}-
3-(fenil)-5-(4-R2-benziliden)tiazolidin-4-ona
86
3
7.3. CONCLUZII 94
CAPITOLUL 8
DEZVOLTAREA UNOR MICROSISTEME PE BAZĂ DE CHITOSAN CU
APLICABILITATE ÎN TERAPIA DIABETULUI ZAHARAT
8.1. MATERIAL ȘI METODE 95
8.1.1. Procedeu de preparare a microparticulelor de chitosan 95 8.1.2. Procedeu de preparare a microparticulelor de chitosan-substanță activă 96
8.1.3. Tehnici de caracterizare a microparticulelor de chitosan – substanță activă 96
8.1.3.1. Eficacitatera încapsulării substanței active 96 8.1.3.2. Studiul morfologiei microparticulelor de chitosan – substanță activă 97
8.1.3.3. Testul de umflare 97
8.1.3.4. Analiza spectrală IR a microparticulelor de chitosan – substanță activă 98
8.1.3.5. Studiul eliberării in vitro a substanţei active din matricea polimerică 98 8.1.3.6. Studiul degradării enzimatice a microparticulelor de chitosan - substanţă activă 99
8.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII 100
8.2.1. Optimizarea procedeului de preparare a microparticulelor de chitosan 100
8.2.2. Caracterizarea microparticulelor de chitosan - substanţă activă 101 8.2.2.1. Eficienţa încapsulării substanţei active în microsferele de chitosan 101
8.2.2.2. Morfologia microparticulelor de chitosan-substanță activă 102
8.2.2.3. Testul de umflare 104 8.2.2.4. Analiza spectrală IR a microparticulelor de chitosan-substanță activă 105
8.2.2.5. Studiul eliberării in vitro a substanţei active din matricea polimerică 107
8.2.2.6. Studiul degradării enzimatice a microparticulelor de chitosan - substanţă activă 108
8.3. CONCLUZII 110
CAPITOLUL 9
EVALUAREA BIOLOGICĂ A DERIVAȚILOR DE TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU
STRUCTURĂ XANTINICĂ
9.1. EVALUAREA POTENȚIALULUI ANTIOXIDANT in vitro 112
9.1.1. Material și metode 112
9.1.1.1. Puterea reducătoare 112
9.1.1.2. Capacitatea totală antioxidantă 113 9.1.1.3. Capacitatea antiradicalică față de radicalul DPPH 113
9.1.1.4. Capacitatea antiradicalică față de radicalul cation ABTS·+
114
9.1.2. Rezultate şi discuţii 114 9.1.2.1. Puterea reducătoare 114
9.1.2.2. Capacitatea totală antioxidantă 116
9.1.2.3. Capacitatea antiradicalică față de radicalul DPPH 118 9.1.2.4. Capacitatea antiradicalică față de radicalul cation ABTS
·+ 120
9.1.3. Concluzii 122
9.2. SCREENING TOXICOLOGIC. DETERMINAREA TOXICITĂŢII ACUTE 123
9.2.1. Material și metode 123 9.2.2. Rezultate și discuții 123
9.2.3. Concluzii 124
9.3. EVALUAREA UNOR PARAMETRI CLINICI, BIOCHIMICI ȘI HEMATOLOGICI PE
MODEL DE DIABET ZAHARAT
125
9.3.1. Material și metode 125
9.3.1.1. Inducerea diabetului zaharat 125
9.3.1.2. Organizarea protocolului de lucru 126 9.3.1.3. Monitorizarea parametrilor clinici 127
4
9.3.1.4. Evaluarea parametrilor biochimici 127
9.3.1.5. Evaluarea parametrilor hematologicici 130 9.3.2. Rezultate şi discuţii 130
9.3.2.1. Evaluarea parametrilor clinici 130
9.3.2.2. Evaluarea parametrilor biochimici 133
9.3.2.3. Evaluarea parametrilor hematologici 140 9.3.3. Concluzii 142
9.4. STUDIU HISTOPATOLOGIC 144
9.4.1. Material şi metode 144 9.4.2. Rezultate și discuții 145
9.4.3.Concluzii 150
CAPITOLUL 10
CONCLUZII 151
BIBLIOGRAFIE 153
ANEXA 1-LUCRĂRI PUBLICATE ÎN TIMPUL STAGIULUI DOCTORAL 165
5
ABREVIERI
ABTS
ADA
AGEs
ALT
AST
CE 50
CHEM
CLMW
CMMW
CV
CR
DAG
DCCT
DV
DL 50
DMFA
DMSO
DPP IV
DPPH
DZ 1
DZ 2
EMA
FDA
GLP-1
GIP
HbA1c
HDL
HEM
HLA
IR
LDH
LDL
MAP
MBG
MPV (fL)
NAD
Neut W-LCC
Neut W-LCR %
NF-KB
OAT3
OCT2
OMS
PAI 1
2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (eng.)
American Diabetes Association (eng.)
Advanced Glycation End-Products (eng.)
Alaninaminotransferaza
Aspartataminotransferaza
Concentraţia eficientă
Concentraţia medie de hemoglobină
Chitosan Low Molecular Weight (eng.)
Chitosan Medium Molecular Weight (eng.)
Coeficient de variaţie
Corpusculi renali
Diacilglicerol
Diabetes Control and Complications Trial (eng.)
Deviaţie standard
Doza letală 50
Dimetilformamidă
Dimetilsulfoxid
Dipeptidil peptidaza IV
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (eng.)
Diabet zaharat de tip 1
Diabet zaharat de tip 2
European Medicines Agency (eng.)
Food and Drug Administration (eng.)
Glucagon Like Peptide-1(eng.)
Glucose Insulinotropic Peptide (eng.)
Hemoglobina glicozilată
High Density Lipoprotein (eng.)
Hemoglobina eritrocitară medie
Human Leucocyte Antigen (eng.)
Insulino rezistență
Lactat dehidrogenaza
Low Density Lipoprotein (eng.)
Mitogen Activated Protein (eng.)
Membrană bazală glomerulară
Volum trombocitar mediu
Nicotinamide Adenine Dinucleotide (eng.)
Număr absolut de neutrofile
Număr procentual de neutrofile
Factor nuclear Kappa B
Organic Anion Transporter 3 (eng.)
Organic Cation Transporter 2 (eng.)
Organizația Mondială a Sănătății
Plasminogen Activator Inhibitor 1(eng.)
6
PARP
PCT
PDW
P-LCR
PPAR
RDW-CV
RDW-SD
RE
RI
ROS
SCF
SGF
SIF
SOD
TF
TGF- β
TMS
TNF-
TPP
TTGO
TZD
UKPDS
VEGF
VEM
VLDL
Polimerază
Platelet Distribution Width (eng.)
Macrotrombocite
Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (eng.)
Red Cell Distribution Width - Coefficient Variation (eng.)
Red Cell Distribution Width – Standatrd Deviation (eng.)
Reticul endoplasmatic
Receptor specific pentru insulină
Reactive Oxygene Species (eng.)
Simulated Colonic fluid (eng.)
Simulated Gastric Fluid (eng.)
Simulated Intestinal Fluid (eng.)
Superoxid dismutaza
Factor tisular
Transforming Growth Factor β (eng.)
Tetrametil silan
Factorul de necroză tumorală
Tripolifosfat pentasodic
Testul oral de toleranță la glucoză
Tiazolidindione
United Kingdom Prospective Diabetes Study (eng.)
Vascular Endothelium Growth Factor (eng.)
Volum eritrocitar mediu
Very Low Density Lipoprotein (eng.)
7
Prezenta teză de doctorat este ilustrată prin 63 figuri şi 35 tabele. Rezumatul include un
număr limitat din totalul acestora, menţinând numerotarea din teză.
Rezultatele ştiinţifice obţinute în cadrul sudiilor doctorale au putut fi realizate şi datorită
statutului de bursier în cadrul proiectul ’’Burse doctorale pentru creşterea competitivităţii în
domeniul medical şi farmaceutic” POSDRU/88/1.5/S/58965, pe care l-am avut în perioada 2010-
2013.
Formarea mea ca cercetător, iniţiată în cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie
Grigore T. Popa Iaşi, Facultatea de Farmacie, disciplina de Chimie farmaceutica fost completată
prin stagiul de mobilitate transnaţională realizat la University of Ghent, Department of Organic
Chemistry, Polymer Research Group, Belgium.
Sincere mulţumiri şi cele mai alese sentimente de recunoştinţă pentru întrega contribuţie
în formarea mea profesională:
D-nei Prof. dr. Lenuţa Profire
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi
D-ului Prof. dr. Peter Dubruel
Universitatea din Ghent, Departamentul de Chimie organică, Chimia Polimerilor şi a
Biomaterialelor, Belgia
D-nei Prof. dr. Elena Cătălina Lupușoru
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi
D-nei Prof. dr. Irina Draga Căruntu
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi
8
MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
PERSONALE
Diabetul zaharat (DZ) este o afecţiune metabolică cronică,
considerată a fi o problemă majoră de sănătate în întreaga lume şi o povară socio-economică extraordinară.
Conform OMS, la nivel mondial diabetul zaharat cauzează anual
aproape 4 milioane de decese, în timp ce alte 1,5 milioane de cazuri noi sunt diagnosticate. Se estimează că până în anul 2025, numărul bolnavilor
de diabetici va depăşi cifra de 380 de milioane, diabetul zaharat de tip 2
(non-insulinodependent) (DZ 2) reprezentând aproximativ 90% din cazurile diagnosticate.
Această maladie este considerată una din cele cinci cauze de
mortalitate la nivel mondial datorită complicaţiilor micro- şi
macrovasculare care apar şi care se cronicizează sub acţiunea hiperglicemiei.
Din păcate, în ciuda varietăţii de tratamente disponibile în prezent,
majoritatea pacienţilor nu-şi pot controla corespunzător glicemia. Succesul medicamentelor antidiabetice orale este limitat de mecanismul lor de
acţiune, care se adresează adesea simptomelor diabetului zaharat, şi nu
cauzelor care o generează. Aceste medicamente pot avea, de asemenea, efecte secundare nedorite. De exemplu, între 2,5% - 17,5% dintre pacienţii
trataţi cu sulfoniluree prezintă oscilaţii ale glicemiei (hipoglicemie majoră
şi minoră), în timp ce problemele gastro-intestinale afectează până la 63%
dintre pacienţii trataţi cu metformin, 36% cu tiazolidindione şi 30% cu acarboză. Edemul periferic s-a înregistrat la 26% dintre pacienţii trataţi cu
tiazolidindione, iar creşterea greutăţii corporale de la 1 la 5 kg este
comună, atât terapiei cu sulfoniluree cât şi cu tiazolidindione. Aceste efecte secundare pot avea un impact negativ asupra răspunsului pacientului
la tratament, rezultând în creşterea nivelului de hemoglobină glicozilată
(HbA1c) şi a riscului de spitalizare şi mortalitate.
Totodată, costurile economice pentru tratarea acestei afecțiuni sunt enorme. Federaţia Internaţională de Diabet apreciază că diabetul a costat
economia mondială cel puţin 376 miliarde de dolari în 2010, ceea ce
reprezintă 11,6% din totalul cheltuielilor de asistenţă medicală la nivel mondial. Până în 2030, costul este de aşteptat să depăşească 490 bilioane
9
de dolari. Din aceste motive, dezvoltarea de noi medicamente
antidiabetice, mai active, mai sigure şi la costuri mai mici este o
preocupare majoră a cercetătorilor (Buse J.B. et al., 2010). Scopul cercetărilor personale a fost sinteza și evaluarea biologică
a unor noi compuși heterociclici ca potențiali agenți terapeutici în
tratamentul diabetului zaharat tip 2. Compușii proiectați combină două entități structurale diferite - nucleul xantinic cu cel tiazolidinic.
Argumentele care au stat la baza proiectării compuşilor originali
sunt următoarele:
Studii recente au arătat că derivații cu structură xantinică sunt
ţinte importante pentru o serie de modulări structurale, oferind o
selectivitate bună pentru DPP IV. Cel mai recent inhibitor DPP IV
introdus în terapeutică este linagliptina, un inhibitor non-peptidomimetic cu structură xantinică, care reduce valoarea HbA1c
cu 0,6-0,7%, în raport cu placebo (Neumiller J.J., 2012).
Pe de altă parte nucleul de tiazolidină este prezent, sub formă de
tiazolidindionă, în structura pioglitazonei şi rosiglitazonei (Derosa G. and Maffioli P., 2010). Ca agonişti ai receptorilor PPARγ
(nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor
gamma), aceste medicamente reduc rezistenţa la insulină în ficat şi
ţesuturile periferice, cresc concentraţia glucozei insulino-dependente şi reduc gluconeogeneza (Yessoufou A. and Wahli W.,
2010; Barros C.D. et al., 2010). Pe de altă parte, derivaţii de
tiazolidină prezintă efecte antioxidante care ar putea fi eficiente în terapia DZ tip 2 (Kushwaha S.P. et al., 2011).
Pe baza argumentelor prezentate, compuşii sintetizați au toate premisele teoretice de a acţiona ca medicamente “multi-ţintă”. Aceştia ar
putea modula concentraţia incretinelor prin inhibarea activităţii enzimei
DPP IV, reduce rezistenţa periferică la insulină ca agonişti PPAR şi de asemenea ar putea să acţioneaze ca agenţi antioxidanţi.
