1

TEZĂ DE DOCTORAT (REZUMAT)

Obținerea unor compuși aromatici și

heteroaromatici prin sinteză

enzimatică stereocontrolată

Doctorand Annamária Varga

Conducător de doctorat Prof.dr. Valentin Zaharia

2

CUPRINS

CUVINTE CHEIE 3

1. INTRODUCERE 3

2. OBIECTIVE 3

3. CONTRIBUȚIA PERSONALĂ 4

3.1. Sinteza mediată de CaL-B a (R) și a (S)- 3-(2-aril-tiazol-

4-il)-3-hidroxipropanoaților de etil optic puri. 4

3.2. Sinteza unor (R)- 1-(2-aril-tiazol-4-il)etanamine şi a

unor (S)-1-(2-aril-tiazol-4-il)etanamine de înaltă puritate

optică.

6

3.3. Sinteza chemoenzimatică a enantiomerilor acidului 3-

hidroxi-3-fenilpropanoic şi ai acidului 3-amino-3-

fenilpropanoic.

7

4. CONCLUZII GENERALE 9

5. REFERINȚE 9

3

Cuvinte Cheie: biocataliza, reacții stereoselective, enzime, lipaze, Saccharomyces cerevisiae

1. INTRODUCERE

Proprietățile catalitice ale enzimelor sunt esențile în cadrul proceselor biochimice; aproape toate reacțiile

desfășurate în organismele vii, de la virusuri până la om, sunt mediate de către această clasă de catalizatori cu

structură proteică. O mare parte dintre enzime își păstrează activitatea lor și in vitro, ceea ce permite

utilizarea lor în sinteza chimică, în tehnologii alimentare și farmaceutice, în medicină, în tehnologii de

bioremediere etc. Enzimele sunt de un interes fundamental și în științele medicale, deoarece multe boli sunt

conectate direct cu funcționarea atipică sau cu nivelul de exprimare al uneia sau al mai multor enzime.

În ultimele decenii s-a înregistrat o creștere aproape exponențială a cererii pentru cantități mari de substanțe

optic pure. Principalul motiv al acestui fapt este necesitatea creșterii calității vieții. Oamenii au nevoie de

compuși bioactivi noi, de o calitate superioară (substanțe agrochimice și farmaceutice importante) și de alți

produși chimici de sinteză fină (detergenți, parfumuri, insecticide etc.), toate acestea având la bază o serie

vastă de intermediari chimici, care sunt, în mare parte, molecule chirale. Hidroxiesterii, aminele,

cianhidrinele, etandiolii substituiți și aminoacizii sunt doar câteva dintre cele mai căutate clase de substanțe.1

Sinteza industrială a acestora prin procedee biocatalitice (enzimatice) ecologice va deveni mai accesibilǎ în

secolul nostru.

2. Obiective

În vederea sintezei de noi compuși chirali enantiopuri plecând de la compușii chirali racemici

corespunzători s-au dezvoltat diverse strategii de lucru bazate pe rezoluția cintecă enzimatică după cum

urmează:

1. Sinteza catalizată de lipaze a patru noi (R) și (S)-3-(2-aril-tiazol-4-il)-3-hidroxipropanoați de etil și

a esterilor corespunzători, prin intermediul acilării enzimatice enantioselective a 3-(2-aril-tiazol-4-il)-3-

hidroxipropanoaților de etil racemici și prin alcooliza diesterilor racemici corespunzători, în solvenți organici.

Noutatea compușilor a impus determinarea configurației absolute a produșilor de rezoluție printr-un studiu

detaliat 1H-RMN al derivaților Mosher ai acestora.

2. Prin acilare enantiomerselectivă a aminelor racemice şi prin hidroliza amidelor corespunzătoare

cu ajutorul lipazelor, sinteza ambilor enantiomeri ai unor amine cu schelet fenil-tiazolic având potențială

importanţă biologică şi farmaceutică, cu randamente şi cu enantioselectivităţi bune, urmate de determinarea

configurațiilor absolute ale produșilor enantiopuri, prin metode retrosintetice.

3. Posibilitatea exploatării oxidoreductazelor din diverse surse microbiene și vegetale pentru sinteza

(S)-3-hidroxi-3-fenilpropanoatului de etil prin reducerea asimetrică a 3-fenil-3-oxopropanoatului de etil.

Investigarea rezoluției cinetice a 2-acetoxi-3-fenil-propanoatului de etil racemic mediată de hidrolazele din

aceleași surse biologice, folosind aceleași microorganisme, pentru obținerea (R) și a (S)-3-hidroxi-3-

fenilpropanoatului de etil urmând ca aceștia să fie transformați printr-o serie de reacții în enantiomerii

acidului 3-amino-3-fenil-propanoic.

4

3. Contribuția Personală

3.1. Sinteza mediată de CaL-B a (R) și a (S)- 3-(2-aril-tiazol-4-il)-3-

hidroxipropanoaților de etil optic puri

3-(2-Aril-tiazol-4-il)-3-hidroxipropanoații de etil racemici (rac-1a-d) au fost sintetizați prin

intermediul reacției Reformatsky, pornind de la 2-aril-tiazol-4-carbaldehidele corespunzătoare. Prin acilarea

rac-1a-d, cu anhidridă butanoică, în prezenţǎ de trietilamină și a unei cantitǎţi catalitice de 4-N,N-

dimetilaminopiridină (DMAP) în diclormetan, s-au obținut diesterii racemici rac-2a-d, după cum se poate

observa în Schema 1, calea I și II.

Schema 1. Sinteza chimică a rac-1a-d și rac-2a-d și ruta enzimatică pentru obținerea aril-tiazol-β-hidroxiesterilor și a diesterilor

corespunzători optic puri.

