cercetări privind noi compuși cu structură xantinică cu potențial ...

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

“GRIGORE T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

CERCETĂRI PRIVIND NOI COMPUŞI CU

STRUCTURĂ XANTINICĂ CU POTENŢIAL

BIOLOGIC

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

PROF. DR. Lenuța PROFIRE

DOCTORAND

Florentina Geanina GHEAŢĂ (LUPAŞCU)

Investeşte în oameni ! Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Axa prioritară „Educatia si formarea profesională în sprijinul cresterii economice si dezvoltării societătii bazate pe cunoastere” Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale si post-doctorale în sprijinul cercetării” Titlul proiectului: „Burse doctorale pentru cresterea competitivitatii in domeniul medical si farmaceutic” Numărul de identificare al contractului: POSDRU/88/1.5/S/58965 Beneficiar : Universitatea de Mdicina si Farmacie „Gr. T. Popa” Iasi Partener : Universitatea de Medicina si Farmacie „Iuliu Hatieganu” Cluj Napoca

2013

Componenţa comisiei de doctorat:

PREŞEDINTE: Decan Prof. univ dr. Monica Hânceanu

Universitatea de Medicină şi Farmacie ’’Grigore T. Popa’’, Iaşi

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ dr. LENUŢA PROFIRE


REFERENŢI OFICIALI:

Prof. univ dr. Daniela Lucia Muntean

Universitatea de Medicină şi Farmacie Tg. Mureş

Prof. univ dr. Ovidiu Oniga

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca

Prof. univ dr. CĂTĂLINA ELENA LUPUŞORU,


1

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

CUPRINS i

ABREVIERI v

STADIUL CUNOAŞTERII

CAPITOLUL 1

DIABETUL ZAHARAT 2

1.1. TERMINOLOGIE 3

1.2. FIZIOPATOLOGIE 3

1.3. CLASIFICARE 4

1.3.1. Diabet zaharat tip 1 4 1.3.2. Diabetul zaharat de tip 2 6

1.3.3. Diabet gestational 9

I.4.SIMPTOME 10

I.5. COMPLICAŢII 11

I.5.1. Afecţiuni cardiovasculare 13

I.5.2. Nefropatia diabetică 15

I.5.3. Neuropatia diabetică 17 I.5.4. Retinopatia diabetică 19

I.5.5. Arteriopatia diabetică 21

I.5.6. Piciorul diabetic 22 I.5.7. Cetoacidoza diabetică 23

I.6. INSULINOREZISTENŢA 24

CAPITOLUL 2

TERAPIA DIABETULUI ZAHARAT TIP 2 26

2.1. BIGUANIDE 27

2.2. SULFONILUREE 28

2.3. GLINIDE 30

2.4. INHIBITORI DE ALFA-GLUCOZIDAZĂ 30

2.5.TIAZOLIDINDIONELE 31

2.6. MODULATORI AI INCRETINELOR 33

2.6.1. Analogi sintetici ai GLP-1 34 2.6.2. Inhibitori ai DPP IV 35

2.7. INSULINA 39

CAPITOLUL 3

STRESUL OXIDATIV 41

3.1. STRESUL OXIDATIV CELULAR ŞI DIABETUL ZAHARAT 43

CAPITOLUL 4

BIOPOLIMERI CU APLICABILITATE ÎN TERAPIA DIABETULUI ZAHARAT 46

4.1. CHITOSAN 46

2

CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL 5

MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE 51

CAPITOLUL 6

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ A UNOR NOI DERIVAȚI

DE TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU STRUCTURĂ XANTINICĂ

54

6.1. MATERIAL SI METODĂ 54

6.1.1. Procedeu pentru obținerea derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 54 6.1.2. Procedeu pentru obținerea derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetil-hidrazina 55

6.1.3. Procedeu general pentru obținerea derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]-4-(4-R-

fenil)tiosemicarbazida

55

6.1.4. Procedeu general pentru obținerea derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]

hidrazono}-3-(4-R-fenil)tiazolidin-4-ona

55

6.1.5. Procedeu general pentru obținerea derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil] hidrazono}-3-(4-R1-fenil)-5-(4-R2-benziliden)tiazolidin-4-ona

56

6.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII 56

6.2.1. Sinteza derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 57

6.2.2. Sinteza 1,3-dimetilxantin-7-il-acetil hidrazina 58 6.2.3. Sinteza derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]-4-(4-R-fenil) tiosemicarbazida 60

6.2.4. Sinteza derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-R-fenil)

tiazolidin-4-ona

62

6.2.5. Sinteza derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-R1-fenil)-5-(4-

R2-benziliden)tiazolidin-4-ona

64

6.3. CONCLUZII 71

CAPITOLUL 7

CONFIRMAREA STRUCTURII CHIMICE A COMPUŞILOR SINTETIZAŢI

7.1. MATERIAL ȘI METODE 72

7.1.1. Spectroscopia în infraroşu 72

7.1.2. Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară 73


7.2.1. Spectroscopia în infraroșu 73

7.2.1.1. Spectrul IR al derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 73 7.2.1.2. Spectrul IR al derivatului 1,3-dimetilxantin-7-il-acetil hidrazina 74

7.2.1.3. Spectrul IR al derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)-acetil]-4-(4-R-fenil)

tiosemicarbazida

75

7.2.1.4. Spectrul IR al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-R-fenil)tiazolidin-4-ona

76

7.2.1.5. Spectrul IR al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-

(4-R1-fenil)-5-(4-R2-benziliden)tiazolidin-4-ona

78

7.2.2. Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară 82

7.2.2.1. Spectrul RMN al derivatului1,3-dimetilxantin-7-il-acetat de etil 82

7.2.2.2. Spectrul RMN al derivatului1,3-dimetilxantin-7-il-acetil hidrazina 83 7.2.2.3. Spectrul RMN al derivaților 1-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]-4-(4-R-fenil)

tiosemicarbazida

84

7.2.2.4. Spectrul 1H-RMN al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]

hidrazono}-3-(4-R-fenil)tiazolidin-4-ona

85

7.2.2.5. Spectrul RMN al derivaților 2-{2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-il)acetil]hidrazono}-

3-(fenil)-5-(4-R2-benziliden)tiazolidin-4-ona

86

3

7.3. CONCLUZII 94

CAPITOLUL 8

DEZVOLTAREA UNOR MICROSISTEME PE BAZĂ DE CHITOSAN CU

APLICABILITATE ÎN TERAPIA DIABETULUI ZAHARAT

8.1. MATERIAL ȘI METODE 95

8.1.1. Procedeu de preparare a microparticulelor de chitosan 95 8.1.2. Procedeu de preparare a microparticulelor de chitosan-substanță activă 96

8.1.3. Tehnici de caracterizare a microparticulelor de chitosan – substanță activă 96

8.1.3.1. Eficacitatera încapsulării substanței active 96 8.1.3.2. Studiul morfologiei microparticulelor de chitosan – substanță activă 97

8.1.3.3. Testul de umflare 97

8.1.3.4. Analiza spectrală IR a microparticulelor de chitosan – substanță activă 98

8.1.3.5. Studiul eliberării in vitro a substanţei active din matricea polimerică 98 8.1.3.6. Studiul degradării enzimatice a microparticulelor de chitosan - substanţă activă 99


8.2.1. Optimizarea procedeului de preparare a microparticulelor de chitosan 100

8.2.2. Caracterizarea microparticulelor de chitosan - substanţă activă 101 8.2.2.1. Eficienţa încapsulării substanţei active în microsferele de chitosan 101

8.2.2.2. Morfologia microparticulelor de chitosan-substanță activă 102

8.2.2.3. Testul de umflare 104 8.2.2.4. Analiza spectrală IR a microparticulelor de chitosan-substanță activă 105

8.2.2.5. Studiul eliberării in vitro a substanţei active din matricea polimerică 107

8.2.2.6. Studiul degradării enzimatice a microparticulelor de chitosan - substanţă activă 108

8.3. CONCLUZII 110

CAPITOLUL 9

EVALUAREA BIOLOGICĂ A DERIVAȚILOR DE TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU

STRUCTURĂ XANTINICĂ

9.1. EVALUAREA POTENȚIALULUI ANTIOXIDANT in vitro 112

9.1.1. Material și metode 112

9.1.1.1. Puterea reducătoare 112

9.1.1.2. Capacitatea totală antioxidantă 113 9.1.1.3. Capacitatea antiradicalică față de radicalul DPPH 113

9.1.1.4. Capacitatea antiradicalică față de radicalul cation ABTS·+

114

9.1.2. Rezultate şi discuţii 114 9.1.2.1. Puterea reducătoare 114

9.1.2.2. Capacitatea totală antioxidantă 116

9.1.2.3. Capacitatea antiradicalică față de radicalul DPPH 118 9.1.2.4. Capacitatea antiradicalică față de radicalul cation ABTS

·+ 120

9.1.3. Concluzii 122

9.2. SCREENING TOXICOLOGIC. DETERMINAREA TOXICITĂŢII ACUTE 123

9.2.1. Material și metode 123 9.2.2. Rezultate și discuții 123

9.2.3. Concluzii 124

9.3. EVALUAREA UNOR PARAMETRI CLINICI, BIOCHIMICI ȘI HEMATOLOGICI PE

MODEL DE DIABET ZAHARAT

125

9.3.1. Material și metode 125

9.3.1.1. Inducerea diabetului zaharat 125

9.3.1.2. Organizarea protocolului de lucru 126 9.3.1.3. Monitorizarea parametrilor clinici 127

4

9.3.1.4. Evaluarea parametrilor biochimici 127

9.3.1.5. Evaluarea parametrilor hematologicici 130 9.3.2. Rezultate şi discuţii 130

9.3.2.1. Evaluarea parametrilor clinici 130

9.3.2.2. Evaluarea parametrilor biochimici 133

9.3.2.3. Evaluarea parametrilor hematologici 140 9.3.3. Concluzii 142

9.4. STUDIU HISTOPATOLOGIC 144

9.4.1. Material şi metode 144 9.4.2. Rezultate și discuții 145

9.4.3.Concluzii 150

CAPITOLUL 10

CONCLUZII 151

BIBLIOGRAFIE 153

ANEXA 1-LUCRĂRI PUBLICATE ÎN TIMPUL STAGIULUI DOCTORAL 165

5

ABREVIERI

ABTS

ADA

AGEs

ALT

AST

CE 50

CHEM

CLMW

CMMW

CV

CR

DAG

DCCT

DV

DL 50

DMFA

DMSO

DPP IV

DPPH

DZ 1

DZ 2

EMA

FDA

GLP-1

GIP

HbA1c

HDL

HEM

HLA

IR

LDH

LDL

MAP

MBG

MPV (fL)

NAD

Neut W-LCC

Neut W-LCR %

NF-KB

OAT3

OCT2

OMS

PAI 1

2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (eng.)

American Diabetes Association (eng.)

Advanced Glycation End-Products (eng.)

Alaninaminotransferaza

Aspartataminotransferaza

Concentraţia eficientă

Concentraţia medie de hemoglobină

Chitosan Low Molecular Weight (eng.)

Chitosan Medium Molecular Weight (eng.)

Coeficient de variaţie

Corpusculi renali

Diacilglicerol

Diabetes Control and Complications Trial (eng.)

Deviaţie standard

Doza letală 50

Dimetilformamidă

Dimetilsulfoxid

Dipeptidil peptidaza IV

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (eng.)

Diabet zaharat de tip 1

Diabet zaharat de tip 2

European Medicines Agency (eng.)

Food and Drug Administration (eng.)

Glucagon Like Peptide-1(eng.)

Glucose Insulinotropic Peptide (eng.)

Hemoglobina glicozilată

High Density Lipoprotein (eng.)

Hemoglobina eritrocitară medie

Human Leucocyte Antigen (eng.)

Insulino rezistență

Lactat dehidrogenaza

Low Density Lipoprotein (eng.)

Mitogen Activated Protein (eng.)

Membrană bazală glomerulară

Volum trombocitar mediu

Nicotinamide Adenine Dinucleotide (eng.)

Număr absolut de neutrofile

Număr procentual de neutrofile

Factor nuclear Kappa B

Organic Anion Transporter 3 (eng.)

Organic Cation Transporter 2 (eng.)

Organizația Mondială a Sănătății

Plasminogen Activator Inhibitor 1(eng.)

6

PARP

PCT

PDW

P-LCR

PPAR

RDW-CV

RDW-SD

RE

RI

ROS

SCF

SGF

SIF

SOD

TF

TGF- β

TMS

TNF-

TPP

TTGO

TZD

UKPDS

VEGF

VEM

VLDL

Polimerază

Platelet Distribution Width (eng.)

Macrotrombocite

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (eng.)

Red Cell Distribution Width - Coefficient Variation (eng.)

Red Cell Distribution Width – Standatrd Deviation (eng.)

Reticul endoplasmatic

Receptor specific pentru insulină

Reactive Oxygene Species (eng.)

Simulated Colonic fluid (eng.)

Simulated Gastric Fluid (eng.)

Simulated Intestinal Fluid (eng.)

Superoxid dismutaza

Factor tisular

Transforming Growth Factor β (eng.)

Tetrametil silan

Factorul de necroză tumorală

Tripolifosfat pentasodic

Testul oral de toleranță la glucoză

Tiazolidindione

United Kingdom Prospective Diabetes Study (eng.)

Vascular Endothelium Growth Factor (eng.)

Volum eritrocitar mediu

Very Low Density Lipoprotein (eng.)

7

Prezenta teză de doctorat este ilustrată prin 63 figuri şi 35 tabele. Rezumatul include un

număr limitat din totalul acestora, menţinând numerotarea din teză.

Rezultatele ştiinţifice obţinute în cadrul sudiilor doctorale au putut fi realizate şi datorită

statutului de bursier în cadrul proiectul ’’Burse doctorale pentru creşterea competitivităţii în

domeniul medical şi farmaceutic” POSDRU/88/1.5/S/58965, pe care l-am avut în perioada 2010-

2013.

Formarea mea ca cercetător, iniţiată în cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie

Grigore T. Popa Iaşi, Facultatea de Farmacie, disciplina de Chimie farmaceutica fost completată

prin stagiul de mobilitate transnaţională realizat la University of Ghent, Department of Organic

Chemistry, Polymer Research Group, Belgium.