Pentru realizarea cercetărilor personale s-a avut în vedere următoarele obiective:
Sinteza, caracterizarea și evaluarea biologică a unor noi derivați de
tiazolidin-4-onă cu structură xantinică, obiectiv în cadrul căruia s-a
realizat:
10
optimizarea metodelor de preparare a compuşilor intermediari
și finali în vederea obţinerii lor în randamente ridicate şi
puritate avansată; caracterizarea fizico-chimică a compușilor intermediari și finali
sintetizați (formula moleculară, temperatura de topire,
solubilitate, randament); confirmarea structurii chimice a compuşilor sintetizaţi prin
metode spectrale (IR, 1H-RMN şi
13C-RMN);
evaluarea potentialului antioxidant al derivaților de tiazolidin-4-onă prin metode in vitro (capacitatea totală antioxidantă,
puterea reducătoare, capacitatea de inhibare a radicalilor liberi
DPPH și ABTS);
stabilirea profilului toxicologic al compuşilor sintetizaţi prin determinarea dozei letale 50;
evaluarea parametrilor biochimici și hematologici şi a
potențialului antidiabetic pe model de diabet indus la șobolan cu streptozptocin;
studii histopatologice ale fragmentelor de țesut recoltate de la
organele țintă. Îmbunătățirea profilului farmacotoxicologic al celor mai activi
compuși utilizând matrici polimerice, obiectiv în cadrul căruia s-a realizat:
prepararea de microparticule pe bază de chitosan şi
caracterizarea lor fizico-chimică; înglobarea celor mai activi compuși în microparticule pe bază
de chitosan;
evaluarea profilului de eliberare a substanţei active prin teste in vitro;
determinarea capacităţii de biodegradare in vitro a matricelor
obţinute;
evaluarea parametrilor biochimici și hematologici, și a potențialului antidiabetic pe model de diabet indus la șobolan
cu streptozptocin;
studii histopatologice pe fragmente de ţesut recoltate de la organele țintă.
11
CONTRIBUȚII PERSONALE
Capitolul 6. SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ
A UNOR NOI DERIVAȚI DE TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU
STRUCTURĂ XANTINICĂ
Folosind ca model structural teofilina (1,3-dimetil-xantina) s-au
realizat o serie de modulări structurale la atomul de azot din poziția 7, ceea
ce a avut drept rezultat obținerea a 8 noi compuși intermediari și a 21 de noi compuși finali, derivați de benzilidentiazolidin-4-onă cu structură
xantinică (Fig. 6.1).
N
N N
N -
O
O
H3C
CH3
N
N N
N
O
O
H3C
CH3
CH2COOC2H5
N
N N
N
O
O
H3C
CH3
H2C C
O
NH NH C NH
S
.
C6H4
N
N N
N
O
O
H3C
CH3
CH2CONHNH2
N
N N
N
O
O
H3C
CH3
H2C C
O
NH NN
C O
CH2S
1 2 3
4a, 4b, 4c 5a, 5b, 5c
N
N N
N
O
O
H3C
CH3
H2C C
O
NH NN
C O
CS CH
Na+
6a1-7, 6b1-7, 6c1-7
R1 = H, Cl;
R2 = H, F(4), Cl(4), Br(4), OH(4), N(CH3)2(4), NO2(2)
R1C6H4 R1
R2
R1
1
2
3
45
67
8 9
101112
1314 15
16
1718
20
2122
23
24
19
25
H2N NH2.H2O+
OHC+
Cl CH2 CO
OC2H5
+ - NaCl
N C SR1+ ClCH2COCl+
R2
Fig. 6.1. Schema generală de obținere a derivaților de tiazolidin-4-onă cu
structură xantinică.
Compușii sintetizați se prezintă sub forma unor pulberi cristaline
formate din cristale aciculare / romboedrice / plăci cristaline, de culori
diferite. În urma optimizării metodei de sinteză s-au obținut în randamente bune iar prin purificare prin recristalizare repetată din diferiţi solvenţi
organici se topesc în intervale de maxim 3 C (Tabel 6.5).
12
Tabel 6.5. Caracteristicile fizico-chimice ale derivaților 2-{2-[2-(1,3-
dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(fenil)-5-(4-R2-benziliden) tiazolidin-4-ona (6a1-7).
N
N N
N
O
O
H3C
CH3
H2C C
O
NH NN
C O
CS CH
6a1-7, 6b1-7, 6c1-7
R2
R1
Nr.
comp R2
Formulă
moleculară /
Masă relativă
η
(%) P.t. (
0C) Solubilitate
6a1 -H(4)
C25H21N7O4S
515,5
72 260-262
solubil la cald în alcool etilic
96%, dioxan, alcool propilic,
alcool izopropilic, DMFA,
DMSO, insolubil în apă, alcool
etilic 50%, alcool metilic,
cloroform, acetonă, benzen,
eter etilic, HCl 100 g/L, NaOH
100 g/L.
6a2 -F(4)
C25H20N7O4SF
533,5
70 263-265
solubil la cald în alcool etilic
96%, alcool metilic, acetonă,
dioxan, DMFA, DMSO,
insolubil în apă, alcool etilic 50%, cloroform, alcool
propilic, alcool izopropilic,
benzen, eter etilic, HCl 100
g/L, NaOH 100 g/L.
6a3 -Cl(4)
C25H20N7O4SCl
549,9
74 235-237
solubil la cald în alcool etilic
96%, acetonă, dioxan, alcool
propilic, alcool izopropilic,
DMFA, DMSO, insolubil în
apă, alcool 50%, alcool
metilic, cloroform, benzen,
13
eter etilic, HCl 100g/L, NaOH
100 g/L.
6a4 -Br(4)
C25H20N7O4SBr
594,4
62 258-260
solubil la cald în alcool etilic
96%, cloroform, dioxan,
DMFA, DMSO, benzen,
insolubil în apă, alcool etilic
50%, alcool metilic, acetonă,
alcool izopropilic, alcool
propilic, eter etilic, HCl 100
g/L, NaOH 100 g/L.
6a5 -OH(4)
C25H21N7O5S
531,5
78
255-257
solubil la cald în alcool etilic 96%, alcool metilic, acetonă,
dioxan, alcool propilic, alcool
izopropilic, DMFA, DMSO,
insolubil în apă, alcool etilic
50%, cloroform, benzen, eter
etilic, HCl 100 g/L, NaOH 100
g/L.
6a6
-
N(CH3)2(4)
C27H26N8O4S 558,6
88 255-257
solubil la cald în alcool etilic
96%, alcool metilic,
cloroform, acetonă, dioxan,
DMFA, DMSO, benzen,
insolubil în apă, alcool etilic 50%, alcool propilic, alcool
izopropilic, eter etilic, HCl 100
g/L, NaOH 100 g/L.
6a7 -NO2(2)
C25H20N8O6S
560,5
91 247-250
solubil la cald în alcool etilic
96%, alcool metilic, dioxan,
alcool propilic, alcool
izopropilic, DMFA, DMSO,
benzen, insolubil în apă, alcool
etilic 50%, cloroform, acetonă,
eter etilic, HCl 100 g/L,
NaOH100g/L
14
Capitolul 7. CONFIRMAREA STRUCTURII CHIMICE A
COMPUŞILOR SINTETIZAŢI
Confirmarea structurii chimice reprezintă o etapă importantă în
caracterizarea fizico-chimică a compușilor organici întrucât oferă
argumentele științifice ce validează proiectarea și sinteza organică.
7.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII
7.2.1. Spectroscopia în infraroșu
Formarea esterului etilic al acidului teofilin-acetic este confirmată în spectrul IR prin identificarea benzilor de absorbție caracteristice grupării
ceto (C=O) din structura esterului ca o bandă de absorbţie îngustă, liberă,
de intensitate mare la lungimea de undă λ=1752 cm-1. Prezenţa grupărilor
iminice (-C=N) şi aminice terţiare (C-N ), din structura xantinică, este
confirmată prin benzi de absorbţie intense, asociată în cazul grupării C=N
şi liberă pentru gruparea C-N , de lăţimi medii cu frecvenţa caracteristică la lungimea de undă λ=1643 cm
-1, respectiv λ=1213 cm
-1.
Grupările funcţionale metil (atât din structura dimetilxantinică cât
și din cea esterică), și metilen, imprimă vibrații de deformare simetrică, identificate în spectru sub formă de benzi de absorbţie libere, înguste, de
intensitate medie, la lungimile de undă λ=1369 cm-1, respectiv λ=1429 cm
-
1. Gruparea C-O-C din structura esterului prezintă o bandă de absorbţie
liberă, îngustă, de intensitate medie cu frecvenţa caracteristică la lungimea de undă λ=1294 cm
-1.
Reacționarea teofilin-acetatului de etil cu hidratul de hidrazină este
susținută prin prezenţa în spectrul IR a benzilor de absorbţie libere, de lăţime medie şi intensitate mică, specifice hidrazidei, la lungimile de undă
λ=3296 cm-1
și 3188 cm-1
.
Spectrele IR ale tiosemicarbazidelor cu structură xantinică (4a-c),
obținute prin tratarea hidrazidei xantinice (3) cu izotiocianați aromatici (fenilizotiocianat, 4-clorfenilizotiocianat și 4-bromfenilizotiociant)
prezintă benzile de absorbție carcateristice grupării tiono (C=S) în
intervalul 1160-1188 cm-1
, și nucleului aromatic. Nucleul aromatic s-a identificat prin benzile de absorbţie corespunzătoare vibraţiilor de alungire
15
ale grupării funcţionale –C=C- (două benzi, înguste, de intensitate medie
situate în regiunea 1520-1600 cm-1
şi ale vibraţiilor de alungire ale
legăturii Csp2-H din gruparea funcţională =C-H (bandă lată, de intensitate slabă prezentă în regiunea 3012-3040 cm
-1. În plus, în spectrul acestor
compușilor 4b, 4c vibraţia de valenţă a legăturii C-Cl, respectiv C-Br
imprimă benzi de absorbţie înguste, de intensitate medie, libere situate la lungimea de undă 825 cm
-1, respectiv 667 cm
-1.
În spectrul IR al derivaților de tiazolidin-4-onă cu structură
xantinică (5a-c), formați în urma reacției de ciclizare a tiosemicarbazidelor corespunzătoare (4a-c) cu clorura acidului cloracetic, nucleul de tiazolidin-
4-onă a fost pus în evidenă prin identificarea benzilor de absorbție
caracteristice legării C-S în regiunea 665-695 cm-1
și grupării cetonice din
ciclu de tiazolidin-4-onă (C=O) în regiunea 1694-1701 cm-1
. Condensarea derivaților de tiazolidin-4-onă cu structură xantinică
(5a-c) cu diferite aldehide aromatice (benzaldehida, 4-flour/4-clor/4-
brom/4-hidroxi/4-dimetilamino-benzaldehida, 2-nitro-benzaldehida) este confirmtă prin apariția în spectrul derivaților de benziliden-tiazolidin-4-
onă (6a1-7, 6b1-7, 6c1-7) a benzilor de absorbție caracteristice substituenților
de pe nucleul aromatic. Astfel vibraţia de alungire datorată legăturii halogenului F a determinat apariţia unei benzi de absorbţie de intensitate
medie în intervalul 1149-1153 cm-1
. Frecvenţele vibraţiei de alungire
datorate halogenilor Cl şi Br s-au înregistrat în intervalele 759-804 cm-1
respectiv 635-660 cm-1
. Poziţia benzii de absorbţie înguste, de intensitate medie, specifice a legăturii -OH fenolice se află în domeniul 3240-3318
cm-1
. Derivații benziliden-tiazolidinici obținuți prin condensarea 4-
N(dimetilamino)benzaldehidei cu tiazolidin-4-onă corespunzătoare au prezentat o intensificare a benzilor de absorbţie de intensitate medie
datorate vibraţiei de deformare simetrică a grupărilor metil (-CH3) care
apar în intervalul 1344-1376 cm-1
. Pentru nitroderivaţii corespunzători s-a
observat prezenţa în spectrul IR a a două benzi intense datorate vibraţiilor de alungire cuplate ale legaturilor NO din grupările -NO2, vibraţie de
alungire simetrică νsim cu bandă de absorţie care s-a situat în intervalul
1323-1376 cm-1
şi vibraţie de alungire asimetrică νasim cu banda de absorbţie care a apărut în intervalul 1487-1499 cm
-1.
16
Spre exemplificare în Fig. 7.5 se prezintă caracteristicile spectrale
ale compusului 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-fenil-5-
(2-nitrobenziliden)tiazolidin-4-ona (6b7).
Fig. 7.5. Spectru IR al 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-
il)acetil]hidrazono}-3-fenil-5-(2-nitro-benziliden)tiazolidin-4-ona (6b7).
