UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

Studii asupra drojdiei Saccharomyces cerevisiae utilizata in vinificatie.

Cuprins1. Clasificarea si obiectivele stiintelor microbiene applicative2. Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme cu importanta in

industria alimentara2.1. Raspandire2.2. Caractere morfofiziologice2.3. Forma si aspectul coloniei2.4. Caractere fiziologice generale2.5. Stari ale celulelor de drojdie

3. Progrese ale ingineriei metabolice la Saccharomyces cerevisiae4. Polimorfismul genomului drojdiilor de vin5. Influenta factorilor de mediu asupra metabolismului drojdiilor de vin6. Multiplicarea si dezvoltarea drojdiilor7. Principalele genuri si specii utilizate la obtinerea drojdiilor selectionate8. Tulpini de drojdii folosite in industria vinului9. Culturi de drojdii destinate vinificatiei10. Obiectivele ingineriei genetice la Saccharomyces cerevisiae pentru productia de

vin10.1. Utilizarea ingineriei genetice10.2. Proprietati biologice10.3. Impactul strategiilor de inginerie genetica

11. Bibliografie

CLASIFICAREA ȘI OBIECTIVELE STIINŢELOR MICROBIOLOGICE APLICATIVE

MICROBIOLOGIA – o stiință biologică fundamentală care studiază morfologia, fiziologia și sistematica microorganismelor, originea și evolutia lor, fenomene de ereditate și variabilitate microbiană și reprezintă un sistem organizat de cunostințe privind legile după care se desfășoară viața microorganismelor.

MICROORGANISMELE – sisteme complexe, mono- sau pluricelulare, cu celule de tip procariot sau eucariot, înzestrate cu un metabolism propriu și continuitate genetică, foarte diversificate ca formă, dimensiuni și activitate metabolică.

Dezvoltarea microbiologiei generale a condus la apariția unor discipline microbiologice cu caracter aplicativ: virusologia – studiul virusurilor; bacteriologia – studiul bacteriilor; micologia – studiul micromicetelor.

Numeroase discipline microbiologice s-au dezvoltat pe mai multe domenii de cercetare: microbiologia chimică, microbiologia acvatică, microbiologia solului, microbiologia cosmică; dintre acestea s-au desprins cele cu caracter aplicativ: microbiologia produselor alimentare, microbiologia industriala, biotehnologia.

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE – știința cu caracter aplicativ care studiază structura, proprietățile, morfofiziologia organismelor cu implicații în industria alimentară pentru cunoașterea următoarelor grupe de microorganisme : microorganisme utile folosite sub formă de culturi starter pentru procese fermentative care stau la baza dezvoltării subramurilor industriilor alimentare: drojdiile fermentative folosite la fabricarea berii, a vinului, a alcoolului etilic, în panificatie; bacteriile lactice și propionice folosite în industria laptelui și la conservarea produselor alimentare; microorganisme dăunătoare care produc alterări ale alimentelor sau care prin consum de alimente contaminate produc îmbolnaviri ale consumatorului.

Microbiologia produselor alimentare stă la baza controlului microbiologic și igienico-sanitar în diferite procese tehnologice pentru a asigura obținerea unor produse de calitate, prin respectarea normelor și standardelor microbiologice.

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALĂ – știința de investigare și control a fermentațiilor, respectiv a acelor procese industriale catalizate de către microorganisme selecționate sau de enzime produse de acestea, procese industriale din care rezultă un produs cu valoare economică, un produs eficient.

În prezent, cu ajutorul microorganismelor, se obțin peste 200 de produse la scara industrială, avantajos, numai pe cale microbiană: - alcooli: etilic, metilic, butilic, izopropilic;- acizi: citric, lactic, gluconic, acetic, kojic, ustilagic;- proteine; aminoacizi;- enzime; vitamine;- antibiotice; insecticide biologice.

În cantități mici se obtin hormoni, interferon, insulină.

BIOTEHNOLOGIA – un sistem integrativ și multidisciplinar care integrează biochimia, biologia moleculară, microbiologia (cea industrială în special), informatică, microelectronică, prin care microorganisme ca atare, țesuturi de celule vegetale sau animale, enzime sau microorganisme obținute prin inginerie genetică, sunt dirijate la tehnologii care includ un coeficient mare de inteligență și care permit dezvoltarea industriilor alimentare, farmaceutice, medicale și de protecție a mediului înconjurător.Domeniul agroalimentar este unul dintre marii beneficiari ai dezvoltării biotehnologiei, fiind capabil ca într-un viitor apropiat să asigure majoritatea materiilor prime necesare hranei omenirii. Procesele tehnologice de obținere a produselor alimentare, cu unele excepții (industria zahărului, industria uleiurilor, industria morăritului), sunt biotehnologii care se bazează pe folosirea microorganismelor sau metaboliților acestora.Implementarea biotehnologiilor avansate în industria alimentară urmărește realizarea următoarelor obiective: obținerea unor alimente sigure și de calitate, a alimentelor probiotice și nutraceutice; realizarea unor bioproduse alimentare cu rol terapeutic pentru diferite segmente țintă de consumatori (copii, bătrâni, persoane hipertensive, diabetici) dar și a unor alimente cu rol în prevenirea unor maladii sau utilizabile ca adjuvanți în tratamentul unor boli; obținerea de ingrediente și aditivi alimentari prin procedee biotehnologice; crearea unor biotehnologii mai puțin energofage decât tehnologiile clasice; ecologizarea proceselor tehnologice din industria alimentară prin folosirea unor biotehnologii avansate.

CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME CU IMPORTANŢĂ ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ

Drojdiile - organite monocelulare de tip eucariot care se înmultesc prin mitoză (înmugurire), sau prin meioză (sporulare) și au drept caracteristică principală calitatea de a produce fermentarea zaharurilor simple cu formare, în condiții anaerobe, de alcool etilic și dioxid de carbon. - au rol foarte important și sunt folosite în industria alimentară la fabricarea vinului, a berii, a spirtului de fermentație, a pâinii și produselor derivate, a drojdiei comprimate.- au o compozitie chimică valoroasă și sunt folosite în microbiologia industrială la obținerea de proteine ce pot fi folosite în alimentația omului (de tip SCP – single cell protein), la obținerea de drojdii furajere pentru alimentația animalelor, drojdii care conțin 5,5% proteină, vitamine din grupul B, aminoacizi.- pot conduce la extracte lizate, plasmolizate, folosite ca aditivi alimentari sau care îmbogățesc mediile de cultură destinate cultivarii microorganismelor selecționate.

Prin mari poluări genetice sau hibridizări, cu ajutorul drojdiilor se pot obține substanțe valoroase cum ar fi: interferon, cu efect citostatic și antiviral; vitamine din grupul B, cu efect terapeutic complex.