Sincere mulţumiri şi cele mai alese sentimente de recunoştinţă pentru întrega contribuţie

în formarea mea profesională:

D-nei Prof. dr. Lenuţa Profire

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Grigore T. Popa” Iaşi

D-ului Prof. dr. Peter Dubruel

Universitatea din Ghent, Departamentul de Chimie organică, Chimia Polimerilor şi a

Biomaterialelor, Belgia

D-nei Prof. dr. Elena Cătălina Lupușoru


D-nei Prof. dr. Irina Draga Căruntu


8

MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

PERSONALE

Diabetul zaharat (DZ) este o afecţiune metabolică cronică,

considerată a fi o problemă majoră de sănătate în întreaga lume şi o povară socio-economică extraordinară.

Conform OMS, la nivel mondial diabetul zaharat cauzează anual

aproape 4 milioane de decese, în timp ce alte 1,5 milioane de cazuri noi sunt diagnosticate. Se estimează că până în anul 2025, numărul bolnavilor

de diabetici va depăşi cifra de 380 de milioane, diabetul zaharat de tip 2

(non-insulinodependent) (DZ 2) reprezentând aproximativ 90% din cazurile diagnosticate.

Această maladie este considerată una din cele cinci cauze de

mortalitate la nivel mondial datorită complicaţiilor micro- şi

macrovasculare care apar şi care se cronicizează sub acţiunea hiperglicemiei.

Din păcate, în ciuda varietăţii de tratamente disponibile în prezent,

majoritatea pacienţilor nu-şi pot controla corespunzător glicemia. Succesul medicamentelor antidiabetice orale este limitat de mecanismul lor de

acţiune, care se adresează adesea simptomelor diabetului zaharat, şi nu

cauzelor care o generează. Aceste medicamente pot avea, de asemenea, efecte secundare nedorite. De exemplu, între 2,5% - 17,5% dintre pacienţii

trataţi cu sulfoniluree prezintă oscilaţii ale glicemiei (hipoglicemie majoră

şi minoră), în timp ce problemele gastro-intestinale afectează până la 63%

dintre pacienţii trataţi cu metformin, 36% cu tiazolidindione şi 30% cu acarboză. Edemul periferic s-a înregistrat la 26% dintre pacienţii trataţi cu

tiazolidindione, iar creşterea greutăţii corporale de la 1 la 5 kg este

comună, atât terapiei cu sulfoniluree cât şi cu tiazolidindione. Aceste efecte secundare pot avea un impact negativ asupra răspunsului pacientului

la tratament, rezultând în creşterea nivelului de hemoglobină glicozilată

(HbA1c) şi a riscului de spitalizare şi mortalitate.

Totodată, costurile economice pentru tratarea acestei afecțiuni sunt enorme. Federaţia Internaţională de Diabet apreciază că diabetul a costat

economia mondială cel puţin 376 miliarde de dolari în 2010, ceea ce

reprezintă 11,6% din totalul cheltuielilor de asistenţă medicală la nivel mondial. Până în 2030, costul este de aşteptat să depăşească 490 bilioane

9

de dolari. Din aceste motive, dezvoltarea de noi medicamente

antidiabetice, mai active, mai sigure şi la costuri mai mici este o

preocupare majoră a cercetătorilor (Buse J.B. et al., 2010). Scopul cercetărilor personale a fost sinteza și evaluarea biologică

a unor noi compuși heterociclici ca potențiali agenți terapeutici în

tratamentul diabetului zaharat tip 2. Compușii proiectați combină două entități structurale diferite - nucleul xantinic cu cel tiazolidinic.

Argumentele care au stat la baza proiectării compuşilor originali

sunt următoarele:

Studii recente au arătat că derivații cu structură xantinică sunt

ţinte importante pentru o serie de modulări structurale, oferind o

selectivitate bună pentru DPP IV. Cel mai recent inhibitor DPP IV

introdus în terapeutică este linagliptina, un inhibitor non-peptidomimetic cu structură xantinică, care reduce valoarea HbA1c

cu 0,6-0,7%, în raport cu placebo (Neumiller J.J., 2012).

Pe de altă parte nucleul de tiazolidină este prezent, sub formă de

tiazolidindionă, în structura pioglitazonei şi rosiglitazonei (Derosa G. and Maffioli P., 2010). Ca agonişti ai receptorilor PPARγ

(nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor

gamma), aceste medicamente reduc rezistenţa la insulină în ficat şi

ţesuturile periferice, cresc concentraţia glucozei insulino-dependente şi reduc gluconeogeneza (Yessoufou A. and Wahli W.,

2010; Barros C.D. et al., 2010). Pe de altă parte, derivaţii de

tiazolidină prezintă efecte antioxidante care ar putea fi eficiente în terapia DZ tip 2 (Kushwaha S.P. et al., 2011).

Pe baza argumentelor prezentate, compuşii sintetizați au toate premisele teoretice de a acţiona ca medicamente “multi-ţintă”. Aceştia ar

putea modula concentraţia incretinelor prin inhibarea activităţii enzimei

DPP IV, reduce rezistenţa periferică la insulină ca agonişti PPAR şi de asemenea ar putea să acţioneaze ca agenţi antioxidanţi.

Pentru realizarea cercetărilor personale s-a avut în vedere următoarele obiective:

Sinteza, caracterizarea și evaluarea biologică a unor noi derivați de

tiazolidin-4-onă cu structură xantinică, obiectiv în cadrul căruia s-a

realizat:

http://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_receptor

10

optimizarea metodelor de preparare a compuşilor intermediari

și finali în vederea obţinerii lor în randamente ridicate şi

puritate avansată; caracterizarea fizico-chimică a compușilor intermediari și finali

sintetizați (formula moleculară, temperatura de topire,

solubilitate, randament); confirmarea structurii chimice a compuşilor sintetizaţi prin

metode spectrale (IR, 1H-RMN şi

13C-RMN);

evaluarea potentialului antioxidant al derivaților de tiazolidin-4-onă prin metode in vitro (capacitatea totală antioxidantă,

puterea reducătoare, capacitatea de inhibare a radicalilor liberi

DPPH și ABTS);

stabilirea profilului toxicologic al compuşilor sintetizaţi prin determinarea dozei letale 50;

evaluarea parametrilor biochimici și hematologici şi a

potențialului antidiabetic pe model de diabet indus la șobolan cu streptozptocin;

studii histopatologice ale fragmentelor de țesut recoltate de la

organele țintă. Îmbunătățirea profilului farmacotoxicologic al celor mai activi

compuși utilizând matrici polimerice, obiectiv în cadrul căruia s-a realizat:

prepararea de microparticule pe bază de chitosan şi

caracterizarea lor fizico-chimică; înglobarea celor mai activi compuși în microparticule pe bază

de chitosan;

evaluarea profilului de eliberare a substanţei active prin teste in vitro;

determinarea capacităţii de biodegradare in vitro a matricelor

obţinute;

evaluarea parametrilor biochimici și hematologici, și a potențialului antidiabetic pe model de diabet indus la șobolan

cu streptozptocin;

studii histopatologice pe fragmente de ţesut recoltate de la organele țintă.

11

CONTRIBUȚII PERSONALE

Capitolul 6. SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ

A UNOR NOI DERIVAȚI DE TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU

STRUCTURĂ XANTINICĂ

Folosind ca model structural teofilina (1,3-dimetil-xantina) s-au

realizat o serie de modulări structurale la atomul de azot din poziția 7, ceea

ce a avut drept rezultat obținerea a 8 noi compuși intermediari și a 21 de noi compuși finali, derivați de benzilidentiazolidin-4-onă cu structură

xantinică (Fig. 6.1).

N

N N

N -

O

O

H3C

CH3

N

N N

N

O

O

H3C

CH3

CH2COOC2H5

N

N N

N

O

O

H3C

CH3

H2C C

O

NH NH C NH

S

.

C6H4

N

N N

N

O

O

H3C

CH3

CH2CONHNH2

N

N N

N

O

O

H3C

CH3

H2C C

O

NH NN

C O

CH2S

1 2 3

4a, 4b, 4c 5a, 5b, 5c

N

N N

N

O

O

H3C

CH3

H2C C

O

NH NN

C O

CS CH

Na+

6a1-7, 6b1-7, 6c1-7

R1 = H, Cl;

R2 = H, F(4), Cl(4), Br(4), OH(4), N(CH3)2(4), NO2(2)

R1C6H4 R1

R2

R1

1

2

3

45

67

8 9

101112

1314 15

16

1718

20

2122

23

24

19

25

H2N NH2.H2O+

OHC+

Cl CH2 CO

OC2H5

+ - NaCl

N C SR1+ ClCH2COCl+

R2

Fig. 6.1. Schema generală de obținere a derivaților de tiazolidin-4-onă cu

structură xantinică.

Compușii sintetizați se prezintă sub forma unor pulberi cristaline

formate din cristale aciculare / romboedrice / plăci cristaline, de culori

diferite. În urma optimizării metodei de sinteză s-au obținut în randamente bune iar prin purificare prin recristalizare repetată din diferiţi solvenţi

organici se topesc în intervale de maxim 3 C (Tabel 6.5).

12

Tabel 6.5. Caracteristicile fizico-chimice ale derivaților 2-{2-[2-(1,3-

dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(fenil)-5-(4-R2-benziliden) tiazolidin-4-ona (6a1-7).

N

N N

N

O

O

H3C

CH3

H2C C

O

NH NN

C O

CS CH

6a1-7, 6b1-7, 6c1-7

R2

R1

Nr.

comp R2

Formulă

moleculară /

Masă relativă

η

(%) P.t. (

0C) Solubilitate

6a1 -H(4)

C25H21N7O4S

515,5

72 260-262

solubil la cald în alcool etilic

96%, dioxan, alcool propilic,

alcool izopropilic, DMFA,

DMSO, insolubil în apă, alcool

etilic 50%, alcool metilic,

cloroform, acetonă, benzen,

eter etilic, HCl 100 g/L, NaOH

100 g/L.

6a2 -F(4)

C25H20N7O4SF

533,5

70 263-265


96%, alcool metilic, acetonă,

dioxan, DMFA, DMSO,

insolubil în apă, alcool etilic 50%, cloroform, alcool

propilic, alcool izopropilic,

benzen, eter etilic, HCl 100

g/L, NaOH 100 g/L.

6a3 -Cl(4)

C25H20N7O4SCl

549,9

74 235-237


96%, acetonă, dioxan, alcool

propilic, alcool izopropilic,

DMFA, DMSO, insolubil în

apă, alcool 50%, alcool

metilic, cloroform, benzen,

13

eter etilic, HCl 100g/L, NaOH

100 g/L.

6a4 -Br(4)

C25H20N7O4SBr

594,4

62 258-260


96%, cloroform, dioxan,

DMFA, DMSO, benzen,

insolubil în apă, alcool etilic

50%, alcool metilic, acetonă,

alcool izopropilic, alcool

propilic, eter etilic, HCl 100

g/L, NaOH 100 g/L.

6a5 -OH(4)

C25H21N7O5S

531,5

78

255-257

solubil la cald în alcool etilic 96%, alcool metilic, acetonă,

dioxan, alcool propilic, alcool

izopropilic, DMFA, DMSO,

insolubil în apă, alcool etilic

50%, cloroform, benzen, eter

etilic, HCl 100 g/L, NaOH 100

g/L.

6a6

-

N(CH3)2(4)

C27H26N8O4S 558,6

88 255-257


96%, alcool metilic,

cloroform, acetonă, dioxan,

DMFA, DMSO, benzen,

insolubil în apă, alcool etilic 50%, alcool propilic, alcool

izopropilic, eter etilic, HCl 100

g/L, NaOH 100 g/L.

6a7 -NO2(2)

C25H20N8O6S

560,5

91 247-250


96%, alcool metilic, dioxan,

alcool propilic, alcool

izopropilic, DMFA, DMSO,

benzen, insolubil în apă, alcool

etilic 50%, cloroform, acetonă,

eter etilic, HCl 100 g/L,

NaOH100g/L

14

Capitolul 7. CONFIRMAREA STRUCTURII CHIMICE A

COMPUŞILOR SINTETIZAŢI

Confirmarea structurii chimice reprezintă o etapă importantă în

caracterizarea fizico-chimică a compușilor organici întrucât oferă

argumentele științifice ce validează proiectarea și sinteza organică.

7.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

7.2.1. Spectroscopia în infraroșu

Formarea esterului etilic al acidului teofilin-acetic este confirmată în spectrul IR prin identificarea benzilor de absorbție caracteristice grupării

ceto (C=O) din structura esterului ca o bandă de absorbţie îngustă, liberă,

de intensitate mare la lungimea de undă λ=1752 cm-1. Prezenţa grupărilor

iminice (-C=N) şi aminice terţiare (C-N ), din structura xantinică, este

confirmată prin benzi de absorbţie intense, asociată în cazul grupării C=N

şi liberă pentru gruparea C-N , de lăţimi medii cu frecvenţa caracteristică la lungimea de undă λ=1643 cm

-1, respectiv λ=1213 cm

-1.

Grupările funcţionale metil (atât din structura dimetilxantinică cât

și din cea esterică), și metilen, imprimă vibrații de deformare simetrică, identificate în spectru sub formă de benzi de absorbţie libere, înguste, de

intensitate medie, la lungimile de undă λ=1369 cm-1, respectiv λ=1429 cm

-

1. Gruparea C-O-C din structura esterului prezintă o bandă de absorbţie

liberă, îngustă, de intensitate medie cu frecvenţa caracteristică la lungimea de undă λ=1294 cm

-1.

Reacționarea teofilin-acetatului de etil cu hidratul de hidrazină este

susținută prin prezenţa în spectrul IR a benzilor de absorbţie libere, de lăţime medie şi intensitate mică, specifice hidrazidei, la lungimile de undă

λ=3296 cm-1

și 3188 cm-1

.

Spectrele IR ale tiosemicarbazidelor cu structură xantinică (4a-c),

obținute prin tratarea hidrazidei xantinice (3) cu izotiocianați aromatici (fenilizotiocianat, 4-clorfenilizotiocianat și 4-bromfenilizotiociant)

prezintă benzile de absorbție carcateristice grupării tiono (C=S) în

intervalul 1160-1188 cm-1

, și nucleului aromatic. Nucleul aromatic s-a identificat prin benzile de absorbţie corespunzătoare vibraţiilor de alungire

15

ale grupării funcţionale –C=C- (două benzi, înguste, de intensitate medie

situate în regiunea 1520-1600 cm-1

şi ale vibraţiilor de alungire ale

legăturii Csp2-H din gruparea funcţională =C-H (bandă lată, de intensitate slabă prezentă în regiunea 3012-3040 cm

-1. În plus, în spectrul acestor

compușilor 4b, 4c vibraţia de valenţă a legăturii C-Cl, respectiv C-Br

imprimă benzi de absorbţie înguste, de intensitate medie, libere situate la lungimea de undă 825 cm

-1, respectiv 667 cm

-1.