7.2.2. Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară
În spectrul 1H-RMN al esterului etilic al acidului teofilin-acetic s-
au identificat 5 semnale datorate protonilor din structura xantinică și lanțul esteric:
un semnal puternic, de tip singlet datorat protonului de la gruparea
N-CH=N ce prezintă deplasarea chimică la 8,06 ppm; un semnal mai slab, de tip singlet, specific celor doi protoni
aparţinând grupării metilen ( N-CH2-C=O) înregistrat la 5,17 ppm.
semnalul de la 4,16 ppm, datorat celor doi protoni din gruparea
metilen din restul esteric (-CH2-CH3) şi care apare ca un multiplet semnalul de la 1,22 ppm, triplet specific celor trei protoni ai
grupării metil (CH3) din restul esteric, indică o dezecranare
puternică explicată prin efectul exercitat în spaţiu de gruparea
esterică; două semnale puternice, de tip singlet, (3,30 ppm, 3,20 ppm) apar
pentru protonii aparţinând celor două grupări metil din structura
xantinică. Datele spectrale obținute prin înregistrarea spectrului
1H-RMN al
hidrazidei xantinice (3), confirmă formarea compusului prin dispariția
17
semnalelor caracteritice grupării etilen (CH2 – 4,28 ppm, CH3 – 1,24 ppm)
și apariția semnalelor protonilor grupării hidrazinice (-NH-NH2), la 7,99
ppm respectiv 2,09 ppm. Obţinerea tiosemicarbazidelor (4a-c) este confirmată prin
identificarea în spectrul 1H-RMN a semnalelor caracteritice protonilor
nucleului aromatic. Astfel în spectrul compusului 4a obținut prin tratarea hidrazidei xantinice cu fenilizotiocianatul, protonii nucleului aromatic apar
ca două dublete la 7,47 (CH= din poziţia orto), 7,35 (CH= din poziţia
meta) și un triplet la 7,19 (CH= din poziţia para). Pentru compușii 4b și 4c, obținuți în urma reacției cu 4-clor/4-brom fenilizotiocianat, protonii
nucleului aromatic au fost identificați ca dublete în regiunea 7,51 ppm,
7,41 ppm (4b) respectiv 7,53 ppm, 7,46 ppm (4c). Deplasările mai mari
înregistrate comparativ cu cele pentru compusul 4a sunt datorate efectului atrăgător de electroni al halogenilor şi implicit a ecranării slabe.
Ciclizarea tiosemicarbazidelor (4a-c) cu clorura acidului cloracetic
este confirmată prin identificarea în spectrul 1H-RMN a semnalelor
caracteristice celor doi protoni de la gruparea CH2 din poziţia 5 a ciclului de tiazolidin-4-onă format. Astfel în spectrul compuşilor (5a-c) s-au
înregistrat deplasări chimice ale celor doi protoni de la gruparea CH2 care
apare la frecvenţă mai joasă în intervalul 3,57-3,78 ppm, efect datorat învecinării cu atomul de sulf care prezintă caracter atrăgător de electroni
diminuat.
Formarea derivaţilor benzilidentiazolidinici cu nucleu xantinic
(6a1-7, 6b1-7, 6c1-7) este dovedită prin prezenţa în spectrul 1H-RMN a
protonului de la gruparea C=CH din ciclul tiazolidinic, care prezintă
semnal în intervalul de frecvenţe 7,04-7,48 ppm. În spectrul 13
C-RMN al
derivaţilor 6a1-7, 6b1-7, 6c1-7, au fost identificaţi carbonii radicalului aril nou introdus şi carbonii C11 şi C13 implicați în dubla legătură rezultată în urma
reacției de condensare. Prezenţa acestor semnale confirmă încă o dată
condensarea benzaldehidelor la ciclul tiazolidinic. Semnalele atomilor de
carbon C11 şi C13 apar în intervalele 117,08-119,78 ppm (pentru C11) şi 138,51-143,07 ppm (pentru C13), caracterizate de o dezecranare puternică
datorată învecinării C11 cu atomul de sulf şi cu cel de oxigen, şi a C13 cu
nucleul aril (efect puternic atrăgător de electroni). Totodată în spectrele 13
C-RMN au fost înregistrate semnalele caracteristice atomilor de carbon
18
prezenţi în nucleul xantinic, lanțul acetil-hidrazinic, ciclului tiazolidinic şi
celor două nuclee aromatice.
Spre exemplificare in Fig. 7.10 și 7.11 sunt prezentate spectrul 1H-
RMN şi spectrul 13
C-RMN al compusului 2-{2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-
il)acetil]hidrazono}-3-(fenil)-5-(benziliden) tiazolidin-4-ona (6a1).
Fig.7.10. Spectrul 1H-RMN al 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-
il)acetil]hidrazono}-3-(fenil)-5-(benziliden) tiazolidin-4-ona (6a1).
Fig.7.11. Spectrul 13
C-RMN al 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-
il)acetil]hidrazono}-3-(fenil)-5-(benziliden) tiazolidin-4-ona (6a1).
Informaţiile structurale furnizate prin înregistrarea spectrelor IR, 1H-RMN şi
13C-RMN au validat obţinerea derivaţilor benziliden-
tiazolidinici şi implicit succesul sintezelor realizate.
19
Capitolul 8. DEZVOLTAREA UNOR MICROSISTEME PE BAZĂ
DE CHITOSAN CU APLICABILITATE ÎN TERAPIA
DIABETULUI ZAHARAT Sistemul de eliberare controlată ales pentru creşterea
biodisponibilităţii substanţei active este reprezentat de sistemul matrice,
preparat sub formă de microparticule în care principiul activ este dispersat uniform în faza polimerică-chitosanul. Mecanismul de eliberare a
substanţei active constă în eliberarea controlată de difuzie (prin porii
membranei) şi eliberarea controlată chimic (prin degradarea enzimatică a matricei de chitosan).
8.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII
În vederea obţinerii unor microparticule de chitosan stabile atât în soluţia agentului de reticulare cât şi după uscare au fost modificate
concentraţiile şi condiţiile de lucru. Astfel s-a variat concentraţia şi masa
moleculară a polimerului şi concentraţia agentului de reticulare ionică –TPP. S-a lucrat cu chitosan cu greutate moleculară medie (CMMW) și
chitosan cu greutate moleculară mică (CLMW), în concentrație de 1% și
2%. Concentrațiile de TPP utilizate în studiu au fost de 2%, 5% și 10%. Cele mai stabile microparticulele au fost cele obținute în
următoarele condiții: chitosan cu greutate moleculă medie, concentrația
soluției de chitosan de 2%, TPP 5%.
Microparticulele de chitosan au fost utilizate ca matrici pentru înglobarea a doi compuși sintetizați, din grupa benziliden-tiazolidin-4-onă:
2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-bromfenil)-5-(4-
clorobenziliden)tiazolidin-4-ona (6c3) și 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil] hidrazono}-3-(4-bromfenil)-5-(4--hidroxibenziliden)tiazolidin-4-
ona (6c5), în vederea îmbunătățirii profilului lor farmacocinetic și
farmacotoxicologic.
8.2.2.1. Eficienţa încapsulării substanţei active în microparticule de
chitosan
În vederea stabilirii concentrației optime de substanță activă, care să asigure o încapsulare maximă și eficientă, cei doi compuși (6c3, 6c5) au
fost utilizați fiecare dintre ei în trei concentrații de 0,5 mg/mL (CH - 6c3
A), 2,5 mg/mL (CH - 6c3 B), 5 mg/mL (CH - 6c3 C) şi respectiv 2,5 mg/mL
(CH - 6c5 D), 5 mg /mL (CH - 6c5 E), 7,5 mg/mL (CH - 6c5 F). Cantitatea
20
de substanță activă înglobată în microparticulele de chitosan, respectiv
eficiența procesului de încapsulare, s-a determinat spectrofotometric pe
baza curbei de calibrare, stabilită pentru fiecare compus studiat (6c3 și 6c5). Curba de calibrare s-a trasat prin monitorizarea creşterii absorbanţei în
raport cu creşterea concentraţiei substanței active în soluție.
Din analiza rezultatelor prezentate în Fig. 8.2 se constată că
procesul de înglobare a fost eficient, valoarea încapsulării fiind direct proporţională cu concentraţia derivaţilor de benziliden-tiazolidin-4-onă cu
structură xantinică, variind între 68,98% și 90,89%.
Fig. 8.2. Eficienţa încapsulării compușilor 6c3 și 6c5 la diferite concentrații: CH - 6c3, 0,5 mg/mL - A, 2,5 mg/mL - B, 5 mg/mL - C); CH-
6c5, 2,5 mg/mL - D, 5 mg/mL - E, 7,5 mg/mL - F.
8.2.2.2. Morfologia microparticulelor de chitosan-substanță activă
Studiul morfologic a evidențiat faptul că microparticulelor de
chitosan au conturul regulat, suprafaţa sferică şi uşor rugoasă, mărimea
acestora fiind de aproximativ 279 μm în stare uscată, prezentând o relativă transparenţă. Odată cu creșterea concentrației de substanţă activă (6c3, 6c5)
în matricea de chitosan, sfericitatea microparticulelor se reduce, conturul
devine neregulat, suprafaţa netedă şi are loc apariţia unor fisuri pe suprafaţa microsferelor observate prin intermediul microscopului
electronic cu scanare. Acest fenomen este explicat prin caracterul puternic
hidrofob şi cristalinitatea accentuată a celor două substanţe încorporate. Culoarea microparticulelor chitosan-substanţă activă este alb-gălbuie iar
aspectul este mat.
21
Particularităţile privind morfologia microparticulelor de chitosan -
substanță activă, în funcție de concentrația de substanță activă folosită sunt
prezentate în Fig. 8.5.
Fig. 8.5. Imigini SEM ale microparticulelor de chitosan-substanță
activă CH - 6c3 A (I), CH - 6c3 B (II), CH - 6c3 C (III); CH - 6c5 D (IV), CH - 6c5 E (V), CH - 6c5 F (VI), CH (VII).
8.2.2.3. Testul de umflare
Capacitatea matricelor polimerice de a reține apa a fost testată în mediu de apă distilată şi mediu cu pH acid (1,6), ce simulează mediul
gastric uman, pentru a observa comportarea microparticulelor în mediul
specific eliberării substanței active in vivo. Comportamentul microparticulelor de chitosan și chitosan-
substanță activă privind capacitatea de reţinere a apei este prezentat in
Fig.8.6. (apă distilată) și Fig. 8.7 (mediu cu pH acid). Rezultatele testului de umflare a microparticulelor de chitosan
cu/fără substanță activă încapsulată efectuat în apă distilată a evidențiat
faptul că puterea microparticulelor încărcate cu substanță activă de a reține
apa este mult diminuată (grad de umflare de aproximativ 40%) comparativ
22
cu cea a microparticulelor de chitosan (aproximativ 120%) datorită
caracterului hidrofob al derivaților de benziliden-tiazolidin-4-onă cu
structură xantinică (6c3, 6c5), care reduc hidrofilia matricei de chitosan. Acest efect de diminuare a cantităţii de apă reţinută este direct proporțional
cu creşterea concentrației substanţelor active hidrofobe - 6c3, 6c5 din
matricea polimerică. Totodată s-a observat că pentru ambele tipuri de microparticule (CH - 6c3, CH – 6c5) echilibrul termodinamic, referitor la
capacitatea de hidratare, se atinge la 2 ore de la începerea experimentului și
se menține pe toată durata acestuia.
Fig. 8.6. Capacitatea de reţinere a apei a microparticulelor CH - 6c3 (I) şi
CH - 6c5 (III) - apă distilată.
Fig. 8.7. Capacitatea de reţinere a apei a microparticulelor CH - 6c3 (II) şi
CH - 6c5 (IV) - mediu cu pH acid.
23
Studiul gradului de hidratare în mediu cu pH acid, similar
mediului gastric a evidențiat o îmbunătăţire a capacităţii de umflare a
microparticulelor (în cazul microparticulelor CH – 6c3, fiind de aproximativ 2,7 ori mai mare la concetraţia 0,5 mg/mL), comparativ cu cel
obținut în apă distilată, astfel gradul de hidratare a fost mai intens şi a
prezentat o creştere continuă şi gradată a procentului de umflare atât pentru microparticulele de chitosan fără substanţa activă încorporată cât şi pentru
microparticulele chitosan-substanță activă (CH - 6c3, CH – 6c5).
8.2.2.4. Analiza spectrală IR a microparticulelor de chitosan-substanță
activă
În spectrul IR înregistrat pentru microparticule de chitosan-substanță activă, au fost identificate benzile de absorbție specifice
grupărilor funcționale ale derivaţilor de benziliden-tiazolidin-4-onă cu
structură xantinică. Spectrele IR ale microparticulelor de CH - 6c3, respectiv CH – 6c5,
la diferite concentrații comparativ cu chitosanul și substanțele active (6c3,
6c5) sunt prezentate in Fig. 8.8.
Fig. 8.8. Spectrul IR al microparticulelor de chitosan CH – 6c3 A, CH –
6c3 B, CH – 6c3 C; CH – 6c5 D, CH – 6c5 E, CH – 6c5 F; CH.
Astfel în spectrul IR al microparticulelor de CH-6c3 şi CH-6c5 au
fost identificate benzile de absorbţie de intensitate medie determinate de
24
vibraţiile de deformare în afara planului ale legăturilor C-H din nucleul
benzenic para substituit şi de vibraţia de alungire asimetrică a legături
duble cumulate (C=C), prezente în intervalele 2993-2995, 1593-1594, 1543-1545 cm
-1. Benzile de absorbţie specifice grupării (-NH-) au fost
identificate la lungimile de undă situate în intervalul 3176-3244, 3111-
3177 cm-1
. Bandă de absorbţie atribuită vibraţiei de valenţă a grupării (C-
S-C) a fost înregistrată în intervalul 680-682 cm-1. În spectrul IR al
microparticulelor CH-6c3 s-au înregistrat benzi de absorbţie înguste, de
intensitate medie, specifice vibraţiilor de valenţă ale legăturii C-halogen: 659 (C-Br), 793 (C-Cl). Bandă de absorbţie atribuită legăturii (C-Br) a fost
identificată la λ= 659 cm-1
şi pentru microparticulelor CH-6c5.
În urma analizei spectrale IR se poate afirma prezența substanțelor
active în microparticulele de chitosan, ceea ce constituie un argument în plus pentru încorporarea acestora în matricea polimerică.
8.2.2.5. Studiul eliberării in vitro a substanţei active din matricea polimerică
Studiul eliberării substantei active din microparticulele de chitosan
a fost realizat în trei tipuri de lichide care mimează cele trei medii biologice: mediul gastric, intestinal și colonic.
