UB Doctorat Biologie 2014 Gheorghe Irina PDF (1)

7/25/2019 UB Doctorat Biologie 2014 Gheorghe Irina PDF (1)

1/200

Universitatea din Bucureti

Facultatea de Biologie

coala Doctoral de Biologie

Tez de doctorat

Coordonator tiinific:

Prof. dr. Veronica LAZR

Doctorand:

Irina GHEORGHE

2014


2/200

Investete n oameni!Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor

Umane 2007 2013Axa prioritar: 1 Educaia i formarea profesional n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii bazate pecunoatereDomeniul major de intervenie: 1.5 Programe doctorale i postdoctoralen sprijinul cercetriiTitlul proiectului: Programe doctorale i post-doctorale de excelen pentru formarea de resurse umane nalt calificate pentrucercetare n domeniile tiinele Vieii, Mediului i PmntuluiCod proiect: POSDRU/159/1.5/S/133391Beneficiar: Universitatea din Bucureti

Markeri fenotipici i moleculari de rezisten la antibioticele

betalactamice la tulpini de bacili Gram negativi non

fermentativi oportuniti

Conductor doctorat: Prof. Dr. Veronica Lazr

Doctorand: Irina Gheorghe

2014

Cercetrile tiinifice care au dus la realizarea acestei teze de doctorat

au fost realizate cu suportul financiar al Programului Operational

Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013, cofinantat prin FondulSocial European, n cadrul proiectului cu ID:

POSDRU/159/1.5/S/133391


3/200


4/200

Markeri fenotipici i moleculari de rezisten la antibioticele -lactamice la tulpini de bacili Gramnegativi non fermentativi oportuniti

- 2 -

2.3.1.1. Mecanismele de aciune ale antibioticelor-lactamice...402.3.1.1.1.Ptrunderea -lactaminelor n celule la bacterii Gram negative...402.3.1.1.2. Producerea de -lactamaze..............................................................................42

2.3.1.1.2.1. Clasificarea-lactamazelor..42

2.3.1.1.2.1.1. Clasificarea-lactamazelor n funcie de spectrul de activitate.432.3.1.1.2.1.2. Clasificarea-lactamazelor pe baza secvenei moleculare i tipul

de molecule hidrolizate........................................................................................................432.3.1.1.2.3. Rezistena prin impermebilitate.512.3.1.1.2.4. Mecanismele de eflux......51

2.3.2. Rezistena la aminoglicozide...522.3.3. Rezistena la quinolone...53

II. Contribuii originale privind studiul markerilor fenotipici i molecular i de rezisten laantibioticele -lactamice la tulpini de BGNNF oportuniti

SCOPUL SI OBIECTIVELE STUDIULUI54

CAPITOLUL 3Obiectivul 1. EVIDENIEREA FENOTIPIC A ANTIBIOREZISTENEI LA TULPINIDE BGNNF IZOLATE DE LA PACIENI SPITALIZAI..................................................56Materiale i metode......................................................................................................................57Rezultate i discuii......................................................................................................................65Concluzii......................................................................................................................................89

Obiectivul 2. EVIDENIEREA GENOTIPIC A ANTIBIOREZISTENEI LA TULPINIDE BGNNF.91

Materiale i metode.....................................................................................................................92Rezultate i discuii......................................................................................................................98Concluzii....................................................................................................................................120

Obiectivul 3. CARACTERIZAREA GENETIC A TULPINILORDE P. AERUGINOSABLAVIM-2 IA. BAUMANNIIBLAOXA-23 REZISTENTE LA CARBAPENEMECIRCULANTE N ROMNIA.....121Materiale i metode...................................................................................................................123Rezultate i discuii...................................................................................................................140Concluzii...................................................................................................................................154

Capitolul 4. CONCLUZII GENERALE.................................................................................156Lucrri publicate pe parcursul elaborrii tezei.........157Bibliografie.....160ANEXE...175


5/200


- 3 -

List de abrevieri

BGNNF= bacili Gram negativi non fermentativiMBL = metalo--lactamazeCHLD = -lactamaze din clasa DCG I = cefalosporine de generaia ICG II = cefalosporine de generaia a II- aCG III = cefalosporine de generaia a III- aCG IV= cefalosporine de generaia a IV- aESBL = BLSE = extended spectrum -lactamases = -lactamaze de spectru extinsMDR = Multi Drug Resistance = multirezistenPDR = Pan Drug Resistance = panrezistenXDR = Extended Drug Resistance = rezisten extins

SI = secven de inseriePFGE = electroforez pe gel n cmp pulsatorFTIR-ATR = Fourier Transform Infrared Spectroscopy with Attenuated Total ReflectanceMLST = Multilocus Sequence TypingINBCV = Institutul Naional de Boli CardiovasculareSCF = Spitalul Clinic FundeniVIM = Verona imipenemaseSPM = Sa Paolo metallo--lactamaseGIM = German imipenemaseAIM = Adelaide imipenmaseSIM = Seoul imipenemase

GES = Guyana Extended Spectrum -lactamasePER =Pseudomonas aeruginosa extended resistanceTEM = for Temoneira patients nameSHV = Sulfhydryl Variable enzymeCTX-M = Cefotaxime first isolated in MunichVEB = Vietnamese Extended Spectrum -lactamaseECDC =European Center Disease ControlAmpC = cefalosporinaz inductibilPBRT =PCR - Based Replicon Typing


6/200


- 4 -

INTRODUCERE

Grupul bacililor Gram negativi a cror pondere n patologia infecioas a crescut mult n

ultimul timp, include bacilii fermentativi respectiv enterobacteriile i bacilii non fermentativi

(BGNNF). Frecvena lor de izolare se datoreaz pe de o parte, creterii numrului de pacieni

imunodeprimai, iar pe de alt parte dobndirii unor factori genetici de rezisten la antibiotice

sau a unor factori de virulen care le determin condiia de patogeni oportuniti, aceste aspecte

constituind i obiectul de studiu al lucrrii de fa.

Primele dou capitole ale tezei reprezint partea de documentare tiinific a lucrrii i

prezint o caracterizare general a principalelor specii de BGNNF i evidenierea mecanismelor

de rezisten la antibiotice -lactamice i non -lactamice la speciile analizate.

Bacilii Gram negativi non fermentativi din speciile Pseudomonas aeruginosa i

Acinetobacter baumannii sunt responsabili de mare parte din infeciile nosocomiale, fiind

patogeni oportuniti responsabili de infecii severe la pacienii imunocompromii. Tratamentele

tradiionale ale bolilor infecioase bazate pe compui cu aciune microbiostatic sau microbicid

au condus, datorit utilizrii excesive, la selectarea i evoluia fenomenelor de multirezisten,

rezisten extins i chiar panrezisten la antibiotice.P. aeruginosa,A. baumannii i Stenotrophomonas maltophilia prezint anumite trsturi

comune, ca de exemplu: prezena n mediul extern, rezistena intrinsec la o serie de antibiotice

i capacitatea de a determina o serie de infecii asociate dispozitivelor medicale. Multirezistena

este frecvent prezent la tulpini izolate din clinic, astfel c un numr tot mai ridicat de tulpini

au fost semnalate ca prezentnd rezisten la majoritatea antibioticelor folosite n mod curent:

peniciline, cefalosporine, carbapeneme, aminoglicozide, tetracicline, fluoroquinolone i

trimethoprim sulfamethoxazol.

Tulpinile aparinnd speciilor menionate mai sus au capacitate ridicat de rspndire pe

orizontal n mediul spitalicesc i de a dobndi o serie de determinani genetici mobili. n cazul

fiecreia dintre ele factorii predispozani ai gazdei sunt asociai cu evoluia unui proces infecios.

Dac n urm cu 10 ani A. baumannii era complet necunoscut ca agent etiologic al

infeciilor nosocomiale, n prezent este o specie comun n mediul spitalicesc, persistena fiind


7/200


- 5 -

condiionat de rezistena la desicaie, ca i rezistena la dezinfectani. Supravieuirea i

multiplicarea pe suprafaa tegumentului i a mucoaselor este rezultatul selectrii unor clone multi

i panrezistente la aciunea agenilor antimicrobieni i a mecanismelor locale de aprare.

A. baumannii are capacitatea de a coloniza dispozitive medicale i de a dezvolta biofilme(Karthika i colab., 2008). De cele mai multe ori, sursa bacteriemiei determinate de A. baumannii

este reprezentat de cateterele intravasculare pe suprafaa crora poate dezvolta biofilme.