Acilarea enzimatică la scară analitică a rac-1a-d

În vederea obţinerii de produși de rezoluție de înaltă enantiopuritate, au fost testate mai multe lipaze

disponibile comercial, atât în formă nativă cât și în formǎ imobilizată (25mg/mL), în diferiți solvenți organici,

la temperatura camerei, în cazul acilării enantioselective a rac-1a (0.025M), folosit drept compus model, cu

acetat de vinil și cu butanoat de vinil, ca donori de acil ireversibili (0.1M). Lipaza A din Candida antarctica

imobilizată prin adsorbție pe celită (CaL-A pe celită), CaL-B (Novozyme 435), lipaza B din Candida antarctica

imobilizată prin adsorbție pe nanotuburi de carbon cu un singur perete (CaL-B-SWCNT), lipaza din Candida

rugosa (CrL liberă), lipaza din Pseudomonas cepacia neimobilizată (LPS liberă), precum și lipaza AK

imobilizată prin adsorbție pe celită (AK pe celită), au fost testate ca biocatalizatori în solvenți organici anhidri.

Experimentele au fost realizate în prezență de sită moleculară, deoarece apa poate duce la reacții de hidroliză

chiar și în cantități foarte mici, rezultând produși secundari nedoriți sau se poate produce o scădere a

enantiopurității produșilor.

Natura solventului și natura nucleofilului pot influența semnificativ activitatea și selectivitatea acilării

enzimatice enantioselective. O îmbunătățire majoră a selectivității a fost obținută în urma reacției de O-

acilare mediată de CaL-B , cu butanoat de vinil, folosind hexan și toluen ca solvenți (Tabel 1, liniile 4-5),

rezultând produși de înaltă enantiopuritate la o conversie de aproximativ 50%. În mod interesant, CaL-B-

5

SWCNT s-a dovedit a fi complet inactivǎ pentru obiectivul nostru, deși a arătat activitate și selectivitate mari

în cazul acilării rac-1-feniletanolului.

Tabel 1. Screening de lipază și de solvent pentru O-acilarea selectivă a substratului racemic rac-1a folosind butanoat de vinil, după 17 ore.

Linia Lipază Solvent c (%) ee(R)-2a ee(S)-1a E

1 CaL-A pe celită MTBE 81.9 13 59 2

2 CaL-B MTBE 51.6 91 97 89

3 CaL-B DIPE 52.6 89 99 89.7

4 CaL-B Hexan 52.8 89 >99 127.8

5 CaL-B Toluen 50 >99 >99 »200

6 CrL MTBE 20 32 8 2

7 CrL DIPE 39.6 35 23 2.5

8 CrL Hexan 54.9 41 50 3.8

9 LPS liberă Hexan 47.7 80 73 19.5

Alcooliza enzimatică la scară analitică a rac-2a

Lipazele își rețin, de obicei, enantiopreferința constatatǎ la reacțiile de acilare stereoselectivă a alcoolilor

chirali și în cazul hidrolizei sau al alcoolizei esterilor corespunzători. În consecință, asemenea reacții ar trebui

să ducă la obținerea formelor enantiomere opuse ale 3-hidroxi-3-(2-aril-tiazol-4-il) propanoaților de etil 1a-d

și a diesterilor acestora 2a-d, decât cele obţinute în urma reacțiilor de acilare enzimatică a rac-1a-d. Mai

departe, am investigat alcooliza enzimatică a rac-2a, folosit drept compus model. Experimentele au fost

efectuate folosind aceleași enzime, în toți solvenții testați în cazul acilării enzimatice, prin adăugarea în

amestecul de reacție a 5 echivalenți de etanol sau de 1-butanol. Etanoliza mediată de CaL-B a arătat cele mai

mari valori ale selectivității și ale activității atunci când MTBE (Tabel 2, linia 5) și DIPE ( Tabel 2, linia 6) au

fost utilizate ca mediu de reacție. Datorită activității enzimatice mai mari în DIPE, acest solvent a fost utilizat

în experimentele ulterioare.

Tabel 2. Screening de alcool, lipază și solvent pentru alcooliza selectivǎ a diesterului racemic rac-2a, după 14 ore. Linia Alcool Lipază Solvent c (%) ee(R)-1a ee(S)-2a E

1 EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

CaL-A

CaL-A

CaL-A

CaL-A

MTBE 11.1 64 8 4.9

2 DIPE 32.2 59 28 5

3 Acetonitril 8.3 77 7 8.2

4 Hexan 19.3 71 17 7

5 CaL-B

CaL-B

CaL-B

MTBE 49.7 97 96 >200

6 DIPE 48.4 >99 93 »200

7 Toluen 6.6 >99 7 >200

8 CRL Hexan 9.8 55 6 3.6

Acilarea enzimatică la scară preparativă a rac-1a-d

Folosind condițiile optime găsite pentru biotransformările la scară analitică atât a rac-1a cât și a rac-2a, a fost

realizată acilarea rac-1a-d mediată de CaL-B la scară preparativă, cu butanoat de vinil în toluen (Tabel 3, linia

1-4) și etanoliza rac-2a-d mediată de CaL-B în DIPE (Tabel 3, liniile 5-8), obținându-se reactivități și

selectivități bune (E»200, ee=99% pentru majoritatea produșilor, la conversii de 50%). Toate diluțiile,

rapoartele substrat: biocatalizator și condițiile de reacție au fost aceleași ca în experimentul la scară analitică.