Profilul eliberării celor două substanţe active (6c5, 6c3), reprezentat
grafic în Fig. 8.9. a permis obţinerea unei imagini globale asupra profilului
farmacocinetic al microparticulelor.
Fig. 8.9. Profilul eliberării compușilor 6c3 şi 6c5 din matricea de chitosan.
În urma analizei profilului de cedare a substanţelor active de către
microparticulele de chitosan în cele trei medii de eliberare (Fig. 8.9), se
25
observă pentru ambele substanţe o eliberare diminuată (aprox. 15%) în
lichidul care mimează mediul gastric, urmată de o eliberare mai accentuată
(aproximativ 60% din cantitatea iniţială prezentă în microsferele de chitosan) în lichidul ce mimează mediul intestinal şi lipsa eliberării
substanţei active în lichidul care mimează mediul colonic sau a eliberării
unei cantităţi foarte mici care nu a putut fi detectată spectrofotometric. Eliberarea diminuată a substanţelor active în mediu care mimează lichidul
gastric poate fi explicată prin caracterul puternic hidrofob al derivaţilor 6c3
şi 6c5 care imprimă o capacitate scăzută de umflare şi un timp de aproximativ 2 ore pentru ca porii membranei polimerice să se deschidă
treptat prin creşterea în volum a microsferelor de chitosan. Această umflare
a microparticulelor de chitosan în mediu gastric a contribuit la eliberarea
mai accentuată a substanţelor 6c3 şi 6c5 în lichidul care mimează mediul intestinal şi la eliberarea unei cantităţi infime în mediul colonic, care nu a
putut fi detectată spectrofotometric.
Cedarea substanţelor active încorporate în matricea de chitosan în mediile de eliberare simulate a fost invers proporţională cu creşterea
concentraţiei de substanţă activă prezentă în microparticule. Prin urmare,
microparticulele de chitosan în care concentraţia substanţei active este de 7,5 mg/mL sunt caracterizate de o eliberare redusă a substanței active
55,97% în timp ce pentru microparticulele care conţin o cantitate redusă de
substanţă activă (0,5 mg/mL) s-a înregistrat o eliberare mult mai mare, de
91,33%.
8.2.2.6. Studiul degradării enzimatice a microparticulelor de chitosan -
substanţă activă Lizozimul, utilizat la degradarea enzimatică a microparticulelor de
chitosan-substanță activă, este o enzimă bacteriană prezentă în proporţie
mare în sucul gastric. În condițiile experimentului, degradarea enzimatică
indusă de lizozim, contribuie semnificativ la eliberarea substanţei active din matricea polimerică prin degradarea membranei polimerice.
Prin analiza rezultatelor obţinute se remarcă importanţa
concentraţiei substanţei active încorporate asupra stabilităţii microparticulei de chitosan. Astfel, se observă că microparticulele de
chitosan încărcate cu o cantitate mai mare de substanţă activă prezintă o
predispoziţie crescută la biodegradarea enzimatică.
26
Fig. 8.10. Biodegradarea enzimatică
a microparticulelor de CH-substanță
activă la diferite concentraţii.
Fig. 8.11. Modificări morfologice
ale microparticulelor: CH (I), CH -
6c5 E (II) după 7 zile.
În cazul microparticulelor de chitosan încărcate cu substanţele 6c3
şi 6c5 se observă că degradarea enzimatică are loc lent, cea mai intensă rată înregistrându-se în cazul microparticulelor ce conțin 7,5 mg/mL substanță
activă, gradul de degradare enzimatică fiind de 61,16%. În condiții
similare pentru microparticulele cu un conținut de 0,5 mg/mL substanţă
activă s-a înregistrat biodegradarea cea mai redusă în procent de 41%. Microparticulele de chitosan fără substanţa activă încorporată (CH) sunt
mai stabile la biodegradare, gradul de degradare enzimatică după 7 zile
fiind de 40,59%. Diferențele observate între microparticulele de chitosan și cele încărcate cu substanță activă sunt datorate influenţelor exercitate de
substanța activă cu caracter hidrofob asupra stabilităţii matricei
polimerice. Modificările observate în morfologia microparticulelor în urma
procesului de biodegradare au fost: un grad ridicat de rugozitate, contur
neregulat, dimensiunea microparticulelor redusă comparativ cu cea iniţială.
27
Capitolul 9. EVALUAREA BIOLOGICĂ A DERIVAȚILOR DE
TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU STRUCTURĂ XANTINICĂ
9.1.EVALUAREA POTENȚIALULUI ANTIOXIDANT in vitro
Compușii sintetizați, derivați de tiazolidin-4-onă cu structură
xantinică au fost evaluați din punct de vedere biologic, urmărindu-se, într-o primă etapă, determinarea potențialului antioxidant, avându-se în vedere
importanța stresului oxidativ în declanșarea dar și în evoluția diabetului
zaharat. Acţiunea antioxidantă a fost determinată prin patru metode: puterea reducătoare, capacitatea totală antioxidantă, şi capacitatea de
inhibare a radicalilor liberi DPPH şi ABTS. Activitatea antiradicalică
(DPPH şi ABTS), a fost exprimată ca procent de inhibiţie (I%) a acestor
radicali şi prin calcularea valorii concentraţiei eficiente 50 (CE50 µg/mL). Puterea reducătoare şi capacitatea totală antioxidantă a compuşilor testaţi a
fost exprimată prin calcularea valorii concentraţiei eficiente 50 (CE50
µg/mL) şi prin reprezentarea grafică a valorilor absorbanţei compușilor testați, obținute la diferite concentraţii.
9.1.2. Rezultate şi discuţii
9.1.2.1. Puterea reducătoare
Rezultatele studiului privind puterea reducătoare a compuşilor
testaţi sunt prezentate în Tabelul 9.1 și Fig. 9.2. Prin creşterea concentrației de substanță activă în probă a avut loc o creştere evidentă a puterii
reducătoare.
Modulările structurale realizate la nivelul ciclului tiazolidinic prin condensare cu diferite aldehide aromatice a condus la obţinerea unor
compuşi cu potenţial antioxidant remarcabil şi totodată diferenţiabil în
funcţie de radicalul din poziția orto sau para de pe nucleul benziliden.
Astfel valorile EC50 pentru compusul 6a5 (R2=OH) a fost de 33,72 µg/mL iar pentru compusul 6a6 (R2 = N(CH3)2) de 33,48 µg/mL, ceea ce
însemană că derivații sunt de aproximativ patru ori mai activi decât
tiazolidin-4-ona corepunzătoare seriei (5a) la care valoarea CE50 a fost de 137,78 µg/mL. În cea de a doua serie, compușii rezultați în urma
condensării cu 4-hidroxibenzaldehida (compusul 6b5) și 4-dimetilamino-
benzaldehida (compusul 6b6) au fost cei mai activi. Ei s-au dovedit a fi de 5,7 ori (6a5, CE50 = 27,21 µg/mL), respectiv 6,7 ori (6a6, CE50 = 23,68
28
µg/mL) mai activi decât tiazolidin-4-ona corespunzătoare (5b, CE50 =
155,85 µg/mL).
În cea de-a treia serie compușii rezultați în urma reacției de condensare a tiazolidin-4-onei corespunzătoare (5c) cu 4-hidroxi-
benzaldehida și 4-dimetilaminobenzaldehida au fost de 6 ori (6c5, CE50 =
23,13 µg/mL) şi respectiv 6,7 ori (6c6, CE50 = 20,44 µg/mL) mai activi decât 5c (EC50 = 137,85 µg/mL).
Tabel 9.1. Puterea reducătaore a derivaților (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a tiazolidin-4-onelor corespunzătoare (5a-c).
Comp CE50
µg/mL
Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/ml
5a 137,78 ± 0,31 5b 155,85 ± 0,97 5c 137,85 ± 0,41
6a1 109,52 ± 0,75 6b1 109,29 ± 0,54 6c1 108,86 ± 0,54
6a2 97,68 ± 0,77 6b2 102,84 ± 0,89 6c2 98,17 ± 0,72
6a3 55,75 ± 1,13 6b3 46,92 ± 0,54 6c3 59,31 ± 0,99
6a4 96,44 ± 1,19 6b4 66,16 ± 0,74 6c4 87,53± 0,85
6a5 33,72 ± 0,84 6b5 27,21 ± 0,39 6c5 23,13 ± 0,96
6a6 33,48 ± 1,14 6b6 23,68 ± 1,13 6c6 20,44 ± 0,57
6a7 58,46 ± 1,15 6b7 41,66 ± 1,39 6c7 38,86 ± 0,53
Acid ascorbic 5.75 ± 0.24
*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard.
29
Fig. 9.2. Puterea reducătoare a derivaţilor benziliden tiazolidinici cu
structură xantinică 6a1-7 (I), 6b1-7 (II), 6c1-7 (III) față de tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).
Studiul efectuat privind evaluarea puterii reducătoare a evidențiat
faptul că toţi cei 21 de compuşi finali prezintă o capacitate antioxidantă superioară tiazolidin-4-onelor corespunzătoare dar inferioară acidului
ascorbic, antioxidant de referință, la aceeaşi concentraţie.
9.1.2.2. Capacitatea totală antioxidantă
Compararea rezultatelor obținute cu cele trei serii de compuși a
evidențiat faptul că prezenţa substituentului 4-clorfenil la atomul de azot
din poziția 3 (N3) din ciclul de tiazolidin-4-onă influenează favorabil acțiunea antioxidantă, compușii din această serie (6b1-7) fiind mai activi
decât analogii lor 3-fenil (6a1-7) , respectiv 3-(4-bromfenil) (6c1-7) (tabel
9.2, fig. 9.3).
În ceea ce privește influența benzaldehidei utilizate în reacția de condensare cu formarea derivaților de benziliden-tiazolidin-4-onă,
rezultatele obținute au evideniat faptul că cei mai activi compuși au fost cei
30
rezultați în urma reacției de condensare cu 4-hidroxi-benzaldehida (6a5,
6b5, 6c5) şi 4-dimetilaminobenzaldehida (6a6, 6b6, 6c6).
Tabel 9.2. Capacitatea totală antioxidantă a derivaților de benziliden-
tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a tiazolidin-
4-onelor corespunzătoare (5a-c).
Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL
5a 124,01 ± 0,92 5b 133,28 ± 0,63 5c 136,94 ± 0,21
6a1 105,31 ± 0,25 6b1 90,89 ± 0,83 6c1 120,35 ± 0,31
6a2 99,3 ± 0,18 6b2 90,18 ± 0,87 6c2 114,14 ± 0,34
6a3 48,34 ± 0,32 6b3 43,67 ± 0,63 6c3 62,13 ± 0,92
6a4 76,46 ± 0,52 6b4 99,57 ± 2,45 6c4 89,44 ± 0,43
6a5 25,06 ± 0,51 6b5 22,84 ± 0,34 6c5 22,94 ± 0,21
6a6 31,97 ± 1,05 6b6 23,68 ± 1,13 6c6 29,37 ± 0,51
6a7 37,88 ± 0,74 6b7 26,97 ± 0,84 6c7 33,13 ± 0,41
Acid ascorbic 5,15 ± 0,15
*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard
Derivaţii cu radicalul hidroxil în poziţia para a nucleului benzilidenic, 6a5 (CE50 = 25,06 µg/mL), 6b5 (CE50 = 22,84 µg/mL) şi 6c5
(CE5 0= 22,94 µg/mL) s-au dovedit a fi de 4,96; 5,83 și respectiv 5,95 ori
mai activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare, 5a (CE50 = 124.01
µg/ml), 5b (CE50 = 133,28 µg/mL) și respectiv 5c (CE50 = 136,94 µg/mL). Capacitatea totală antioxidantă a analogilor 4-dimetilamino-
benziliden (6a6, 6b6, 6c6) a fost similară cu cea a derivaţilor 4-hidroxi-
benziliden, fiind de 3,87 (6a6, CE50 = 31,97 µg/mL), 5,62 (6b6, CE50 = 23,68 µg/mL) și respectiv 4,65 (6c6, CE50 = 29,37 µg/mL) ori mai activi
decât tiazolidin- 4-onele corespunzătoare.
Toţi compuşii testaţi au prezentat o acțiune antioxidantă mai redusă în comparativ cu acidul ascorbic, în acceași concentrație și în
condiții experimentale similare.
31
Fig. 9.3. Capacitatea totală antioxidantă a derivaților de benziliden-
tiazolidin-4-onă cu structură xantinică, 6a1-7 (I), 6b1-7 (II) și 6c1-7 (III), față
de tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).
9.1.2.3. Capacitatea antiradicalică față de radicalul DPPH
Activitatea de scavenger a compuşilor testaţi a variat dependent de concentraţie. Toți compușii finali obținuți (6a1-7, 6b1-7, 6c1-7) sunt mai
activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c), în capacitatea de a
reduce radicalii liberi DPPH (tabel 9.3, fig. 9.5).
Astfel compuşii din seria (6a1-7) s-au dovedit a fi de 1,27-3,57 ori mai activi (CE50 = 107,54 – 38,21 µg/mL) față de tiazolidin-4-ona
corespunzătoare (5a, CE50 = 136,6 µg/mL). Cei mai activi compuși s-au
dovedit a fi compusii 6a5 (CE50 = 25,06) și 6a6 (CE50 = (31,97), rezultați
în urma reacției de condensare cu 4-hidroxibenzaldehida, respectiv cu 4-dimetilaminobenzaldehida.