Dezvoltarea de biofilme explic rezistena crescut la aciunea unui spectru larg de

antibiotice chiar i la cele care sunt sensibile atunci cnd sunt testate prin metode standard ca

celule n suspensie. Celulele nglobate n biofilm prezint o rezisten de tip special, consecutiv

dezvoltrii acestei comuniti, numit rezisten comportamental sau toleran, pentru a evita

confuzia cu rezistena mediat de factori genetici de rezisten. Deci chiar dac sunt sensibile

atunci cnd sunt n suspensie, testate prin metoda standard de determinare a concentraiei minime

inhibitorii, cnd sunt aderate i nglobate n matricea unui biofilm, celulele sunt rezistente la

dozele uzuale de antibiotic, calculate pe baza C.M.I. n plus, n biofilm, datorit proximitii

celulelor este favorizat i transferul pe orizontal al plasmidelor R ntr-un biofilm multispecific

sau multiclonal, ceea ce amplific fenomenul de rezisten la antibiotice n general.

Dac n urm cu 40 de ani incidena infeciilor determinate de BGNNF era destul de

sczut, acestea avnd o pondere crescut consecutiv interveniilor chirurgicale la nivelul

tractului urinar, astzi acestea afecteaz aproximativ 30% din pacienii internai n seciile deterapie intensiv.

Pn n prezent apte familii de metalo--lactamaze (MBL) au fost descrise la izolate

clinice deP. aeruginosa (VIM, IMP, SPM, GIM, SIM, AIM, i mai recent, NDM), unele avnd

distribuie global (VIM, IMP i NDM) (Michalopoulos i colab., 2010). -lactamazele din

familia VIM au fost descrise prima dat n Europa n 1990, iar ulterior au fost semnalate ca

avnd distribuie global si asociate casetelor genice ale clasei 1 de integroni. OXA-23 este cea

mai rspndit -lactamaz din clasa D (CHLD) laA. baumannii , localizat n structura Tn2006,

Tn2007, Tn2008 sau la nivel cromosomal/plasmidial.

La nivel european, potrivit ECDC (European Center Disease Control), n 2011 Romnia

a ocupat cea mai nalt rat a rezistenei la carbapeneme la izolate clinice de P. aeruginosa,

datele disponibile n prezent fiind destul de puine i limitate doar la regiunea de nord a rii. La


8/200


- 6 -

A. baumannii, caracterizarea contextului genetic al genelor de rezisten la antibioticele -

lactamice a fost raportat numai de spitale din regiunea de vest a rii.

Similar 2011, n 2012 rezistena tulpinilor de P. aeruginosa la carbapeneme n ara

noastr a ocupat locul I ntre rile europene urmat de Grecia, Bulgaria i Ungaria, ri vecineRomniei (www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-Net/database). La A.

baumannii, date referitoare la profilurile de rezisten la antibiotice au fost raportate din 30 de

ri ale Europei prin programul SENTRY (Turner i colab., 2003) n perioada 2001-2004,

perioad pe parcursul creia procentul tulpinilor rezistente la imipenem, meropenem, ampicilin -

sulbactam i polimixin B a fost de: 26,3; 29,6; 51,6; si respective 2,7%. n Grecia procentul

tulpinilor de A. baumannii rezistente la imipenem izolate de la pacieni din seciile de terapie

intensiv n perioada 1996-2007 a fost de 85% (http://www.mednet.gr/whonet).

Avnd n vedere rezultatele limitate la doar dou regiuni ale rii raportate n studiile

precedente i datele insuficiente privind caracterizarea genetic a tulpinilor de P. aeruginosa i

A. baumannii circulante n Romnia i rezistente la carbapeneme aceast tez a avut ca scop

studiul fenotipic i molecular al fenomenului de rezisten la antibiotice -lactamice la tulpini de

bacili Gram negativi non fermentativi oportuniti izolai din infecii nosocomiale n vederea

reducerii riscului epidemiologic i elaborrii unor msuri eficiente de prevenire a diseminrii

clonelor rezistente.


9/200


- 7 -

I. PARTEA TEORETIC

CAPITOLUL 1

CARACTERIZAREA GENERAL A BACILILOR GRAM NEGATIVI NON-

FERMENTATIVI OPORTUNITI

Bacilii Gram negativi nonfermentativi (BGNNF) cuprind specii n general saprobionte

n natur, fiind larg rspndite n sol i ape, comensale la animale i om i pe suprafaa plantelor,

n special n habitatele umede, avnd un rol important n patologia uman, ca ageni ai infeciilor

oportuniste i nosocomiale, mai ales la gazde imunocompromise. Virulena lor este mediat de

adezine i toxine, de capacitatea de a forma biofilme (Tomaras i colab., 2003), ca i de

multirezistena natural sau dobndit la numeroase antibiotice, ceea ce explic frecvena tot mai

mare a infeciilor nosocomiale cuP. aeruginosa iA. baumannii (Chifiriuc i colab., 2011).

BGNNF sunt strict aerobi, nu fermenteaz glucoza i alte glucide, dar le degradeaz pe

cale oxidativ i au multiple capaciti nutriionale: metabolizeaz substraturi foarte diverse, ceea

ce le permite creterea pe medii foarte selective (cetrimid, Drigalski) sau minimale (ap de

robinet, glucoz, ioni de (NH4)2, -SO4, oligoelemente); supravieuiesc n ap distilat, soluii de

substane antiseptice i dezinfectante (Chifiriuc i colab., 2011). Pot fi transmii prin intermediul

aparaturii medicale contaminate (Tomaras i colab., 2003). FamiliaPseudomonadaceae cuprinde

genul Pseudomonas cu 256 de specii, mprite n 4 grupe metabolice i genul Xanthomonas,

care alturi dePseudomonas formeaz grupulPseudomonadelor(Tabelul 1). Ali ageni patogeni

din acelai grup cu Pseudomonas sp. sunt: Acinetobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia,

Alcaligenes sp., Flavimonas oryzihabitans, i Sphingobacterium sp. (Steinberg i colab., 2000) .

Aceste microorganisme au trsturi comune: majoritatea provoac infecii nosocomiale i sunt de

obicei rezistente la antibiotice (Nerad i colab., 1998; Rubinstein 1999). n prezent infeciilegrave datorate acestui grup de microorganisme au o frecven ridicat (Wisplinghoffi colab.,

2000; Duggan i colab., 1996).


10/200


- 8 -

Tabelul 1. Clasificarea pseudomonadelor de importan medical (dup Gilligan i colab., 2003)

Grupuri i subgrupuri de omologie pe bazaanalizei ARNr

Genuri i specii

I. Specii fluorescente Pseudomonas aeruginosa

P. fluorescens

P. putida P .stutzeri

II. Specii nefluorescenteP. mendocina

Burkholderia pseudomallei

B. mallei

B. cepacia

Ralstonia pickettii

III. Comamonas sp.Acidovorax sp.

IV. Brevundimonas sp.V. Stenotrophomonas maltophilia

1.1. Specia Pseudomonas aeruginosa este cea mai bine cunoscut din punct de vedere

microbiologic i clinic dintre bacilii Gram negativi non-fermentativi (Quinn,1998; Hancock,

1988); fiind un patogen oportunist care determin infecii foarte frecvente n mediul spitalicesc.

Dei colonizeaz ca un comensal organismul uman, devine patogen pentru indivizii

imunocompromii producnd infecii ale tractului urinar, ale aparatului respirator, ale esutului

conjunctiv, dermatite, bacteriemii i infecii sistemice, mai ales la o serie de pacieni fie cu arsuri

severe extinse, cu fibroz chistic sau neoplazici, ca i la pacienii cu SIDA, n condiiile

imunosupresiei secundare unor afeciuni sau medicamentoase produs de citostatice i respectiv

ale imunodeficienei dobndite ca urmare a infeciei cu virusul HIV. P. aeruginosa poate fi de

asemenea, ocazional un agent fitopatogen (Vidal i colab., 2002).

1.1.1. Habitat

Tulpinile de Pseudomonas grupeaz specii bacteriene ubicuitare, ntlnite n sol, pe

suprafaa materiei vegetale, n habitate acvatice dulcicole i marine. Numeroase tulpini sunt

psichrofile i contamineaz produsele alimentare sau farmaceutice conservate. Au fost semnalate

cazuri cnd pot fi izolate din microbiota intestinal a omului i animalelor (Chifiriuc i colab.,

2011).