În spectrul IR al derivaților de tiazolidin-4-onă cu structură

xantinică (5a-c), formați în urma reacției de ciclizare a tiosemicarbazidelor corespunzătoare (4a-c) cu clorura acidului cloracetic, nucleul de tiazolidin-

4-onă a fost pus în evidenă prin identificarea benzilor de absorbție

caracteristice legării C-S în regiunea 665-695 cm-1

și grupării cetonice din

ciclu de tiazolidin-4-onă (C=O) în regiunea 1694-1701 cm-1

. Condensarea derivaților de tiazolidin-4-onă cu structură xantinică

(5a-c) cu diferite aldehide aromatice (benzaldehida, 4-flour/4-clor/4-

brom/4-hidroxi/4-dimetilamino-benzaldehida, 2-nitro-benzaldehida) este confirmtă prin apariția în spectrul derivaților de benziliden-tiazolidin-4-

onă (6a1-7, 6b1-7, 6c1-7) a benzilor de absorbție caracteristice substituenților

de pe nucleul aromatic. Astfel vibraţia de alungire datorată legăturii halogenului F a determinat apariţia unei benzi de absorbţie de intensitate

medie în intervalul 1149-1153 cm-1

. Frecvenţele vibraţiei de alungire

datorate halogenilor Cl şi Br s-au înregistrat în intervalele 759-804 cm-1

respectiv 635-660 cm-1

. Poziţia benzii de absorbţie înguste, de intensitate medie, specifice a legăturii -OH fenolice se află în domeniul 3240-3318

cm-1

. Derivații benziliden-tiazolidinici obținuți prin condensarea 4-

N(dimetilamino)benzaldehidei cu tiazolidin-4-onă corespunzătoare au prezentat o intensificare a benzilor de absorbţie de intensitate medie

datorate vibraţiei de deformare simetrică a grupărilor metil (-CH3) care

apar în intervalul 1344-1376 cm-1

. Pentru nitroderivaţii corespunzători s-a

observat prezenţa în spectrul IR a a două benzi intense datorate vibraţiilor de alungire cuplate ale legaturilor NO din grupările -NO2, vibraţie de

alungire simetrică νsim cu bandă de absorţie care s-a situat în intervalul

1323-1376 cm-1

şi vibraţie de alungire asimetrică νasim cu banda de absorbţie care a apărut în intervalul 1487-1499 cm

-1.

16

Spre exemplificare în Fig. 7.5 se prezintă caracteristicile spectrale

ale compusului 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-fenil-5-

(2-nitrobenziliden)tiazolidin-4-ona (6b7).

Fig. 7.5. Spectru IR al 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-

il)acetil]hidrazono}-3-fenil-5-(2-nitro-benziliden)tiazolidin-4-ona (6b7).

7.2.2. Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară

În spectrul 1H-RMN al esterului etilic al acidului teofilin-acetic s-

au identificat 5 semnale datorate protonilor din structura xantinică și lanțul esteric:

un semnal puternic, de tip singlet datorat protonului de la gruparea

N-CH=N ce prezintă deplasarea chimică la 8,06 ppm; un semnal mai slab, de tip singlet, specific celor doi protoni

aparţinând grupării metilen ( N-CH2-C=O) înregistrat la 5,17 ppm.

semnalul de la 4,16 ppm, datorat celor doi protoni din gruparea

metilen din restul esteric (-CH2-CH3) şi care apare ca un multiplet semnalul de la 1,22 ppm, triplet specific celor trei protoni ai

grupării metil (CH3) din restul esteric, indică o dezecranare

puternică explicată prin efectul exercitat în spaţiu de gruparea

esterică; două semnale puternice, de tip singlet, (3,30 ppm, 3,20 ppm) apar

pentru protonii aparţinând celor două grupări metil din structura

xantinică. Datele spectrale obținute prin înregistrarea spectrului

1H-RMN al

hidrazidei xantinice (3), confirmă formarea compusului prin dispariția

17

semnalelor caracteritice grupării etilen (CH2 – 4,28 ppm, CH3 – 1,24 ppm)

și apariția semnalelor protonilor grupării hidrazinice (-NH-NH2), la 7,99

ppm respectiv 2,09 ppm. Obţinerea tiosemicarbazidelor (4a-c) este confirmată prin

identificarea în spectrul 1H-RMN a semnalelor caracteritice protonilor

nucleului aromatic. Astfel în spectrul compusului 4a obținut prin tratarea hidrazidei xantinice cu fenilizotiocianatul, protonii nucleului aromatic apar

ca două dublete la 7,47 (CH= din poziţia orto), 7,35 (CH= din poziţia

meta) și un triplet la 7,19 (CH= din poziţia para). Pentru compușii 4b și 4c, obținuți în urma reacției cu 4-clor/4-brom fenilizotiocianat, protonii

nucleului aromatic au fost identificați ca dublete în regiunea 7,51 ppm,

7,41 ppm (4b) respectiv 7,53 ppm, 7,46 ppm (4c). Deplasările mai mari

înregistrate comparativ cu cele pentru compusul 4a sunt datorate efectului atrăgător de electroni al halogenilor şi implicit a ecranării slabe.

Ciclizarea tiosemicarbazidelor (4a-c) cu clorura acidului cloracetic

este confirmată prin identificarea în spectrul 1H-RMN a semnalelor

caracteristice celor doi protoni de la gruparea CH2 din poziţia 5 a ciclului de tiazolidin-4-onă format. Astfel în spectrul compuşilor (5a-c) s-au

înregistrat deplasări chimice ale celor doi protoni de la gruparea CH2 care

apare la frecvenţă mai joasă în intervalul 3,57-3,78 ppm, efect datorat învecinării cu atomul de sulf care prezintă caracter atrăgător de electroni

diminuat.

Formarea derivaţilor benzilidentiazolidinici cu nucleu xantinic

(6a1-7, 6b1-7, 6c1-7) este dovedită prin prezenţa în spectrul 1H-RMN a

protonului de la gruparea C=CH din ciclul tiazolidinic, care prezintă

semnal în intervalul de frecvenţe 7,04-7,48 ppm. În spectrul 13

C-RMN al

derivaţilor 6a1-7, 6b1-7, 6c1-7, au fost identificaţi carbonii radicalului aril nou introdus şi carbonii C11 şi C13 implicați în dubla legătură rezultată în urma

reacției de condensare. Prezenţa acestor semnale confirmă încă o dată

condensarea benzaldehidelor la ciclul tiazolidinic. Semnalele atomilor de

carbon C11 şi C13 apar în intervalele 117,08-119,78 ppm (pentru C11) şi 138,51-143,07 ppm (pentru C13), caracterizate de o dezecranare puternică

datorată învecinării C11 cu atomul de sulf şi cu cel de oxigen, şi a C13 cu

nucleul aril (efect puternic atrăgător de electroni). Totodată în spectrele 13

C-RMN au fost înregistrate semnalele caracteristice atomilor de carbon

18

prezenţi în nucleul xantinic, lanțul acetil-hidrazinic, ciclului tiazolidinic şi

celor două nuclee aromatice.

Spre exemplificare in Fig. 7.10 și 7.11 sunt prezentate spectrul 1H-

RMN şi spectrul 13

C-RMN al compusului 2-{2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-

il)acetil]hidrazono}-3-(fenil)-5-(benziliden) tiazolidin-4-ona (6a1).

Fig.7.10. Spectrul 1H-RMN al 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-


Fig.7.11. Spectrul 13

C-RMN al 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-


Informaţiile structurale furnizate prin înregistrarea spectrelor IR, 1H-RMN şi

13C-RMN au validat obţinerea derivaţilor benziliden-

tiazolidinici şi implicit succesul sintezelor realizate.

19

Capitolul 8. DEZVOLTAREA UNOR MICROSISTEME PE BAZĂ

DE CHITOSAN CU APLICABILITATE ÎN TERAPIA

DIABETULUI ZAHARAT Sistemul de eliberare controlată ales pentru creşterea

biodisponibilităţii substanţei active este reprezentat de sistemul matrice,

preparat sub formă de microparticule în care principiul activ este dispersat uniform în faza polimerică-chitosanul. Mecanismul de eliberare a

substanţei active constă în eliberarea controlată de difuzie (prin porii

membranei) şi eliberarea controlată chimic (prin degradarea enzimatică a matricei de chitosan).

8.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

În vederea obţinerii unor microparticule de chitosan stabile atât în soluţia agentului de reticulare cât şi după uscare au fost modificate

concentraţiile şi condiţiile de lucru. Astfel s-a variat concentraţia şi masa

moleculară a polimerului şi concentraţia agentului de reticulare ionică –TPP. S-a lucrat cu chitosan cu greutate moleculară medie (CMMW) și

chitosan cu greutate moleculară mică (CLMW), în concentrație de 1% și

2%. Concentrațiile de TPP utilizate în studiu au fost de 2%, 5% și 10%. Cele mai stabile microparticulele au fost cele obținute în

următoarele condiții: chitosan cu greutate moleculă medie, concentrația

soluției de chitosan de 2%, TPP 5%.

Microparticulele de chitosan au fost utilizate ca matrici pentru înglobarea a doi compuși sintetizați, din grupa benziliden-tiazolidin-4-onă:

2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(4-bromfenil)-5-(4-

clorobenziliden)tiazolidin-4-ona (6c3) și 2-{2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil] hidrazono}-3-(4-bromfenil)-5-(4--hidroxibenziliden)tiazolidin-4-

ona (6c5), în vederea îmbunătățirii profilului lor farmacocinetic și

farmacotoxicologic.

8.2.2.1. Eficienţa încapsulării substanţei active în microparticule de

chitosan

În vederea stabilirii concentrației optime de substanță activă, care să asigure o încapsulare maximă și eficientă, cei doi compuși (6c3, 6c5) au

fost utilizați fiecare dintre ei în trei concentrații de 0,5 mg/mL (CH - 6c3

A), 2,5 mg/mL (CH - 6c3 B), 5 mg/mL (CH - 6c3 C) şi respectiv 2,5 mg/mL

(CH - 6c5 D), 5 mg /mL (CH - 6c5 E), 7,5 mg/mL (CH - 6c5 F). Cantitatea

20

de substanță activă înglobată în microparticulele de chitosan, respectiv

eficiența procesului de încapsulare, s-a determinat spectrofotometric pe

baza curbei de calibrare, stabilită pentru fiecare compus studiat (6c3 și 6c5). Curba de calibrare s-a trasat prin monitorizarea creşterii absorbanţei în

raport cu creşterea concentraţiei substanței active în soluție.

Din analiza rezultatelor prezentate în Fig. 8.2 se constată că

procesul de înglobare a fost eficient, valoarea încapsulării fiind direct proporţională cu concentraţia derivaţilor de benziliden-tiazolidin-4-onă cu

structură xantinică, variind între 68,98% și 90,89%.

Fig. 8.2. Eficienţa încapsulării compușilor 6c3 și 6c5 la diferite concentrații: CH - 6c3, 0,5 mg/mL - A, 2,5 mg/mL - B, 5 mg/mL - C); CH-

6c5, 2,5 mg/mL - D, 5 mg/mL - E, 7,5 mg/mL - F.

8.2.2.2. Morfologia microparticulelor de chitosan-substanță activă

Studiul morfologic a evidențiat faptul că microparticulelor de

chitosan au conturul regulat, suprafaţa sferică şi uşor rugoasă, mărimea

acestora fiind de aproximativ 279 μm în stare uscată, prezentând o relativă transparenţă. Odată cu creșterea concentrației de substanţă activă (6c3, 6c5)

în matricea de chitosan, sfericitatea microparticulelor se reduce, conturul

devine neregulat, suprafaţa netedă şi are loc apariţia unor fisuri pe suprafaţa microsferelor observate prin intermediul microscopului

electronic cu scanare. Acest fenomen este explicat prin caracterul puternic

hidrofob şi cristalinitatea accentuată a celor două substanţe încorporate. Culoarea microparticulelor chitosan-substanţă activă este alb-gălbuie iar

aspectul este mat.

21

Particularităţile privind morfologia microparticulelor de chitosan -

substanță activă, în funcție de concentrația de substanță activă folosită sunt

prezentate în Fig. 8.5.

Fig. 8.5. Imigini SEM ale microparticulelor de chitosan-substanță

activă CH - 6c3 A (I), CH - 6c3 B (II), CH - 6c3 C (III); CH - 6c5 D (IV), CH - 6c5 E (V), CH - 6c5 F (VI), CH (VII).

8.2.2.3. Testul de umflare

Capacitatea matricelor polimerice de a reține apa a fost testată în mediu de apă distilată şi mediu cu pH acid (1,6), ce simulează mediul

gastric uman, pentru a observa comportarea microparticulelor în mediul

specific eliberării substanței active in vivo. Comportamentul microparticulelor de chitosan și chitosan-

substanță activă privind capacitatea de reţinere a apei este prezentat in

Fig.8.6. (apă distilată) și Fig. 8.7 (mediu cu pH acid). Rezultatele testului de umflare a microparticulelor de chitosan

cu/fără substanță activă încapsulată efectuat în apă distilată a evidențiat

faptul că puterea microparticulelor încărcate cu substanță activă de a reține

apa este mult diminuată (grad de umflare de aproximativ 40%) comparativ

22

cu cea a microparticulelor de chitosan (aproximativ 120%) datorită

caracterului hidrofob al derivaților de benziliden-tiazolidin-4-onă cu

structură xantinică (6c3, 6c5), care reduc hidrofilia matricei de chitosan. Acest efect de diminuare a cantităţii de apă reţinută este direct proporțional

cu creşterea concentrației substanţelor active hidrofobe - 6c3, 6c5 din

matricea polimerică. Totodată s-a observat că pentru ambele tipuri de microparticule (CH - 6c3, CH – 6c5) echilibrul termodinamic, referitor la

capacitatea de hidratare, se atinge la 2 ore de la începerea experimentului și

se menține pe toată durata acestuia.