Raspandire

Drojdiile sunt răspândite în 4 mari habitaturi naturale reprezentate de: sol, aer, suprafața plantelor, apă.În sol sunt răspândite în stratul superficial unde ajung în mod natural de pe fructe, rădăcini de leguminoase și se găsesc în special în solul grădinilor, al vițelor de vie. În aer se răspândesc datorită curenților de aer.Pe suprafața plantelor și fructelor drojdiile alcătuiesc microflora epifită. În acest habitat răspândirea e favorizată de insecte. Drojdiile rezistă în tractul digestiv al insectelor și iarna, iar primăvara, cu primul drum al acestora, sunt depuse pe suprafața vegetală. În organismul animal drojdiile sunt componente ale microflorei intestinale și aparțin genului Candida care poate cuprinde și specii patogene: Candida albicans care produce candidoze. În apă sunt raspândite chiar pâna la 4000 m adâncime.

Caractere morfofiziologice

Forma celulei de drojdie: ovală, rotundă, elipsoidală (drojdiile de fermentație din genul Saccharomyces), sferică (drojdiile din genul Torulopsis), de lămâie (drojdiile din genurile Hanseniaspora, Kloeckera), sau cilindrică.Cultivarea în mediu lichid, de must de malț, a drojdiilor fermentative face posibilă observarea în timp a unei tulbureli, urmată de formarea de spumă și, în finalul fermentației, are loc depunerea celulelor de drojdie și limpezirea mediului.Drojdiile oxidative și micodermice, cultivate în același tip de mediu, se dezvoltă la suprafața mediului formând un voal cutat, gros, alb gălbui, destul de persistent (drojdii ce dau floarea vinului).Colonia – biomasa de celule ce rezultă în urma cultivarii pe mediu solid și a înmulțirii unei singure celule.

Forma și aspectul coloniei - depinde de specie și gen; - profilul poate fi lenticular, triunghiular sau bombat cu gurgui central; - perimetrul coloniei poate fi circular, neregulat și uneori triunghiular; - aspectul coloniilor variază de la alb strălucitor la mat, cenușiu și există și colonii de drojdii colorate în roz, roz-portocaliu (Rhodotorula) datorită pigmenților carotenoidici.

Caractere fiziologice generaleDrojdiile sunt facultativ anaerobe. În condiții de aerobioză zaharurile sunt asimilate până la dioxid de carbon și apă, obținând-se astfel o cantitate mare de energie necesară creșterii și înmultirii rapide.Domeniul de temperatura: 0-35°C; Temperatura optima de înmultire: 28-32°C;Temperatura de fermentare: 30°C pentru drojdii de fermentație superioară (pâine); 6 -12°C pentru drojdii de fermentația inferioară (bere);PH-ul optim: 4,5 – 6,5.

Stari ale celulelor de drojdie

Metabioză: stare activă în care drojdiile cresc și se înmultesc prin înmugurire;Anabioză: stare în care celula își menține caracterele vitale dar nu se mai poate înmulti;Autoliză: are loc solubilizarea compușilor intracelulari sub acțiunea enzimelor proprii, stare ce conduce la moartea fiziologică a celulei.Plasmoliză: stare dependentă de presiunea osmotică a mediului hipertonic; celula pierde apa, membrana citoplasmatica se zbârcește, celula trece în stare de anabioză care dacă se menține conduce la moartea celulei (proprietatea este folosită la conservarea alimentelor în sirop de zahăr sau saramură).Turgescență: starea celulei imersate în mediu hipotonic (apă distilată) care, pentru a realiza izotonia, își mărește volumul și se produc fisuri la nivelul peretelui celular.

Progrese ale ingineriei metabolice la Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae este fără îndoială cel mai investigat microorganism eucariot care apermis nu numai înțelegerea biologiei celulei eucariote, ci și pe cea a celulei umane.Saccharomyces cerevisiae reprezintă un microorganism preferat în cercetare deoarece estenepatogen, uşor de cultivat în laborator, implicat în obţinerea unor numeroase produse alimentare pe cale fermentativă (vin, bere, pâine, etanol), definit drept GRAS (Generally Recognized as Safe) adică ca un organism sigur, netoxic, de către U.S. Food and Drug Administration (Byrne și colab., 2005; Hahn-Hagerdal și colab., 2001). Un alt motiv important al aplicabilității sale în afară de cel biotehnologic, îl constitue susceptibilitatea la modificări genetice prin tehnologia ADN-ului recombinant, proprietate care a fost facilitată și de cunoașterea întregului său genom (Goffeau și colab., 1996). Baze de date precum Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org) și Comprehensive Yeast Genome Database (http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast) conțin o cantitate enormă de informații referitoare la cadrele deschise citirii (Open Reading Frames) ale drojdiei Saccharomyces cerevisiae sau despre produșii de expresie ai genelor. Ca o completare, bazele de date oferă accesul la rezultatele studiilor de DNA microarray (http://transcriptome.ens.fr/ymg/index.php) și la informațiile legate de relațiile dintre rețelele proteice. Totodată Saccharomyces cerevisiae are un rol major în cercetarea aplicată datorită remarcabilei sale capacități de a produce etanol și dioxid de carbon din glucoză. Această drojdie este relativ tolerantă la valori scăzute ale pH-ului și la concentrații înalte de glucide și etanol, aspect pozitiv pentru industria fermentativă prin riscul scăzut de contaminare. Mai mult decât atât, această drojdie este extrem de rezistentă la inhibitorii prezenți în biomasa vegetală hidrolizată și este capabilă de a crește în condiții anaerobe realizând astfel fermentația. Aceste elemente constitue principalele motive pentru care Saccharomyces cerevisiae a fost explorată și la nivel industrial, accentul fiind pus pe obținerea prin fermentație a unor importanți compuși biochimici precum: glicerolul, propandiolul, acizii organici, alcoolii steroizi sau izoprenoizi. Aceste substanțe sunt utilizate fie direct în industria farmaceutică sau chimică, fie reprezintă precursori pentru viitoarele sinteze chimice sau enzimatice. Ingineria genetică a tulpinilor de drojdii utilizate îndiferite industrii a ridicat numeroase provocări pentru cercetători deoarece calitatea senzorială a pâinii sau a băuturilor alcoolice este determinată de numeroși compuși, care trebuie să fie prezențiîn cantități foarte bine echilibrate.

Saccharomyces cerevisiae este capabilă să fermenteze glucoza, manoza, fructoza, maltoza și zaharoza, dar nu poate fermenta celobioza, xiloza, sau arabinoza, principalele glucide din

resursele lignocelulozice derivate din plante. Extinderea gamei de substraturi asupra cărora poate acționa Saccharomyces cerevisiae reprezintă o opțiune importantă în utilizarea materialelor neprelucrate, precum produșii nefolositori din agricultură sau pentru sinteza unor compuși biotehnologici la scală industrială. Un organism optim pentru producerea de etanol din biomasă lignocelulozică ar trebui să fie capabil să hidrolizeze poliglucide și să utilizeze toți compușii fermentabili pe care să-i transforme în etanol.Nici un microorganism cunoscut până în prezent nu prezintă toate aceste caracteristici. De exemplu, Saccharomyces cerevisiae nu poate utiliza celuloza sau hemiceluloza. Mai mult decât atât, nu poate utiliza multe din componentele rezultate în timpul hidrolizei biomasei lignocelulozice precum xiloză, arabinoză, acid glucuronic sau alte oligozaharide.