Randamentele produșilor izolați și purificați cromatografic au valori cuprinse între 45 şi 48%, sunt calculate

6

raportându-se la substraturile racemice de pornire și sunt redate în Tabelul 3, împreună cu unghiurile de

rotație optică ale produșilor enantiopuri.2

Tabel 3. Acilarea enzimatică la scară preparativă a rac-1a-d și etanoliza rac-2a-d. Linia Substrat Timp

(h)

Produși E

ee(R)-2 η (%) [α]Da ee(S)-1 η(%) [α]Da

1 rac-1a 19 99 47 +78.5 99 46 -56.8 »200

2 rac-1b 19 98 45 +75.2 >99 47 -53.5 »200

3 rac-1c 19 99 45 +72.8 99 45 -51.3 »200

4 rac-1d 17 99 46 +86.2 >99 45 -60.4 »200

ee(R)-1 ee(S)-2

5 rac-2a 17 >99 48 +57.2 98 48 -76 »200

6 rac-2b 48 98 46 +49.8 >99 45 -74.1 »200

7 rac-2c 48 >99 45 +51.9 >99 45 -68.5 »200

8 rac-2d 17 >99 45 +59.8 99 46 -83 »200

3.2. Sinteza unor (R)- 1-(2-aril-tiazol-4-il)etanamine şi a unor (S)-1-

(2-aril-tiazol-4-il)etanamine de înaltă puritate optică

Cererea pentru ariletanamine de înaltă puritate optică este într-o continuă creştere în special în industria

farmaceutică şi în cea a sintezei organice fine. Ca urmare, ne-am propus sinteza a patru etanamine cu schelet

feniltiazolic, sub forma ambilor enaqntiomeri, printr-o procedură chemoenzimatică (Schema 2). Etapa cheie

constă în rezoluţia cinetică enzimatică a rac-4a-d ȋn reacția de N-acilare.

R

NH2

R

HN

rac-3'a-d rac-4a-d

R'

O

R

HN

(R)-5a-d

R'

O

+

R

NH2

(S)-4a-d

O

R

a-dR

NH2

(R)-4a-d

I.

OH

R

rac-3a-d

II. III.

IV.

V.N3

R

rac-5a-d

R

NH2

(R)-3'a

OH

R

N3

R

(S)-3a

(R)-4a

II.

III.

ab c

ee 99%

ee 91%

ee 91%

I. CH3MgI, dietil eter; II. (PhO)2PON3/ toluen; III. Zn/NH4Cl, H2O/ THF; IV. CH3(CH2)2COCl/DMAP/Piridina/DCM; V. CaL-B/ etil n-butirat/ACN; VI. CaL-A-CLEA/H2O VII. CaL-B/H2O.

S

N

S

N

S

N

S

N

a b c d

R

HN R'

O

+

(S)-5a-d

VI.

VII.

Cl

Schema 2. Sinteza și biotransformarea stereoselectivă a aminelor heterociclice. Determinarea configuarației absolute a

produșilor de rezoluție.

S-a studiat sinteza aminelor rac-4a-d pornind de la aldehidele corespunzătoare şi urmărind

metodele descrise în literatură (ruta I→II→III, Schema 2). Într-o primă etapă etanolii racemici rac-3a-d au

fost obţinuţi prin reacţia Grignard din aldehidele corespunzătoare.3 În continuare, aminele rac-4a-d s-au

preparat din alcoolii corespunzători rac-3a-d prin intermediul azidelor rac-3’a-d, după cum se poate observa

7

în Schema 2, pasul a. Amidele rac-5a-d au fost sintetizate prin acilare chimică cu clorură de butanoil în

prezenţă de piridină şi a unei cantitǎţi catalitice de DMAP (ruta IV, Schema 2.).

N-acilarea enzimatică la scară analitică, presupune dizolvarea substratului rac-4a-d (0.025M) în

0,5 mL solvent organic anhidru, la care se adaugă 12,5 mg enzimă Novozyme 435 și 2-3 bucăți de sită

moleculară, urmând apoi adăugarea agentului de acilare (0.1 M). Amestecurile de reacţiile s-au menţinut la

temperatura camerei, cu agitare și s-au monitorizat prin cromatografie în strat subţire. Cele mai ridicate

enantioselectivităţi şi reactivităţi s-au obţinut după 16 ore în reacţia de N-acilare a rac-4a cu butirat de etil în

ACN anhidru, ȋn prezența lipazei CaL-B.

N-acilarea enzimatică a rac-4a-d la scară preparativă

Condiţiile optime stabilite pentru rezoluţia cinetică enzimatică a rac-4a au fost folosite în continuare

pentru N-acilarea enantioselectivă la scară preparativă a celor patru etanamine rac-4a-d. Produşii rezoluţiei

[enantiomerii (S)-4a-d nereacţionaţi şi (R)-5a-d] au putut fi separaţi cu randamente teoretice foarte

apropiate de 50% (93-97% din cantităţile teoretice la o conversie de 50%) obţinându-se sub forme de

enantiopuritate foarte ridicată (ee 82-99%)

3.3. Sinteza chemoenzimatică a enantiomerilor acidului 3-hidroxi-3-

fenilpropanoic şi ai acidului 3-amino-3-fenilpropanoic

În această lucrare, descriem sinteza ambilor enantiomeri ai 3-hidroxi-3-fenilpropanoatului de etil

folosind drojdia Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9080). 3-Hidroxi-3-fenilpropanoatul de etil este un

intermediar important în sinteza fluoxetinei. De asemenea, β-hidroxi esterii pot fi transformați în β-

aminoacizii corespunzători,4 cum sunt acizii (R)-3-amino-3-fenilpropanoic și (S)-3-amino-3-fenilpropanoic,

care sunt produși ai reacțiilor cu TcPAM și PaPAM și care sunt precursori chirali valoroşi pentru sinteza

compușilor biologic activi.

Reducerea enantioselectivă a β-cetoesterului 6

În prima etapǎ s-a realizat reducerea enzimatică a 3-oxo-3-fenilpropanoatului de etil 6 cu

Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9080, depozitată original ca și Saccharomyces carlsbergensis Hansen) și s-a

comparat cu alte metode deja raportate5, cum ar fi reducerea mediată de drojdia de bere (S. cerevisiae) sau de

Daucus carota.