Fig. 8.6. Capacitatea de reţinere a apei a microparticulelor CH - 6c3 (I) şi

CH - 6c5 (III) - apă distilată.

Fig. 8.7. Capacitatea de reţinere a apei a microparticulelor CH - 6c3 (II) şi

CH - 6c5 (IV) - mediu cu pH acid.

23

Studiul gradului de hidratare în mediu cu pH acid, similar

mediului gastric a evidențiat o îmbunătăţire a capacităţii de umflare a

microparticulelor (în cazul microparticulelor CH – 6c3, fiind de aproximativ 2,7 ori mai mare la concetraţia 0,5 mg/mL), comparativ cu cel

obținut în apă distilată, astfel gradul de hidratare a fost mai intens şi a

prezentat o creştere continuă şi gradată a procentului de umflare atât pentru microparticulele de chitosan fără substanţa activă încorporată cât şi pentru

microparticulele chitosan-substanță activă (CH - 6c3, CH – 6c5).

8.2.2.4. Analiza spectrală IR a microparticulelor de chitosan-substanță

activă

În spectrul IR înregistrat pentru microparticule de chitosan-substanță activă, au fost identificate benzile de absorbție specifice

grupărilor funcționale ale derivaţilor de benziliden-tiazolidin-4-onă cu

structură xantinică. Spectrele IR ale microparticulelor de CH - 6c3, respectiv CH – 6c5,

la diferite concentrații comparativ cu chitosanul și substanțele active (6c3,

6c5) sunt prezentate in Fig. 8.8.

Fig. 8.8. Spectrul IR al microparticulelor de chitosan CH – 6c3 A, CH –

6c3 B, CH – 6c3 C; CH – 6c5 D, CH – 6c5 E, CH – 6c5 F; CH.

Astfel în spectrul IR al microparticulelor de CH-6c3 şi CH-6c5 au

fost identificate benzile de absorbţie de intensitate medie determinate de

24

vibraţiile de deformare în afara planului ale legăturilor C-H din nucleul

benzenic para substituit şi de vibraţia de alungire asimetrică a legături

duble cumulate (C=C), prezente în intervalele 2993-2995, 1593-1594, 1543-1545 cm

-1. Benzile de absorbţie specifice grupării (-NH-) au fost

identificate la lungimile de undă situate în intervalul 3176-3244, 3111-

3177 cm-1

. Bandă de absorbţie atribuită vibraţiei de valenţă a grupării (C-

S-C) a fost înregistrată în intervalul 680-682 cm-1. În spectrul IR al

microparticulelor CH-6c3 s-au înregistrat benzi de absorbţie înguste, de

intensitate medie, specifice vibraţiilor de valenţă ale legăturii C-halogen: 659 (C-Br), 793 (C-Cl). Bandă de absorbţie atribuită legăturii (C-Br) a fost

identificată la λ= 659 cm-1

şi pentru microparticulelor CH-6c5.

În urma analizei spectrale IR se poate afirma prezența substanțelor

active în microparticulele de chitosan, ceea ce constituie un argument în plus pentru încorporarea acestora în matricea polimerică.

8.2.2.5. Studiul eliberării in vitro a substanţei active din matricea polimerică

Studiul eliberării substantei active din microparticulele de chitosan

a fost realizat în trei tipuri de lichide care mimează cele trei medii biologice: mediul gastric, intestinal și colonic.

Profilul eliberării celor două substanţe active (6c5, 6c3), reprezentat

grafic în Fig. 8.9. a permis obţinerea unei imagini globale asupra profilului

farmacocinetic al microparticulelor.

Fig. 8.9. Profilul eliberării compușilor 6c3 şi 6c5 din matricea de chitosan.

În urma analizei profilului de cedare a substanţelor active de către

microparticulele de chitosan în cele trei medii de eliberare (Fig. 8.9), se

25

observă pentru ambele substanţe o eliberare diminuată (aprox. 15%) în

lichidul care mimează mediul gastric, urmată de o eliberare mai accentuată

(aproximativ 60% din cantitatea iniţială prezentă în microsferele de chitosan) în lichidul ce mimează mediul intestinal şi lipsa eliberării

substanţei active în lichidul care mimează mediul colonic sau a eliberării

unei cantităţi foarte mici care nu a putut fi detectată spectrofotometric. Eliberarea diminuată a substanţelor active în mediu care mimează lichidul

gastric poate fi explicată prin caracterul puternic hidrofob al derivaţilor 6c3

şi 6c5 care imprimă o capacitate scăzută de umflare şi un timp de aproximativ 2 ore pentru ca porii membranei polimerice să se deschidă

treptat prin creşterea în volum a microsferelor de chitosan. Această umflare

a microparticulelor de chitosan în mediu gastric a contribuit la eliberarea

mai accentuată a substanţelor 6c3 şi 6c5 în lichidul care mimează mediul intestinal şi la eliberarea unei cantităţi infime în mediul colonic, care nu a

putut fi detectată spectrofotometric.

Cedarea substanţelor active încorporate în matricea de chitosan în mediile de eliberare simulate a fost invers proporţională cu creşterea

concentraţiei de substanţă activă prezentă în microparticule. Prin urmare,

microparticulele de chitosan în care concentraţia substanţei active este de 7,5 mg/mL sunt caracterizate de o eliberare redusă a substanței active

55,97% în timp ce pentru microparticulele care conţin o cantitate redusă de

substanţă activă (0,5 mg/mL) s-a înregistrat o eliberare mult mai mare, de

91,33%.

8.2.2.6. Studiul degradării enzimatice a microparticulelor de chitosan -

substanţă activă Lizozimul, utilizat la degradarea enzimatică a microparticulelor de

chitosan-substanță activă, este o enzimă bacteriană prezentă în proporţie

mare în sucul gastric. În condițiile experimentului, degradarea enzimatică

indusă de lizozim, contribuie semnificativ la eliberarea substanţei active din matricea polimerică prin degradarea membranei polimerice.

Prin analiza rezultatelor obţinute se remarcă importanţa

concentraţiei substanţei active încorporate asupra stabilităţii microparticulei de chitosan. Astfel, se observă că microparticulele de

chitosan încărcate cu o cantitate mai mare de substanţă activă prezintă o

predispoziţie crescută la biodegradarea enzimatică.

26

Fig. 8.10. Biodegradarea enzimatică

a microparticulelor de CH-substanță

activă la diferite concentraţii.

Fig. 8.11. Modificări morfologice

ale microparticulelor: CH (I), CH -

6c5 E (II) după 7 zile.

În cazul microparticulelor de chitosan încărcate cu substanţele 6c3

şi 6c5 se observă că degradarea enzimatică are loc lent, cea mai intensă rată înregistrându-se în cazul microparticulelor ce conțin 7,5 mg/mL substanță

activă, gradul de degradare enzimatică fiind de 61,16%. În condiții

similare pentru microparticulele cu un conținut de 0,5 mg/mL substanţă

activă s-a înregistrat biodegradarea cea mai redusă în procent de 41%. Microparticulele de chitosan fără substanţa activă încorporată (CH) sunt

mai stabile la biodegradare, gradul de degradare enzimatică după 7 zile

fiind de 40,59%. Diferențele observate între microparticulele de chitosan și cele încărcate cu substanță activă sunt datorate influenţelor exercitate de

substanța activă cu caracter hidrofob asupra stabilităţii matricei

polimerice. Modificările observate în morfologia microparticulelor în urma

procesului de biodegradare au fost: un grad ridicat de rugozitate, contur

neregulat, dimensiunea microparticulelor redusă comparativ cu cea iniţială.

27

Capitolul 9. EVALUAREA BIOLOGICĂ A DERIVAȚILOR DE

TIAZOLIDIN-4-ONĂ CU STRUCTURĂ XANTINICĂ

9.1.EVALUAREA POTENȚIALULUI ANTIOXIDANT in vitro

Compușii sintetizați, derivați de tiazolidin-4-onă cu structură

xantinică au fost evaluați din punct de vedere biologic, urmărindu-se, într-o primă etapă, determinarea potențialului antioxidant, avându-se în vedere

importanța stresului oxidativ în declanșarea dar și în evoluția diabetului

zaharat. Acţiunea antioxidantă a fost determinată prin patru metode: puterea reducătoare, capacitatea totală antioxidantă, şi capacitatea de

inhibare a radicalilor liberi DPPH şi ABTS. Activitatea antiradicalică

(DPPH şi ABTS), a fost exprimată ca procent de inhibiţie (I%) a acestor

radicali şi prin calcularea valorii concentraţiei eficiente 50 (CE50 µg/mL). Puterea reducătoare şi capacitatea totală antioxidantă a compuşilor testaţi a

fost exprimată prin calcularea valorii concentraţiei eficiente 50 (CE50

µg/mL) şi prin reprezentarea grafică a valorilor absorbanţei compușilor testați, obținute la diferite concentraţii.

9.1.2. Rezultate şi discuţii

9.1.2.1. Puterea reducătoare

Rezultatele studiului privind puterea reducătoare a compuşilor

testaţi sunt prezentate în Tabelul 9.1 și Fig. 9.2. Prin creşterea concentrației de substanță activă în probă a avut loc o creştere evidentă a puterii

reducătoare.

Modulările structurale realizate la nivelul ciclului tiazolidinic prin condensare cu diferite aldehide aromatice a condus la obţinerea unor

compuşi cu potenţial antioxidant remarcabil şi totodată diferenţiabil în

funcţie de radicalul din poziția orto sau para de pe nucleul benziliden.

Astfel valorile EC50 pentru compusul 6a5 (R2=OH) a fost de 33,72 µg/mL iar pentru compusul 6a6 (R2 = N(CH3)2) de 33,48 µg/mL, ceea ce

însemană că derivații sunt de aproximativ patru ori mai activi decât

tiazolidin-4-ona corepunzătoare seriei (5a) la care valoarea CE50 a fost de 137,78 µg/mL. În cea de a doua serie, compușii rezultați în urma

condensării cu 4-hidroxibenzaldehida (compusul 6b5) și 4-dimetilamino-

benzaldehida (compusul 6b6) au fost cei mai activi. Ei s-au dovedit a fi de 5,7 ori (6a5, CE50 = 27,21 µg/mL), respectiv 6,7 ori (6a6, CE50 = 23,68

28

µg/mL) mai activi decât tiazolidin-4-ona corespunzătoare (5b, CE50 =

155,85 µg/mL).

În cea de-a treia serie compușii rezultați în urma reacției de condensare a tiazolidin-4-onei corespunzătoare (5c) cu 4-hidroxi-

benzaldehida și 4-dimetilaminobenzaldehida au fost de 6 ori (6c5, CE50 =

23,13 µg/mL) şi respectiv 6,7 ori (6c6, CE50 = 20,44 µg/mL) mai activi decât 5c (EC50 = 137,85 µg/mL).

Tabel 9.1. Puterea reducătaore a derivaților (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a tiazolidin-4-onelor corespunzătoare (5a-c).

Comp CE50

µg/mL

Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/ml

5a 137,78 ± 0,31 5b 155,85 ± 0,97 5c 137,85 ± 0,41

6a1 109,52 ± 0,75 6b1 109,29 ± 0,54 6c1 108,86 ± 0,54

6a2 97,68 ± 0,77 6b2 102,84 ± 0,89 6c2 98,17 ± 0,72

6a3 55,75 ± 1,13 6b3 46,92 ± 0,54 6c3 59,31 ± 0,99

6a4 96,44 ± 1,19 6b4 66,16 ± 0,74 6c4 87,53± 0,85

6a5 33,72 ± 0,84 6b5 27,21 ± 0,39 6c5 23,13 ± 0,96

6a6 33,48 ± 1,14 6b6 23,68 ± 1,13 6c6 20,44 ± 0,57

6a7 58,46 ± 1,15 6b7 41,66 ± 1,39 6c7 38,86 ± 0,53

Acid ascorbic 5.75 ± 0.24

*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard.

29

Fig. 9.2. Puterea reducătoare a derivaţilor benziliden tiazolidinici cu

structură xantinică 6a1-7 (I), 6b1-7 (II), 6c1-7 (III) față de tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).

Studiul efectuat privind evaluarea puterii reducătoare a evidențiat

faptul că toţi cei 21 de compuşi finali prezintă o capacitate antioxidantă superioară tiazolidin-4-onelor corespunzătoare dar inferioară acidului

ascorbic, antioxidant de referință, la aceeaşi concentraţie.

9.1.2.2. Capacitatea totală antioxidantă

Compararea rezultatelor obținute cu cele trei serii de compuși a

evidențiat faptul că prezenţa substituentului 4-clorfenil la atomul de azot

din poziția 3 (N3) din ciclul de tiazolidin-4-onă influenează favorabil acțiunea antioxidantă, compușii din această serie (6b1-7) fiind mai activi

decât analogii lor 3-fenil (6a1-7) , respectiv 3-(4-bromfenil) (6c1-7) (tabel

9.2, fig. 9.3).

În ceea ce privește influența benzaldehidei utilizate în reacția de condensare cu formarea derivaților de benziliden-tiazolidin-4-onă,

rezultatele obținute au evideniat faptul că cei mai activi compuși au fost cei

30

rezultați în urma reacției de condensare cu 4-hidroxi-benzaldehida (6a5,

6b5, 6c5) şi 4-dimetilaminobenzaldehida (6a6, 6b6, 6c6).

Tabel 9.2. Capacitatea totală antioxidantă a derivaților de benziliden-

tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a tiazolidin-

4-onelor corespunzătoare (5a-c).

Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL Comp CE50 µg/mL

5a 124,01 ± 0,92 5b 133,28 ± 0,63 5c 136,94 ± 0,21

6a1 105,31 ± 0,25 6b1 90,89 ± 0,83 6c1 120,35 ± 0,31

6a2 99,3 ± 0,18 6b2 90,18 ± 0,87 6c2 114,14 ± 0,34

6a3 48,34 ± 0,32 6b3 43,67 ± 0,63 6c3 62,13 ± 0,92

6a4 76,46 ± 0,52 6b4 99,57 ± 2,45 6c4 89,44 ± 0,43

6a5 25,06 ± 0,51 6b5 22,84 ± 0,34 6c5 22,94 ± 0,21

6a6 31,97 ± 1,05 6b6 23,68 ± 1,13 6c6 29,37 ± 0,51

6a7 37,88 ± 0,74 6b7 26,97 ± 0,84 6c7 33,13 ± 0,41

Acid ascorbic 5,15 ± 0,15

*valorile CE50 reprezintă media a trei determinări ± deviaţia standard

Derivaţii cu radicalul hidroxil în poziţia para a nucleului benzilidenic, 6a5 (CE50 = 25,06 µg/mL), 6b5 (CE50 = 22,84 µg/mL) şi 6c5

(CE5 0= 22,94 µg/mL) s-au dovedit a fi de 4,96; 5,83 și respectiv 5,95 ori

mai activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare, 5a (CE50 = 124.01

µg/ml), 5b (CE50 = 133,28 µg/mL) și respectiv 5c (CE50 = 136,94 µg/mL). Capacitatea totală antioxidantă a analogilor 4-dimetilamino-

benziliden (6a6, 6b6, 6c6) a fost similară cu cea a derivaţilor 4-hidroxi-

benziliden, fiind de 3,87 (6a6, CE50 = 31,97 µg/mL), 5,62 (6b6, CE50 = 23,68 µg/mL) și respectiv 4,65 (6c6, CE50 = 29,37 µg/mL) ori mai activi

decât tiazolidin- 4-onele corespunzătoare.

Toţi compuşii testaţi au prezentat o acțiune antioxidantă mai redusă în comparativ cu acidul ascorbic, în acceași concentrație și în

condiții experimentale similare.

31

Fig. 9.3. Capacitatea totală antioxidantă a derivaților de benziliden-

tiazolidin-4-onă cu structură xantinică, 6a1-7 (I), 6b1-7 (II) și 6c1-7 (III), față

de tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).

9.1.2.3. Capacitatea antiradicalică față de radicalul DPPH

Activitatea de scavenger a compuşilor testaţi a variat dependent de concentraţie. Toți compușii finali obținuți (6a1-7, 6b1-7, 6c1-7) sunt mai

activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c), în capacitatea de a

reduce radicalii liberi DPPH (tabel 9.3, fig. 9.5).

Astfel compuşii din seria (6a1-7) s-au dovedit a fi de 1,27-3,57 ori mai activi (CE50 = 107,54 – 38,21 µg/mL) față de tiazolidin-4-ona

corespunzătoare (5a, CE50 = 136,6 µg/mL). Cei mai activi compuși s-au

dovedit a fi compusii 6a5 (CE50 = 25,06) și 6a6 (CE50 = (31,97), rezultați

în urma reacției de condensare cu 4-hidroxibenzaldehida, respectiv cu 4-dimetilaminobenzaldehida.

Compuşii finali din seria (6b1-7) au dovedit o capacitate de

reducere a radicalilor liberi DPPH de 1,2-3,4 ori mai ridicată (CE50 =

32

106,48 – 37,42 µg/mL) faţă de tiazolidin-4-ona corespunzătoare (5b, CE50

= 127,01 µg/mL). Compuşii cei mai activi s-au dovedit a fi cei rezultaţi în

urma condensării cu 4-hidroxibenzaldehida (6b5, CE50 = 38,93), cu 4-dimetilaminobenzaldehida (6b6, CE50 = 37,42), respectiv cu 2-

nitrobenzaldehida (6b7, CE50 = 38,83).

Compuşii finali din seria (6c1-7) s-au dovedit a fi de 1,4-3,7 ori mai

activi (CE50 = 100,34 – 38,13 µg/mL) faţă de tiazolidin -4-ona corespunzătoare (5c, CE50 = 141,33 µg/mL). Compuşii cei mai activi s-au

dovedit a fi cei rezultaţi în urma condensării cu 4-hidroxibenzaldehida

(6c5, CE50 = 38,13), respectiv cu 4-dimetilaminobenzaldehida (6c6, CE50 = 38,13).

Tabel 9.3. Acțiunea antiradicalică DPPH (EC50) a derivaților de

benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).



5a 136,6 ± 0,06 5b 127,01 ± 0,13 5c 141,33 ± 0,14

6a1 94,14 ± 0,35 6b1 106,48 ± 0,41 6c1 100,34 ± 0,31

6a2 107,54 ± 0,84 6b2 101,34 ± 0,51 6c2 93,47 ± 0,21

6a3 66,93 ± 0,83 6b3 49,92 ± 0,61 6c3 69,57 ± 0,91

6a4 77,43 ± 1,03 6b4 85,64 ± 0,71 6c4 85,82 ± 0,27

6a5 38,21 ± 0,41 6b5 38,93 ± 0,41 6c5 38,13 ± 0,15

6a6 39,58 ± 0,81 6b6 37,42 ± 0,81 6c6 38,13 ± 0,95

6a7 48,29 ± 0,41 6b7 38,83 ± 1,41 6c7 46,53 ± 0,29


33

Fig.9.5. Capacitatea de inhibare (I%) a radicalilor liberi DPPH de către

derivații de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică 6a1-7 (I), 6b1-7

(II) și 6c1-7 (III) și tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).

9.1.2.4. Capacitatea antiradicalică față de radicalul cation ABTS·+

Din analiza rezultatelor obținute și reprezentate grafic în Fig. 9.7 se observă că activitatea antiradicalică a compușilor studiați crește odată cu

concentrația, cea mai mare inhibiție înregistrându-se la concentrația de 75

µg/mL la care valoarea inhibiției a variat între 57,63%-97,31% în seria derivaţilor 6a1-7, 52,34%-92,07% în seria derivaţilor 6b1-7, respectiv

51,59%-90,31% în seria derivaţilor 6c1-7.

Datele experimetale referitoarea la valoarea CE50 (Tab. 9.4) susţin pe deplin afirmaţia că toţi derivaţii de benziliden-tiazolidin-4-onă (6a1-7,

6b1-7, 6c1-7) sunt mai activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).

Compuşii cei mai activi s-au dovedit a fi cei obţinuţi prin

condensarea tiazolidin-4-onelor cu 4-hidroxibenzaldehida (6a5, 6b5, 6c5), 4-dimetilaminobenzaldehida (6a6, 6b6, 6c6) şi 2-nitrobenzaldehida (6a7,

6b7, 6c7).

Astfel compușii 4-hidroxibenziliden (6a5, 6b5, 6c5) s-au dovedit a fi de 2,63-2,89 ori (CE50 = 25,83; 25,87 respectiv 27,28 µg/mL), cei 4-

34

dimetilaminobenziliden (6a6, 6b6, 6c6) de 2,99-3,3 ori (CE50 = 25,01; 21,23

respectiv 21,77 µg/mL) iar cei 2-nitrobenziliden (6a7, 6b7, 6c7) de 2,04-

2,15 ori (CE50 = 36,53; 31,31 respectiv 33,25 µg/mL) mai activi decât tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a, 5b, 5c).

Fig.9.7. Capacitatea de inhibare (I%) a radicalilor ABTS

+˙ de către

derivații de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7

și 6c1-7) și tiazolidin-4-onele (5a-c).

Tabel 9.4. Acțiunea antiradicalică ABTS

+˙ (CE50) a derivaților de

benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6a1-7, 6b1-7 și 6c1-7) și a

tiazolidin-4-onele corespunzătoare (5a-c).


5a 74,81 ± 0,34 5b 69,64 ± 0,31 5c 71,81 ± 0,11

6a1 47,73 ± 0,26 6b1 48,64 ± 0,41 6c1 49,03 ± 0,05

6a2 49,93 ± 0,68 6b2 41,32 ± 0,25 6c2 49,65 ± 0,31

6a3 37,74 ± 0,15 6b3 31,03 ± 0,45 6c3 48,82 ± 0,51

6a4 43,01 ± 0,82 6b4 40,57 ± 0,91 6c4 49,56 ± 0,41

6a5 25,83 ± 0,72 6b5 25,87 ± 0,71 6c5 27,28 ± 0,44

6a6 25,01 ± 0,21 6b6 21,23 ± 0,61 6c6 21,77 ± 0,71

6a7 36,53 ± 0,91 6b7 31,31 ± 0,11 6c7 33,25 ± 0,91

35



9.2. SCREENING TOXICOLOGIC. DETERMINAREA

TOXICITĂŢII ACUTE

Derivații de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică sintetizați au fost evaluați in vivo, din punct de vedere toxicologic,

determinându-se doza letală 50.

9.2.2. Rezultate și discuții

Pe baza rezultatelor prezentate în Tab. 9.5 se poate afirma că

derivații studiați se încadreaza în grupa substanţelor cu grad foarte redus de toxicitate. Compușii din seria 6c1-7, cu valori ale DL50 cuprinse în

intervalul 1468,75-1875,02 mg/kg corp au fost mai puțin toxici faţă de cei

din seria 6b1-7 care au prezentat valori ale DL50 cuprinse în intervalul

1281,25-1562,51 mg/kg corp. În seria 6c1-7 cei mai puțin toxici au fost derivaţii: 6c2 condensat cu

4-fluorbenzaldehida (DL50 = 1875,02 mg/kg corp) şi 6c7 condensat cu 2-

nitrobenzaldehida (DL50 = 1812,51 mg/kg corp). În seria 6b1-7 , compuşii cei mai puţin toxici au fost 6b4 condensat cu 4-brombenzaldehida (DL50 =

1562,51), 6b5 condensat cu 4-hidroxibenzaldehida (DL50 = 1500,01) şi

6b7 condensat cu 2-nitrobenzaldehida (DL50 = 1468,75).

Comparativ cu teofilina (DL50 = 235 mg/kg corp), utilizată ca model structural, compuşii studiați (seria 6b1-7 şi 6c1-7 ) sunt de aproximativ

6 ori mai puţin toxici (Lindamood C., et al., 1987). Față de pioglitazonă

(DL50 = 181 mg/kg corp), compus antidiabetic de referinţă cu structură de tiazolidin-2,4-dionă, compuşii sintetizaţi din seria 6b1-7 şi 6c1-7 sunt de

aproximativ 8 ori mai puţin toxici (USP, 2010).

Tabel 9.5. Valorile dozei letale (DL50 în mg/kg corp) obţinute pentru

compuşii benziliden-tiazolidin-4-onă din seriile 6b1-7, 6c1-7

Compus DL50 (mg/kg corp) Compus DL50 (mg/kg corp)

6b1 1281,25 6c1 1500,01

6b2 1437,51 6c2 1875,02

6b3 1281,25 6c3 1593,75

6b4 1562,51 6c4 1687,51

36

6b5 1500,01 6c5 1625,01

6b6 1281,25 6c6 1468,75

6b7 1468,75 6c7 1812,51

9.3. EVALUAREA UNOR PARAMETRI CLINICI, BIOCHIMICI ȘI

HEMATOLOGICI PE MODEL DE DIABET ZAHARAT

Pe baza rezultatelor obținute la screeningul toxicologic și la

studiile privind evaluarea potențialului antioxidant in vitro au fost selectați doi compuși, (2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)

-5-(4-hidroxibenziliden)tiazolidin-4-ona (6c5) (2-[2-(1,3-dimetil-xantin-7-

il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)-5-(4-clorbenziliden)tiazolidin-4-ona)

(6c3) care au fost studiați în continuare privind efectul asupra următorilor parametri:

clinici - greutate, consum de hrană, consum de apă;

biochimici - aspartataminotransferaza (AST), alaninamino-transferaza (ALT), bilirubină totală, bilirubină directă,

lactatdehidrogenaza (LDL), uree, creatinină, acid uric, colestrol

total, LDL colesterol, HDL colestrol, trigliceride; hematologici - hemograma, glicemie postprandială, hemoglobină

glicozilată.

Avându-se în vedere, de pe o parte influența favorabilă a

chitosanului asupra profilului toxicologic și farmacocinetic al substanțelor

active, și pe de altă parte potențialele efecte antidiabetice ale acestui polimer, cei doi compuși selectați au fost studiați și sub formă de

microparticule de chitosan - CH-6c3 și CH-6c5, urmându-se același

protocol de lucru.

9.3.2. Rezultate şi discuţii

9.3.2.1. Evaluarea parametrilor clinici

Pe parcursul studiului a fost monitorizată creşterea în greutate a şobolanilor, consumul de hrană şi de apă.

Din rezultatele studiului realizat privind creşterea în greutate (Fig.

9.8), se observă că șobolanii din Lotul 5 care au fost tratați cu pioglitazonă

37

au prezentat o creştere net superioară a masei corporale medii (21.91%)

faţă de greutatea iniţială, cunoscut fiind faptul că tratamentul cu

medicamente antidiabetice de tipul tiazolidindionelor (pioglitazona, rosiglitazona) este deseori asociat cu numeroase efecte secundare, precum

creşterea în greutate (Havale S. H. et al., 2009).

În cazul şobolanilor din Loturile 3 şi 4 care au fost trataţi cu derivaţii de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6c3,

respectiv 6c5), creșterea a fost mult mai redusă decât în cazul lotului tratat

cu pioglitazona. Creșterea în greutate înregistrată a fost de 8,55 ori (6c3, G = 2,56%), respectiv de 6,18 ori (6c5, G=3,54%) mai mică decât la

animalele din Lotul 5 tratat cu pioglitazonă (G = 21,91%).

În cazul șobolanilor trataţi cu microparticule de chitosan -

substanţă activă (Lot 1, 1a, 2, 2a) s-a înregistrat, dimpotrivă, o scădere a masei corporale față de valoarea inițială, cea mai drastică scădere

înregistrându-se pentru șobolanii din lotul 1, cu până la -5,34 %. Acest

fenonem ar putea fi datorat chitosanului, care prin capacitatea sa de umflare ar determina senzație de sațietate cu reducerea poftei de mâncare

și implicit cu reducerea greutății corporale.

Fig.9.8. Monitorizarea masei corporale la şobolanii din loturile de studiu

(1-7, 1a, 2a). L1: CH-6c5

*, L1a: CH-6c5**, L2: CH-6c3

*, L2a: CH6c3**, L3: 6c5, L4:

6c3, L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă 1/20 DL50, ** doză echivalentă 1/40 DL50.

38

Simptomele care apar în perioada de debut clinic al diabetului

zaharat, când glicemia a jeun este de obicei mai mare de 180 mg/dL (10

mmol/L), includ pe lângă scădere în greutate și senzaţie de sete continuă urmată de un consum mărit de apă (polidipsie).