POLIMORFISMUL GENOMULUI DROJDIILOR DE VIN

Pe lânga cei 16 cromozomi, genomul S. cerevisiae conține ADN mitocondrial, retrotranspozoni Ty (35- 55 copii per genom haploid), 50- 100 copii ale plasmidului de 2m, si elemente genetice citoplasmatice. Aproximativ 70% din secvența ADN este organizată în ORF-uri (un ORF la fiecare 2Kb), genomul lui S. cerevisiae conținând aprox. 6000 de gene, dintre care 275 pentru ARNt, 140 pentru ARNr, 20 pentru ARNsn și restul pentru proteine. Doar 4% dintre ORF-uri conțin introni. Tulpinile implicate în vinificație manifestă un înalt polimorfism, aproape că nu există două izolate care să prezinte cariotipuri și modele de restricție a ADN mitocondrial identice, existând doar un anume grad de similaritate între tulpinile aparținând aceleiași specii. Acest fapt s-ar datora influenței factorilor din mediul de fermentație, fapt susținut prin aceea că tulpinile de laborator sunt haploide sau diploide și manifestă o constantă a cariotipului, prin opoziție cu tulpinile de vin, care sunt diploide, aneuploide, diploide, homotalice și înalt heterozigote, cu un polimorfism cromozomial pronunțat.S-au constatat variații semnificative ale microbiotei, funcție de microregiune și de condițiile de mediu, la rândul lor variabile, de la an la an. Totodată, s-a observat substituția treptată a tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae, care se realizează pe măsură ce crește concentrația alcoolului în mediul de fermentație.Nu s-a putut stabili o corelație între similaritățile de nivel genetic și distribuția geografică a drojdiilor de vin- a rămas neclar dacă prezența unui grup de tulpini asemănătoare într-o anumită regiune este rezultatul răspândirii lor pe cale fie naturală, fie antropică.

Necesitatea identificarii izolatelor naturale- cazul drojdiilor de vin

Exista, in domeniul vinificatiei, biotehnologie traditionala, bine intemeiata, doua tendinte aparent contradictorii. Producerea anumitor soiuri constituie monopolul anumitor viticultori. Prin urmare, pentru producatorii de vinuri superioare, nobile, rare, identitatea tulpinii este, in ultima instanta, un secret profesional. Pe de alta parte, exista o sumedenie de vinuri de consum, de calitate satisfacatoare, care se produc in cantitati mari si pentru care aspectul identificarii drojdiilor implicate este foarte important. Faptul ca productia de vin este, totusi, majoritar reprezentata de soiuri de consum, „de masa” a oferit campul necesar de actiune pentru cercetare. S-a constatat ca identificarea precisa a microorganismelor implicate in vinificatie nu aduce prejudicii, din contra, poate contribui la imbunatatirea calitatii produselor. Practic, se trece de la metoda traditionala, de fermentatie necontrolata, la metode moderne, care presupun supunerea

fermentatiei unui anumit control, prin introducerea unor tulpini de drojdii bine caracterizate, care sporesc, prin activitatea lor, calitatile vinului obtinut.

Influența factorilor de mediu asupra metabolismului drojdiilor de vinEchipamentul enzimatic al drojdiilor de vin. În must sunt active numeroase enzime produse de drojdiile vii sau eliberate dupã autolizã. Acestea se caracterizeazã prin mãrirea capacitãþii de biosintezã, de reglare a metabolismului și a realizãrii unei permeabilitãții a melaninei citoplasmatice. Drojdiile împreunã cu enzimele din struguri vor cataliza reacțiile de oxido-reducere care condiționeazã transformarea mustului în vin.Absorbția și fermentația zaharurilor. Drojdiile fermenteazã D-glucoza, D-fructoza, maltoza,zaharoza, galactoza și 1/3 din rafinozã. Nu sunt fermentate lactoza, melibioza, dextrinele. Absorþia zaharurilor se face la nivelul membranei citoplasmatice, prin difuzie sau prin transport activ, sub forma esterilor fosforici, cu consum energetic din partea celulei, necesar pentru activizarea transportorului. Viteza de fermentare este mare în intervalul de transformare a concentrației de zahãr, de la 85% la 15% în alcool, dupã care aceasta scade.Substanțele de metabolism ale drojdiilor cu efect inhibitor asupra fermentației zaharurilorreziduale. Hexozele fac parte din zaharurile reducãtoare și se gãsesc în vinul tânãr. Ele sunt fermentate lent de cãtre drojdii din cauza substanțelor inhibitoare (alcoolul etilic și acizii grași) din mediu.Cauzele stagnãrii procesului de fermentaþie sunt urmãtoarele:condițiile de desfãșurare a fermentației, cu formarea condițiilor de anaerobiozã și temperaturi ridicate de fermentație, care inhibã biosinteza sterolilor care participã la reglarea stãrii fiziologice a membranei;concentrația excesivã de zahãr;carența mediului în vitamine;carența mediului în surse de azot;prezența substanþelor cu efect antilevuric (reziduuri de pesticide)Substanțe produse de: Aspergillus, Penicillium, Mucor ºi bacterii:Acetobacter, Gluconobacter;concentrația în alcool etilic;acumularea în mediul de fermentație a acizilor grași cu 8 și 10 atomide carbon în moleculã.Concentrația în celule și starea fiziologicã a drojdiilor. Viteza de fermentație crește prin creșterea numãrului de celule de drojdie. Pentru fermentarea complete a zahãrului din must este necesar un numãr mare de celule de drojdii, aproximativ 107/cm3 must, cu condiția ca acestea sã fie viabile.Fermentația nedirijatã a mustului de struguri se produce datoritã a trei factori și anume:creșterea numãrului de celule;capacitatea de supraviețuire a populației de drojdii;activitatea metabolicã a biomasei de celule.În cazul fermentației dirijate se recomandã adãugarea de culturi pure de drojdii, astfel încât sãDepãșeascã numeric microflora spontanã, adicã 100 milioane celule de drojdii la 1litru must fermentat.Formarea spumei în timpul fermentãrii mustului. Formarea spumei este datoratã prezenței unor tulpini de drojdii în mediu, care aderã la suprafața bulelor de dioxid de carbon

degajate prin fermentație alcoolicã. Spuma stabilã se formeazã datoritã altor tupini de drojdii controlate genetic și se datoreazã prezenței unor proteine specifice, localizate la suprafața celulelor de drojdii. Se recomandã selecționarea de drojdii care nu formeazã spumã pentru a mãrii capacitatea de ocupare a vaselor.Efectul pereților celulari ai drojdiilor. O datã obținute preparatele de drojdii, rezultã o fracțiune de pereții celulari, care adãugatã în must previne oprirea fermentației, acționând ca un factor de supraviețuire a drojdiilor.Adãugarea de 0,5 g/l dintr-un preparat de drojdie care conține fragmente de pereți celulari, este utilã în douã cazuri:când conþinutul în zaharuri inițial este ridicat;când mustul conþine substanțe chimice reziduale.În aceste cazuri are loc o absorbție selectivã a unor substanțe toxice pentru drojdii, în special a esterilor etilici ai acizilor grași cu 8 și 10 atomi de carbon în moleculã și a pesticidelor.Factorii de creștere și supravieþuire a drojdiilor de vin. În dezvoltarea drojdiilor se disting trei etape și anume:faza de multiplicare;faza de staționare;faza de declin.În funcție de concentrația în zaharuri, fermentația mustului poate dura de la 8 pânã la 40 zile, din care faza de multiplicare dureazã, 2-5 zile. În aceastã perioadã când s-a pornit de la un inocul natural de 105-106 celule/cm3, se ajunge la 106-108 celule/cm3.