Rezoluția cinetică a 3-acetoxi-3-fenilpropanoatului de etil racemic rac-8

Pe lângă utilizarea lor ca biocatalizatori ai reducerilor enantioselective, celulele de drojdie mai conțin și

hidrolaze chemoselective, regioselective și stereoselective cu acceptabilitate largă de substrat. Astfel, ne-am

extins studiile spre explorarea drojdiei în hidroliza enantiomer selectivă a 3-acetoxi-3-fenilpropanoatului de

etil racemic rac-8.

După cum se prezintǎ în Schema 3, hidroliza enantiomer selectivă a alcoolilor secundari urmează regula lui

Kazlauskas, rezultând (R)-3-hidroxi-3-fenilpropanoatul de etil (R)-7 și (S)-acetoxi-3-fenilpropanoatul de etil

nereacționat (S)-8.

8

O

OEt

O

(S)

OH

OEt

O

OAc

OEt

O

Saccharomycespastorianus

(R)

OH

OEt

O

(S)

OAc

OEt

O

6

rac-8

(S)-7

(R)-7 (S)-8

+Saccharomycespastorianus

Schema 3. Sinteza mediată de drojdie a derivaților -hidroxiacizilor optic activi.

Conversia enantiomerilor 3-hidroxi-3-fenilpropanoatului (R)-7 și (S)-7 în (R) și (S)-3-amino-3-

fenilpropanoați (R)-11 și (S)-11

(R)-β-Hidroxi propanoatul de etil și (S)-β-Hidroxipropanoatul de etil enantiomeric puri, au fost transformați

chimic în acizii (S)-3-amino-3-fenilpropanoic și (R)-3-amino-3-fenilpropanoic, (R)-11 și (S)-11, conform

Schemei 3. Se cunosc câteva metode de transformare a alcoolilor secundari în aminele corespunzătoare, fără

pierderi majore ale enantiopurității.6 În urma investigării diferitor metode, cele mai bune randamente și

enantiopurități ale produsului au fost obținute cînd grupările hidroxil din (R)-7și (S)-7 au fost transformate în

azide (S)-9 și (R)-9, folosind difenil fosforazidă. Această reacție urmează un mecanism SN2 care implică

inversia stereospecifică de configurație. Reducerea azidei (S)-9 sau (R)-9, folosind reacția Staudinger, a dus la

formarea (S)- și (R)-3-amino-3-fenilpropanoaților de etil corespunzători (S)-10 și (R)-10, cu aceleași

enantiopurități ca și cele determinate pentru (R)- și (S)-3-hidroxipropanoați, (R)-7 și (S)-7.

(PhO)2PON3

Ph3P, H2O

THF

(S)

OH

OEt

O

(R)

N3

OEt

O

(R)

NH2

OEt

O

THF

(R)

OH

OEt

O

(S)-7

(R)-9

(R)

NH2

OH

O

(R)-10

apa

6M HCl

(R)-11

(PhO)2PON3

Ph3P, H2O

THF

(S)

N3

OEt

O

(S)

NH2

OEt

O

THF

(S)-9

(S)

NH2

OH

O

(S)-10

apa

6M HCl

(S)-11

(R)-7

Schema 4. Transformarea (S)-7 și (R)-8 în enantiomerii β-aminoacizilor corespunzători.

9

Concluzii generale

1. A fost descris un procedeu enzimatic eficient pentru sinteza 3-(2-aril-tiazol-4-il)-3-hidroxi

propanoaților de etil optic puri (ee 99%). Prin utilizarea rezoluției cinetice enzimatice, au fost sintetizați cu

randamente bune ambii enantiomeri optic puri ai celor patru 3-hidroxi-3-(2-aril-tiazol-4-il)propanoați de etil

1a-d și ai celor patru butanoați 2a-d. CaL-B s-a dovedit a fi biocatalizatorul optim atât pentru acilarea rac-1a-

d cu butanoat de vinil în toluen, cât și pentru etanoliza rac-2a-d în DIPE. De asemenea, CaL-B s-a dovedit

eficientǎ la reutilizarea în zece cicluri, activitatea și stereoselectivitatea ei rămânând nealterate.

2. S-a realizat sinteza unor etanamine cu schelet feniltiazolic de puritate optică ridicată, care prezintă

potenţial de utilizare în industria farmaceutică şi agrochimică. Metoda de sintezǎ este nouǎ, eficientă şi

compatibilă cu mediul. Ambii enantiomeri ai celor patru 1-(2-ariltiazol-4-il)etanamine sintetizate au fost

obţinuţi cu excese enantiomerice şi enantioselectivităţi foarte bune la conversii aproape maxime. În urma

studiului de optimizare a metodei, lipaza CaL-B s-a dovedit a fi optimă pentru rezoluțiile cinetice ale rac-4,5a-

d în timp ce lipaza CaL-A-CLEA a manifestat activitate hidrolitică superioară enzimei CaL-B, dar selectivitatea

este foarte scăzută. În ceea ce priveşte reacţia de N-acilare enzimatică, rezultatele optime s-au obţinut în ACN,

folosind butanoatul de etil ca donor de acil, iar reacţiile de hidroliză enzimatică au fost realizate în apă, la

temperatura de 45oC.

3. A fost demonstrată capacitatea de biocatalizator enantioselectiv a speciei Saccharomyces cerevisiae

pentru reducerea 3-oxo-3-fenilpropanoatului de etil 6 la (S)-3-hidroxi-3-fenilpropanoat de etil (S)-7, cu

randament mare și şi cu enantiopuritate ridicatǎ. În prezența aceluiași biocatalizator, s-a realizat rezoluția

cinetică înalt enantioselectivǎ și chemoselectivă a 3-acetoxi-3-fenilpropanoatului de etil rac-8, prin hidroliza

enantiomer selectivă, la (R)-hidroxiester (R)-7. Ambele procese au fost optimizate prin varierea mediului de

reacție și prin utilizarea aditivilor. β-Hidroxi esterii enantiopuri, (S)-7 și (R)-7, au fost transformați în acizii

(R)- și (S)-3-aminopropanoici corespunzători, (R)-11 și (S)-11, printr-o secvență de reacții care implică o

etapă stereospecifică SN2, care decurge cu inversie de configurație.