Compuşii finali din seria (6b1-7) au dovedit o capacitate de
reducere a radicalilor liberi DPPH de 1,2-3,4 ori mai ridicată (CE50 =
32
106,48 – 37,42 µg/mL) faţă de tiazolidin-4-ona corespunzătoare (5b, CE50
= 127,01 µg/mL). Compuşii cei mai activi s-au dovedit a fi cei rezultaţi în
urma condensării cu 4-hidroxibenzaldehida (6b5, CE50 = 38,93), cu 4-dimetilaminobenzaldehida (6b6, CE50 = 37,42), respectiv cu 2-
nitrobenzaldehida (6b7, CE50 = 38,83).
Compuşii finali din seria (6c1-7) s-au dovedit a fi de 1,4-3,7 ori mai
activi (CE50 = 100,34 – 38,13 µg/mL) faţă de tiazolidin -4-ona corespunzătoare (5c, CE50 = 141,33 µg/mL). Compuşii cei mai activi s-au
dovedit a fi cei rezultaţi în urma condensării cu 4-hidroxibenzaldehida
(6c5, CE50 = 38,13), respectiv cu 4-dimetilaminobenzaldehida (6c6, CE50 = 38,13).
Tabel 9.3. Acțiunea antiradicalică DPPH (EC50) a derivaților de
benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).
*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard.
Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL
5a 136,6 ± 0,06 5b 127,01 ± 0,13 5c 141,33 ± 0,14
6a1 94,14 ± 0,35 6b1 106,48 ± 0,41 6c1 100,34 ± 0,31
6a2 107,54 ± 0,84 6b2 101,34 ± 0,51 6c2 93,47 ± 0,21
6a3 66,93 ± 0,83 6b3 49,92 ± 0,61 6c3 69,57 ± 0,91
6a4 77,43 ± 1,03 6b4 85,64 ± 0,71 6c4 85,82 ± 0,27
6a5 38,21 ± 0,41 6b5 38,93 ± 0,41 6c5 38,13 ± 0,15
6a6 39,58 ± 0,81 6b6 37,42 ± 0,81 6c6 38,13 ± 0,95
6a7 48,29 ± 0,41 6b7 38,83 ± 1,41 6c7 46,53 ± 0,29
Acid ascorbic 6,51 ± 0,031
33
Fig.9.5. Capacitatea de inhibare (I%) a radicalilor liberi DPPH de către
derivații de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică 6a1-7 (I), 6b1-7
(II) și 6c1-7 (III) și tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).
9.1.2.4. Capacitatea antiradicalică față de radicalul cation ABTS·+
Din analiza rezultatelor obținute și reprezentate grafic în Fig. 9.7 se observă că activitatea antiradicalică a compușilor studiați crește odată cu
concentrația, cea mai mare inhibiție înregistrându-se la concentrația de 75
µg/mL la care valoarea inhibiției a variat între 57,63%-97,31% în seria derivaţilor 6a1-7, 52,34%-92,07% în seria derivaţilor 6b1-7, respectiv
51,59%-90,31% în seria derivaţilor 6c1-7.
Datele experimetale referitoarea la valoarea CE50 (Tab. 9.4) susţin pe deplin afirmaţia că toţi derivaţii de benziliden-tiazolidin-4-onă (6a1-7,
6b1-7, 6c1-7) sunt mai activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).
Compuşii cei mai activi s-au dovedit a fi cei obţinuţi prin
condensarea tiazolidin-4-onelor cu 4-hidroxibenzaldehida (6a5, 6b5, 6c5), 4-dimetilaminobenzaldehida (6a6, 6b6, 6c6) şi 2-nitrobenzaldehida (6a7,
6b7, 6c7).
Astfel compușii 4-hidroxibenziliden (6a5, 6b5, 6c5) s-au dovedit a fi de 2,63-2,89 ori (CE50 = 25,83; 25,87 respectiv 27,28 µg/mL), cei 4-
34
dimetilaminobenziliden (6a6, 6b6, 6c6) de 2,99-3,3 ori (CE50 = 25,01; 21,23
respectiv 21,77 µg/mL) iar cei 2-nitrobenziliden (6a7, 6b7, 6c7) de 2,04-
2,15 ori (CE50 = 36,53; 31,31 respectiv 33,25 µg/mL) mai activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a, 5b, 5c).
Fig.9.7. Capacitatea de inhibare (I%) a radicalilor ABTS
+˙ de către
derivații de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7
și 6c1-7) și tiazolidin-4-onele (5a-c).
Tabel 9.4. Acțiunea antiradicalică ABTS
+˙ (CE50) a derivaților de
benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a
tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).
Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL
5a 74,81 ± 0,34 5b 69,64 ± 0,31 5c 71,81 ± 0,11
6a1 47,73 ± 0,26 6b1 48,64 ± 0,41 6c1 49,03 ± 0,05
6a2 49,93 ± 0,68 6b2 41,32 ± 0,25 6c2 49,65 ± 0,31
6a3 37,74 ± 0,15 6b3 31,03 ± 0,45 6c3 48,82 ± 0,51
6a4 43,01 ± 0,82 6b4 40,57 ± 0,91 6c4 49,56 ± 0,41
6a5 25,83 ± 0,72 6b5 25,87 ± 0,71 6c5 27,28 ± 0,44
6a6 25,01 ± 0,21 6b6 21,23 ± 0,61 6c6 21,77 ± 0,71
6a7 36,53 ± 0,91 6b7 31,31 ± 0,11 6c7 33,25 ± 0,91
35
Acid ascorbic 5,51 ± 0,098
*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard.
9.2. SCREENING TOXICOLOGIC. DETERMINAREA
TOXICITĂŢII ACUTE
Derivații de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică sintetizați au fost evaluați in vivo, din punct de vedere toxicologic,
determinându-se doza letală 50.
9.2.2. Rezultate și discuții
Pe baza rezultatelor prezentate în Tab. 9.5 se poate afirma că
derivații studiați se încadreaza în grupa substanţelor cu grad foarte redus de toxicitate. Compușii din seria 6c1-7, cu valori ale DL50 cuprinse în
intervalul 1468,75-1875,02 mg/kg corp au fost mai puțin toxici faţă de cei
din seria 6b1-7 care au prezentat valori ale DL50 cuprinse în intervalul
1281,25-1562,51 mg/kg corp. În seria 6c1-7 cei mai puțin toxici au fost derivaţii: 6c2 condensat cu
4-fluorbenzaldehida (DL50 = 1875,02 mg/kg corp) şi 6c7 condensat cu 2-
nitrobenzaldehida (DL50 = 1812,51 mg/kg corp). În seria 6b1-7 , compuşii cei mai puţin toxici au fost 6b4 condensat cu 4-brombenzaldehida (DL50 =
1562,51), 6b5 condensat cu 4-hidroxibenzaldehida (DL50 = 1500,01) şi
6b7 condensat cu 2-nitrobenzaldehida (DL50 = 1468,75).
Comparativ cu teofilina (DL50 = 235 mg/kg corp), utilizată ca model structural, compuşii studiați (seria 6b1-7 şi 6c1-7 ) sunt de aproximativ
6 ori mai puţin toxici (Lindamood C., et al., 1987). Față de pioglitazonă
(DL50 = 181 mg/kg corp), compus antidiabetic de referinţă cu structură de tiazolidin-2,4-dionă, compuşii sintetizaţi din seria 6b1-7 şi 6c1-7 sunt de
aproximativ 8 ori mai puţin toxici (USP, 2010).
Tabel 9.5. Valorile dozei letale (DL50 în mg/kg corp) obţinute pentru
compuşii benziliden-tiazolidin-4-onă din seriile 6b1-7, 6c1-7
Compus DL50 (mg/kg corp) Compus DL50 (mg/kg corp)
6b1 1281,25 6c1 1500,01
6b2 1437,51 6c2 1875,02
6b3 1281,25 6c3 1593,75
6b4 1562,51 6c4 1687,51
36
6b5 1500,01 6c5 1625,01
6b6 1281,25 6c6 1468,75
6b7 1468,75 6c7 1812,51
9.3. EVALUAREA UNOR PARAMETRI CLINICI, BIOCHIMICI ȘI
HEMATOLOGICI PE MODEL DE DIABET ZAHARAT
Pe baza rezultatelor obținute la screeningul toxicologic și la
studiile privind evaluarea potențialului antioxidant in vitro au fost selectați doi compuși, (2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)
-5-(4-hidroxibenziliden)tiazolidin-4-ona (6c5) (2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-
il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)-5-(4-clorbenziliden)tiazolidin-4-ona)
(6c3) care au fost studiați în continuare privind efectul asupra următorilor parametri:
clinici - greutate, consum de hrană, consum de apă;
biochimici - aspartataminotransferaza (AST), alaninamino-transferaza (ALT), bilirubină totală, bilirubină directă,
lactatdehidrogenaza (LDL), uree, creatinină, acid uric, colestrol
total, LDL colesterol, HDL colestrol, trigliceride; hematologici - hemograma, glicemie postprandială, hemoglobină
glicozilată.
Avându-se în vedere, de pe o parte influența favorabilă a
chitosanului asupra profilului toxicologic și farmacocinetic al substanțelor
active, și pe de altă parte potențialele efecte antidiabetice ale acestui polimer, cei doi compuși selectați au fost studiați și sub formă de
microparticule de chitosan - CH-6c3 și CH-6c5, urmându-se același
protocol de lucru.
9.3.2. Rezultate şi discuţii
9.3.2.1. Evaluarea parametrilor clinici
Pe parcursul studiului a fost monitorizată creşterea în greutate a şobolanilor, consumul de hrană şi de apă.
Din rezultatele studiului realizat privind creşterea în greutate (Fig.
9.8), se observă că șobolanii din Lotul 5 care au fost tratați cu pioglitazonă
37
au prezentat o creştere net superioară a masei corporale medii (21.91%)
faţă de greutatea iniţială, cunoscut fiind faptul că tratamentul cu
medicamente antidiabetice de tipul tiazolidindionelor (pioglitazona, rosiglitazona) este deseori asociat cu numeroase efecte secundare, precum
creşterea în greutate (Havale S. H. et al., 2009).
În cazul şobolanilor din Loturile 3 şi 4 care au fost trataţi cu derivaţii de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6c3,
respectiv 6c5), creșterea a fost mult mai redusă decât în cazul lotului tratat
cu pioglitazona. Creșterea în greutate înregistrată a fost de 8,55 ori (6c3, G = 2,56%), respectiv de 6,18 ori (6c5, G=3,54%) mai mică decât la
animalele din Lotul 5 tratat cu pioglitazonă (G = 21,91%).
În cazul șobolanilor trataţi cu microparticule de chitosan -
substanţă activă (Lot 1, 1a, 2, 2a) s-a înregistrat, dimpotrivă, o scădere a masei corporale față de valoarea inițială, cea mai drastică scădere
înregistrându-se pentru șobolanii din lotul 1, cu până la -5,34 %. Acest
fenonem ar putea fi datorat chitosanului, care prin capacitatea sa de umflare ar determina senzație de sațietate cu reducerea poftei de mâncare
și implicit cu reducerea greutății corporale.
Fig.9.8. Monitorizarea masei corporale la şobolanii din loturile de studiu
(1-7, 1a, 2a). L1: CH-6c5
*, L1a: CH-6c5**, L2: CH-6c3
*, L2a: CH6c3**, L3: 6c5, L4:
6c3, L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă 1/20 DL50, ** doză echivalentă 1/40 DL50.
38
Simptomele care apar în perioada de debut clinic al diabetului
zaharat, când glicemia a jeun este de obicei mai mare de 180 mg/dL (10
mmol/L), includ pe lângă scădere în greutate și senzaţie de sete continuă urmată de un consum mărit de apă (polidipsie).
Din datele obținute în cadrul studiului privind consumul de lichide
și reprezentate grafic în Fig. 9.9 se observă că şobolanii diabetici aflaţi în faza iniţială a experimetului au prezentat o polidipsie accentuată, fenomen
care s-a ameliorat spre finalul experimetului. Fenomenul de ameliorare s-a
observat și pentru loturile tratate cu pioglitazona (Lot 5), cu derivații 6c5 (Lot 3) și 6c3 (Lot 4), precum și pentru loturile tratate cu microparticule de
chitosan – substanță activă (Lot 1, 1a, 2, 2a).
Pentru șobolanii nediabetici din lotul 7 s-a înregistrat un consum
normal de apă în 24 de ore de 67,34-114,5 mL/kg corp. În cazul loturilor 3 şi 4, în care șobolanii au fost tratați cu derivații de benziliden-tiazolidin-4-
onă (6c3, 6c5) consumul de apă în 24 de ore a fost de 153,84-483,87
mL/24 h/kg corp (6c3) și respectiv 123,46-463,57 mL/24 h/kg corp (6c5) fiind similar consumului înregistrat pentru lotul 5 tratat cu pioglitazonă
(162,16-335,19 mL/24 h/kg corp) şi net superioară lotului 6, martorul
diabet (588,23-807,56 mL/24 h/kg corp) (Fig.9.9).
Fig. 9.9. Monitorizarea consumului de apǎ mediu timp de 24 de ore
raportat pe kg corp la şobolanii din loturile de studiu (1-7, 1a 2a).
39
L1: CH-6c5*, L1a: CH-6c5
**, L2: CH-6c3*, L2a: CH6c3
**, L3: 6c5, L4: 6c3, L5:
pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă 1/20 DL50, ** doză
echivalentă 1/40 DL50.
Rezultatele monitorizării aportului de hrană, pe fiecare lot de studiu, exprimate în grame de hrană consumată timp de 24 de ore, pe kg
corp, sunt reprezentate grafic în Fig.9.10.