11/200


- 9 -

1.1.2. Morfologie, caractere de cultur i cretere

Tulpinile pot produce trei tipuri de colonii: cele izolate din sol sau ap produc colonii

mici de tip R (rugos); tulpinile izolate din clinic produc una dintre cele dou tipuri de colonii

netede (tip S): colonii cu aspect de ou prjit (fig. 2), mari, netede, cu marginile aplatizate i cuprofil ridicat sau colonii cu aspect mucoid, produse de tulpini izolate din secreiile tractului

respirator i urinar, aspect datorat produciei de alginat(Chifiriuc i colab., 2011). Tulpinile care

produc colonii netede i mucoide au capacitate mai mare de colonizare i virulen. P.

aeruginosa este rezistent la fagocitoz i la efectul bactericid al serului datorit capsulei sale

mucoide i posibil datorit LPS (fig. 1). Ca i n cazul altor specii bacteriene Gram negative,

lipidul A din structura LPS mediaz manifestrile patologice ale septicemiilor cu bacterii Gram

negative: febr, hipotensiune, coagulare intravascular diseminat (Beare i colab., 2003;

Chifiriuc i colab., 2011).

Fig. 1. Reprezentarea diversitii LPS prezente pe suprafaa unei celule de P. aeruginosa (dup Lam i

colab., 2011)

1.1.3. Factori de virulen i rezistena la antibiotice

Tulpinile de P. aeruginosa cresc pe medii de cultur diverse i produc un miros

caracteristic de flori de tei. Coloniile caracteristice sunt netede (S), de culoare verzui-

Monozaharide


12/200


- 10 -

fluorescent (fig. 2), datoritpiocianinei, un pigment ce difuzeaz n mediul de cultur (Chifiriuc

i colab., 2011). Piocianina este o protein non enzimatic, care se leag la flavoproteinele

sistemului citocrom; este un factor de virulen care interfer cu transferul terminal de electroni,

ceea ce determin un deficit de energie i apoptoz. Funcia sa este de a mpiedica funcianormal a cililor nazali de la om, de a ntrerupe bariera epiteliului respirator i de a exercita un

efect proinflamator asupra fagocitelor (Chifiriuc i colab., 2011)

Fig. 2. Aspectul tulpinilor deP. aeruginosa ce produc colonii netede (tip S) productoare de diferii pigmeni

Unele tulpini produc pioverdina, pigment fluorescent ce coloreaz mediul de cultur ntr-o

nuan verzuie (fig. 2 stnga), piorubina (rou nchis) sau piomelanina (pigment negru).

Pioverdina este produs n cantitate mare n medii private de Fe (Chifiriuc i colab., 2011).

Acest pigment secretat n mediu are rol de chelare a fierului i de formare a complexelor feri-

pioverdin, transportate apoi n celula bacterian prin proteinele specifice ale membranei externe

cu rol de receptor de suprafa celular (FpvAI-III) (De Chial i colab., 2003). Pioverdinele de

asemenea acioneaz ca molecule de semnalizare ce induc producerea a doi factori de virulen

secretai: exotoxina A, endoproteaza PrpL (Beare i colab., 2003). Piochelina, este un siderofor

ce poate juca rol n invazie dac competiioneaz cu proteinele chelatoare de fier ale gazdei.Rolul pigmenilor fluoresceni n virulen nu a fost nc complet elucidat (Beare i colab.,

2003).

Pentru un patogen oportunist ca P. aeruginosa ca i n cazul altor patogeni, procesul

infecios ncepe cu alterarea sau evitarea mecanismelor de aprare a gazdei (Chifiriuc i colab.,

2011). Patogeneza infeciilor cu Pseudomonas este variat, fiind reflectat n gama larg de


13/200


- 11 -

localizri i manifestri ale infeciilor: septicemii, infecii ale tractului urinar, pneumonii i

infecii pulmonare cronice, endocardite, dermatite i osteocondrite (Kiska; Gilligan, 2003).

Capacitatea tulpinilor deP. aeruginosa de a determina un numr impresionant de infecii acute i

cronice se datoreaz unui arsenal de factori de virulen (componente parietale sau extraparietaleale celulei bacteriene i factori solubili, secretai) pe care tulpinile acestei specii i pot sintetiza.

Factorii de virulen interfer cu mecanismele de aprare ale gazdei, furnizeaz elemente

eseniale pentru creterea bacteriei, intensific potenialul de aderen i invaziv, i lizeaz direct

esuturile gazd (Van Delden i colab., 1998; Chifiriuc i colab., 2011).

1.1.3.1. Etapele infeciei cuP. aeruginosa i factorii de virulen implicai

Dup o etap iniial de colonizare, dependent de factori de virulen asociai celulei, procesul

infecios evolueaz fie ctre o infecie cronic, caracterizat printr-o secreie sczut a factorilorde virulen extracelulari, fie ctre o infecie acut (fig. 3A), caracterizat prin producia nalt a

acestor factori de virulen, a cror sintez este dependent de semnalizarea celular (fig. 3B). n

cursul episoadelor acute ale unei infecii cronice, crete mult producia acestor factori de

virulen dependeni de semnalizarea celular (Van Delden i colab., 1998).

Fig. 3A. Caracteristici specifice ale procesului infecios cronic i acut (dup Van Delden i colab., 1998).

Infecie acut

- sinteza coordonat a unor cantiti mari de factori dvirulen solubili dependeni de sistemele de semnalizarcelular ce conduc la;

- producerea de leziuni tisulare mediate de proteaze toxine: invazia vaselor sangvine, diseminarea sistemicsindromul de rspuns inflamator, insuficiena multipl deorgane i moarte consecutiv.

Infecie cronic

- specific pacienilor cu fibroz chistic;

- evolueaz cu selectarea de mutante productoarede alginat;

- reducerea expresiei factorilor de virulensolubili;

-producere de leziuni tisulare datorate inflamaiei

cronice.

Colonizare


14/200


- 12 -

Fig. 3B . Reprezentarea schematic a fazelor infeciei cuP. aeruginosa (dup Chifiriuc i colab., 2011).

1.1.3.2. Interaciunea gazd-agent patogen. Speciile bacteriile patogene n general, produc

civa factori de virulen implicai n lezarea tisular, prin aciune direct, sau indirect prin

activarea rspunsului inflamator al gazdei. Celulele bacteriene au capacitatea de a evita

mecanismele de aprare nespecific i specific ale gazdei i de a coloniza cile aeriene, prin

clivarea componentelor complementului i a moleculelor de Ig, precum i prin perturbarea

procesului de clearance mucociliar. Aceste evenimente contribuie la natura persistent a

inflamaiei i la leziunile progresive din bolile pulmonare cronice, care n schimb conduc la o

colonizare bacterian mai intens i la un ciclu de inflamaie autoperpetuat (Engel i colab.,

2003). Majoritatea infeciilor cu Pseudomonas sp. sunt att invazive, ct i toxigenice. InfeciacuPseudomonas sp. evolueaz n trei etape succesive (Van Delden i colab., 1998; Chifiriuc i

colab., 2011).:

aderena bacterian i colonizarea;

invazia local;


15/200


- 13 -

infecia sistemic generalizat.

Aderena i colonizarea

Pentru a iniia infecia, P. aeruginosa induce dezechilibre ale mecanismelor primei linii

de aprare a organismului gazd. Astfel de dezechilibre pot rezulta din: ruperea sau ocolirea

barierelor normale cutanate sau ale mucoaselor (intervenii chirurgicale, arsuri severe sau

utilizarea de dispozitive medicale), alterarea efectului de barier antiinfecioas a microbiotei

normale a mucoasei de ctre antibioticele cu spectru larg sau alterri ale mecanismelor de

aprare imun (neutropenia indus de chemoterapie, defecte ale mecanismelor de clearance a

mucoaselor n fibroza chistic, SIDA, diabetul zaharat). Colonizarea tractului respirator de ctre

P. aeruginosa necesit aderena fimbrial i poate fi favorizat de producerea unei enzime

proteaza, care degradeaz fibronectina seric pentru a expune receptorii pentru fimbrii existenipe suprafaa celulelor epiteliale. Celulele de P. aeruginosa ader la celulele epiteliale ale

tractului respirator superior i ale altor epitelii, prin intermediulfimbriilor(pili de tip IV) (Van

Delden i colab., 1998), cu rol esenial n virulen, n micarea n tirbuon, n procesele de

transformare genetic ca i receptori de fagi (Chifiriuc i colab., 2011). Lezarea tisular de

asemenea joac rol n colonizarea tractului respirator, deoarece P. aeruginosa ader la celulele

epiteliale traheale ale oarecilor infectai cu virusul gripal, dar nu i la epiteliul traheal normal.