Referințe

1. Poppe, L., Novák, L. Selective Biocatalysis: A Synthetic Approach, VCH Publishers, New York, 1992.

2. Varga, A., Naghi, M.A., Füstös, M., Katona, G., Zaharia, V. Tetrahedron: Asymmetry 2014, 25, 298-304.

3. Hapǎu, D., Brem, J., Moisǎ, M., Toşa, M. I., Irimie, F. D., Zaharia, V. J. Mol. Catal. B, Enzymatic 2013, 94, 88-94.

4. Varga, A., Zaharia, V., Nógrádi, M., Poppe, L. Tetrahedron: Asymmetry 2013, 24, 1389-1394.

5. (a) Carballeira, J. D.; Quezada, M. A.; Hoyos, P.; Simeó, Y.; Hernaiz, M. J.; Alcantara, A. R.; Sinisterra, J. V. Biotech. Advances,

2009, 27, 686–714; (b) Bencze, L. C.; Paizs, C.; Toşa, M. I.; Trif, M.; Irimie, F.-D. Tetrahedron: Asymmetry, 2010, 21, 1999–

2004.

6. (a) Santamaría, S. A.; Gotor-Fernández, V.; Gotor, V. Eur. J. Org. Chem. 2009, 15, 2533–2538; (b) Thompson, A. S.;

Humphrey, G. R.; DeMarco, A. M.; Mathre, D. J.; Grabowski, E. J. J. J. Org. Chem. 1993, 58, 5886–5888; (c) Felluga, F.;

Baratta, W.; Fanfoni, L.; Pitacco, G.; Rigo, P.; Benedetti, F. J. Org. Chem. 2009, 74, 3547–3550.

10

PhD THESIS (ABSTRACT)

Stereocontroled Enzymatic

Synthesis of aromatic and

heteroaromatic compounds

PhD Student Annamária Varga

Scientific Supervisor Prof.dr. Valentin Zaharia

11

Table of content

KEYWORDS 3

1. INTRODUCTION 3

2. OBJECTIVES 3

3. PERSONAL CONTRIBUTIONS 4

3.1. CaL-B mediated synthesis of optically pure (R)- and

(S)- ethyl 3-(2-arylthiazol-4-yl)-3-hydroxypro-panoates. 4

3.2.Synthesis of highly enantiopure (R)- and (S)-1-(2-

phenylthiazol-4-yl)ethanamines. 6

3.3. Chemoenzymatic synthesis of both enantiomers of 3-

hydroxy- and 3-amino-3-phenylpropanoic acid. 7

4. GENERAL CONCLUSIONS 9

5. REFERENCES 9

12

Keywords: biocatalysis, stereoselective reactions, enzymes, lipases, Saccharomyces cerevisiae

1. Introduction

The catalytic power of enzymes is crucial in biochemical processes since almost all reactions, from viruses to

man, are mediated by this class of proteins. Many enzymes retain their catalytic activity also in vitro, being a

prerequisite for their use in synthetic chemistry, food technology, medicine, bioremediation etc. In this way

nowadays enzymes are highly important in many food, beverage, detergent technologies, various chiral

building blocks or biological active compound production. Enzymes are also of fundamental interest in the

medical sciences, since many disease are directly connected with atypical function or expression level of one

or several enzymes.

In the last decades there was an almost exponential increase in the requisite of high quantities of various

optically pure substances. The main purpose for this need is the necessity of increasing the life quality of our

civilization. The people need new medicines of better quality (agrochemicals and pharmaceutically important

substances) and other fine chemical products (detergents, perfumes, insecticides, etc.) and all of them are

based on different chemical building-blocks.1 The optically pure hydroxy-esters, amines, cyanohydrins,

substituted ethane-diols and amino acids are just some of the most desired classes of substances.

2. Obiectives

In order to obtain novel enantiopure compounds, several strategies based on the enantiomer

selective enzymatic kinetic resolutons of various racemates were elaborated as presented below:

1. The lipase catalyzed synthesis of four new enantiomerically pure (R)- and (S)- ethyl 3-hydroxy-3-

(2-aryl-thiazol-4-yl) propanoates and their butanoates by enzymatic enantioselective acylation of the racemic

alcohols and by ethanolysis of the corresponding racemic esters mediated by lipases in organic solvents is

presented . For the absolute configuration of the resolution products a detailed 1H NMR study of the Mosher’s

derivatives of these compounds was proposed.

2. The synthesis of both enantiomers of four new potentially biological active phenylthiazole-based

amines by enantiomer-selective acylation of racemic amines and by hydrolysis of the corresponding racemic

amides using lipases as chiral catalyst with good yields and excellent enantioselectivities is described. For the

absolute configuration of the enantiopure products a retrosynthetic method was proposed.

3. The synthesis of ethyl (S)-3-hydroxy-3-phenylpropionate by asymmetric reduction of ethyl 3-

phenyl-3-oxopropionate with the yeast was proposed to be investigated. Kinetic resolution of racemic ethyl

2-acetoxy-3-phenyl-propionate with the same microorganism was expected to gave after hydrolysis ethyl

(R)- and (S)-3-hydroxy-3-phenylpropionate which could be converted by a straightforward series of reactions

to the enantiomers of 3-amino-3-phenyl-propionic acid. The asymmetric reduction and hydrolytic kinetic

resolution were proposed also to be tested with several other whole cell systems under a variety of

conditions.