Cauzele terminãrii fazei de multiplicare sunt urmãtoarele:epuizarea mediului în substanțe indispensabile dezvoltãrii drojdiilor;acumularea de alcooli și alte substanþe inhibitoare dezvoltãrii drojdiilor;modificarea structuralã a celulei de drojdie.Adãugarea unor factori de creștere (tiaminã 100mg/l sau de sãruri de amoniu) se favorizeazãmultiplicarea celulelor de drojdii, care duc la dublarea biosintezei componentelor și mãrind viteza de fermentație din cadrul primei etape.Dintre substanțele cu rol de factori de supraviețuire fac parte:sterolii (ergosterolul, colesterolul și lanasterolul);acidul oleooleic prezent în ceara cuticularã a bobului de strugure;hormonul peptidic, ocitocina.Biosinteza sterolilor în celulã este stimulatã prin aerarea moderatã a mustului.

Multiplicarea și dezvoltarea drojdiilorDrojdiile se înmulțesc prin înmugurire. În timpul înmuguririi se formeazã, prin diviziune, din celula mamã, o micã bulã, sub formã de protuberanțã, în citoplasma cãreia trece nucleul fiicã. Dupã separarea celulei fiice de celula mamã, de la înmugurire rãmâne o urmã, iar alte celule fiice rãmân atașate de celula mamã și formeazã lanțuri. Când microorganismele sunt transferate într-o soluție nutritivã proaspãtã, ele încep sã se dezvolte. Creșterea este coordonatã de unele legi fixe. Creșterea drojdiilor este divizatã în șase faze:faza latentã sau de inducție sau de lag, în care are loc activarea metabolismului. Lungimea fazei de inducție variazã foarte mult, depinzând de tipul organismelor, de vârsta culturii și de condițiile de cultivare. Faza latentã se sfârșește cu prima diviziune;faza de accelerare are loc înmulțirea continuã a celulelor cu dublarea numãrului de celule;

faza exponențialã sau creșterea logaritmicã, are loc continuarea ratei de creștere, care este constantã și maximã și are loc într-o perioadã limitatã de timp. Pentru drojdii, în condiții optime de multiplicare, timpul este de aproximativ 90.120 minute;faza de decelerare, în timpul cãreia rata descreșterii graduale are loc din cauza reduceri cantitãții de substanțe nutritive și a creșterii cantitãții de metaboliți inhibitori;faza staționarã, în aceastã fazã numãrul microorganismelor rãmâne constant, existã o balanțã între celule noi, care se formeazã și a celor care mor;faza de declin, în aceastã ultimã fazã, rata de celule moarte exced ratei de celule noi formate, din aceastã cauzã numãrul celulelor descrește. Durata și mãrimea fiecãrei faze este influențatã de substrat, temperatura mediului și de starea fiziologicã a drojdiilor. Substratul trebuie sã conținã toți nutrienții necesari creșterii. Conținutul de apã, pHul și concentrația de oxigen sunt, de asemenea, decisive pentru creștere. Trebuie sã se ținã seama de:calitatea de drojdie din mediu;pH-ul mediului;temperatura mediului;rolul oxigenului;influența presiunii;influența aciditãții;influența alcoolului;acțiune dioxidului de sulf;influența azotului.

Apa este compusul cel mai important din materiile vii și joacã un rol important în procesul vital al microorganismelor. Microorganismele se dezvoltã într-un substrat care conține cel puțin 15% apã. Ele diferã considerabil unele de altele din punctul de vedere al optimului de pH. Drojdiile preferã un mediul acid, iar creșterea lor este asiguratã prin aerare. Temperatura are un efect foarte important asupra dezvoltãrii microorganismelor. Fiecare microorganism are o temperaturã optimã de dezvoltare caracteristicã, la care faza de lag este mai scurtã. Creșterea nu este restricționatã de temperatura optimã dar poate avea loc într-un domeniu mai larg. Pentru drojdiile din genul Saccharomyces aceastã temperaturã este între 25 ºi 30°C. Starea fiziologicã a celulei - vârsta și starea nutriționalã - joacã un rol determinant asupra duratei fazei de lag. În cazul drojdiilor, o activare rapidã a metabolismului se petrece dacã acestea sunt transferate într-un substrat proaspãt, în timpul fazei de creștere exponențialã. De aceea, la fabricarea drojdiei de panificație, o pornire rapidã a fermentãrii se obține cu drojdii preluate din stadiul de fermentare avansatã și adãugate melasã proaspãtã și aeratã.

Principalele genuri și specii utilizabile la obținerea drojdiilor selecționate

De la începutul utilizãrii lor și pânã în prezent drojdiile selecționate au fost și sunt folosite în scopul obținerii unor vinuri calitativ mai bune decât cele fermentate spontan.Un vin corect și sãnãtos se realizeazã cu drojdii din genul Saccharomyces, cele mai frecvent folosite sunt speciile: Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces oviformis și Saccharomyces bayanus. De curând au început sã se foloseascã și drojdii selecționate din genul Schizosaccharomyces și anume din specia Schizosaccharomyces pombe.Drojdii din specia Saccharomyces ellipsoideusDe la început, de când se folosesc în vinificație, s-au preferat levurile selecționate din specia