Acest tip de aderen este specific agenilor oportuniti i constituie o etap important n

keratite, infecii ale tractului respirator i cele ale tractului urinar cu P. aeruginosa. Colonizarea

mucoaselor cu P. aeruginosa este rezultatul aciunii mai multor factori de virulen asociai

celulei bacteriene, cu rol de adezine, reprezentai de: pili, fimbrii, polizaharide de suprafa i

flageli. Ocazional, P. aeruginosa poate coloniza diferite situsuri ale organismului uman, cu

preferin pentru zonele umede, ca zona perine al, axila, urechea, mucoasa nazal i gtul.

Prevalena colonizrii cu P. aeruginosa la subiecii sntoi prezint rate mai mici dect la cei

spitalizai, mai ales la subiecii tratai cu antibiotice de spectru larg (Rossolini, 2005).

Colonizarea tractului respirator este frecvent la pacienii ventilai mecanic, iar a tractului gastro-

intestinal la pacienii neoplazici post-chimioterapie. De asemenea, soluiile dezinfectante,

tubulatura echipamentelor respiratorii, robinetele i alte medii umede pot aciona drept

rezervoare ale tulpinilor de P. aeruginosa n mediul spitalicesc (Rossolini, 2005).


16/200


- 14 -

Invazie i diseminare

Capacitatea P. aeruginosa de a invada esuturile gazdei depinde de capacitatea sa de a

produce enzime i toxine extracelulare, care ntrerup barierele fizice i lezeaz celulele gazd,

precum i de capacitatea de a rezista la fagocitoz i la alte mecanisme de aprare imun ale

organismului gazd (Chifiriuc i colab., 2011). Deseori, invazia esuturilor de ctre P.

aeruginosa este determinat de producerea unor factori de virulen extracelulari importani:

proteaze (LasA, LasB ce determin hemoragii pulmonare n infeciile pulmonare acute

determinate de tulpini MDR de P. aeruginosa; elastaza i proteaza alcalin cu rol n evoluia

infeciilor corneene ns rolul acesteia n infeciile sistemice nu a fost pe deplin elucidat)

hemolizine labile - i stabile-termic, fosfolipaze C i exotoxinele A, S, T, U, Y , ramnolipide

(Van Delden i colab., 1998). Invazia sistemului circulator i diseminarea P. aeruginosa de lasitusurile locale de infecie este mediat att de produi asociai celulei bacteriene ct i de

factori extracelulari responsabili de boli localizate, dei nu este pe deplin cunoscut modul n care

agentul patogen produce infecia sistemic (Chifiriuc i colab., 2011).

Reglarea expresiei factorilor de virulen. Secreia unora dintre aceti factori necesit

sistemul de secreie de tip III (TTSS), ce permite translocarea unui set de toxine, denumite

proteine efectoare, direct n celulele gazd, unde moduleaz cile de transducie a semnalului,

determinnd citotoxicitatea i blocarea citoscheletului celulelor gazd (Engel i colab., 2003).

Acest sistem de secreie este asociat cu infeciile invazive acute i necesit contactul mediat de

pili dintre bacterii i celule epiteliale (Engel i colab., 2003). De asemenea TTSS este activat de

contactul cu membranele celulelor eucariote i interfer cu transducia semnalului, conducnd la

moartea celular sau la alterri ale rspunsului imun nespecific i specific al gazdei (Engel i

colab., 2003). Sistemele de semnalizare celular controleaz expresia i permit producerea

coordonat dependent de densitatea celular a mai multor factori de virulen extracelulari. De

asemenea, aceste sisteme ce permit comunicarea ntre celulele bacteriene, sunt implicate i n

producerea factorilor care ajutP. aeruginosa s depeasc mecanismele de aprare ale gazdei.Producerea de factori de virulen extracelulari de ctre un numr mic de bacterii ar putea

conduce probabil la o neutralizare eficient a rspunsului gazdei fa de aceti compui. Ori,

expresia coordonat a genelor de virulen de ctre o ntreag populaie bacterian odat ce a

atins un prag critic al densitii permite celulelor deP. aeruginosa s secrete factori extracelulari


17/200


- 15 -

la nivel suficient de nalt pentru a depi mecanismele de aprare ale gazdei. Aceti factori pot

altera balana precar dintre mecanismele de aprare ale gazdei i producerea de toxine

bacteriene conducnd la invazia pe calea vaselor sanguine, diseminare, sindromul de rspuns

inflamator sistemic i n final la moarte. Chiar utilizarea terapiei cu antibioticele corespunztoareeste frecvent ineficient n stoparea infeciei, de aceea procesul ar trebui blocat din timp, nainte

ca expresia genelor de virulen s poat fi activat (Nord i colab., 1975).

1.1.3.3. Mecanisme de rezisten

Severitatea infeciilor cu Pseudomonas sp. rezid n multirezistena la antibiotice, att

natural, ct i dobndit (Chifiriuc i colab., 2011).Rezistena natural este consecina aciunii

mai multor factori: bariera impermeabil oferit de membrana extern i LPS; creterea n

biofilme astfel c, celulele bacteriene chiar sensibile la un antibiotic manifest o rezisten

comportamental sau toleran la antibiotic n condiiile nglobrii acestora n biofilme, situaie

care le confer celulelor protecie fa de concentraiile terapeutice de antibiotice; prezena

plasmidelor R i a factorilor de transfer ai determinanilor genetici de rezisten (RTF) prin

procesul de conjugare i tranducie (Chifiriuc i colab., 2011).Rezistena dobndit se datoreaz

presiunii selective a antibioticelor administrate n mediul spitalicesc. Ineficiena antibioticelor n

tratamentul infeciilor cu Pseudomonas sp. este cel mai dramatic aspect evideniat n cazul

pacienilor cu fibroz chistic, infectai de obicei cu tulpini multirezistente la antibioticeledisponibile i imposibil de tratat (Chifiriuc i colab., 2011). n ultimii ani factorii de rezisten

sunt considerai i factori de virulen.P. aeruginosa prezint rezisten la majoritatea agenilor

antimicrobieni datorit capacitii sale selective de a mpiedica diferite molecule de a ptrunde

prin membrana extern, prin pompele de eflux astfel nct clasele de antibiotice ce rmn active

includ -lactaminele, fluoroquinolonele, aminoglicozidele i colistinul

(www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance).

n 2011 rezistena P. aeruginosa la carbapeneme n ara noastr a ocupat locul I ntre

rile europene (fig. 4 i fig. 5) (www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance).


18/200


- 16 -

Fig.4. Distributia procentuala a rezistenei P. aeruginosa la carbapeneme n 2011 n Europa

(www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-Net/database)

n mod similar i n 2012 Romnia a ocupat locul I printre rile Europei privind

rezistena la carbapeneme (fig. 6 i 7) (www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-

Net/database).

Fig.5. Distributia procentuala a rezistenei P. aeruginosa la carbapeneme n 2012 n Europa

(www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-Net/database)


19/200


- 17 -

Fig. 6. Reprezentarea nivelului rezisteneiP.aeruginosa la carbapeneme n 2011 la nivel european

(www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-Net/database).

Fig. 7. Reprezentarea nivelului rezisteneiP.aeruginosa la carbapeneme n 2012 la nivel european.

(www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-Net/database).


20/200


- 18 -

1.1.4. Implicarea specieiP. aeruginosan patologia uman

Infeciile cuP. aeruginosa apar la pacienii spitalizai o perioad ndelungat, astfel la 2/3 din

cazurile semnalate poarta de intrare poate fi reprezentat de (Chifiriuc i colab., 2011):

translocaia digestiv la bolnavii imunocompromii, focare de infecie digestive;

catetere intravasculare sau urinare;

leziuni tegumentare sau ale mucoaselor (arsuri, rni, plgi chirurgicale).

Infeciile nosocomiale cauzate de P. aeruginosa sunt localizate mai frecvent la nivelul

tractului respirator, ale tractului urinar i la nivelul plgilor (Rossolini; Mantengoli, 2005). P.

aeruginosa reprezint una din cele mai importante cauze de pneumonie nosocomial, mai ales la

pacienii ventilai mecanic (Rossolini; Mantengoli, 2005). n general, aceti pacieni au o

probabilitate mai mare de a dezvolta pneumonie nosocomial cu P. aeruginosa, ratele demortalitate variind de la 40% la de 60% (Rello i colab., 1997).