13

3. Personal contributions

3.1. CaL-B mediated synthesis of optically pure (R)- and (S)- ethyl 3-

(2-arylthiazol-4-yl)-3-hydroxypropanoates

Racemic ethyl 3-(2-arylthiazol-4-yl)-3-hydroxypropanoates (rac-1a-d) were prepared by the

Reformatsky reaction starting from the corresponding 2-arylthiazol-4-carbaldehydes. By the chemical

acylation with butanoic anhydride in presence of triethylamine and a catalytic amount of 4-N,N-

dimethylamino-pyridine (DMAP) in dichloromethane of rac-1a-d the preparation of the racemic diesters rac-

2a-d was also performed as shown in Scheme 1, route I and II.

Scheme 1. The chemical synthesis of the rac-1a-d and rac-2a-d and the enzymatic route for the preparation of optically

pure arylthiazol-β-hydroxy esters and their corresponding diesters.

Analytical scale enzymatic acylation of rac-1a-d

In an effort to obtain highly enantiomerically enriched resolution products, commercially available free or

immobilized lipase preparations (25 mg/mL) were screened in various organic solvents at room

temperature, for the enantioselective acylation using vinyl acetate and vinyl butanoate as irreversible acyl

donors (0.1M) of the racemic 3-hydroxy-3-(2-phenylthiazol-5-yl)propanoate rac-1a (0.025M), used as model

compound. Lipase A from Candida antarctica immobilized by adsorption on Celite (CaL-A on Celite), CaL-B

(Novozyme 435), lipase B from Candida antarctica immobilized by adsorption on single wall carbon nanotube

(CaL-B-SWCNT), lipase from Candida rugosa (CrL), free Pseudomonas cepacia lipase (LPS free) and lipase AK

immobilized by adsorption on Celite (AK on Celite) were tested as suitable biocatalysts in dry organic

solvents. The experiments were performed in the presence of molecular sieves since even small traces of

water could promote hydrolytic reactions, thus yielding undesired by-products or causes a decrease in the

enantiopurity of the products.

The nature of the solvent and the nucleophile can significantly influence the activity and selectivity of the

enantiomer selective enzymatic acylation. Thus, the solvents used were selected and tested as they are

commonly accepted by lipases. A major improvement in selectivity was obtained for the CaL-B catalyzed O-

acylation with vinyl butanoate using hexane and toluene as solvents (Table 1, entries 4-5), yielding highly

enantiomerically enriched resolution products at approx. 50% conversion. Interestingly, CaL-B-SWCNT

14

proved to be completely inactive for the present purpose, however it showed high activity and selectivity for

the acylation of rac-1-phenylethanol.

Tabel 1. Lipase and solvent screenings for the selective O-acylation of the racemic substrate rac-1a using vinyl butanoate, after 17 hours.

Entry Lipase Solvent c (%) ee(R)-2a ee(S)-1a E

1 CaL-A on celite MTBE 81.9 13 59 2

2 CaL-B MTBE 51.6 91 97 89

3 CaL-B DIPE 52.6 89 99 89.7

4 CaL-B Hexane 52.8 89 >99 127.8

5 CaL-B Toluene 50 >99 >99 »200

6 CrL MTBE 20 32 8 2

7 CrL DIPE 39.6 35 23 2.5

8 CrL Hexane 54.9 41 50 3.8

9 LPS free Hexane 47.7 80 73 19.5

Analytical scale enzymatic alcoholysis of rac-2a-d

Lipases usually retain their enantiomer preference found in the stereoselective acylation of chiral alcohols

including the case of hydrolysis or alcoholysis of the esteric counterparts. Consequently, such reactions

should result in opposite enantiomeric forms of the enantiomerically enriched ethyl 3-(2-arylthiazol-4-yl)-3-

hydroxypropanoates 1a-d and their diesters 2a-d as those found in the enzymatic acylation of rac-1a-d.

Further, the enzymatic alcoholysis of rac-2a, used as model compound, was investigated. The experiments

were carried out using the same enzymes in all of the tested solvents checked for the enzymatic acylation, by

adding 5 equivalents of ethanol or 1-butanol into the reaction mixture. Ethanolysis mediated by CaL-B

showed the highest selectivity and activity when MTBE (Table 2, entry 5) and DIPE (Table 2, entry 6) were

used as reaction media. Due to the higher activity of the enzyme in DIPE, this solvent was used in further

experiments.

Tabel 2. Alcohol, lipase and solvent screening for the selective alcoholysis of the racemic diester rac-2a, after 14 hours. Entry Alcohol Lipase Solvent c (%) ee(R)-1a ee(S)-2a E

1 EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

EtOH

CaL-A

CaL-A

CaL-A

CaL-A

MTBE 11.1 64 8 4.9

2 DIPE 32.2 59 28 5

3 Acetonitrile 8.3 77 7 8.2

4 Hexane 19.3 71 17 7

5 CaL-B

CaL-B

CaL-B

MTBE 49.7 97 96 >200

6 DIPE 48.4 >99 93 »200

7 Toluene 6.6 >99 7 >200

8 CrL Hexane 9.8 55 6 3.6

Preparative scale enzymatic acylation of rac-1a-d

Using the optimal conditions found for the analytical scale biotransformations of both rac-1a and rac-2a, the

CaL-B mediated preparative scale acylation of rac-1a-d with vinyl butanoate in toluene (Table 3, entries 1-4)

and ethanolysis of rac-2a-d in DIPE (Table 3, entries 5-8) was next performed with good reactivity and

selectivity (E » 200, 99% ees for the most of the resolution products at approx. 50% conversion). All the

15

dilutions, substrate:biocatalyst ratio and reaction conditions were the same as in the case of the analytical

scale reactions. The yields of the isolated and chromatographically purified resolution products were in the

range of 45-48%, calculated related to the starting racemic substrates and are given in Table 3, together with

the optically rotatory power of the enantiopure products.2

Table 3. Preparative scale enzymatic acylation of rac-1a-d and ethanolysis of rac-2a-d. Entry Substrate Time

(h)