Din datele obținute în cadrul studiului privind consumul de lichide

și reprezentate grafic în Fig. 9.9 se observă că şobolanii diabetici aflaţi în faza iniţială a experimetului au prezentat o polidipsie accentuată, fenomen

care s-a ameliorat spre finalul experimetului. Fenomenul de ameliorare s-a

observat și pentru loturile tratate cu pioglitazona (Lot 5), cu derivații 6c5 (Lot 3) și 6c3 (Lot 4), precum și pentru loturile tratate cu microparticule de

chitosan – substanță activă (Lot 1, 1a, 2, 2a).

Pentru șobolanii nediabetici din lotul 7 s-a înregistrat un consum

normal de apă în 24 de ore de 67,34-114,5 mL/kg corp. În cazul loturilor 3 şi 4, în care șobolanii au fost tratați cu derivații de benziliden-tiazolidin-4-

onă (6c3, 6c5) consumul de apă în 24 de ore a fost de 153,84-483,87

mL/24 h/kg corp (6c3) și respectiv 123,46-463,57 mL/24 h/kg corp (6c5) fiind similar consumului înregistrat pentru lotul 5 tratat cu pioglitazonă

(162,16-335,19 mL/24 h/kg corp) şi net superioară lotului 6, martorul

diabet (588,23-807,56 mL/24 h/kg corp) (Fig.9.9).

Fig. 9.9. Monitorizarea consumului de apǎ mediu timp de 24 de ore

raportat pe kg corp la şobolanii din loturile de studiu (1-7, 1a 2a).

39

L1: CH-6c5*, L1a: CH-6c5

**, L2: CH-6c3*, L2a: CH6c3

**, L3: 6c5, L4: 6c3, L5:

pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă 1/20 DL50, ** doză

echivalentă 1/40 DL50.

Rezultatele monitorizării aportului de hrană, pe fiecare lot de studiu, exprimate în grame de hrană consumată timp de 24 de ore, pe kg

corp, sunt reprezentate grafic în Fig.9.10.

Se observă că aportul de hrană pentru şobolanii diabetici trataţi cu pioglitazonă (lot 5) a variat de la 146,17 g/24 h/kg în prima zi a

experimentului până la 74,07 g/24 h/kg corp în ziua a 43-a de tratament,

scădere datorată controlului glicemic bun obținut cu pioglitazonă. Pentru șobolanii din loturile 3 şi 4, care au fost trataţi cu derivații

de benziliden-tiazolidin-4-onă (6c3 şi 6c5) s-a observat o scădere a

aportului de hrană, scădere comparabilă cu cea determinată de

administrarea pioglitazonei. O scădere și mai semnificativă a aportului de hrană (aproximativ

67 g/24 h/kg corp) s-a înregistrat pentru loturile tratate cu microparticule

de chitosan-substanță activă (lot 1,1a, 2, 2a), explicată prin senzaţia de saţietate determinată de administrarea microparticulelor de chitosan.

Fig. 9.10. Monitorizarea consumului de hrană mediu timp de 24 de ore

raportat pe kg corp la şobolanii din loturile de studiu (1-7, 1a 2a).

40

L1: CH-6c5*, L1a: CH-6c5

**, L2: CH-6c3

*, L2a: CH6c3

**, L3: 6c5, L4: 6c3,

L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă 1/20

DL50, **

doză echivalentă 1/40 DL50.

9.3.2.2. Evaluarea parametrilor biochimici

Glicemia postprandială

Analiza rezultatelor obținute în cadrul studiului realizat (Fig. 9.11)

a evidențiat faptul că administrarea cronică, pe cale orală, în doză unică pe zi, a derivaţilor benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică (6c3,

6c5) atât ca substanță activă (lot 3, 4) cât și sub formă de microparticule

(lot 1, 1a, 2, 2a), în doză echivalentă 1/20 din DL50 şi respectiv 1/40 DL50, a

determinat reducerea nivelului de glucoză plasmatică. Compuşii cei mai activi au fost 6c5 (lotul 3) şi microparticulele de

chitosan încărcate cu substanţa 6c5 (lotul 1 şi lotul 1a) pentru care s-a

înregistrat o scădere cu 47,94% a nivelului de glucoză plasmatică (lotul 3 după 43 de zile de tratament), cu 85,68% (lotul 1 după 15 zile) și cu

58,37% (lotul 1a după 12 zile de tratament). De remarcat este faptul că în

ziua a 12-a de experiment efectul hipoglicemic obţinut cu microparticulele de chitosan - 6c5 (lot 1) (114,5 mg/dL) a fost superior celui obținut prin

administrarea substanţei de referinţă (pioglitazonă, 148,5 mg/dL) iar în

cazul lotului 1 tratat cu substanţa 6c5 nivelul gicemiei în zilele 21, 36, 43 a

fost apropiat de cel al şobolanilor trataţi cu pioglitazonă. Față de pioglitazonă pentru care la finalul experimentului s-a

înregistrat o glicemie de 158 mg/dL compușii s-au dovedit mai puțin

activi.

41

Fig. 9.11. Monitorizarea glicemiei postprandiale la şobolanii din loturile de

studiu (1-7, 1a 2a). L1: CH-6c5*, L1a: CH-6c5

**, L2: CH-6c3

*, L2a:

CH6c3**, L3: 6c5, L4: 6c3, L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză

echivalentă 1/20 DL50, **doză echivalentă 1/40 DL50.

Hemoglobina glicozilată

Rezultatele obținute în cadrul studiului realizat (Fig. 9.12), susțin

faptul că toţi compuşii testaţi, derivați de benziliden-tiazolidin-4-onă cu nucleu xantinic (6c3, 6c5) cât și microparticulele de chitosan – substanță

activă (CH-6c3, CH-6c5) au realizat un bun control glicemic, valorile

HbA1c înregistrate fiind mai mici de 8%.

Figura 912. Monitorizarea hemoglobinei glicozilate la şobolanii din

loturile de studiu (1-7, 1a, 2a) L1a: CH-6c5**, L2: CH-6c3

*, L2a: CH6c3**, L3:

42

6c5, L4: 6c3, L5: pioglitazona, L6: martor diabet, L7: control; *doză echivalentă

1/20 DL50, **doză echivalentă 1/40 DL50.

Compusul cel mai activ a fost derivatul 6c5, rezultat în urma reacției de condensare dintre tiazolidin-4-ona corespunzătoare cu 4-

hidroxibenzaldehida, pentru care s-a înregistrat o valoare a HbA1c de

4,30% când a fost adminstrat ca substanță unitară (lot 3). Pentru lotul 1a în care compusul s-a administrat sub formă de micropaticule, valoarea

HbA1c în ziua a 12-a de tratament a fost de 4,35%. Valorile înregistrate

pentru cele două loturi au fost similare valorii HbA1c determinată în

cadrul lotului tratat cu pioglitazona (lot 5).

Parametri biochimici de evaluare a funcției hepatice

Din analiza rezultatelor obținute (tabel 9.6) se constată că în cazul lotului cu diabet zaharat (lot 6), enzimele hepatice au înregistrat valori

crescute, AST (216,9 mg/dL), ALT (82,15 mg/dL), LDH (408,45 mg/dL)

ceea ce denotă afectarea hepatică indusă de această afecțiune comparativ

cu lotul martor (lot 7) la care valorile enzimelor hepatice au fost mai reduse, AST (100 mg/dL), ALT (46,15 mg/dL), LDH (400,6 mg/dL).

În cazul microparticulelor de chitosan – substanță activă, cel mai

favorabil efect s-a înregistrat cu formularea chitosan-6c3, în concentrație echivalentă de 1/40 DL50 (lot 2a). La acest lot valoarea indicatorului de

citoliză hepatică, ALT, a fost de 50,11 UI/L față de valoarea 57,85 UI/L

determinată pentru lotul tratat cu pioglitazonă (lot 5). Valori similare au fost înregistrate și pentru formularea chitosan-6c5; aceasta prezentând

totodată și cel mai favorabil efect asupra AST, valoarea înregistrată fiind

de 124 UI/L, mult scăzută comparativ cu lotul diabetic și cel tratat cu

pioglitazonă (193,15 UI/L). Pentru toți compușii testați valoarile LDH au fost compararabile valorii de 404,85 UI/L obținute pentru lotul de referință

(lot 5).

Tabel 9.6. Valorile parametrilor funcției hepatice la şobolanii din loturile

1a (CH-6c5**

), 2 (CH-6c3*), 2a (CH-6c3

**) și 6 (martor diabet).

Parametru

biochimic Lot 1a** Lot 2* Lot 2a** Lot 6

AST (UI/L) 124,00 ± 2,72 193,45 ± 2,32 199,13 ± 2,41 216,9 ± 2,08

43

ALT (UI/L) 62,21 ± 1,43 52,21 ± 1,72 50,11 ± 1,17 82,15 ± 1,33

LDH (UI/L) 404,8 ± 3,11 402,31 ± 2,09 407,15 ± 1,92 408,45 ± 0,7

Bilirubina totală (mg/dL)

0,14 ± 0,09 0,12 ± 0,06 0,17 ± 0,05 0,22 ± 0,09

Bilirubina

directă (mg/dL) 0,08 ± 0,05 0,09 ± 0,04 0,08 ± 0,12 0,15 ± 0,07

*doză echivalentă 1/20 DL50, **doză echivalentă 1/40 DL50

Valorile bilirubinei totale şi directe pentru loturile tratate cu

derivații 6c3 și 6c5 și cu microparticule de CH – substanță activă au fost

similare (Tab. 9.6, 9.7) pioglitazonei, încadrându-se în limitele normale descrise de Weber D. K. et al., 2002 şi Johnson-Delaney C., 1996.

Tabel 9.7. Valorile parametrilor funcției hepatice la şobolanii din loturile 3

(6c5), 4 (6c3), 5 (pioglitazonă) și 7 (control).

Parametru

biochimic Lot 3 Lot 4 Lot 5 Lot 7

AST (UI/L) 177,65 ± 1,17 185,45 ± 0,41 193,15 ± 1,87 100 ± 1,08

ALT (UI/L) 55,15 ± 0,55 53,21 ± 1,84 57,85 ± 1,45 46,15 ± 1,33

LDH (UI/L) 404,35 ± 1,76 406,05 ± 0,63 404,85 ± 0,75 400,6 ± 0,83

Bilirubina totală

(mg/dL) 0,08 ± 0,09 0,11 ± 0,05 0,14 ± 0,01 0,085 ± 0,04

Bilirubina directă (mg/dL)

0,04 ± 0,11 0,06 ± 0,03 0,04 ± 0,02 0,03 ± 0,02

Parametri biochimici ai profilului lipidic

Valorile parametrului LDL colesterol la şobolanii diabetici au fost crescute, fiind cuprinse în intervalul 50-70 mg/dL în comparaţie cu lotul

martor 7 (40 mg/dL). Se poate aprecia totuși că pentru toți compușii testați

valoarea LDL colesterolului a fost semnificativ mai redusă comparativ cu lotul tratat cu pioglitazonă; cea mai importantă scădere (50 mg/dL)

înregistrându-se pentru lotul 1a, tratat cu microparticule de chitosan – 6c5,

în doză echivalentă 1/20 din DL50.

Referitor la parametrul HDL colesterol, se apreciază că toate loturile testate, inclusiv lotul cu diabet (lot 6) au prezentat valori ale

acestui parametru apropiate valorii lotului 7 (şobolani nediabetici).

44

Valoarea trigliceridelor înregistrată pentru lotul 6 (martor diabet,

104,41 mg/dL) a fost mai mare comparativ cu lotul 7 (șobolani nediabetici,

54,25 mg/dL). Pentru toate celelalte loturi valoarea trigliceridelor a fost cuprinsă în intervalul 45,81-67,41 mg/dL.

Tabel 9.8. Valorile parametrilor profilului lipidic la şobolanii din loturile 1a (CH-6c5

**), 2 (CH-6c3

*), 2a (CH-6c3


Parametru

biochimic

(mg/dL)

Lot 1a** Lot 2* Lot 2a** Lot 6

Colesterol total 47,8 ± 1,70 45,9 ± 1,20 62,70 ± 1,10 51,55 ± 1,87

LDL Colesterol 50,0 ± 1,23 55,0 ± 1,12 65,00 ± 1,12 70,00 ± 1,07

HDL Colesterol 59,1 ± 1,10 54,0 ± 1,50 61,17 ± 1,16 55,05 ± 1,72

Trigliceride 65,0 ± 1,70 61,5 ± 1,10 67,41 ± 0,98 104,41 ± 1,3

Tabel 9.9. Valorile parametrilor profilului lipidic la şobolanii din loturile 3


Parametru

biochimic

(mg/dL)

Lot 3 Lot 4 Lot 5 Lot 7

Colesterol total 37,15 ± 1,98 51,51 ± 1,39 48,95 ± 1,48 50,13 ± 1,08

LDL Colesterol 65,00 ± 1,21 65,00 ± 1,07 70,00 ± 1,14 40,00 ± 1,72

HDL Colesterol 59,00 ± 1,55 59,60 ± 0,14 58,81 ± 0,14 58,63 ± 0,72

Trigliceride 45,81 ± 1,21 52,95 ± 1,48 51,05 ± 1,18 54,25 ± 1,14

În ansamblu, se apreciază că rezultatele obţinute la evaluarea

parametrilor biochimici ai profilului lipidic susţin afirmaţia că substanțele

studiate, derivați de benziliden-tiazolidin-4-onă cu structură xantinică au

determinat scăderea hiperlipidemiei comparativ cu datele înregistrate pentru martorul diabet (lot 6).

Parametri biochimici ai funcției renale Rezultatele evaluării funcției renale, prin determinarea

parametrilor biochimici, uree, creatinină și acid uric în condițiile

experimentului realizat sunt prezentate în tabel 9.10 și 9.11.

45

Din datele obținute se observă că, referitor la concentrația

creatininei, nu s-au înregistrat diferențe semnificative între valorile

loturilor studiate, acestea încadrându-se în intervalul 0,55 mg/dL și 0,72 mg/dL, fiind mai reduse comparativ cu valoarea înregistrată pentru lotul

martor diabet (0,81 mg/dL) şi lotul 5 tratat cu pioglitazonă (0,72 mg/dL).