Se observă că aportul de hrană pentru şobolanii diabetici trataţi cu pioglitazonă (lot 5) a variat de la 146,17 g/24 h/kg în prima zi a
experimentului până la 74,07 g/24 h/kg corp în ziua a 43-a de tratament,
scădere datorată controlului glicemic bun obținut cu pioglitazonă. Pentru șobolanii din loturile 3 şi 4, care au fost trataţi cu derivații
de benziliden-tiazolidin-4-onă (6c3 şi 6c5) s-a observat o scădere a
aportului de hrană, scădere comparabilă cu cea determinată de
administrarea pioglitazonei. O scădere și mai semnificativă a aportului de hrană (aproximativ
67 g/24 h/kg corp) s-a înregistrat pentru loturile tratate cu microparticule
de chitosan-substanță activă (lot 1,1a, 2, 2a), explicată prin senzaţia de saţietate determinată de administrarea microparticulelor de chitosan.
Fig. 9.10. Monitorizarea consumului de hrană mediu timp de 24 de ore
raportat pe kg corp la şobolanii din loturile de studiu (1-7, 1a 2a).
40
L1: CH-6c5*, L1a: CH-6c5
**, L2: CH-6c3
*, L2a: CH6c3
**, L3: 6c5, L4: 6c3,
L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă 1/20
DL50, **
doză echivalentă 1/40 DL50.
9.3.2.2. Evaluarea parametrilor biochimici
Glicemia postprandială
Analiza rezultatelor obținute în cadrul studiului realizat (Fig. 9.11)
a evidențiat faptul că administrarea cronică, pe cale orală, în doză unică pe zi, a derivaţilor benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6c3,
6c5) atât ca substanță activă (lot 3, 4) cât și sub formă de microparticule
(lot 1, 1a, 2, 2a), în doză echivalentă 1/20 din DL50 şi respectiv 1/40 DL50, a
determinat reducerea nivelului de glucoză plasmatică. Compuşii cei mai activi au fost 6c5 (lotul 3) şi microparticulele de
chitosan încărcate cu substanţa 6c5 (lotul 1 şi lotul 1a) pentru care s-a
înregistrat o scădere cu 47,94% a nivelului de glucoză plasmatică (lotul 3 după 43 de zile de tratament), cu 85,68% (lotul 1 după 15 zile) și cu
58,37% (lotul 1a după 12 zile de tratament). De remarcat este faptul că în
ziua a 12-a de experiment efectul hipoglicemic obţinut cu microparticulele de chitosan - 6c5 (lot 1) (114,5 mg/dL) a fost superior celui obținut prin
administrarea substanţei de referinţă (pioglitazonă, 148,5 mg/dL) iar în
cazul lotului 1 tratat cu substanţa 6c5 nivelul gicemiei în zilele 21, 36, 43 a
fost apropiat de cel al şobolanilor trataţi cu pioglitazonă. Față de pioglitazonă pentru care la finalul experimentului s-a
înregistrat o glicemie de 158 mg/dL compușii s-au dovedit mai puțin
activi.
41
Fig. 9.11. Monitorizarea glicemiei postprandiale la şobolanii din loturile de
studiu (1-7, 1a 2a). L1: CH-6c5*, L1a: CH-6c5
**, L2: CH-6c3
*, L2a:
CH6c3**, L3: 6c5, L4: 6c3, L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză
echivalentă 1/20 DL50, **doză echivalentă 1/40 DL50.
Hemoglobina glicozilată
Rezultatele obținute în cadrul studiului realizat (Fig. 9.12), susțin
faptul că toţi compuşii testaţi, derivați de benziliden-tiazolidin-4-onă cu nucleu xantinic (6c3, 6c5) cât și microparticulele de chitosan – substanță
activă (CH-6c3, CH-6c5) au realizat un bun control glicemic, valorile
HbA1c înregistrate fiind mai mici de 8%.
Figura 912. Monitorizarea hemoglobinei glicozilate la şobolanii din
loturile de studiu (1-7, 1a, 2a) L1a: CH-6c5**, L2: CH-6c3
*, L2a: CH6c3**, L3:
42
6c5, L4: 6c3, L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă
1/20 DL50, **doză echivalentă 1/40 DL50.
Compusul cel mai activ a fost derivatul 6c5, rezultat în urma reacției de condensare dintre tiazolidin-4-ona corespunzătoare cu 4-
hidroxibenzaldehida, pentru care s-a înregistrat o valoare a HbA1c de
4,30% când a fost adminstrat ca substanță unitară (lot 3). Pentru lotul 1a în care compusul s-a administrat sub formă de micropaticule, valoarea
HbA1c în ziua a 12-a de tratament a fost de 4,35%. Valorile înregistrate
pentru cele două loturi au fost similare valorii HbA1c determinată în
cadrul lotului tratat cu pioglitazona (lot 5).
Parametri biochimici de evaluare a funcției hepatice
Din analiza rezultatelor obținute (tabel 9.6) se constată că în cazul lotului cu diabet zaharat (lot 6), enzimele hepatice au înregistrat valori
crescute, AST (216,9 mg/dL), ALT (82,15 mg/dL), LDH (408,45 mg/dL)
ceea ce denotă afectarea hepatică indusă de această afecțiune comparativ
cu lotul martor (lot 7) la care valorile enzimelor hepatice au fost mai reduse, AST (100 mg/dL), ALT (46,15 mg/dL), LDH (400,6 mg/dL).
În cazul microparticulelor de chitosan – substanță activă, cel mai
favorabil efect s-a înregistrat cu formularea chitosan-6c3, în concentrație echivalentă de 1/40 DL50 (lot 2a). La acest lot valoarea indicatorului de
citoliză hepatică, ALT, a fost de 50,11 UI/L față de valoarea 57,85 UI/L
determinată pentru lotul tratat cu pioglitazonă (lot 5). Valori similare au fost înregistrate și pentru formularea chitosan-6c5; aceasta prezentând
totodată și cel mai favorabil efect asupra AST, valoarea înregistrată fiind
de 124 UI/L, mult scăzută comparativ cu lotul diabetic și cel tratat cu
pioglitazonă (193,15 UI/L). Pentru toți compușii testați valoarile LDH au fost compararabile valorii de 404,85 UI/L obținute pentru lotul de referință
(lot 5).
Tabel 9.6. Valorile parametrilor funcției hepatice la şobolanii din loturile
1a (CH-6c5**
), 2 (CH-6c3*), 2a (CH-6c3
**) și 6 (martor diabet).
Parametru
biochimic Lot 1a** Lot 2* Lot 2a** Lot 6
AST (UI/L) 124,00 ± 2,72 193,45 ± 2,32 199,13 ± 2,41 216,9 ± 2,08
43
ALT (UI/L) 62,21 ± 1,43 52,21 ± 1,72 50,11 ± 1,17 82,15 ± 1,33
LDH (UI/L) 404,8 ± 3,11 402,31 ± 2,09 407,15 ± 1,92 408,45 ± 0,7
Bilirubina totală (mg/dL)
0,14 ± 0,09 0,12 ± 0,06 0,17 ± 0,05 0,22 ± 0,09
Bilirubina
directă (mg/dL) 0,08 ± 0,05 0,09 ± 0,04 0,08 ± 0,12 0,15 ± 0,07
*doză echivalentă 1/20 DL50, **doză echivalentă 1/40 DL50
Valorile bilirubinei totale şi directe pentru loturile tratate cu
derivații 6c3 și 6c5 și cu microparticule de CH – substanță activă au fost
similare (Tab. 9.6, 9.7) pioglitazonei, încadrându-se în limitele normale descrise de Weber D. K. et al., 2002 şi Johnson-Delaney C., 1996.
Tabel 9.7. Valorile parametrilor funcției hepatice la şobolanii din loturile 3
(6c5), 4 (6c3), 5 (pioglitazonă) și 7 (control).
Parametru
biochimic Lot 3 Lot 4 Lot 5 Lot 7
AST (UI/L) 177,65 ± 1,17 185,45 ± 0,41 193,15 ± 1,87 100 ± 1,08
ALT (UI/L) 55,15 ± 0,55 53,21 ± 1,84 57,85 ± 1,45 46,15 ± 1,33
LDH (UI/L) 404,35 ± 1,76 406,05 ± 0,63 404,85 ± 0,75 400,6 ± 0,83
Bilirubina totală
(mg/dL) 0,08 ± 0,09 0,11 ± 0,05 0,14 ± 0,01 0,085 ± 0,04
Bilirubina directă (mg/dL)
0,04 ± 0,11 0,06 ± 0,03 0,04 ± 0,02 0,03 ± 0,02
Parametri biochimici ai profilului lipidic
Valorile parametrului LDL colesterol la şobolanii diabetici au fost crescute, fiind cuprinse în intervalul 50-70 mg/dL în comparaţie cu lotul
martor 7 (40 mg/dL). Se poate aprecia totuși că pentru toți compușii testați
valoarea LDL colesterolului a fost semnificativ mai redusă comparativ cu lotul tratat cu pioglitazonă; cea mai importantă scădere (50 mg/dL)
înregistrându-se pentru lotul 1a, tratat cu microparticule de chitosan – 6c5,
în doză echivalentă 1/20 din DL50.
Referitor la parametrul HDL colesterol, se apreciază că toate loturile testate, inclusiv lotul cu diabet (lot 6) au prezentat valori ale
acestui parametru apropiate valorii lotului 7 (şobolani nediabetici).
44
Valoarea trigliceridelor înregistrată pentru lotul 6 (martor diabet,
104,41 mg/dL) a fost mai mare comparativ cu lotul 7 (șobolani nediabetici,
54,25 mg/dL). Pentru toate celelalte loturi valoarea trigliceridelor a fost cuprinsă în intervalul 45,81-67,41 mg/dL.
Tabel 9.8. Valorile parametrilor profilului lipidic la şobolanii din loturile 1a (CH-6c5
**), 2 (CH-6c3
*), 2a (CH-6c3
**) și 6 (martor diabet).
Parametru
biochimic
(mg/dL)
Lot 1a** Lot 2* Lot 2a** Lot 6
Colesterol total 47,8 ± 1,70 45,9 ± 1,20 62,70 ± 1,10 51,55 ± 1,87
LDL Colesterol 50,0 ± 1,23 55,0 ± 1,12 65,00 ± 1,12 70,00 ± 1,07
HDL Colesterol 59,1 ± 1,10 54,0 ± 1,50 61,17 ± 1,16 55,05 ± 1,72
Trigliceride 65,0 ± 1,70 61,5 ± 1,10 67,41 ± 0,98 104,41 ± 1,3
Tabel 9.9. Valorile parametrilor profilului lipidic la şobolanii din loturile 3
(6c5), 4 (6c3), 5 (pioglitazonă) și 7 (control).
Parametru
biochimic
(mg/dL)
Lot 3 Lot 4 Lot 5 Lot 7
Colesterol total 37,15 ± 1,98 51,51 ± 1,39 48,95 ± 1,48 50,13 ± 1,08
LDL Colesterol 65,00 ± 1,21 65,00 ± 1,07 70,00 ± 1,14 40,00 ± 1,72
HDL Colesterol 59,00 ± 1,55 59,60 ± 0,14 58,81 ± 0,14 58,63 ± 0,72
Trigliceride 45,81 ± 1,21 52,95 ± 1,48 51,05 ± 1,18 54,25 ± 1,14
În ansamblu, se apreciază că rezultatele obţinute la evaluarea
parametrilor biochimici ai profilului lipidic susţin afirmaţia că substanțele
studiate, derivați de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică au
determinat scăderea hiperlipidemiei comparativ cu datele înregistrate pentru martorul diabet (lot 6).
Parametri biochimici ai funcției renale Rezultatele evaluării funcției renale, prin determinarea
parametrilor biochimici, uree, creatinină și acid uric în condițiile
experimentului realizat sunt prezentate în tabel 9.10 și 9.11.
45
Din datele obținute se observă că, referitor la concentrația
creatininei, nu s-au înregistrat diferențe semnificative între valorile
loturilor studiate, acestea încadrându-se în intervalul 0,55 mg/dL și 0,72 mg/dL, fiind mai reduse comparativ cu valoarea înregistrată pentru lotul
martor diabet (0,81 mg/dL) şi lotul 5 tratat cu pioglitazonă (0,72 mg/dL).
Tabel 9.10. Valorile parametrilor funcției renale la şobolanii din
loturile 1a (CH-6c5**
), 2 (CH-6c3*), 2a (CH-6c3
**) și 6 (martor diabet).
Parametru
biochimic
(mg/dL)
Lot 1a** Lot 2* Lot 2a** Lot 6
Uree 73,65 ± 1,48 57,24 ± 1,97 65,92 ± 1,52 107,00 ± 1,6
Creatinină 0,62 ± 0,09 0,57 ± 0,05 0,55 ± 0,16 0,81 ± 0,04
Acid uric 1,04 ± 0,45 1,41 ± 0,17 1,22 ± 0,72 1,55 ± 0,28
Tabel 9.11. Valorile parametrilor funcției renale la şobolanii din loturile 3
(6c5), 4 (6c3), 5 (pioglitazonă) și 7 (control).