Saccharomyces ellipsoideus. Operațiunea pentru drojdiile eliptice a fost și este justificatã de faptul cã acestea, comparativ cu drojdiile sãlbatice, au o putere alcooligenã suficientã de mare, suportã concentrații de dioxid de sulf relativ ridicate, dau un randament ridicat în alcool, pun rapid stãpânire pe mediu și conduc întotdeauna la realizarea unui vin corect și sãnãtos. Prin drojdii sãlbatice se înțeleg celelalte drojdii, prezente în mod natural pe strugure, care dau rezultate mai puþin satisfãcãtoare la fermentarea mustului. Majoritate drojdiilor sãlbatice aparțin speciei Kloeckera apiculata, care în comparație cu Saccharomyces ellipsoideus formeazã mai multã aciditate volatilã și dã și un randament mai scãzut în alcool. Cu toate avantajele arãtate, existã și situații când fermentarea cu drojdii din specia Saccharomyces ellipsoideus nu este apreciatã pozitiv. Un exemplu în aceastã direcție îl constituie vinurile destinate distilãrii în vederea preparãrii coniacului. Rezultatele sunt cu mult mai bune când fermentarea unor astfel de vinuri se face spontan. Prezența drojdiilor apiculate în mediul de fermentare joacã un rol deosebit în dezvoltarea mirosului fructuos al buchetului de coniac. În prezent este unanim recunoscut cã folosirea drojdiilor selecționate din specia Saccharomyces ellipsoideus trebuie sã fie consideratã ca o mãsurã oenologicã indispensabilã la vinificarea recoltelor avariate, a celor provenite din podgorii recent înființate, în care predominã drojdii sãlbatice, la cele rezultate din plantații care au primit numeroase tratamente cu fungicide și insecticide, precum și în procesul producerii vinurilor spumante.Folosirea drojdiilor de Saccharomyces ellipsoideus prezintã o serie de avantaje:fermentația se poate regla mai ușor, dupã dorințã, deoarece ea nu este provocatã de drojdii necunoscute ajunse în must în mod întâmplãtor, ci numai de o anumitã clonã cu însușiiri cunoscute;garanția obținerii unui vin corect și sãnãtos este mai mare, parte din cauzele care duc la apariția unor defecte sunt îndepãrtate sau atenuante cu ocazia deburbãrii prin sulfitare, fermentația alcoolicã nu este însoțitã de alte fermentații, introduse în must drojdiile eliptice se înmulțesc rapid și pun stãpânire pe mediu, înlãturând posibilitatea apariției altor fermentații datorate bacteriilor și în mare parte drojdiilor sãlbatice ce eventual au mai rãmas dupã deburbare;faza prefermentativã este mult redusã, procesul se declanșeazã rapid, la 1-2 zile de la însãmânțare, decurge normal, iar pericolul întreruperii este de obicei exclus. Pentru o mai mare garanție se impune ca drojdiile sã fie sã fie înmulțite într-un mediu sulfitic, încât la introducerea lor în must, ele ã fie deja adaptate la un asemenea mediu;vinul se limpezește mai ușor și într-un timp mai scurt, creindu-se posibilitatea de a fi dat în consum mai devreme decât ce a fermentat spontan. La aceasta din urmã, microflora și diferitele precipitate, prin sedimentare, formeazã un depozit pulverulent care se separã mai greu decât cel care rezultã din fermentarea cu levuri eliptice, care de obicei este granular;gustul de pãmânt care apare la unele vinuri, datoritã naturii solului și soiului din care provin, nu se reliefeazã pregnant ca la cele fermentate spontan, ci din contra este ceva mai atenuat;tãria alcoolicã a vinului este mai ridicatã cu câteva zecimi de grad (pânã la 0,5% vol. alcool) faþã de cel fermentat sub influența microflorei naturale, iar parfumul de vin tânãr este mai agreabil. Folosirea drojdiilor eliptice este necesarã ori de câte ori se aplicã sulfitarea. Aceste douã operații, respectiv sulfitarea și inoculare, se completeazã reciproc.Drojdiile din specia Saccharomyces oviformisObținerea de vinuri seci din musturi bogate în zahãr necesitã prezenșa în mediul de fermentare a drojdiilor din specia Saccharomyces oviformis. Având o putere alcooligenã superioarã drojdiilor din specia Saccharomyces ellipsoideus pot fermenta zahãrul dintr-un mediu care deja este bogat în alcool. La fermentația spontanã, îndeosebi în prima parte, pânã ce gradul alcoolic n-a atins 10% vol. alcool, datoritã competiției, este posibil ca numãrul drojdiilor de Saccharomyces oviformis sã se diminueze foarte mult, iar uneori acestea chiar

dispar complet. Pentru a putea evita astfel de situații favorabile apariþiei diferitelor boli bacteriene, se recomandã folosirea drojdiilor selecþionate din specia Saccharomyces oviformis. Adaosul acestor drojdii se poate face înainte de pornirea în fermentaþie sau ulterior. În primul caz, preferabil la producerea vinurilor albe, reușita este asiguratã numai în condițiile în care însãmânțarea este masivã. Numãrul acestor drojdii, în momentul când vinul a atins tãria alcoolicã de 10% vol. alcool este cu atât mai mare cu cât numãrul inițial a fost mai mare. De obicei un adaos de 10 ori mai mare decât adausul de drojdii din specia ellipsoideus dã certitudine cã la sfârșitul fermentației zgomotoasã se mai gãsesc suficiente drojdii de Saccharomyces oviformis, care prin multiplicare sã punã stãpânire pe mediu. Din acest moment, când ele devin predominante, fermentarea trece pe seama lor. Când adaosurile se fac în cantitãți egale, Saccharomyces ellipsoideus predominã mediul așa de tare, încât Saccharomyces oviformis nu mai poate supravieþui pentru ca sã-și îndeplineascã rolul de drojdii finisoare. Dat fiind faptul cã în practica vinicolã, un adaos masiv de maia este greu de realizat, s-a preconizat ca introducerea maialei sã se facã și dupã declanșarea fermentației, mai precis în momentul când mediul de fermentare are tãria alcoolicã de 10% vol. alcool. La producerea vinurilor roșii, acest moment coincide, aproximativ, cu termenul de tragere a vinului de pe boștinã. Un adaos de Saccharomyces oviformis efectuat în acest moment s-a dovedit suficient pentru ca fermentația sã se desãvârșeascã complet. De altfel și noile orientãri opineazã ca adaosul de drojdii, în astfel de cazuri, sã nu se facã dintr-odatã ci succesiv, adicãdrojdii de Saccharomyces ellipsoideus la începutul fermentației și drojdii de Saccharomyces oviformis spre sfârșitul ei.Drojdii din specia Schizasaccharomyces pombeDrojdiile responsabile de fermentația alcoolicã, pe lângã transformarea zahãrului, produc și odescompunere parțialã a acidului malic în produse neacide. Prin aceastã degradarea, independentã de fermentația malolacticã, 15-25% din cantitatea inițialã de acid malic este transformatã în alcool etilic și dioxid de carbon.Drojdiile Schizasaccharomyces, prin natura particularitãților lor fiziologice, pot degrada, în aceleași condiții, cantitãți mult mai mari, ajungând pânã la 95% din acidul malic inițial. De aici s-a nãscut ideea folosirii lor la dezacidifierea recoltelor prea acide. Dintre speciile genului, s-a constatat cã Schizasaccharomyces pombe dã cele mai bune rezultate. Degradând acidul malic drojdia poate diminua aciditatea fixã fãrã formare de acizi volatili. Deci, din acest punct de vedere, specia Schizasaccharomyces pombe are un rol deosebit la fermentația recoltelor acide, unde poate sã înlocuiascã fermentația malolacticã. Folosirea drojdiilor Schizasaccharomyces prezintã însã și unele dificultãți. Astfel, datoritã competiției, acestea sunt foarte ușor eliminate de celelalte specii. Un rezultat bun se poate obține fie prin utilizarea lor în cantitãți foarte mari, fie prin sterilizarea completã a mediului de fermentare în care suntintroduse. Pentru a supraviețui în timpul fermentației ele trebuie sã reprezinte minimum 30% fațã de drojdiile inițiale, iar ca sã producã dezacidifierea doritã, proporția lor trebuie sã fie cu mult mai mare. Este suficient ca Saccharomyces oviformis reclamã însãmânțãri atât de masive încât devin irealizabile. O micșorare a cantitãții de drojdiilor Schizasaccharomyces poate fi acceptatã numai dacã recolta este în prealabil sterilizatã prin încãlzire la 75oC. Dar cum aceastã operație necesitã un consum ridicat de energie, fiind și foarte greu de efectuat, mai ales la vinificația în roșu, înseamnã cã pentru utilizarea, la scarã industrialã, a proprietãților dezacidifiate ale drojdiilor Schizasaccharomyces mai sunt necesare noi cercetãri.Un alt inconvenient, nu mai puþin important , pe care-l prezintã întrebuințarea drojdiilor Schizasaccharomyces. În vinificație, constã în faptul cã ele modificã nefavorabil calitatea vinurilor. Sub influența lor se formeazã cantitãți apreciabile de histaminã. Vinurile rezultate conținând frecvent hidrogen sulfurat, sunt mai puþin plãcute.