Products E

ee(R)-2 η (%) [α]Da ee(S)-1 η(%) [α]Da

1 rac-1a 19 99 47 +78.5 99 46 -56.8 »200

2 rac-1b 19 98 45 +75.2 >99 47 -53.5 »200

3 rac-1c 19 99 45 +72.8 99 45 -51.3 »200

4 rac-1d 17 99 46 +86.2 >99 45 -60.4 »200

ee(R)-1 ee(S)-2

5 rac-2a 17 >99 48 +57.2 98 48 -76 »200

6 rac-2b 48 98 46 +49.8 >99 45 -74.1 »200

7 rac-2c 48 >99 45 +51.9 >99 45 -68.5 »200

8 rac-2d 17 >99 45 +59.8 99 46 -83 »200

3.2. Synthesis of highly enantiopure (R)- and (S)-1-(2-phenylthiazol-

4-yl)ethanamines

Enantiopure amines and their derivatives represent important chiral building blocks and final

products especially in pharmaceutical and fine chemical industries. Our aim has been to prepare both

enantiomers of four phenylthiazole-based ethanamines in a highly enantiomerically enriched form by a

chemoenzymatic pathway (Scheme 2). The key tool consists in the use of lipases in the enzymatic kinetic

resolution of the racemic ethanamines rac-4a-d through N-acylation.

R

NH2

R

HN

rac-3'a-d rac-4a-d

R'

O

R

HN

(R)-5a-d

R'

O

+

R

NH2

(S)-4a-d

O

R

a-dR

NH2

(R)-4a-d

I.

OH

R

rac-3a-d

II. III.

IV.

V.N3

R

rac-5a-d

R

NH2

(R)-3'a

OH

R

N3

R

(S)-3a

(R)-4a

II.

III.

ab c

ee 99%

ee 91%

ee 91%

I. CH3MgI, diethyl eter; II. (PhO)2PON3/ toluene; III. Zn/NH4Cl, H2O/ THF;

IV. CH3(CH2)2COCl/DMAP/Pyridine/DCM; V. CaL-B/ ethyl n-butyrate/ACN; VI. CaL-A-CLEA/H2O VII. CaL-B/H2O.

S

N

S

N

S

N

S

N

a b c d

R

HN R'

O

+

(S)-5a-d

VI.

VII.

Cl

Scheme 2. Synthesis and biotransformations of 1-(2-phenylthiazol-4-yl)ethanamines and ethanacetamides.

Based on the methods described in literature, the preparation of amines rac-4a-d from the corresponding

aldehydes was first studied. The racemic ethanols rac-3a-d obtained from the corresponding alcohols by the

16

Grignard reaction3 were transfomed into racemic amines rac-4a-d via azide derivatives rac-3'a-d as shown in

Scheme 2 (route I→II→III Scheme 2). Racemic amides rac-5a-d were obtained by chemical acylation with

butyryl chloride of rac-4a-d, in acetonitrile, in the presence of pyridine and a catalytic amount of DMAP

(Scheme 2, route IV).

Analytical scale enzymatic N-acylation of rac-4a-d

Common commercial lipase preparations were screened for the N-acylation of the model compound,

rac-4a (0.025 M), at room temperature (step V, Scheme 2). In order to find the optimal reaction conditions

the analytical scale enzymatic reactions were conducted in various organic solvents using four different acyl

donors (0.1 M) for the N-acylation of rac-4a. The addition of molecular sieve [4 Å; the ratio to the catalyst 1:1

(w/w)] to the reaction medium was necessary since even small traces of water could promote lipase-

catalysed hydrolytic reactions.The highest enantioselectivity and reactivity for the CaL-B mediated N-

acylation of rac-4a were obtained with ethyl n-butyrate as acyl donor in dry ACN as solvent after 16 hours.

Preparative scale enzymatic N-acylation of rac-4a-d

The developed kinetic resolution method of rac-4a was next used for the preparative-scale kinetic

resolution of all substrates rac-4a-d. The resolution products [the unreacted (S)-4a-d and the obtained (R)-

5a-d] were separated at close to 50% theoretical yields (93-97% from the theoretical amounts at 50%

conversion) in highly enantiopure forms (ee 82-99%).

3.3. Chemoenzymatic synthesis of both enantiomers of 3-hydroxy-

and 3-amino-3-phenylpropanoic acid

In this part we describe the synthesis of both enantiomers of ethyl 3-hydroxy-3-phenylpropanoate with

the yeast Saccharomices cerevisiae (ATCC 9080). Ethyl 3-hydroxy-3-phenylpropanoate is an important

intermediate of the synthesis of fluoxetine. The -hydroxy esters can also be transformed into the

corresponding -amino acids,4 i.e. (R)- and (S)-3-amino-3-phenylpropanoic acid which are the products of

TcPAM and PaPAM reactions and useful as valuable building blocks for the synthesis of biologically active

compounds.

Enantioselective reduction of β-keto ester 6

First the enzymatic reduction of ethyl 3-oxo-3-phenylpropanoate 6 with Saccharomices cerevisiae

(ATCC® 9080™, originally deposited as Saccharomyces carlsbergensis Hansen) was carried out and compared

with other methods already reported5 such as reduction mediated by baker’s yeast (S. cerevisiae) or Daucus

carota.

Kinetic resolution of racemic ethyl 3-acetoxy-3-phenylpropanoate rac-8

Besides being widely used as biocatalyst for enantioselective reduction, yeast cells contain also

hydrolases with broad range of substrate acceptability and chemo-, regio- and stereoselectivity. Therefore,

we also extended our studies to explore the scope of yeasts for the enantiomer selective hydrolysis of

racemic ethyl 3-acetoxy-3-phenylpropanoate rac-8.

17

As shown in Scheme 3 enantiomer selective hydrolysis of the acylated secondary alcohol followed

Kazlauskas’ rule yielding ethyl (R)-3-hydroxy-3-phenylpropanoate (R)-7 and unreacted ethyl (S)-acetoxy-3-

phenylpropanoate (S)-8.