Parametru
biochimic
(mg/dL)
Lot 3 Lot 4 Lot 5 Lot 7
Uree 48,11 ± 1,74 46,51 ± 1,65 55,9 ± 1,37 37,5 ± 1,97
Creatinină 0,56 ± 0,02 0,62 ± 0,02 0,72 ± 0,01 0,63 ± 0,12
Acid uric 1,12 ± 0,31 1,16 ± 0,41 1,60 ± 0,26 0,70 ± 0,18
Valorile ureei şi acidului uric pentru lotul martor diabet (lot 6) au
fost semnificativ crescute (uree – 107 mg/dL, acid uric – 1,55 mg/dL) față de valorile înregistrate pentru lotul martor nediabetic (lot 7, uree – 37,5
mg/dL, acid uric – 0,7 mg/dL), ceea ce denotă o afectare destul de
accentuată a funcției renale. Pentru loturile de șobolani diabetici tratați cu substanțele studiate, deși valorile înregistrate (uree: 46,51 - 73,65 mg/dL,
acid uric: 1,04 - 1,41 mg/dL) au fost superioare celor din lotul nediabetic,
au fost mult mai reduse comparativ cu lotul diabetic. Aceasta observație susține faptul că administrarea compușilor
selectați în studiu, reduce afectarea renală indusă de diabet şi în unele
situații (lot 3, 4) compușii studiați au avut un efect mult mai favorabil
comparativ cu pioglitazona.
46
9.3.2.3. Evaluarea parametrilor hematologici
Hemograma este un test screening de bază, reprezentând adesea primul pas în stabilirea statusului hematologic şi diagnosticul diverselor
afecţiuni hematologice. De obicei afecţiunile hematologice sunt
congenitale, fiind rezultatul unor tulburări genetice moştenite, dar se pot
manifesta şi ca răspuns al organismului la stres. Diabetul zaharat prin
concentraţiile crescute de glucoză pot creşte stresul oxidativ conducând la
eliberarea speciilor reactive de oxigen/nitrogen.
Din analiza rezultatelor s-a observat că parametri hematologici nu au prezentat variaţii majore de la limitele normale şi nu au existat diferenţe
semnificative în comparaţie cu lotul martor (Lotul 7).
9.4. STUDIU HISTOPATOLOGIC În scopul evaluării efectului compușilor selectați pentru studiul in
vivo pe şobolani diabetici, derivați de benziliden-tiazolidin-4-onă cu
structură xantinică (6c3, 6c5, CH-6c3, CH-6c5) s-a realizat un studiu histopatologic pe fragmente de țesut renal în vederea identificării
modificărilor morfologice produse de către compușii amintiți.
9.4.2. Rezultate și discuții
În urma studiul histopatologic realizat pe fragmente de ţesut renal
s-a observat o protecţie favorabilă a funcției renale (limitarea îngroşării
membranei bazale glomerulare-MBG) prin iniţierea terapiei cu microparticule de chitosan-substanţă activă şi derivații (6c3 şi 6c5) ca
substanţe unitare (tabel 9.14).
Valorile numerice obţinute privind grosimea medie a MBG au relevat în mod clar că:
în lotul diabetic (lot 6), MBG a fost îngroşată evident (3,83 m); cea mai bună protecţie anti-diabetică a fost obţinută prin
administrare de microparticulele de chitosan încărcate cu 6c5 (CH-
6c5) (lot 1) (MBG 1,38 m), administrate în doză echivalentă 1/20 DL50;
microparticulele de chitosan încărcate cu 6c3 (CH-6c3) (lot 2),
administrate în doză echivalentă 1/20 din DL50 asigură protecţie
47
diabetică (MBG 1,70 m), dar mai redusă comparativ cu
microparticulele de chitosan – 6c5 (MBG 1,38 m); cei doi compuși selectați pentru studiu administrați sub formă de
substanțe unitare, 6c5 (lot 3, MBG 2,16 m) și 6c3 (lot 4, MBG
2,56 m) asigură un efect similar administrarii de pioglitazonă (lot
5, MBG 2,14 m);
administrarea microparticulelor de chitosan încărcate cu 6c5 (CH-
6c5) (lot 1a, MBG 2,30 m) și cu 6c3 (CH-6c5) (lot 2a, MBG 2,56
m), în doze echivalente de 1/40 din DL50 protejează similar
substanţelor unitare - 6c5 (lot 3, MBG 2,16 m) şi 6c3 (lot 4, MBG
2,53 m). Imaginile din Fig. 9.17 ilustrează valorile obţinute în procesul de
măsurare.
Fig.9.17. Determinări ale MBG – lotul 6 (HE, x 400)
Capitolul 10. CONCLUZII
1. Studiul realizat aduce contribuții deosebite și originale la
cercetările derulate la ora actuală în domeniul diabetului zaharat. Acest
sindrom metabolic este considerat „epidemia secolului 21” datorită creşterii alarmante pe plan mondial a numărului de cazuri diagnosticate. În
ciuda eforturile întreprinse de către cercetători, datorită complexităţii
acestei maladii, controlul optim al glicemiei prin administrarea terapiei
48
curente, în cele mai multe cazuri s-a dovedit a fi imposibil de realizat.
Astfel, descoperirea unei noi terapii care să realizeze un bun control
glicemic reprezintă o adevărată provocare pentru cercetători şi intensele studii realizate în acest domeniu au avut ca rezultat introducerea în terapie
a unei noi clase de medicamente antidiabetice: inhibitori ai dipeptidil
peptidazei IV (DPP IV), enzimă implicată în metabolizarea celor doi hormoni endogeni – GIP și GLP-1, cu rol important în homeostazia
glicemică. Printre aceşti agenţi terapeutice se numără şi Linagliptina, un
derivat xantinic cu durată lungă de acţiune şi cu o selectivitate crescută pentru DPP IV.
2. În cadrul cercetărilor personale s-au obţinut prin sinteză noi
compuşi heterociclici ca potențiali agenți terapeutici în tratamentul
diabetului zaharat tip 2. Molecula acestor compuşi combină două entităţi structurale cu o deosebită valoare terapeutică în terapia diabetului zaharat,
nucleul xantinic şi ciclul tiazolidinic. Prin modulări structurale realizate
pe structura de teofilină (1,3-dimetil-xantina) la atomul de azot din poziția 7 (N7) au fost sintetizați 21 de compuși noi, derivați de benziliden-
tiazolidin-4-onă cu structură xantinică și un număr de 8 compuși
intermediari. Compuşii sintetizaţi, au fost caracterizaţi fizico-chimic şi spectral şi evaluați din punct de vedere biologic. Structura chimică a
compușilor, intermediari şi finali sintetizați a fost confirmată prin metode
spectroscopice - spectroscopia de infraroşu cu transformată Fourier și prin
spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (1H-RMN,
13C-RMN).
3. Compuşii finali sinetizaţi au fost evaluaţi biologic privind
potențialul antioxidant prin metode in vitro: puterea reducătoare,
capacitatea totală antioxidantă, şi capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH şi ABTS. Rezultatele obţinute au evidențiat că toţi cei 21 de
compuşi finali prezintă o capacitate antioxidantă superioară tiazolidin-4-
onelor corespunzătoare, ceea ce susține influența favorabilă a modulărilor
structurale realizate. Pentru fiecare din cele trei serii de compuși sintetizați, cei mai activi s-au dovedit a fi compușii obţinuţi prin condensarea 4-
hidroxi / 4-N(dimetilamino) și 2-nitro-benzaldehidei cu tiazolidin-4-onele
corespunzătoare. 4. În urma evaluării in vivo a toxicităţii compuşilor finali 6b1-7, 6c1-
7 prin determinarea dozei letale 50, s-a constatat că derivaţii studiaţi se
încadrează în grupa substanţelor cu grad foarte redus de toxicitate.
49
Modulările structurale realizate pe nucleul xantinic au avut o influență
favorabilă, toti compușii obținuți fiind mai puțin toxici decât teofilina şi
pioglitazona (derivat de tiazolidin-2,4-dionă). 5. Pe baza rezultatelor obţinute la screeningul toxicologic și
antioxidant au fost selectaţi doi compuși finali, 2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-
il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)-5-(4-hidroxi-benziliden)tiazolidin-4-ona (6c5) și 2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)-5-(4-
clorbenziliden)tiazolidin-4-ona) (6c3) care au fost incluși într-un amplu
studiu ce a urmărit evaluarea parametrilor clinici, biochimici și hematologici pe model de diabet indus cu streptozotocin la șobolan.
Rezultatele obținute la monitorizarea glicemiei postprandiale şi a
hemoglobinei glicozilate au evidențiat faptul că prin administrarea cronică,
pe cale orală, în doză unică pe zi, a derivaţilor studiați (6c3 şi 6c5) s-a realizat un bun control glicemic. Compusul cel mai activ, cu acţiunea
hipoglicemiantă apropiată de cea a pioglitazonei s-a dovedit a fi derivatul
6c5. Prin evaluarea parametrilor funcţiei hepatice s-a observat că, în general, efectul hepatoprotector al compușilor testaţi 6c3, 6c5 a fost mai
benefic decât cel înregistrat cu pioglitazona, utilizată ca antidiabetic de
referință. Totodată afectarea renală, o complicație gravă a diabetului zaharat preum și un grav efect advers al terapiei antidiabetice cu
tiazolidindione, a fost atenuată prin administrarea compușilor studiați,
efectul observat fiind mult mai favorabil comparativ cu pioglitazona.
Rezultatele obținute prin evaluarea profilului lipidic susţin faptul că substanțele studiate, au determinat o scădere accentuată a hiperlipidemiei
comparativ cu datele înregistrate pentru martorul diabet, și reducerea
concentrației de LDL-colesterol şi trigliceride; valorile înregistrate fiind similare celor din lotul tratat cu pioglitazonă. În urma studiul
histopatologic realizat pe fragmente de ţesut renal s-a observat o protecţie
favorabilă a funcției renale prin iniţierea terapiei cu derivații selectați
(6c3 şi 6c5). 6. În scopul îmbunătăţirii profilului farmacotoxicologic al celor
mai activi compuşi s-au utilizat matrici de chitosan pentru prepararea unor
microparticule ca sisteme de eliberare controlată a substanţei active. Studiile efectuate privind caracterizarea fizico-chimică, capacitatea de
încapsulare, studii IR, gradul de hidratare, biodegradarea in vitro,
eliberarea substanţei active in vitro, au confirmat obţinerea cu succes a
50
acestor microparticule de chitosan şi capacitatea de înglobare şi eliberare
susţinută a celor două substanţe testate. Studiul in vivo derulat pe şobolani
privind efectul lor hipoglicemiant a indicat o acţiune mai intensă comparativ cu substanțele unitare. Valorile parametrilor biochimici şi
hematologici (hemograma, profil glucidic, hepatic, renal, lipidic) susțin
efectul favorabil în normalizarea parametrilor funcţiilor organismului a microparticulleor de chitosan-substanță activă. În urma studiul
histopatologic realizat pe fragmente de ţesut renal s-a observat că efectul
microparticulelor de chitosan-substanţă activă este mai intens decât efectul observat pentru compușii administrați ca substanțe unitare.
În concluzie, rezultatele obținute în cadrul studiilor realizare sunt
originale și cu potențială aplicație biologică în tratamentul diabetului zaharat tip 2, compușii studiați fiind mai siguri și mai eficienți decât
pioglitazona.
Totodată rezultatele obținuțe îndreptățesc continuarea studiilor farmacologice pentru evaluarea derivaților sintetizați ca inhibitori ai DPP
IV, enzimă implicată în metabolizarea hormonilor endogeni (GIP și GLP-
1) precum și ca agoniști PPARγ, cunoscută fiind importanța nucleului tiazolidinic în modularea rezistenței la insulină în țesuturile periferice.
51
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Alagawadi K.R., Alegaon S.G., Synthesis, characterization and
antimicrobial activity evaluation of new 2,4-Thiazolidinediones bearing imidazo [2,1-b][1,3,4]thiadiazole moiety, Asian Journal of
Control 2011, 4: 465-472.
2. Alhnan M.A., Murdan S., Basit A.W. Encapsulation of poorly soluble basic drugs into enteric microparticles: A novel approach to
enhance their oral bioavailability, International Journal of
Pharmaceutics 2011, 416: 55-60. 3. Amr Ael-G., Sabrry N.M., Abdalla M.M., Abdel-Wahab B.F.
Synthesis, antiarhythmic and Arora M.K., Singh U.K., Molecular
mechanism in the pathogenesis of diabetic nephropathy : An update,
Vascular Pharmacology 2013, 58: 259-271. 4. Barquissau V., Morio B; Phsiopathologie de l’insulinoresistance
dans les muscles squelettique et implication des fonctions
mitochondriales, Nutrition clinique et metabolisme 2011, 25: 114-130.
5. Besse J.L., Leemrijse T., Deleu P.A., Diabetic foot: The orthopedic
surgery angle, Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research 2011, 97: 314-329.
6. Bhagat T.M., Swamy D.K., Badne S.G., Kuberkar S.V., Synthesis
and antibacterial activity of 4-thiazolidinone containing
benzothiazolyl moiety, Rasayan Journal Chemistry 2011, 4: 24-28. 7. Bhattarai N., Gunn J., Zhang M., Chitosan-based hydrogels for
controlled, localized drug delivery, Advanced drug delivery reviews
2010, 62:83-99. 8. Bogdanov V.Y., Osterud B., Cardiovascular complications of
diabetes mellitus: The Tissue Factor perspective, Thrombosis
Research 2010, 125: 112-118.
9. Buchanan T. A., Xiang A. H., Page K. A., Gestational diabetes mellitus: risks and management during and after pregnancy, Nature
reviews Endocrinology 2012, 8: 639-649.
10. Cacic M., Molnar M., Sarkanj B., Has-Schon E., Rajkovic V., Synthessis and antioxidant activity of some new coumarinyl-1,3-
Thiazolidine-4-ones, Molecules 2010; 15: 6795-6809.