Tulpini de drojdii folosite în industria vinului

Printre drojdiile din genul Saccharomyces cerevisiae se disting numeroase tulpini de drojdii care sunt clasificate în douã grupe mari:tulpini de drojdie de fermentare superioarã, produc fermentarea plãmezii la temperaturi de 25-30oC, celula mamã și celula fiicã rãmân atașatã una de alta pentru un timp mai lung, se formeazã lanțuri ramificate, drojdiile înmulțite rãmân asociate și sunt ridicate de dioxidul de carbon și depozitate în spumã, nu formeazã flocoane;tulpini de drojdie de fermentare inferioarã, fermenteazã plãmada la temperaturi de 15-25oC. Dupã înmulțire, drojdia fiicã se desparte de drojdia mamã, formând agregate dintr-un numãr mic de drojdii superioare, care se depun compact sau mai puþin compact, la sfârșitul fermentației. Fermenteazã rafinoza în totalitate, au un coeficient de respirație și o capacitate de înmulțire redusã. Se depun la sfârșitul fermentãrii la baza vasului.Cele mai importante diferențe fiziologice între drojdiile de fermentație joasã și drojdiile de fermentație înaltã se referã la:respirație;metabolism;capacitatea de a forma spori;capacitatea de a fermenta rafinoza (cele de fermentație inferioarã).În cazul drojdiilor de fermentație joasã predominã metabolismul fermentativ, în timp ce la drojdiile de fermentație înaltã mai pronunțat este metabolismul respiratoriu. Recolta de drojdie la sfârșitul fermentãrii este mult mai mare în cazul drojdiilor de fermentare înalte decât a celor de fermentație joasã. Drojdiile de fermentație joasã au un conținut enzimatic mai mic decât drojdiile de fermentare înaltã. Drojdiilor de fermentație joasã au abilitatea de a forma ascospori limitat, sporuleazã mai puțin, iar formarea sporilor dureazã mai mult. Dupã modul de comportare la floculare, drojdiilor de fermentație joasã se împart în:drojdii pulverulente, se caracterizeazã prin aceea cã celulele rãmân separateuna de alta, sunt repartizate fin prin mediul lichid și se depun la sfârșitul fermentãrii;drojdii floculante, se caracterizeazã prin aceea cã se adunã dupã un timp scurt și formeazã flocoane care se depun rapid, iar capacitatea floculantã este determinatã genetic împreunã cu toleranța la temperaturã. Abilitatea drojdiilor de a flocula are foarte mare importanțã practicã, aceste drojdii floculante au un grad de fermentare mic, iar depozitul de drojdie este compact. De tulpina de drojdie folositã depinde randamentul și calitatea vinului obþinut. De aceea, drojdiile sunt selecționate, conservate și multiplicate în condiții optime.Principalele caracteristici ale drojdiilor folosite sunt:viteza de fermentare;capacitatea de fermentare;toleranța la alcool;osmotoleranța;rezisteța la antiseptice;rezistența la produsele sintetizate de microflora de contaminare etc.Tulpinile de drojdii folosite în vinificație trebuie sã aibã urmãtoarele însușiiri:sã fermenteze complet zahãrul din substrat;sã reziste la o concentraþie alcoolicã scãzutã;sã reziste la un pH scãzut caracteristic plãmezii din melasã;

sã aibã o capacitate redusã de spumare;sã aibã o capacitate de floculare ridicatã.

Culturi de drojdii destinate vinificației

O verigă importantă din lanțul fluxului tehnologic o constituie și folosirea drojdiilor. În mustul provenit din strugurii sănătoși, fermentația demarează rapid fără a fi necesarã introducerea de culturi starter. În mustul provenit din strugurii infectați pentru demararea fermentației este necesarã folosirea de culturi starter. Avantajele folosirii culturilor starter sunt mai multe și ele se folosesc în urmãtoarele cazuri:fermentația decurge lent, din cauza numãrului scãzut de drojdie provenit de la strugurii spãlați de ploi sau a mustului provenit din strugurii mãnați și tratați cu doze mari de dioxid de sulf;fementația are loc la temperaturi scãzute;la obținerea vinurilor spumante;fermentația la rece a vinurilor roșii.Prin realizarea unor mutaþii genetice a tulpinilor de drojdii s-au obținut celule cu calitãți deosebite.Proprietãțile specifice drojdiilor din vin sunt urmãtoarele:putere alcooligenã drojdiile sunt capabile sã fermenteze zaharurile din must producând alcool etilic pânã la 18-20% vol. alcool;alcoolorezistențã drojdiile pot declanșa fermentația și în prezențã de alcool etilic, în proporție de 8 -12% vol. alcool;osmotoleranțã drojdiile produc fermentația alcoolicã pânã la o concentrație de 10-13% vol. alcool, în mediu cu o concentrație inițialã în glucide de 30%;sulforezistențã drojdiile produc fermentația alcoolicã și în prezențã de dioxid de sulf, în cantitãți de pânã la 300mg dioxid de sulf/l;rezistențã la tanin în cazul vinificãrii în roșu sau la tratamente cu enzime pectolitice;formarea unei pelicule la suprafaþa lichidului în prezența aerului în vinurile cu 16% vol. alcool, de tip Xeres;proprietãți fiziologice specifice formare de acizi organici, din alcooli superiori, formare în cantitate micã de acizi volatili, eliberarea de substanþe cu efect stimulator sau inhibitor asupra bacteriilor care sunt agenți ai fermentației malolactice, caracterul killer, formarea spumei etc.;capacitatea de a crește și produce fermentații la presiuni ridicate de dioxid de carbon cu formare de sedimente pulverulente, aceste drojdii sunt folosite pentru obținerea de vinuri spumante.În funcție de proprietãțile tehnologice, drojdiile se clasificã în mai multe grupe:drojdii criofile produc fermentația mustului la temperaturi scãzute, de 7-12ºC, se obțin vinurile albe seci sau vinuri spumante. Vinurile se caracterizeazã printr-o aromã specificã strugurilor din care provin. La vinurile spumante unde s-au folosit aceste tulpini de drojdii, fermentația decurge mai lent, este completã, se îmbunãtãțește aroma, crește gradul alcoolic și se pãstreazã activitatea sistemului enzimatic;drojdii termofile produc fermentarea la temperaturi ridicate, de 30-35ºC, sunt folosite în centrele viticole tropicale;drojdii spumante au proprietãți hidrofobe determinate de proteinele existente în pereții celulari care migreazã în spumã și plutesc la suprafața lichidului în timpul fermentației alcoolice. Odatã terminatã fermentația, aceste drojdii se depun ușor permiþând limpezirea rapidã a vinului;