O

OEt

O

(S)

OH

OEt

O

OAc

OEt

O

Saccharomycespastorianus

(R)

OH

OEt

O

(S)

OAc

OEt

O

6

rac-8

(S)-7

(R)-7 (S)-8

+Saccharomycespastorianus

Scheme 3. Yeast mediated synthesis of optically active -hydroxyacid derivatives.

Conversion of 3-hydroxy-3-phenylpropanoate enantiomers (R)-7 and (S)-7 into (R)-

and (S)-3-amino-3-phenylpropanoate (R)-11 and (S)-11

Finally the enantiomerically highly enriched ethyl (R)- and (S)-β-hydroxypropanoates were chemically

converted into the corresponding (S)- and (R)-3-amino-3-phenylpropanoic acids (R)-11 and (S)-11 as

presented in Scheme 4. Several methods are known for the transformation of secondary alcohols to the

corresponding amines without significant loss of the enantiopurity.6 Our investigation of various methods

showed the best yields and enantiopurities for the product when the hydroxy group in (R)-7 or (S)-7 was

transformed to azide [(S)-9 or (R)-9, respectively] by using diphenyl phosphorazide. This reaction proceeds

by an SN2 mechanism involving the stereospecific inversion of the configuration. Reducing the azide (S)-9 or

(R)-9 using the Staudinger reaction resulted in formation of the corresponding ethyl (S)- and (R)-3-amino-3-

phenylpropanoates (S)-10 or (R)-10 with the same enantiopurities as determined for the starting ethyl (R)-

or (S)-3-hydroxypropanoates [(R)-7 and (S)-7, respectively].

Scheme 4. Transformation of (S)-2 and (R)-3 into the corresponding β-amino acid enantiomers.

18

4. General Conclusions

1. An efficient enzymatic procedure on the synthesis of enantiomerically pure ethyl 3-hydroxy-3-(2-

aryl-thiazol-4-yl)propanoates has been described (ee 99%). By using enzymatic kinetic resolution, both

optically pure enantiomers of four ethyl 3-hydroxy-3-(2-aryl-thiazol-4-yl)propanoates 1a–d and four

butanoates 2a–d were synthesized with high yields. CaL-B proved to be the optimal biocatalyst for both

acylation of rac-1a-d with vinyl butanoate in toluene and the ethanolysis of rac-2a-d in DIPE. CaL-B also

showed to be efficiently reusable in ten cycles, since its activity and stereoselectivity remain unaltered.

2. An efficient and environmentally friendly new procedure for the synthesis of enantiomerically

enriched phenylthiazol-4-yl-ethanamines has been developed. It was found that CaL-B (Novozyme 435) is the

proper catalyst for both rac-4,5a-d enantioselective N-acylation and hydrolysis. The CaL-B-mediated kinetic

resolution of through N-acylation occured optimal using ethyl n-butyrate as acyl donor and acetonitrile as

solvent at room temperature. The Novozyme 435-mediated hydolysis of rac-5a-d was optimal in water at 45

°C, with no need for additional co-solvents. Deprotection of (R)-5a-d to the corresponding (R)-4a-d was

achieved faster using CaL-A immobilized on celite.

3. In the present work the utility of Saccharomices cerevisiae (ATCC® 9080™) as an enantioselective

biocatalyst in the reduction of ethyl 3-oxo-3-phenylpropanoate 6 to ethyl (S)-3-hydroxy-3-phenylpropanoate

(S)-7 in good yield and high enantiomeric purity was demonstrated. In the presence of the same biocatalyst,

highly enantio- and chemoselective kinetic resolution of ethyl 3-acetoxy-3-phenylpropanoate rac-8 by

enantiomer selective hydrolysis to the (R)-hydroxy-ester (R)-7 was carried out. Both processes were

optimized by varying the medium and using additives. The enantiomerically enriched -hydroxy esters (S)-7

and (R)-7 were converted into the corresponding (R)- and (S)-3-aminopropanoic acids (R)-11 and (S)-11 by a

straightforward reaction sequence involving a stereospecific SN2 reaction step with inversion of the

configuration.

REFERENCES

1. Poppe, L., Novák, L. Selective Biocatalysis: A Synthetic Approach, VCH Publishers, New York, 1992.

2. Varga, A., Naghi, M.A., Füstös, M., Katona, G., Zaharia, V. Tetrahedron: Asymmetry 2014, 25, 298-304.

3. Hapǎu, D., Brem, J., Moisǎ, M., Toşa, M. I., Irimie, F. D., Zaharia, V. J. Mol. Catal. B, Enzymatic 2013, 94, 88-94.

4. Varga, A., Zaharia, V., Nógrádi, M., Poppe, L. Tetrahedron: Asymmetry 2013, 24, 1389-1394.

5. (a) Carballeira, J. D.; Quezada, M. A.; Hoyos, P.; Simeó, Y.; Hernaiz, M. J.; Alcantara, A. R.; Sinisterra, J. V. Biotech. Advances,

2009, 27, 686–714; (b) Bencze, L. C.; Paizs, C.; Toşa, M. I.; Trif, M.; Irimie, F.-D. Tetrahedron: Asymmetry, 2010, 21, 1999–

2004.

6. (a) Santamaría, S. A.; Gotor-Fernández, V.; Gotor, V. Eur. J. Org. Chem. 2009, 15, 2533–2538; (b) Thompson, A. S.;

Humphrey, G. R.; DeMarco, A. M.; Mathre, D. J.; Grabowski, E. J. J. J. Org. Chem. 1993, 58, 5886–5888; (c) Felluga, F.;

Baratta, W.; Fanfoni, L.; Pitacco, G.; Rigo, P.; Benedetti, F. J. Org. Chem. 2009, 74, 3547–3550.