Infeciile respiratorii produse de P. aeruginosa apar ndeosebi la indivizii cu leziuni ale

epiteliului tractului respirator inferior sau imunocompromii (Chifiriuc i colab., 2011). n

majoritatea cazurilor raportate, infecia tractului respirator inferior la bolnavii cu fibroz chistic

de ctre tulpinile mucoide de P. aeruginosa este dificil de tratat (Chifiriuc i colab., 2011). P.

aeruginosa este un agent patogen de temut la pacienii cu fibroz chistic, care de cele mai multe

ori, dezvolt infecii ale tractului respirator. Epiteliul cilor respiratorii al acestor pacieni

permite colonizarea pe termen lung de ctre P. aeruginosa avnd un rol critic n progresia bolii

pulmonare (Rossolini; Mantengoli, 2005).

Majoritatea bacteriemiilorproduse de Pseudomonas sp. sunt infecii nosocomiale (25%

din totalul bacteriemiilor nregistrate n spitale) (Livermore, 2001). Cauza major a bacteriemiei

determinate de Pseudomonas sp. o reprezint dispozitivele medicale contaminate din mediul

spitalicesc unde rata mortalitii depete 10% (http:// medscape.com).

P. aeruginosa este agentul etiologic n cazurile de otit extern (Chifiriuc i colab.,

2011). Prezena speciei a fost rareori semnalat la nivelul analizatorului acustico-vestibular, darpopuleaz adeseori canalul auditiv extern dup rnire, inflamaie sau n condiii de umiditate

crescut. La bolnavii diabetici produce otita invaziv (Chifiriuc i colab., 2011).

P. aeruginosa este cauza frecvent a keratitei bacteriene, abceselor sclerei, i

endoftalmiei neonatale (http://medscape.com). Tulpinile de Pseudomonas sp. pot coloniza


21/200


- 19 -

epiteliul ocular prin ataarea fimbriilor la receptorii reprezentai de acidul sialic. La pacienii

imunocompromii, celulele bacteriene pot prolifera rapid i prin secreia enzimelor (elastaza,

proteaza alcalin i exotoxina A) produc o infecie rapid i distructiv care poate duce la

pierderea ochiului (Chifiriuc i colab., 2011).Infeciile tractului urinar determinate de P. aeruginosa sunt de obicei dobndite n

unitile spitaliceti (12% din infeciile urinare nosocomiale) i sunt datorate utilizrii

dispozitivelor medicale contaminate n interveniile chirurgicale sau cateterizrii tractului urinar.

Tulpinile aparinnd speciei Pseudomonas reprezint cei mai adereni ageni patogeni ai

epiteliului vezicii urinare, infecia evolund ascendent sau descendent (Chifiriuc i colab., 2011).

Infecii ale tractului digestiv.

Tulpinile de P. aeruginosa pot produce leziuni la indivizii imunosupresai la nivelul

oricrui segment al tractului gastrointestinal de la cavitatea bucal, faringe la rect, fiind ageni de

temut n etiologia infeciilor perirectale, a diareilor la copii, a gastroenteritelor tipice i

enterocolitelor necrozante (Chifiriuc i colab., 2011).

Alte localizri: infecii ale pielii, att localizate, ct i difuze, foliculite i forme de acneea

vulgaris, endocardita n special la consumatorii de droguri dup invazia pe cale sanguin

(Chifiriuc i colab., 2011).

P. aeruginosa poate fi o cauz important de morbiditate i mortalitate la copii i adolesceni

bolnavi de SIDA i cu un numr foarte sczut de limfocite CD4+ (Manfredi i colab., 2000).1.2. Burkholderia pseudomalleieste un patogen oportunist, reprezentnd agentul etiologic al

meloidozei, o boal tropical fatal la om i alte mamifere domestice, endemic n SE Asiei, N

Australiei, i alte zone tropicale (Currie; Cheng, 2010). B. pseudomallei este un bacil Gram

negativ aerob, saprotrof n ap, sol, orezrii, material vegetal; crete la 42C, oxideaz glucoza i

lactoza (Chifiriuc i colab., 2011). Infecia urmeaz inoculrii percutanate sau prin inhalarea

bacteriei prezente n sol, praf i apele de suprafa. Simptomele bolii pot fi strile febrile, tusea,

tulburrile respiratorii, producia de sput (Vietri ; Deshazer, 2007). Este o infecie pulmonar

studiat folosind aerosoli sau inoculnd intranazal animale mici. Ambele metode prezint

dezavantaje inerente pentru c nu pot modela cu exactitate meloidoza pulmonar la om. La

cabaline B. pseudomallei produce morva transmisibil la om (Chifiriuc i colab., 2011). La cal

infecia implic plamnul, evolueaz sistemic, cu leziuni subcutanate, ulcerative i adenopatie.

La om boala poate fi localizat sau sistemic rezultnd o gam larg de simptome (ulceraii


22/200


- 20 -

tegumentare sau ale mucoaselor, adenopatie, septicemia) i poate evolua fatal ( Loveleena i

colab., 2004).

1.3. ComplexulBurkholderia cepacia (Bcc) cuprinde specii ubicuitare cu efecte benefice dari

detrimentale plantelor i mediului, izolate din sol, de pe suprafaa materiei vegetale, aanimalelor, din materia organic n descompunere, din reelele de ap potabil, din mediul

spitalicesc n condiii de umiditate ridicat (Mahenthiralingam i colab., 2005). Specia prezint

interes la bolnavii cu fibroz chistic la care infecia poate evolua cu deteriorarea progresiv a

esutului pulmonar, cu apariia pneumoniei necrozante i a bacteriemiei (Chifiriuc i colab.,

2011). Virulena include o serie de factori, implicnd aderena la celulele epiteliale ale gazdei i

la mucin, prin intermediul pililor, producere de hemolizine, proteaze, endotoxine i structura

unic a compuilor polizaharidici ai LPS care i confer rezistena la fagocitoz, producerea de

melanin ce are rolul de a proteja celulele bacteriene de sistemele microbicide dependente de

oxigen ale neutrofilelor polimorfonucleare (Speert, 2010). n fibroza chistic, infecia pulmonar

cu B. cepacia este n general cronic, refractar la terapia antimicrobian i asociat cu rate

crescute de morbiditate i mortalitate. La un numr semnificativ de pacieni cu fibroz chistic,

pneumonia necrozant evolueaz rapid sau de cele mai multe ori transplantul s-a dovedit a fi

ineficient. Cu toate acestea, muli pacieni cu fibroz chistic rmn colonizai cu B. cepacia ani

de zile, fr un impact negativ asupra evoluiei clinice. Evoluia diferit a procesului infecios

sugereaz diferene n potenialul epidemiogen, de patogenitate i virulen ntre tulpinile de B.cepacia (Lipuma i colab., 2001).

1.4. Ralstonia pickettiieste o specie ocazional patogen ce determin septicemii nosocomiale i

infecii tisulare. n 1992 organismul a fost rencadrat din genul Pseudomonas n genul

Burkholderia (Ryan i colab., 2007) i, ulterior, n 1995, n genul Pseudomonas. Este o specie

omniprezent n mediul acvatic dar i n cel spitalicesc (Adley; Saieb, 2005; Ryan i colab.,

2006), devenit n ultimul deceniu un agent patogen nosocomial asociat n special indivizilor

imunosupresai (Lacey; Want, 1991; Ryan i colab., 2007). Apari ia de noi specii patogene

oportuniste este legat mai ales de un fenotip de rezisten care le face refractare la antibioticele

utilizate n mod curent n practica medical (Zellwegeri colab., 2004). Majoritatea tulpinilor de

R. pickettii izolate din clinic au fost caracterizate ca fiind multirezistente la antibioticele comune

(Zellweger i colab., 2004). R. pickettii este implicat n formarea biofilmelor n conductele de

ap industrial din material plastic (Anderson i colab., 1990) i a fost izolat din ap industrial


23/200


- 21 -

de nalt puritate (Adley; Saieb, 2005; Kulakov i colab., 2002), fiind deci capabil s

supravieiasc n medii oligotrofice. n plus, specia prezint capacitate biodegradativ ce ajut la

supravieuirea i adaptarea n mediile srace n nutrieni i ar putea servi utilizrilor

biotehnologice (Anderson i colab., 1990).1.5. Brevundimonas vesicularis este un bacil Gram negativ non-fermentativ aerob (Gilligan i

colab., 2003), izolat din mediul extern, dar i de la pacieni spitalizai (Otto i colab., 1987).