Tabel 9.10. Valorile parametrilor funcției renale la şobolanii din

loturile 1a (CH-6c5**

), 2 (CH-6c3*), 2a (CH-6c3


Parametru

biochimic

(mg/dL)

Lot 1a** Lot 2* Lot 2a** Lot 6

Uree 73,65 ± 1,48 57,24 ± 1,97 65,92 ± 1,52 107,00 ± 1,6

Creatinină 0,62 ± 0,09 0,57 ± 0,05 0,55 ± 0,16 0,81 ± 0,04

Acid uric 1,04 ± 0,45 1,41 ± 0,17 1,22 ± 0,72 1,55 ± 0,28

Tabel 9.11. Valorile parametrilor funcției renale la şobolanii din loturile 3


Parametru

biochimic

(mg/dL)

Lot 3 Lot 4 Lot 5 Lot 7

Uree 48,11 ± 1,74 46,51 ± 1,65 55,9 ± 1,37 37,5 ± 1,97

Creatinină 0,56 ± 0,02 0,62 ± 0,02 0,72 ± 0,01 0,63 ± 0,12

Acid uric 1,12 ± 0,31 1,16 ± 0,41 1,60 ± 0,26 0,70 ± 0,18

Valorile ureei şi acidului uric pentru lotul martor diabet (lot 6) au

fost semnificativ crescute (uree – 107 mg/dL, acid uric – 1,55 mg/dL) față de valorile înregistrate pentru lotul martor nediabetic (lot 7, uree – 37,5

mg/dL, acid uric – 0,7 mg/dL), ceea ce denotă o afectare destul de

accentuată a funcției renale. Pentru loturile de șobolani diabetici tratați cu substanțele studiate, deși valorile înregistrate (uree: 46,51 - 73,65 mg/dL,

acid uric: 1,04 - 1,41 mg/dL) au fost superioare celor din lotul nediabetic,

au fost mult mai reduse comparativ cu lotul diabetic. Aceasta observație susține faptul că administrarea compușilor

selectați în studiu, reduce afectarea renală indusă de diabet şi în unele

situații (lot 3, 4) compușii studiați au avut un efect mult mai favorabil

comparativ cu pioglitazona.

46

9.3.2.3. Evaluarea parametrilor hematologici

Hemograma este un test screening de bază, reprezentând adesea primul pas în stabilirea statusului hematologic şi diagnosticul diverselor

afecţiuni hematologice. De obicei afecţiunile hematologice sunt

congenitale, fiind rezultatul unor tulburări genetice moştenite, dar se pot

manifesta şi ca răspuns al organismului la stres. Diabetul zaharat prin

concentraţiile crescute de glucoză pot creşte stresul oxidativ conducând la

eliberarea speciilor reactive de oxigen/nitrogen.

Din analiza rezultatelor s-a observat că parametri hematologici nu au prezentat variaţii majore de la limitele normale şi nu au existat diferenţe

semnificative în comparaţie cu lotul martor (Lotul 7).

9.4. STUDIU HISTOPATOLOGIC În scopul evaluării efectului compușilor selectați pentru studiul in

vivo pe şobolani diabetici, derivați de benziliden-tiazolidin-4-onă cu

structură xantinică (6c3, 6c5, CH-6c3, CH-6c5) s-a realizat un studiu histopatologic pe fragmente de țesut renal în vederea identificării

modificărilor morfologice produse de către compușii amintiți.

9.4.2. Rezultate și discuții

În urma studiul histopatologic realizat pe fragmente de ţesut renal

s-a observat o protecţie favorabilă a funcției renale (limitarea îngroşării

membranei bazale glomerulare-MBG) prin iniţierea terapiei cu microparticule de chitosan-substanţă activă şi derivații (6c3 şi 6c5) ca

substanţe unitare (tabel 9.14).

Valorile numerice obţinute privind grosimea medie a MBG au relevat în mod clar că:

în lotul diabetic (lot 6), MBG a fost îngroşată evident (3,83 m); cea mai bună protecţie anti-diabetică a fost obţinută prin

administrare de microparticulele de chitosan încărcate cu 6c5 (CH-

6c5) (lot 1) (MBG 1,38 m), administrate în doză echivalentă 1/20 DL50;

microparticulele de chitosan încărcate cu 6c3 (CH-6c3) (lot 2),

administrate în doză echivalentă 1/20 din DL50 asigură protecţie

http://www.sfatulmedicului.ro/Stresul-si-sindromul-de-oboseala-cronica/cauzele-stresului_49

47

diabetică (MBG 1,70 m), dar mai redusă comparativ cu

microparticulele de chitosan – 6c5 (MBG 1,38 m); cei doi compuși selectați pentru studiu administrați sub formă de

substanțe unitare, 6c5 (lot 3, MBG 2,16 m) și 6c3 (lot 4, MBG

2,56 m) asigură un efect similar administrarii de pioglitazonă (lot

5, MBG 2,14 m);

administrarea microparticulelor de chitosan încărcate cu 6c5 (CH-

6c5) (lot 1a, MBG 2,30 m) și cu 6c3 (CH-6c5) (lot 2a, MBG 2,56

m), în doze echivalente de 1/40 din DL50 protejează similar

substanţelor unitare - 6c5 (lot 3, MBG 2,16 m) şi 6c3 (lot 4, MBG

2,53 m). Imaginile din Fig. 9.17 ilustrează valorile obţinute în procesul de

măsurare.

Fig.9.17. Determinări ale MBG – lotul 6 (HE, x 400)

Capitolul 10. CONCLUZII

1. Studiul realizat aduce contribuții deosebite și originale la

cercetările derulate la ora actuală în domeniul diabetului zaharat. Acest

sindrom metabolic este considerat „epidemia secolului 21” datorită creşterii alarmante pe plan mondial a numărului de cazuri diagnosticate. În

ciuda eforturile întreprinse de către cercetători, datorită complexităţii

acestei maladii, controlul optim al glicemiei prin administrarea terapiei

48

curente, în cele mai multe cazuri s-a dovedit a fi imposibil de realizat.

Astfel, descoperirea unei noi terapii care să realizeze un bun control

glicemic reprezintă o adevărată provocare pentru cercetători şi intensele studii realizate în acest domeniu au avut ca rezultat introducerea în terapie

a unei noi clase de medicamente antidiabetice: inhibitori ai dipeptidil

peptidazei IV (DPP IV), enzimă implicată în metabolizarea celor doi hormoni endogeni – GIP și GLP-1, cu rol important în homeostazia

glicemică. Printre aceşti agenţi terapeutice se numără şi Linagliptina, un

derivat xantinic cu durată lungă de acţiune şi cu o selectivitate crescută pentru DPP IV.

2. În cadrul cercetărilor personale s-au obţinut prin sinteză noi

compuşi heterociclici ca potențiali agenți terapeutici în tratamentul

diabetului zaharat tip 2. Molecula acestor compuşi combină două entităţi structurale cu o deosebită valoare terapeutică în terapia diabetului zaharat,

nucleul xantinic şi ciclul tiazolidinic. Prin modulări structurale realizate

pe structura de teofilină (1,3-dimetil-xantina) la atomul de azot din poziția 7 (N7) au fost sintetizați 21 de compuși noi, derivați de benziliden-

tiazolidin-4-onă cu structură xantinică și un număr de 8 compuși

intermediari. Compuşii sintetizaţi, au fost caracterizaţi fizico-chimic şi spectral şi evaluați din punct de vedere biologic. Structura chimică a

compușilor, intermediari şi finali sintetizați a fost confirmată prin metode

spectroscopice - spectroscopia de infraroşu cu transformată Fourier și prin

spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (1H-RMN,

13C-RMN).

3. Compuşii finali sinetizaţi au fost evaluaţi biologic privind

potențialul antioxidant prin metode in vitro: puterea reducătoare,

capacitatea totală antioxidantă, şi capacitatea de inhibare a radicalilor liberi DPPH şi ABTS. Rezultatele obţinute au evidențiat că toţi cei 21 de

compuşi finali prezintă o capacitate antioxidantă superioară tiazolidin-4-

onelor corespunzătoare, ceea ce susține influența favorabilă a modulărilor

structurale realizate. Pentru fiecare din cele trei serii de compuși sintetizați, cei mai activi s-au dovedit a fi compușii obţinuţi prin condensarea 4-

hidroxi / 4-N(dimetilamino) și 2-nitro-benzaldehidei cu tiazolidin-4-onele

corespunzătoare. 4. În urma evaluării in vivo a toxicităţii compuşilor finali 6b1-7, 6c1-

7 prin determinarea dozei letale 50, s-a constatat că derivaţii studiaţi se

încadrează în grupa substanţelor cu grad foarte redus de toxicitate.

49

Modulările structurale realizate pe nucleul xantinic au avut o influență

favorabilă, toti compușii obținuți fiind mai puțin toxici decât teofilina şi

pioglitazona (derivat de tiazolidin-2,4-dionă). 5. Pe baza rezultatelor obţinute la screeningul toxicologic și

antioxidant au fost selectaţi doi compuși finali, 2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-

il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)-5-(4-hidroxi-benziliden)tiazolidin-4-ona (6c5) și 2-[2-(1,3-dimetilxantin-7-il)acetil]hidrazono}-3-(bromfenil)-5-(4-

clorbenziliden)tiazolidin-4-ona) (6c3) care au fost incluși într-un amplu

studiu ce a urmărit evaluarea parametrilor clinici, biochimici și hematologici pe model de diabet indus cu streptozotocin la șobolan.

Rezultatele obținute la monitorizarea glicemiei postprandiale şi a

hemoglobinei glicozilate au evidențiat faptul că prin administrarea cronică,

pe cale orală, în doză unică pe zi, a derivaţilor studiați (6c3 şi 6c5) s-a realizat un bun control glicemic. Compusul cel mai activ, cu acţiunea

hipoglicemiantă apropiată de cea a pioglitazonei s-a dovedit a fi derivatul

6c5. Prin evaluarea parametrilor funcţiei hepatice s-a observat că, în general, efectul hepatoprotector al compușilor testaţi 6c3, 6c5 a fost mai

benefic decât cel înregistrat cu pioglitazona, utilizată ca antidiabetic de

referință. Totodată afectarea renală, o complicație gravă a diabetului zaharat preum și un grav efect advers al terapiei antidiabetice cu

tiazolidindione, a fost atenuată prin administrarea compușilor studiați,

efectul observat fiind mult mai favorabil comparativ cu pioglitazona.

Rezultatele obținute prin evaluarea profilului lipidic susţin faptul că substanțele studiate, au determinat o scădere accentuată a hiperlipidemiei

comparativ cu datele înregistrate pentru martorul diabet, și reducerea

concentrației de LDL-colesterol şi trigliceride; valorile înregistrate fiind similare celor din lotul tratat cu pioglitazonă. În urma studiul

histopatologic realizat pe fragmente de ţesut renal s-a observat o protecţie

favorabilă a funcției renale prin iniţierea terapiei cu derivații selectați

(6c3 şi 6c5). 6. În scopul îmbunătăţirii profilului farmacotoxicologic al celor

mai activi compuşi s-au utilizat matrici de chitosan pentru prepararea unor

microparticule ca sisteme de eliberare controlată a substanţei active. Studiile efectuate privind caracterizarea fizico-chimică, capacitatea de

încapsulare, studii IR, gradul de hidratare, biodegradarea in vitro,

eliberarea substanţei active in vitro, au confirmat obţinerea cu succes a

50

acestor microparticule de chitosan şi capacitatea de înglobare şi eliberare

susţinută a celor două substanţe testate. Studiul in vivo derulat pe şobolani

privind efectul lor hipoglicemiant a indicat o acţiune mai intensă comparativ cu substanțele unitare. Valorile parametrilor biochimici şi

hematologici (hemograma, profil glucidic, hepatic, renal, lipidic) susțin

efectul favorabil în normalizarea parametrilor funcţiilor organismului a microparticulleor de chitosan-substanță activă. În urma studiul

histopatologic realizat pe fragmente de ţesut renal s-a observat că efectul

microparticulelor de chitosan-substanţă activă este mai intens decât efectul observat pentru compușii administrați ca substanțe unitare.

În concluzie, rezultatele obținute în cadrul studiilor realizare sunt

originale și cu potențială aplicație biologică în tratamentul diabetului zaharat tip 2, compușii studiați fiind mai siguri și mai eficienți decât

pioglitazona.

Totodată rezultatele obținuțe îndreptățesc continuarea studiilor farmacologice pentru evaluarea derivaților sintetizați ca inhibitori ai DPP

IV, enzimă implicată în metabolizarea hormonilor endogeni (GIP și GLP-

1) precum și ca agoniști PPARγ, cunoscută fiind importanța nucleului tiazolidinic în modularea rezistenței la insulină în țesuturile periferice.

51

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Alagawadi K.R., Alegaon S.G., Synthesis, characterization and

antimicrobial activity evaluation of new 2,4-Thiazolidinediones bearing imidazo [2,1-b][1,3,4]thiadiazole moiety, Asian Journal of

Control 2011, 4: 465-472.

2. Alhnan M.A., Murdan S., Basit A.W. Encapsulation of poorly soluble basic drugs into enteric microparticles: A novel approach to

enhance their oral bioavailability, International Journal of

Pharmaceutics 2011, 416: 55-60. 3. Amr Ael-G., Sabrry N.M., Abdalla M.M., Abdel-Wahab B.F.

Synthesis, antiarhythmic and Arora M.K., Singh U.K., Molecular

mechanism in the pathogenesis of diabetic nephropathy : An update,

Vascular Pharmacology 2013, 58: 259-271. 4. Barquissau V., Morio B; Phsiopathologie de l’insulinoresistance

dans les muscles squelettique et implication des fonctions

mitochondriales, Nutrition clinique et metabolisme 2011, 25: 114-130.

5. Besse J.L., Leemrijse T., Deleu P.A., Diabetic foot: The orthopedic

surgery angle, Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research 2011, 97: 314-329.

6. Bhagat T.M., Swamy D.K., Badne S.G., Kuberkar S.V., Synthesis

and antibacterial activity of 4-thiazolidinone containing

benzothiazolyl moiety, Rasayan Journal Chemistry 2011, 4: 24-28. 7. Bhattarai N., Gunn J., Zhang M., Chitosan-based hydrogels for

controlled, localized drug delivery, Advanced drug delivery reviews

2010, 62:83-99. 8. Bogdanov V.Y., Osterud B., Cardiovascular complications of

diabetes mellitus: The Tissue Factor perspective, Thrombosis

Research 2010, 125: 112-118.