52
11. Cariou B., Charbonnel B., Staels B., Thiazolidinediones and PPAR γ
agonists: time for a reassessment, Trends in Endocrinology and
Metabolism 2012, 23 ( 5): 205-215. 12. Chiha M., Njeim M., Chedrawy E.G., Diabetes and Coronary Heart
Disease: A risk factor for the Global Epidemic, International
Journal of Hypertension 2012, 14: 1-7. 13. Chua H. R., Schneider A., Bellomo R., Bicarbonate in diabetic
ketoacidosis-asystematic review, Annals of Intensive Care 2011,
23(1):1-12. 14. Daher S., Torloni M.R., gueuvoghlanian-Silva B.Y., Moron A.F.,
Mattar R., Inflammatory mediator gene polymorphisms and
gestational diabetes: a review of the literature, Journal of
Reproductive Immunology 2011, 90: 111-116. 15. Dai T., Tanaka M., Huang Y.Y., Hamblin M.R., Chitosan
preparations for wounds and burns: antimicrobial and wound-healing
effects, Expert Review of Anti-Infective Therapy 2011, 9(7): 857-879.
16. Dash M., Chiellini F., Ottenbrite R.M., Chiellini E., Chitosan—A
versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications, Progress in Polymer Science 2011, 36: 981–1014.
17. Derosa G., Maffioli P., Effects of thiazolidinediones and
sulfonylureas in patients with diabetes, Diabetes Technology and
Therapeutics 2010, 12: 491-501.
18. Gallwitz B., Linagliptin-A Novel Dipeptidyl Peptidase inhibitor for
Type 2 Diabetes Therapy, Clinical Medicine Insights Endocrinology
and Diabetes 2012, 5:1-11.
19. Garcia A.A., The Diabetes Symptom Self-Care Inventory: Development and Psychometric Testing with Mexican Americans,
Journal of Pain and Symptom Management 2011, 41 (4): 715-726.
20. Gautier J.-F., Sauvanet J.P., Efficacy of saxagliptin as an add-on to oral monotherapy in the phase 3 clinical development program:
Predictive factors of the treatment response in type 2 diabetes,
Annales d’Endocrinologie 2011, 72: 287–295.
21. Hausner L., Talmadge K., American Diabetes Association. Standards of Medical Care in Diabetes, Diabetes Care 2012, 35 (1):
11–63.
53
22. Heydari I., Radi V., Razmjou S., Amiri A., Chronic complications of
diabetes mellitus in newly diagnosed patients, International Journal
of Diabetes Mellitus 2010, 2: 61-63. 23. Hocher B., Reichtzeder C., Alter M. L., Renal and cardiac effects of
DPP IV inhibitors-from preclinical development to clinical research,
Kidney and Blood Pressure Research 2012, 36 (1): 65-84. 24. Hopps E., Noto D., Caimi G., Averna M.R., A novel component of
the metabolic szndrome: The oxidative stress, Nutrition, Metabolism
& Cardiovascular Disease 2010, 20: 72-77. INomansulin glargine 25. Ju C., Yue W., Yang Z., Zhang Q., Yang X., Liu Z., Zhang F.,
Antidiabetic effect and mechanism of chitooligosaccharides.
Biological & Pharmaceutical Bulletin 2010, 33(9):1511-1516.
26. Kang H., Current therapeutic agents and anesthetic consideration for diabetes mellitus, Korean Journal of Anesthesiology 2012, 63 (3):
195-202.
27. Kangralkar V. A., Patil S. D., Bandivadekar R. M., Oxidative stress and diabetes: a review, International Journal of Pharmaceutical
Applications 2010, 1(1): 38-45.
28. Kaplan M., Aviram M., Hayek T., Oxidative stress and macrophage foam cell formation during diabetes mellitus-induced atherogenesis:
Role of insulin therapy, Pharmacology & Therapeutics 2012, 136:
175-185.
29. Khardori R., Type 1 Diabetes mellitus, Medscape 2013, 33: 2153-2163.
30. Kota S.K., Meher L.K., Jammula S., Kota S.K., Modi K.D., Clinical
profile of coexisting conditions in type 1 diabetes mellitus patients, Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review 2012,
6: 70-76.
31. Kudaravalli J., Vijayalakshmi G., Kishore K.K., Safety and efficacy
of sulfonylureas drugs in type 2 diabetes mellitus, Apollo Medicine 2013, 10: 165-168.
32. Kumar A., Negi G., Sharma S., Suppression of NF-kB and NF-kB
regulated oxidative stress and neuroinflammation by BAY 11-7082 (IkB phosphorylation inhibitor) in experimental diabetic neuropathy,
Biochimie 2012, 94: 1158-1165.
54
33. Kumar R. B. S., Kar B., Dolai N., Bala A., Haldar P. K., Evaluation
of antihyperglycemic and antioxidant properties of Streblus asper
Lour against streptozotocin-induced diabetes in rats, Asian Pacific Journal of Tropical Disease 2012, 139-143.
34. Lungu Apetrei C, Tuchilus C, Aprotosoaie AC et al. Chemical,
antioxidant and antimicrobial investigations of Pinus cembra L. Bark and Needles. Molecules 2011; 16: 7773-7788.
35. Maric-Bilkan C., Obesity and Diabetic Kidney Disease, Medical
Clinics of North America 2013, 97(1): 59-74. 36. Moţăţăianu A., Stoian A., Bajko Z., Neuropatia Diabetică Autonomă
Cardiovasculară-Impact Clinic, Acta Medica Transilvanica 2013,
2(1): 156-158.
37. Mulakayala N., Reddy C.H., Iqbal J., Pal M., Synthesis of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors: a brief overview, Tetrahedron 2010, 66:
4919-4938.of glargine or nsulin to oral therapy of t
38. Petry C.J., Gestational diabetes: risk factors and recent advances in its genetics and treatement, British Journal of Nutrition 2010,
104:775-787.
39. Rungby J., Laursen T., Hoimark L., Potential role of linagliptin as on oral once-daily treatment for patients with type 2 diabetes, Diabetes,
Metabolic, Syndrome and Obesity: Targets and Therapy 2012, 5:
295-302.
40. Shanmugam K.D., Mallikarjuna K., Nishanth K., Kuo C. H., Protective effect of dietary ginger on antioxidant enzymes and
oxidative damage in experimental diabetic rat tissues, Food
Chemistry 2011, 124: 1436-1442. 41. Sharma R., Samadhiya P., Srivastava S., Srivastava S., Synthesis of
Some New Thiazolidine Derivatives and Their Biological
Significance, Latvian Journal of Chemistry 2012, 50: 296–307.
42. Valensi P., Picard S., Lipids, lipid-lowering therapy and diabetes complications, Diabetes and Metabolism 2011, 37: 15-24.
43. Van Raalte D.H., Diamant M., Glucolipotoxicity and beta cells in
type 2 diabetes mellitus: Target for durable therapy, Diabetes Research and Clinical Practice 2011, 93: 37-46.
44. Zanchi A., Lehmann R., Philippe J., Antidiabetic drugs and kidney
disease, Swiss Medical Weekly 2012, 142: 1-8.
55
LISTĂ LUCRĂRILOR ȘTIINȚIFICE PUBLICATE ÎN
TIMPUL STAGIULUI DOCTORAL
Articole publicate in extenso din tema tezei de doctorat:
1. Florentina Geanina Lupascu, Oana Maria Dragostin, Liliana Foia,
Dan Lupascu, and Lenuta Profire, The Synthesis and the
Biological Evaluation of New Thiazolidin-4-one Derivatives Containing a Xanthine Moiety, Molecules, 2013, 18(8): 9684-
9703, (ISI, IF 2,67).
2. Florentina Lupascu, Mamoni Dash, Sangram Keshari Samal, Cătălina Elena Lupuşoru, Raoul Vasile Lupuşoru, Lenuţa Profire,
Peter Dubruel, Delivery of Hydrophobic Antioxidant Drugs via
Chitosan: An Approach to Enhance their Oral Bioavailability,
Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2013, under review, (ISI, IF 2,32).
3. Florentina Lupaşcu, Oana Maria Dragostin, Maria Apotrosoaei,
Andreea Pânzariu, Dan Lupaşcu, Cornelia Vasile, Lenuţa Profire, Synthesis And Evaluation Of Antioxidant Activity Of Some New
Benzylidene-Thiazolidine-Xanthine Derivatives, Revista Medico-
chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iași, 2013,
117(1): 244-249, (BDI, B+).
4. Florentina Geanina Lupașcu, Ioana Mirela Geangalău, Andreea
Pânzariu, Lenuța Profire - Incretin modulators, a new perspective
in diabetes mellitus treatment, Revista Medico-chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iași, 2012, 116(2): 630-634,
(BDI, B+).
Alte articole publicate in extenso:
1. Oana Maria Dragostin, Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, Mihai Mares, Valentin Nastasa, Ramona Florina Moraru, Dragos Pieptu,
Lenuţa Profire, Synthesis and Biological Evaluation of New 2-
56
Azetidinones with Sulfonamide Structures, Molecules 2013, 18(4):
4140-4157, (ISI, IF 2,67).
2. Oana Maria Parasca (Dragostin), Florentina Gheaţă (Lupaşcu), Andreea Pânzariu, Ioana Geangalău (Vasincu), Lenuţa Profire –
The importance of sulfonamide moiety in current and future
therapy, Revista Medico-Chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iași, 2013, 117(2): 558-564, (BDI, B
+).
3. Oana Maria Parasca, Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, M.
Mares, V. Nastasa, Lenuţa Profire, New Hydrazines with sulphonamidic structure: Synthesis, Characterization and
Biological Activity, Revista Medico-Chirurgicală a Societății de
Medici și Naturaliști, Iaşi, 2013, 117(1): 238-243, (BDI, B+).
4. Maria Apotrosoaei, Ioana Vasincu, Cristina Tuchiluş, Florentina Lupascu, Sandra Constantin, Dan Lupaşcu, Lenuţa Profire, New
Hydrazones With Pyrazolone Structure: Synthesis,
Characterization, and Biological Evaluation, Revista Medico-Chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iaşi, 2013,
117(2): 538-544, (BDI, B+).
Participări la Conferinţe Naţioanale şi Internaţionale:
1. Florentina Geanina Lupaşcu, Oana Maria Dragostin, Andreea
Pânzariu, Ioana Vasincu, Dan Lupaşcu, Lenuţa Profire, Istoria
Enzimei Dipeptidil Peptidaza IV şi a Inhibitorilor Acesteia, A XXII a Reuniunea Naţională de Istoria Farmaciei 4-6 aprilie 2013
(rezumat şi poster).
2. Lupașcu Florentina Geanina, Dragostin Oana, Geangalău Ioana, Apotrosoaei Maria, Vasile Cornelia, Lupașcu Dan, Pânzariu
Andreea, Profire Lenuța - Synthesis and antioxidant activity of
some new benzylidene thiazolidine-4-ones, Conferința
internaţională RICT 2012: Interfacing Chemical Biology and Drug Discovery, Poitiers, Franţa, 4-6 iulie 2012, 160 (rezumat și poster).
3. Oana Dragostin, Florentina Lupascu, Maria Apotrosoaei,Cristina
Tuchilus, Cornelia Vasile, Dan Lupascu, Lenuta Profire, Synthesis, characterization and antimicrobial potential of some new
hydrazones with sulphonamide structure” - RICT 2012:
57
Interfacing Chemical Biology and Drug Discovery, Poitiers,
Franţa, 4-6 iulie 2012, 159 (rezumat şi poster).
4. Florentina Lupascu, Oana Dragostin, Andreea Panzariu, Cornelia Vasile, Liliana Foia, Lenuta Profire, Synthèse et évaluation
biologique de quelques nouveaux dérivés de benzylidene-
thiazolidine-4-ones qui peuvent avoir une action antidiabétique”- COFrRoCA 2012: 7čme Colloque Franco- Roumain de Chimie
Appliquée, care a avut loc la Universitatea „Vasile Alecsandri din
Bacău, România, 27-29 iunie 2012, 44-45 (rezumat şi poster). 5. Lenuța Profire, Dan Lupașcu, Maria Apotrosoaei, Oana Dragostin,
Florentina Lupașcu, Ioana Geangalău, Andreea Pânzariu - Din
Istoria Nitroglicerinei, a XLII-a Reuniune Națională de Istoria
Medicinei, Iași, 31 Mai-2 Iunie 2012, 77-78 (rezumat și poster). 6. Fawzia Sha’at, Ştefan Bargaoanu, Florentina Lupaşcu, Lenuţa
Profire, Synthesis and antioxidant potential evaluation of some
new thiazolidine-4-one derivatives, MedEspera 2012 - International Medical Congress for Students and Yong Doctors,
Chişinau, Republica Moldova, 17-19 mai 2012 (rezumat şi poster).
7. Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, Oana Maria Dragostin, Lenuta Profire - Sinteza si caracterizarea unor noi derivati
heterociclici cu potentiala actiune antidiabetica ” 50 de ani de
invatamant universitar farmaceutic la Iasi”, 6-8 octombrie 2011,
130-132 (rezumat şi poster). 8. Dragostin O., Vasile C., Lupaşcu F., Maria D., Profire L., Sinteza
şi caracterizarea unor hidrazine cu structură sulfonamidică, 50 de
ani de invatamant universitar farmaceutic la Iasi, 6-8 octombrie 2011 (rezumat şi poster).
9. Profire Lenuţa, Lupaşcu Florentina Geanina, Lupaşcu Dan, New
Therapeutic Strategies In Diabetus Mellitus Treatment, Congresul
International TIM-MEDICA, Timişoara, 16-18 Iunie, 2011, pg.12-13 (lucrare şi poster).