Specia determin abcese dentare, endocardit infecioas, bacteriemii produse n cazul

pacienilor cu maladii autoimune tratai cu medicamente imunosupresoare, antiinflamatoare,

steroidiene pe termen lung, motiv pentru care specia este considerat drept patogen oportunist

(Planes i colab., 1992; Calegari i colab., 1996; Choi i colab., 2006). Numrul redus de cazuri

raportate de infecii cuB. vesicularis la om limiteaz spectrul de afeciuni cauzate de acest agent

patogen, precum i regimurile optime de tratament.

1.6. Brevundimonas diminuta ncadrat pn relativ recent n genul Pseudomonas

(Wellinghausen i colab., 2005), este rspndit n mediul spitalicesc la gazde imunocompromise.

Specia determin infecii n special la nivelul tractului respirator, infecii urinare, emfizem (Chi

i colab., 2004). Specia este rezistent la amoxicilin, amoxicilin-acid clavulanic, ceftazidim,

imipenem, amikacin, tobramicin, gentamicin, rifampicin, piperacilin-tazobactam

(Wellinghausen i colab., 2005).

1.7. Stenotrophomonas maltophiliaDup o ndelungat perioad de incerte poziii taxonomice, specia cunoscut drept

Pseudomonas maltophilia, sau Xanthomonas maltophilia a fost ncadrat n specia

Stenotrophomonas maltophilia. Genul a fost propus n 1993 de Palleroni i Bradbury, tulpina

respectiv fiind izolat nc din 1958 de Hugh de la un pacient cu carcinom oral i denumit P.

maltophilia (Hugh; Ryschenkow, 1960; Hugh; Ryschenkow, 1961). Ulterior, Hugh i

Ryschenkow, l-au rencadrat n specia Bacterium bookeriar n 1943 Edwards a izolat tulpina din

lichid pleural i a denumit-oP. maltophilia (Hugh; Leifson, 1963). n 1963 a fost izolat prima

dat speciaP. melanogena pentru ca ulterior s fie reclasificat drept P. maltophilia (Komagata

i colab., 1974), aceeai tulpin ce a fost iniial caracterizat drept Pseudomonas alcaligenes

(Komagata i colab., 1974). Aceste informaii au fost folosite pentru a propune rencadrarea P.

maltophilia n X. maltophilia (Swings i colab., 1983). Autorii enumer o serie de factori n

sprijinul afirmaiilor lor, printre care procentul molar G+C coninut ( la P. maltophilia G+C =


24/200


- 22 -

63-67,5% iar la X. maltophilia G+C = 63-70%), enzimologia comparativ, absena NADP-

dehidrogenazei etc. Factorii enumerai mpreun cu alte dovezi au fost utilizai pentru a

reinterpreta statutul taxonomic al specieiX. maltophilia (Van i colab., 1992). Acest lucru a fost

susinut de experimente PCR, utiliznd un primer specific de Xanthomonas sp. ARNr 16S(Nesme i colab., 1995). Speciile genului Xanthomonas au fost recunoscute prin prezena unui

singur amplicon PCR specific (480bp), cu toate acestea n cazul X. maltophilia se remarcau

ampliconi suplimentari, fapt ce conducea la ideea c speciaX. maltophilia nu putea fi ncadrat

n genul Xanthomonas. Incertitudinile n ceea ce privete clasificarea acestui organism, au

determinat n cele din urm crearea noului gen Stenotrophomonas cu S. maltophilia ca unic

membru (Palleroni i Bradbury, 1993). Mai recent, Nesme i colab., n 1995 confirm

diferenele dintre S. maltophilia i ceilali membri ai genului Xanthomonas, utiliznd restricia

fragmentelor PCR amplificate pentru gena ARNr 16S. Mai recent, Drancourt i colab., 1997,

propun o nou specie Stenotrophomonas africana ce prezint caracteristici biochimice identice

cu S. maltophilia, exceptnd capacitatea de a asimila cis-aconitatul. Analizele genotipice au

demonstrat omologie de secven ADN de numai 35% ntre cele dou specii.


Bacilii care aparin genului S. maltophilia sunt drepi sau uor incurbai, au o lungime cuprins

ntre 0,5-1,5m, sunt mobili datorit flagelilor polari, pot fi dispui solitar sau n perechi i nu

acumuleaz incluziuni intracelulare de poli--hidroxibutirat. Coloniile sunt netede, strlucitoare,cu margini ntregi, de culoare alb pn la galben-pal (Chifiriuc i colab., 2011).

Fig. 8. Aspectul culturiide S. maltophilia pe

geloz snge (dup

Chifiriuc i colab., 2011)


25/200


- 23 -

Nord i colab., n 1975, au observat -hemoliza la 11 din 31 de tulpini analizate, ns S.

maltophilia nu este considerat o specie -hemolitic. Cu toate acestea, pe agar-snge poate

aprea o coloraie verzuie a mediului n jurul culturii (Gilardi, 1971). Anumite tulpini pot

manifesta o decolorare spre maron a mediului de cretere, fenomen atribuit reaciilor biochimicesecundare n care produii extracelulari se acumuleaz la incubarea tulpinilor la 42C (Hugh i

colab., 1980). S. maltophilia este o specie obligat aerob cu cretere optim la 35C, cu

urmtoarele caracteristici biochimice prezentate n Tabelul 2.

Tabelul 2. Caracteristicile biochimice ale S. maltophilia (adaptat

dup Brooke, 2012)

Test Reacie

Catalaz +Indofenol oxidaz -

Cretere 5C 18C 37C -++

Mobilitate 18C 37CI

Indol -

Lizindecarboxilaz +

Ornitindecarboxilaz -

Oxidaz +

Rou metil -

Reacia Voges-Proskauer -

Reducerea nitratului la nitrit ICitrat I

Fenilalanildezaminaz -

Hidroliza esculinei gelatineiTween 80 ureei

+++-

Sursele de Carbon pentrucretereglucozarabinoz -

hidroxibutiratfructozmanitoltrehalozsorbitol

+--I---

1.7.2. Habitat

Tulpini ale speciei S. maltophilia au fost izolate din medii foarte variate i zonegeografice diferite incluznd Antarctica i alte nie ecologice att n interiorul, ct i n afara

spitalelor. Specia a fost izolat din diferite habitate acvatice cum ar fi rurile, lacurile

hipertrofice, dari ape mbuteliate, caz n care poate fi responsabil de alterarea proprietilor

organoleptice. Iizuka i Komagata (1964) au raportat izolarea S. maltophilia din petrol i alte

materiale petroliere derivate din cmpurile din Japonia. Tulpini de S. maltophilia au fost


26/200


- 24 -

explorate ca poteniali ageni de biocontrol ai rizosferei, nlocuind pesticidele agricole (Berg i

colab., 1996). Avnd n vedere gama larg de ciuperci fitopatogene inhibate de aceast specie, nu

este deloc surprinztor faptul ca S. maltophilia inhib creterea unor fungi patogeni umani ca de

exemplu Candida sp.,Aspergillus fumigates.1.7.3. Factori de virulen

S. maltophilia prezint o gam larg de enzime extracelulare incluznd DN-aze, RN-aze,

fibrinolizin, proteaze, hialuronidaz i elastaz (Arella; Sylvestre, 1979). O caracteristic

important a speciei o reprezint capacitatea de a adera la materiale plastice i de a forma

biofilme. Tulpinile de S. maltophilia au fost izolate de pe suprafeele cateterelor intravenoase,

dispozitivelor protetice (Denton i colab., 2003; Lai i colab., 2006). Tulpinile pot crete i forma

biofilme n sistemele de distribuie a apei potabile reprezentnd un posibil risc de infecie pentru

persoanele imunocompromise. Infeciile pot aprea att la copii, ct i la aduli, iar transmiterea

la persoanele sensibile se realizeaz prin contact direct cu sursa de infecie. S. maltophilia

prezint capacitatea de a forma biofilme pe suprafee variate inclusiv teflon, sticl, materiale

plastice i esuturile gazdei (De Oliveira-Garcia i colab., 2003). Biofilmele au fost estimate a fi

asociate infeciilor dobndite n mediul spitalicesc n proporie de 65% (Potera, 1999).

Lipopolizaharide

Structura LPS la specia S. maltophilia este cea tipic (lipidul A, miezul oligozaharidic i

antigenul O), totui aceste componente prezint o serie de particulariti, i anume:- lipidul A conine resturi de glucozamin fosforilate cu N-acizi grai raportate la S.

maltophilia tulpina ATCC 10257 (Neal; Wilkinson, 1982).

- componentele miezului oligozaharidic includ: D-glucoz, D-manoz, D-

galactoz, D-galactozamin, acid D- galacturonic, L-glicero--D-manoheptoz

(Neal; Wilkinson, 1982).