drojdii nespumante au proprietãți hidrofile, permit fermentația rapidã a mustului, nu permit o spumarea abundentã, au un grad de flotabilitate scãzut și se disperseazã uniform în must. Dintre dezavantaje amintim: sedimentarea lentã la finele fermentației. Existã unele gene de Leuconostoc oenos care se introduc și alãturi de drojdia din vin degradeazã fermentativ acidul malic.În comparație cu alte tehnologii fermentative, în vinificație mustul de struguri nu este supusprocesului de pasteurizare și el conține cantitãți ridicate de drojdii, mucegaiuri și bacterii. Pentru obținerea de vinuri de calitate se impune folosirea de culturi selecționate. Aceste culturi se obțin în minim patru ani de lucru trecându-se prin mai multe etape de lucru.Selectarea culturi de drojdie ține seama de urmãtoarele criterii:comportamentul drojdiei în timpul fermentãrii (viteza de fermentare, rezistența le factorul Killer, gradul de spumare, cantitatea de drojdie formatã în depozit);randamentul în alcool și puterea alcooligenã;cantitate de zahãr nefermentatã;capacitatea de formarea glicogenului și alcoolilor superiori;formarea compușilor volatili (acizi volatili);rezistența la temperaturi ridicate și scãzute.Drojdiile selecționate folosite se prezintã sub formã de drojdii cremã, presate și sub formã de drojdii liofilizate. În industria vinicolã sunt utilizate mai rar drojdiile sub formã de cremã și cele presate, deoarece se pãstreazã greu datoritã umiditãții ridicate, care depãșește 70%. De asemenea, puritatea microbiologicã se poate asigura mai greu, ele se pot degenera ușor și sub aceastã formã sunt supuse infecțiilor cu bacterii, mucegaiuri și alte drojdii. Drojdiile sub formã de cremã se obțin în urma separãrii prin centrifugare a drojdiilor din mediu lichid. Cele presate se preparã dupã aceeași tehnologie, la care se aplicã în plus o filtrare sterilã, printr-un material filtrant textil, urmatã de separarea lor de pe pânza filtrantã, presarea și ambalarea sterilã. Livrarea drojdiilor selecționate se face în flacoane, pungi din plastic, etc.de diferite capacitãți care sunt cuprinse între 100-500ml. Din aceste se preparã maielele de drojdii selecționate.

Modificarea biotehnologică a Saccharomyces cerevisiae: strategie de îmbunătățire a calității vinului

Completa secvențiere a genomului drojdiei a condus la: dezvoltarea unor instrumente care monitorizează schimbările globale în configurația expresiei genetice și a profilelor proteinelor; răspunsul la manipularea genetică sau de mediu; aplicarea unor instrumente genomice sau proteomice pentru o întelegere a caracteristicilor fiziologice și răspunsurilor biologice ale acestui organism; determinarea posibilelor consecințe biologice ale schimbării genetice directe.

Alte cercetări: Dezvoltarea de instrumente moleculare sofisticate pentru analiza transferului lateral de gene; Tratamente de modificare genetică a diferitelor tulpini de Saccharomyces cerevisiae și a altor drojdii și bacterii cu care organismul împarte mediul. Tehnici de screening rapid care elimină utilizarea rezistenței la medicamente sau alți ADN ca markeri și previne transferul genelor către alte organisme din mediu.

Împreună cu Saccharomyces bayanus - conversia mustului în vin;

Îndelungata asociere cu rasa umana si faptul ca vinul este produs de peste 7000 ani, Saccharomyces cerevisiae a evoluat la speciile moderne de azi in mediul fermentatiei anaerobe.

In prezenta aerului, pe suprafata fructelor, in prezenta radiatiei ultraviolete si la temperaturi extreme - prezinta lipsa de dominanta si nivel relativ mare de sensibilitate.

Inocularea greoaie a viilor cu tulpini specifice demonstreaza slaba rezistenta a acestui organism la conditii salbatice - reduce riscul contaminarii mediului cu tulpinile de Saccharomyces recombinante;

asocierea dintre drojdie si oameni - oamenii pot deveni vectori ai transferului drojdiei de la o productie la alta (In industria vinului, sursa drojdiilor contaminante a reprezentat-o angajatii).

Proprietati ale drojdiei, responsabile de imbunatatirea calitatii vinului sau procesului tehnologic

1.Metabolismul drojdiei - responsabil de aparitia catorva componente organoleptice ale vinului. Drojdia genereaza numeroase componente detectabile in vin ca: alcooli si esteri ai acestora, acizi grasi volatili, aldehide, compusi volatili cu sulf, esteri derivati din metabolismul aminoacizilor si fenoli volatili rezultati din modificarile enzimatice ale compusilor fenolici ai plantelor. 2.Obtinerea de tulpini de Saccharomyces recombinante pentru usurarea producerii vinului sau pentru stabilizarea lui.

Metode de imbunatatire a proceselor tehnologice si a calitatii vinului 1.tulpini de drojdii optimizate pentru productia de proteaze acide pentru a previne denaturarea vinului dupa fermentare de catre proteine (reducerea continutul de proteine al vinului).

2.tulpini de Saccharomyces cu activitate pectinazica sau celulazica - o alternativa de preparate enzimatice comerciale (aditia unei enzime poate fi mai usor de controlat si monitorizat decat o tulpina recombinanta) pentru imbunatatirea filtrabilitatii vinului, prin degradarea polizaharidelor din struguri.

3. tulpini de drojdie cu activitati enzimatice care imbunatatesc eliberarea aromei strugurilor.

Obiectivele ingineriei genetice la Saccharomyces cerevisiae pentru productia de vin Imbunatatirea performantei fermentatiei prin: toleranta mare la etanol, acetaldehida sau acetat;

toleranta mica sau mare la temperatura;

utilizarea eficienta a resurselor de azot;

rezistenta la stres.

Imbunatatirea calitatilor organoleptice prin: eliminarea pierderilor de productie;

cresterea productiei de glicerol;

cresterea eliberarii de esteri din drojdie;

imbunatatirea eliberarii compusilor de aroma din precursori glicozizi-glucoza;

cresterea cantitatii de enzime cu rol in biosinteaza compusilor de aroma.

Usurarea procesarii vinului prin: eliminarea opalescentei vinului;

degradarea pectinelor din struguri sau a poliglucidelor;

reglarea abilitatii de floculare;

toleranta la sulf;

productia de bacteriocine.

Modificari benefice pentru sanatate prin: eliminarea carbamatului de etil;

imbunatatirea continutului de vitamine;

eliminarea reziduurilor de pesticide/micotoxine/metale grele;

eliminarea inhibitorilor compusilor fenolici/ a celor cancerigeni naturali care exista in plante;

imbunatatirea nivelelor de substante bioactive/ antioxidanti

Utilizarea ingineriei genetice a.tulpinile care modifica aroma sunt acceptate de catre consumatori ca un mod de a ascunde anumite greseli de fabricatie. b. schimbari genetice care fac vinul mai sigur pentru consumul uman si il imbunatateste din punct de vedere nutritional. c. obtinerea de tulpini care reduc aparitia carbamatului de etil in mediul de fermentatie. Carbamatul de etil = substanta naturala, cancerigena care se formeaza spontan din reactia gruparilor carbamil care contin uree si etanol - in toate bauturile fermentate.