9. Buchanan T. A., Xiang A. H., Page K. A., Gestational diabetes mellitus: risks and management during and after pregnancy, Nature

reviews Endocrinology 2012, 8: 639-649.

10. Cacic M., Molnar M., Sarkanj B., Has-Schon E., Rajkovic V., Synthessis and antioxidant activity of some new coumarinyl-1,3-

Thiazolidine-4-ones, Molecules 2010; 15: 6795-6809.

52

11. Cariou B., Charbonnel B., Staels B., Thiazolidinediones and PPAR γ

agonists: time for a reassessment, Trends in Endocrinology and

Metabolism 2012, 23 ( 5): 205-215. 12. Chiha M., Njeim M., Chedrawy E.G., Diabetes and Coronary Heart

Disease: A risk factor for the Global Epidemic, International

Journal of Hypertension 2012, 14: 1-7. 13. Chua H. R., Schneider A., Bellomo R., Bicarbonate in diabetic

ketoacidosis-asystematic review, Annals of Intensive Care 2011,

23(1):1-12. 14. Daher S., Torloni M.R., gueuvoghlanian-Silva B.Y., Moron A.F.,

Mattar R., Inflammatory mediator gene polymorphisms and

gestational diabetes: a review of the literature, Journal of

Reproductive Immunology 2011, 90: 111-116. 15. Dai T., Tanaka M., Huang Y.Y., Hamblin M.R., Chitosan

preparations for wounds and burns: antimicrobial and wound-healing

effects, Expert Review of Anti-Infective Therapy 2011, 9(7): 857-879.

16. Dash M., Chiellini F., Ottenbrite R.M., Chiellini E., Chitosan—A

versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications, Progress in Polymer Science 2011, 36: 981–1014.

17. Derosa G., Maffioli P., Effects of thiazolidinediones and

sulfonylureas in patients with diabetes, Diabetes Technology and

Therapeutics 2010, 12: 491-501.

18. Gallwitz B., Linagliptin-A Novel Dipeptidyl Peptidase inhibitor for

Type 2 Diabetes Therapy, Clinical Medicine Insights Endocrinology

and Diabetes 2012, 5:1-11.

19. Garcia A.A., The Diabetes Symptom Self-Care Inventory: Development and Psychometric Testing with Mexican Americans,

Journal of Pain and Symptom Management 2011, 41 (4): 715-726.

20. Gautier J.-F., Sauvanet J.P., Efficacy of saxagliptin as an add-on to oral monotherapy in the phase 3 clinical development program:

Predictive factors of the treatment response in type 2 diabetes,

Annales d’Endocrinologie 2011, 72: 287–295.

21. Hausner L., Talmadge K., American Diabetes Association. Standards of Medical Care in Diabetes, Diabetes Care 2012, 35 (1):

11–63.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Derosa%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maffioli%20P%22%5BAuthor%5D

53

22. Heydari I., Radi V., Razmjou S., Amiri A., Chronic complications of

diabetes mellitus in newly diagnosed patients, International Journal

of Diabetes Mellitus 2010, 2: 61-63. 23. Hocher B., Reichtzeder C., Alter M. L., Renal and cardiac effects of

DPP IV inhibitors-from preclinical development to clinical research,

Kidney and Blood Pressure Research 2012, 36 (1): 65-84. 24. Hopps E., Noto D., Caimi G., Averna M.R., A novel component of

the metabolic szndrome: The oxidative stress, Nutrition, Metabolism

& Cardiovascular Disease 2010, 20: 72-77. INomansulin glargine 25. Ju C., Yue W., Yang Z., Zhang Q., Yang X., Liu Z., Zhang F.,

Antidiabetic effect and mechanism of chitooligosaccharides.

Biological & Pharmaceutical Bulletin 2010, 33(9):1511-1516.

26. Kang H., Current therapeutic agents and anesthetic consideration for diabetes mellitus, Korean Journal of Anesthesiology 2012, 63 (3):

195-202.

27. Kangralkar V. A., Patil S. D., Bandivadekar R. M., Oxidative stress and diabetes: a review, International Journal of Pharmaceutical

Applications 2010, 1(1): 38-45.

28. Kaplan M., Aviram M., Hayek T., Oxidative stress and macrophage foam cell formation during diabetes mellitus-induced atherogenesis:

Role of insulin therapy, Pharmacology & Therapeutics 2012, 136:

175-185.

29. Khardori R., Type 1 Diabetes mellitus, Medscape 2013, 33: 2153-2163.

30. Kota S.K., Meher L.K., Jammula S., Kota S.K., Modi K.D., Clinical

profile of coexisting conditions in type 1 diabetes mellitus patients, Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review 2012,

6: 70-76.

31. Kudaravalli J., Vijayalakshmi G., Kishore K.K., Safety and efficacy

of sulfonylureas drugs in type 2 diabetes mellitus, Apollo Medicine 2013, 10: 165-168.

32. Kumar A., Negi G., Sharma S., Suppression of NF-kB and NF-kB

regulated oxidative stress and neuroinflammation by BAY 11-7082 (IkB phosphorylation inhibitor) in experimental diabetic neuropathy,

Biochimie 2012, 94: 1158-1165.

54

33. Kumar R. B. S., Kar B., Dolai N., Bala A., Haldar P. K., Evaluation

of antihyperglycemic and antioxidant properties of Streblus asper

Lour against streptozotocin-induced diabetes in rats, Asian Pacific Journal of Tropical Disease 2012, 139-143.

34. Lungu Apetrei C, Tuchilus C, Aprotosoaie AC et al. Chemical,

antioxidant and antimicrobial investigations of Pinus cembra L. Bark and Needles. Molecules 2011; 16: 7773-7788.

35. Maric-Bilkan C., Obesity and Diabetic Kidney Disease, Medical

Clinics of North America 2013, 97(1): 59-74. 36. Moţăţăianu A., Stoian A., Bajko Z., Neuropatia Diabetică Autonomă

Cardiovasculară-Impact Clinic, Acta Medica Transilvanica 2013,

2(1): 156-158.

37. Mulakayala N., Reddy C.H., Iqbal J., Pal M., Synthesis of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors: a brief overview, Tetrahedron 2010, 66:

4919-4938.of glargine or nsulin to oral therapy of t

38. Petry C.J., Gestational diabetes: risk factors and recent advances in its genetics and treatement, British Journal of Nutrition 2010,

104:775-787.

39. Rungby J., Laursen T., Hoimark L., Potential role of linagliptin as on oral once-daily treatment for patients with type 2 diabetes, Diabetes,

Metabolic, Syndrome and Obesity: Targets and Therapy 2012, 5:

295-302.

40. Shanmugam K.D., Mallikarjuna K., Nishanth K., Kuo C. H., Protective effect of dietary ginger on antioxidant enzymes and

oxidative damage in experimental diabetic rat tissues, Food

Chemistry 2011, 124: 1436-1442. 41. Sharma R., Samadhiya P., Srivastava S., Srivastava S., Synthesis of

Some New Thiazolidine Derivatives and Their Biological

Significance, Latvian Journal of Chemistry 2012, 50: 296–307.

42. Valensi P., Picard S., Lipids, lipid-lowering therapy and diabetes complications, Diabetes and Metabolism 2011, 37: 15-24.

43. Van Raalte D.H., Diamant M., Glucolipotoxicity and beta cells in

type 2 diabetes mellitus: Target for durable therapy, Diabetes Research and Clinical Practice 2011, 93: 37-46.

44. Zanchi A., Lehmann R., Philippe J., Antidiabetic drugs and kidney

disease, Swiss Medical Weekly 2012, 142: 1-8.

55

LISTĂ LUCRĂRILOR ȘTIINȚIFICE PUBLICATE ÎN

TIMPUL STAGIULUI DOCTORAL

Articole publicate in extenso din tema tezei de doctorat:

1. Florentina Geanina Lupascu, Oana Maria Dragostin, Liliana Foia,

Dan Lupascu, and Lenuta Profire, The Synthesis and the

Biological Evaluation of New Thiazolidin-4-one Derivatives Containing a Xanthine Moiety, Molecules, 2013, 18(8): 9684-

9703, (ISI, IF 2,67).

2. Florentina Lupascu, Mamoni Dash, Sangram Keshari Samal, Cătălina Elena Lupuşoru, Raoul Vasile Lupuşoru, Lenuţa Profire,

Peter Dubruel, Delivery of Hydrophobic Antioxidant Drugs via

Chitosan: An Approach to Enhance their Oral Bioavailability,

Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2013, under review, (ISI, IF 2,32).

3. Florentina Lupaşcu, Oana Maria Dragostin, Maria Apotrosoaei,

Andreea Pânzariu, Dan Lupaşcu, Cornelia Vasile, Lenuţa Profire, Synthesis And Evaluation Of Antioxidant Activity Of Some New

Benzylidene-Thiazolidine-Xanthine Derivatives, Revista Medico-

chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iași, 2013,

117(1): 244-249, (BDI, B+).

4. Florentina Geanina Lupașcu, Ioana Mirela Geangalău, Andreea

Pânzariu, Lenuța Profire - Incretin modulators, a new perspective

in diabetes mellitus treatment, Revista Medico-chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iași, 2012, 116(2): 630-634,

(BDI, B+).

Alte articole publicate in extenso:

1. Oana Maria Dragostin, Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, Mihai Mares, Valentin Nastasa, Ramona Florina Moraru, Dragos Pieptu,

Lenuţa Profire, Synthesis and Biological Evaluation of New 2-

56

Azetidinones with Sulfonamide Structures, Molecules 2013, 18(4):

4140-4157, (ISI, IF 2,67).

2. Oana Maria Parasca (Dragostin), Florentina Gheaţă (Lupaşcu), Andreea Pânzariu, Ioana Geangalău (Vasincu), Lenuţa Profire –

The importance of sulfonamide moiety in current and future

therapy, Revista Medico-Chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iași, 2013, 117(2): 558-564, (BDI, B

+).

3. Oana Maria Parasca, Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, M.

Mares, V. Nastasa, Lenuţa Profire, New Hydrazines with sulphonamidic structure: Synthesis, Characterization and

Biological Activity, Revista Medico-Chirurgicală a Societății de

Medici și Naturaliști, Iaşi, 2013, 117(1): 238-243, (BDI, B+).

4. Maria Apotrosoaei, Ioana Vasincu, Cristina Tuchiluş, Florentina Lupascu, Sandra Constantin, Dan Lupaşcu, Lenuţa Profire, New

Hydrazones With Pyrazolone Structure: Synthesis,

Characterization, and Biological Evaluation, Revista Medico-Chirurgicală a Societății de Medici și Naturaliști, Iaşi, 2013,

117(2): 538-544, (BDI, B+).

Participări la Conferinţe Naţioanale şi Internaţionale:

1. Florentina Geanina Lupaşcu, Oana Maria Dragostin, Andreea

Pânzariu, Ioana Vasincu, Dan Lupaşcu, Lenuţa Profire, Istoria

Enzimei Dipeptidil Peptidaza IV şi a Inhibitorilor Acesteia, A XXII a Reuniunea Naţională de Istoria Farmaciei 4-6 aprilie 2013

(rezumat şi poster).

2. Lupașcu Florentina Geanina, Dragostin Oana, Geangalău Ioana, Apotrosoaei Maria, Vasile Cornelia, Lupașcu Dan, Pânzariu

Andreea, Profire Lenuța - Synthesis and antioxidant activity of

some new benzylidene thiazolidine-4-ones, Conferința

internaţională RICT 2012: Interfacing Chemical Biology and Drug Discovery, Poitiers, Franţa, 4-6 iulie 2012, 160 (rezumat și poster).

3. Oana Dragostin, Florentina Lupascu, Maria Apotrosoaei,Cristina

Tuchilus, Cornelia Vasile, Dan Lupascu, Lenuta Profire, Synthesis, characterization and antimicrobial potential of some new

hydrazones with sulphonamide structure” - RICT 2012:

57

Interfacing Chemical Biology and Drug Discovery, Poitiers,

Franţa, 4-6 iulie 2012, 159 (rezumat şi poster).

4. Florentina Lupascu, Oana Dragostin, Andreea Panzariu, Cornelia Vasile, Liliana Foia, Lenuta Profire, Synthèse et évaluation

biologique de quelques nouveaux dérivés de benzylidene-

thiazolidine-4-ones qui peuvent avoir une action antidiabétique”- COFrRoCA 2012: 7čme Colloque Franco- Roumain de Chimie

Appliquée, care a avut loc la Universitatea „Vasile Alecsandri din

Bacău, România, 27-29 iunie 2012, 44-45 (rezumat şi poster). 5. Lenuța Profire, Dan Lupașcu, Maria Apotrosoaei, Oana Dragostin,

Florentina Lupașcu, Ioana Geangalău, Andreea Pânzariu - Din

Istoria Nitroglicerinei, a XLII-a Reuniune Națională de Istoria

Medicinei, Iași, 31 Mai-2 Iunie 2012, 77-78 (rezumat și poster). 6. Fawzia Sha’at, Ştefan Bargaoanu, Florentina Lupaşcu, Lenuţa

Profire, Synthesis and antioxidant potential evaluation of some

new thiazolidine-4-one derivatives, MedEspera 2012 - International Medical Congress for Students and Yong Doctors,

Chişinau, Republica Moldova, 17-19 mai 2012 (rezumat şi poster).

7. Florentina Lupascu, Cornelia Vasile, Oana Maria Dragostin, Lenuta Profire - Sinteza si caracterizarea unor noi derivati

heterociclici cu potentiala actiune antidiabetica ” 50 de ani de

invatamant universitar farmaceutic la Iasi”, 6-8 octombrie 2011,

130-132 (rezumat şi poster). 8. Dragostin O., Vasile C., Lupaşcu F., Maria D., Profire L., Sinteza

şi caracterizarea unor hidrazine cu structură sulfonamidică, 50 de

ani de invatamant universitar farmaceutic la Iasi, 6-8 octombrie 2011 (rezumat şi poster).

9. Profire Lenuţa, Lupaşcu Florentina Geanina, Lupaşcu Dan, New

Therapeutic Strategies In Diabetus Mellitus Treatment, Congresul

International TIM-MEDICA, Timişoara, 16-18 Iunie, 2011, pg.12-13 (lucrare şi poster).

cercetări privind noi compuși cu structură xantinică cu potențial ...

Documents

Transcript of cercetări privind noi compuși cu structură xantinică cu potențial ...