- componentele antigenului O cuprind ramnoz, fucoz, xiloz, glucoz (Juckeri

colab., 1996).

La tulpina menionat mai sus s-a demonstrat c lipsesc proteinele din membrana extern,

fapt ce sugereaz ncrcarea pozitiv a suprafeei celulare=>capacitate ridicat a tulpinilor de S.

maltophilia de a adera la teflon i sticl comparativ cu cea a unui izolat de P. aeruginosa cu

suprafaa celular ncrcat negativ.


27/200


- 25 -

Deficienele LPS pot modifica producia biofilmului la S. maltophilia (Huang i colab.,

2006). S-a demonstrat c deficienele LPS scad virulena tulpinilor de S. maltophilia n infeciile

pulmonare la obolani (McKay i colab., 2003). Modificri n structura LPS afecteaz

sensibilitatea celulei bacteriene la substane antimicrobiene, cum ar fi peptidele cationice iaminoglicozidele. Temperatura reprezint un alt factor ce modific compoziia chimic a LPS,

ducnd la schimbri n susceptibilitatea la aminoglicozide (Rahmati-Bahram i colab., 1997).

1.7.4. Manifestri clinice ale infeciei cuS. maltophilia

Infeciile cu tulpini ale speciei S. maltophilia se caracterizeaz printr-un spectru variat

de simptome i manifestri clinice. Specia prezint potenial patogen strict limitat i rareori este

capabil de a provoca afeciuni la indivizi diferii de cei imunocompromii (Southern i colab.,

1974). Bacteriemiile reprezint manifestrile comune ale infeciei cu S. maltophilia (Elting,

1990; Jang i colab., 1992). Ele pot fi secundare unei surse pulmonare, urinare, gastrointestinal e

(Aoun, 1992), dei uneori nu este posibil determinarea porii de intrare n orga nism.

Endocardite

Cele mai multe cazuri descrise sunt cele aprute n urma unor complicaii ale interveniilor

chirurgicale cu dispozitive protetice (Baddour, 1991), alteori infecia poate aprea n perioada

postoperatorie, probabil din cauza colonizrii dispozitivelor vasculare contaminate (Elting,

1990). Au fost enumerate o serie de manifestri cardiace determinate de infecia cu S.

maltophilia incluznd: pericardite (Elting, 1990), infecii consecutive ocului pseudocardiac,precum i bacteriemii asociate colapsului valvei mitrale (Arpi i colab., 1994).

Infecii ale tractului respirator

Tractul respirator reprezint sursa cea mai frecvent de izolare a S. maltophilia, la

pacienii spitalizai reprezint 56-69% dintre sursele de izolare (Gerner-Smidt i colab., 1995),

Prima citare a izolrii S. maltophilia din tractul respirator al pacienilor cu fibroz chistic

dateaz din 1975 n Danemarca (Frederiksen i colab., 1995). Prevalena a crescut de la 2% n

1975, la 19% n 1993, n Danemarca i de la 0% n 1983 la 10% n 1990 ntr-un singur centru

britanic (Gladman i colab., 1992), i respectiv la 19% ntr-un alt centru britanic i la 30% ntr-

un centru spaniol (Denton i colab., 1996). Cauzele acestei creteri nu sunt foarte clare, ns un

studiu a sugerat c factorii de risc predispozani sunt reprezentai de cantitatea de antibiotice

antipseudomonade cu care pacienii spitalizai au fost tratai, precum i durata spitalizrii

(Gordon i colab., 1988).


28/200


- 26 -

Dei anumii autori afirm c majoritatea pacienilorcu S. maltophilia sunt colonizai i

nu infectai (Khardori i colab., 1991), alii consider c infeciile tractului respirator cu S.

maltophilia sunt asociate cu rate crescute de mortalitate (Morrison i colab., 1986), izolarea

tulpinilor de S. maltophilia reprezentnd un predictor al mortalitii (rata mortalitii pacienilorneotropenici cu pneumonie situndu-se in jurul valorii de 40%).

Infecii oftalmologice

Incidena infeciilor oculare determinate de S. maltophilia este n continu cretere. O

serie de afeciuni oftalmologice au fost menionate, printre care pot fi amintite: conjunctivite,

keratite, ulcere corneene (Penland; Wilhemus, 1996).

Infecii ale tractului urinar

Dei S. maltophilia a fost frecvent izolat din probe de urin, o serie de autori au

demonstrat c nu exist dovezi suficiente pentru a susine c aceast specie reprezint un agent

patogen al tractului urinar (Gardner i colab., 1970). La majoritatea pacienilor infecia este

dobndit n spital (Laing i colab., 1995) i este de obicei secundar interveniei chirurgicale la

nivelul tractului urinar sau post-cateterizare. Printre infeciile tractului urinarpot fi enumerate:

uretrita, abcesele periuretrale, epididimita. Garcia i colab., au descris n 1981 izolarea speciei

din probe de material seminal de la brbai fertili.

Infecii ale pielii i esuturilor moi

S. maltophilia a fost relativ frecvent izolat din secreii i leziuni cutanate (Gilardi, 1969;1971). Mai trziu a fost descris o afeciune de celulit asociat cu leziuni nodulare ale pielii

(Vartivarian i colab., 1994). Aceste leziuni pot mima infeciile fungice asociate cu un

prognostic nefavorabil. Patogenul oportunist S. maltophilia a fost de asemenea izolat din infecii

cutaneo-mucoase i perineale n cazul pacienilor cu boli maligne (Vartivarian i colab., 1994).

Infecii gastrointestinale

Zuravleffi Yu n 1982, au citat un caz de bacteriemie consecutiv gastroenteritei, dei nu este

foarte clar dac cele dou evenimente sunt legate cauzal . Autorii au remarcat existena speciei n

microbiota oral a pacienilor cu cancer supui chimioterapiei mielosupresive, ns autorii nu au

observat simptome ale infeciei acute la aceti indivizi.

Ca i ceilali BGNNF, S.maltophiliaprezint rezisten intrinsec la o serie de antibiotice

mai ales c toate tulpinile prezint o -lactamaz cromosomal ce confer rezisten la

carbapeneme i la majoritatea antibioticelor -lactamice. De asemenea prezint rezisten la


29/200


- 27 -

dezinfectani (Quinn, 1998). Terapia infeciilor cauzate de tulpini aparinnd speciei S.

maltophilia este dificil de stabilit mai ales datorit rezistenei ridicate ale acestui microorganism

la antibiotice (Vartivarian i colab., 1994). A fost raportat un numr semnificativ de tulpini de S.

maltophilia la care cei mai eficieni ageni antimicrobieni au fost minociclina, ticarcilina cuacidul clavulanic i biseptolul (Quinn, 1998).

1.8. GenulAcinetobactercuprinde specii bacteriene non-fermentative, saprotrofe n sol, ap, ap

menajer i hran, comensale ale tegumentului personalului medical i pacienilor, ns

reprezint ageni patogeni nosocomiali de temut n special n seciile de terapie intensiv

(Chifiriuc i colab., 2011).


Aceti bacili, n faz logaritmic de cretere, devin cocoidali i grupai n diplococi sau n

lanuri de lungimi variabile, n faza staionar de cretere. Speciile genului Acinetobacter sunt

strict aerobe i pot crete la 330C dei unele tulpini prefer temperaturi de 300C-420C, iar cele

izolate din mediu 200C-300C (Chifiriuc i colab., 2011). Reacia oxidazei difereniaz tulpinile

de Acinetobacter sp. de genurile nrudite. Toate tulpinile de Acinetobacter sp. sunt oxidazo

negative neavnd citocrom C, ci doar citocrom b i ocazional citocrom d (Chifiriuc i colab.,

2011). Majoritatea tulpinilor cresc pe medii minerale simple; unele tulpini pot utiliza glucoza i

pot produce hemoliza pe mediu de cultur geloz snge datorit producerii de fosfolipaz C

(Chifiriuc i colab., 2011). Tulpinile de Acinetobactersp. pot persista n mediu de la cteva zilela sptmni, chiar n condiii de desicaie (Chifiriuc i colab., 2011). n cadrul genului

Acinetobacter, au fost descrise pe lngA. baumannii, speciileA. johnsonii iA. lwoffii, precum

iA. baumannii/haemolyticus (Quinn, 1998)

A. baumanniieste un bacil imobil, oxidazo-negativ al crui habitat natural rmne nc

nedeterminat (www.cdc.gov). Este inclus n familia Moraxellaceae, care include genurile