- carbamatul de etil a facut parte timp de secole din dieta omului - studii pentru reducerea aceastei substante.

- obtinerea de tulpini care sa influenteze valoarea nutritiva a vinului prin cresterea continutului de vitamine si a cofactorilor acestora; - obtinerea de tulpini recombinante de drojdii pentru a creste continutul in substante fitochimice cum ar fi resveratrolul;

- obtinerea de compusi fenolici bioactivi care se pare ca joaca un rol pozitiv in prevenirea anumitor boli.

Saccharomyces cerevisiae si mediul inconjurator se gaseste in natura pe suprafata strugurilor. Desi reprezinta o minoritate a microflorei existente pe struguri, domina fermentatia.

Initial, continutul de Saccharomyces cerevisiae in sucul de struguri este de la 1 la 100 celule/ml, in timp ce alte drojdii si bacterii se gasesc in numar de la 10(6) la 10(8) cfu/ml. La sfarsitul fermentatiei exista aproape cultura pura de Saccharomyces cerevisiae deoarece aceasta drojdie este foarte bine adaptata la mediul fermentativ.

Proprietati biologice fac sa permita dominanta lui Saccharomyces cerevisiae rezistenta drojdiei la etanol. Concentratiile de 6% si 7% (v/v) etanol sunt inhibitoare pentru majoritatea organismelor in timp ce Saccharomyces tolereaza >12% chiar pana la 17%.

Sensibilitatea la etanol este crescuta daca pH-ul este mai mic de 4, iar pH-ul mustului este intre 3 si 4. Sensibilitatea este de asemenea crescuta la temperaturi mai inalte, iar fermentatia rapida creste temperatura mediului contribuind astfel la cresterea toxicitatii etanolului.

Saccharomyces poate capta cu usurinta micronutrientii din mediu. Aceasta drojdie elibereaza sulfiti la nivele care inhiba bacteriile. Saccharomyces se pare ca rezista la factori inhibitori cum ar fi acid acetic sau alti produsi de metabolism ai altor organisme.

Mustul de struguri are o osmolaritate mare (20-28%) si mari concentratii de glucide existand o concentratie echimoleculara de glucoza si fructoza. Saccharomyces tolereaza schimbarile mari in ceea ce priveste transformarea glucidelor in alcool;

Mediul de fermentatie este limitat in azot - analizele genomice au aratat ca tulpinile comerciale sunt eficiente in reciclarea azotului. Tulpinile de Saccharomyces cerevisiae pentru vin consuma repede aminoacizii.

In timpul fermentatiei, celulele nu cresc, iar glucidele se transforma in etanol. O rata de fermentatie potrivita necesita nutrienti specifici numiti factori de supravietuire, necesari pentru a mentine rata fermentativa la o densitate mare a populatiei si in prezenta a mari concentratii de etanol.

Impactul strategiilor de inginerie genetica in tulpinile de Saccharomyces pentru vin Procesul de obtinere a vinului = proces natural si depinde de activitatea unor bacterii si a unor drojdii alaturi de drojdia Saccharomyces.

Aroma si savoarea trebuie mentinuta si protejata pe tot parcursul procesului.

Cand obtinerea vinului nu se face in conditii sterile, orice tulpina introdusa poate deveni un rezident al locului si pot aparea schimburi genetice cu alti membri de la alte specii - orice strategie de constructie genetica a tulpinilor de vin poate fi considerata un risc de transfer lateral de gene si poate conduce la contaminare incrucisata a lotului.

Schimbarile pot sa nu altereze abilitatea tulpinii de a domina mediul nativ, de a avea toleranta la etanol sau de a continua procesul de fermentatie.

In aditie la transferul lateral de gene, in dezvoltarea tulpinilor modificate genetic trebuie luate in considerare: - persistenta tulpinilor; - dominanta tulpinilor; - activitati nedorite ale microorganismelor; - mutatii secundare; - stabilitatea schimbarii genetice; - impactul altor microorganisme din mediu.

Persistenta organismelor modificate in mediul centrului de vinificatie este cruciala Tulpina ideala = cea care domina fermentatia cand este utilizata ca inocul dar care sa nu domine flora centrului de vinificatie. Acest lucru este foarte greu sa se obtina in practica.

Persistenta in acest caz inseamna nu numai prezenta pe parcursul fermentatiei dar si abilitatea de a forma biofilme si a inlocui alte specii rezidente din centru.

Tulpinile de Saccharomyces modificate genetic trebuie sa: fie capabile sa concureze cu microorganismele native ale aceleiasi specii dar sa nu fie in competitie cu ele pentru dominanta in biofilme;

mentina caracteristicile biologice care permit dominanta in mediul nativ asupra altor drojdii si bacterii;

sa nu genereze caractere nedorite ale vinului sau sa lipseasca vinul de componentele organoleptice importante.

Caractere noi prin inginerie genetica A fost dezvoltata o strategie noua prin utilizarea Saccharomyces pombe care degradeaza malatul la etanol intr-un proces mai complex. Malatul este convertit la piruvat care este apoi succesiv este degradat la etanol si bioxid de carbon.

Desi Saccharomyces cerevisiae poseda aceeasi cale metabolica, afinitatea substratului enzimei malice din Sacharomyces pentru malat este asa de mica astfel incat elimina conversia malatului la piruvat in conditii enologice.

Saccharomyces nu poseda malat permeaza, astfel ca malatul este transportat in celula prin difuzie pasiva.

Nivelul citoplasmatic al malatului este mai mic de Km al enzimei.

Genele care codifica malat permeaza in Saccharomyces pombe (mae1) si enzima malica (mae2) sunt utilizate pentru a transforma tulpina de Saccharomyces cerevisiae, a o face mai eficienta in catabolismul malatului.

Expresia tulpinilor genei bacteriene mleS a fost de asemenea transformata cu transportorul de gene mae1.

Cea mai veche modificare genetica: obtinerea unei tulpini producatoare de enzime bacteriene care catalizeaza conversia acidului malic la lactat.

Acidul malic si acidul tartric sunt doi importanti acizi care se afla in struguri. In regiunile mai reci, continutul de acid malic poate fi foarte mare in timpul recoltarii conducand la vinuri cu gust excesiv astringent.

Bibliografie:1. Genetica microorganismelor si inginerie genetica microbiana-Note de curs si

tehnici de laborator2. Tehnologia alcoolului si a drojdiei-Note de curs

3. ANGHEL, I., 1984, Drojdiile, Editura Academiei R.S.R., Bucureşti4. DUMITRU, I. A.VAMANU, O.POPA, 2002, Drojdiile. Biotehnologii clasice

și moderne, Editura Ars Docendi, București5. www.wikipedia.ro