Acinetobacter, Moraxella, Psychrobacter (Peleg i colab., 2008). Cu toate acestea, specia

colonizeaz mediul din unitile de ngrijire ale sntii i poate fi un agent infecios

nosocomial. Combinaia ntre capacitatea de adaptare la condiiile de mediu i gama larg de

factori de rezisten l face un agent patogen nosocomial de temut (Nordmann, 2004). A.

baumannii reprezint cauza multor focare de infecie la nivel mondial (Villegas; Hartstein,

2003), manifestnd niveluri tot mai ridicate de rezisten. Numeroase semnalri raporteaz

tulpini MDR de A. baumannii izolate din unitile spitaliceti din Europa, America de Nord,


30/200


- 28 -

Argentina, Brazilia, China, Taiwan, Hong Kong, Japonia, Coreea i din zone ndeprtate ca

Tahiti din Pacificul de Sud (Barbolla i colab., 2003; Houang i colab., 2001; Levin i colab.,

1996). Specia determin infecii la pacienii imunosupresai, la pacieni cu boli grave, precum i

la cei tratai cu anibiotice de spectru larg (Garcia-Garmendia i colab., 200, John i colab., 2006).1.8.2. Manifestri clinice ale infeciei cuA. baumannii

Infeciile determinate deA. baumannii sunt frecvente n unitile de terapie intensiv, caz

n care acestea reprezint principala cauz a pneumoniei, infeciilor tractului urinar,

meningitelor, conjunctivitelori a bacteriemiei. Mai puin frecvent, specia determin infecii la

nivelul pielii i esuturilor moi, infecii abdominale, infecii ale sistemului nervos central

(Fournier; Richet, 2006). Mai recent, s-a demonstrat c A. baumannii a devenit un agent patogen

major n infeciile asociate plgilor (Aronson i colab., 2006). De cele mai multe ori este dificil

de fcut distincia ntre colonizarea i infecia cu A. baumannii (Joly-Guillou, 2005). Factorii de

risc n colonizare i infecie sunt reprezentai de proceduri invazive, ca de exemplu ventilaia

mecanic, interveniile chirurgicale recente, utilizarea antibioticelor de spectru larg. Infecia a

fost definit drept izolarea unei tulpini dintr-o surs steril n mod normal, n timp ce colonizarea

reprezint izolarea unei tulpini dintr-un eantion clinic, n absena simptomelor clinice specifice

infeciei (Magret i colab., 2011).

Ca i P. aeruginosa, speciile genului Acinetobacter sunt larg rspndite n mediul ambiant

(Quinn, 1998). Anumite tulpini sunt rezistente la dezinfectani iar acestea reprezint cele maifrecvente microorganisme izolate de pe minile personalului medical (Larson, 1981). 25% din

pacienii sntoi externai prezint colonizare la nivelul pielii, iar 7% la nivelul faringelui

(Quinn, 1998).

Dac n urm cu 25 de ani, s-a fost demonstrat c Acinetobacter sp. poate dobndi factori

genetici de rezisten (Goldstein si colab., 1983), n prezent se cunoate faptul c transpozoni

(elemente genetice mobile, integrate n cromosomul bacterian sau localizate la nivel plasmidial)

au rol important n diseminarea determinanilor genetici de rezisten la tulpinile de

Acinetobactersp. (Palmen; Hellingwerf, 1997). Au fost descrii transpozoni care conin integroni

(din clasa 1) elemente genetice care, dei nu au capacitate de transpozitie, conin gena int i

casete genice ce pot fi mobilizate n ali integroni sau la situsuri secundare din genomul bacterian

(Poirel si colab., 2005).


31/200


- 29 -

Majoritatea tulpinilor sunt rezistente la penicilin, iar unele izolate clinice sunt rezistente de

asemenea la cefalosporine prin supraproducia unei cefalosporinaze cromozomale. Nivelul de

rezisten la carbapeneme a crescut de la 9% n 1995, la 40% n 2010 (fig. 9) i este ntr-o

continu cretere n prezent, potrivit ECDC (Munoz-Price i Weinstein, 2008). Nivelul demultirezisten este net superior celorlali ageni patogeni Gram negativi (Lockhart i colab.,

2007). Din acest motiv, este foarte important s se fac disticia ntre colonizarea i infecia cu A.

baumannii, n vederea stabilirii dozelor terapeutice (Shelburme i colab., 2008).

Fig. 9. Reprezentarea nivelului rezistenei A. baumannii la carbapeneme n 2010 Europa ( www.mystic-data.org.)

A. baumannii reprezint cauza unor infecii n multe ri ale Europei (Looveren;

Goossens, 2004). De la nceputul anilor '80, au fost descrise focare de infecie determinate de

tulpini de A. baumannii n Europa, n special n Anglia, Frana, Germania, Italia, Spania, i

Olanda (Villegas; Hartstein, 2003). Diseminarea tulpinilor MDR de A. baumannii nu se

limiteaz doar la unitile spitaliceti intraurbane ci are loc la nivel naional; de exemplu

diseminarea tulpinilor MDR aparinnd EU II (clona european II) de A. baumannii dinPortugalia (Da Silva i colab., 2007). Transferul internaional de pacieni colonizai a dus la

introducerea i rspndirea epidemiei ulterioare cu tulpini de A. baumannii multirezistente n

rile de Sud din Europa de Nord, cum ar fi Belgia i Germania (Schulte i colab., 2005). Aceste

evenimente subliniaz importana unui screening adecvat precum i a msurilor de control

epidemiologic (Peleg si colab., 2008).


32/200


- 30 -

CAPITOLUL 2

MECANISME DE REZISTEN ALE BACILILOR GRAM NEGATIVI NON-FERMENTATIVI LA ANTIBIOTICELE -LACTAMICE

Rezistena reprezint capacitatea unui microorganism de a crete n prezena unei

concentraii ridicate ale unui agent antimicrobian. Bacteriile au o capacitate remarcabil de a

dezvolta rezisten la fiecare nou antibiotic introdus n terapia antiinfecioas.

Incidena tot mai ridicat n ultimii ani a BGNNF se datoreaz att dobndirii unor factori

genetici de rezisten la antibiotice, ct i a unor factori de virulen, care le determin condiiade patogeni oportuniti. Infeciile datorate BGNNF sunt n prezent mai rspndite i cu evoluie

sever datorit inclusiv antibiorezistenei, ca i riscului de oc endotoxic (Lazr, 2001).

Principalele clase de antibiotice utilizate n tratamentul infeciilordeterminate de BGNNF sunt -

lactamii, aminoglicozidele i quinolonele.

Rezistena la antibiotice poate fi natural (intrinsec) sau dobndit prin intermediul

genelor de rezisten dobndite sau aprute prin mutaii (Jehl i colab., 2010).

2.1. Mecanisme de rezisten natural

Rezistena intrinsec se refer la bacteriile insensibile la un antibiotic, n stare natural,

fr s dobndeasc factori genetici de rezisten de la alte specii sau tulpini bacteriene (Jehl i

colab., 2010).

Rezistena natural este o caracteristic proprie, aparinnd tulpini lor unei specii sau unui

gen, oricare ar fi mediul de izolare. Rezistena natural este ntotdeauna transmisibil la

descendeni (transmitere vertical), materialul genetic codificator fiind localizat n cromosomul

bacterian. Rezistena intrinsec fa de antibiotice face parte dintre caracteristicile fenotipurilor

slbatice ale speciilor bacteriene (Jehl i colab., 2010).Mecanismele rezistenei naturale

Rezistena natural se produce prin urmtoarele mecanisme:

inta de aciune a antibioticului este inaccesibil;


33/200


- 31 -

antibioticul prezint o afinitate sczut pentru int sau inta celular de aciune a

antibioticului lipsete; de exemplu, membrana extern a bacililor Gram negativi

este impermeabil pentru anumite clase de antibiotice (glicopeptide, macrolide,

lincosamide, streptogramine) (Kotrai colab., 2002).Originea genelor de rezisten la antibiotice n populaiile bacteriene este dubl

(Mihescu i colab., 2007) :

pe de o parte exist, n mod natural, gene de rezisten, care probabil au aprut n

evoluie n populaiile bacteriene din sol i ape, ca modaliti de autoprotecie a

productorilor de antibiotice sau de protecie a speciilor asociate acestora i fa

de substanele nocive produse de exemplu de speciile vegetale asociate;

pe de alt parte datorit unor mutaii ale unor gene constitutive ce codific pentru

anumite enzime din metabolismul bacterian i care au evoluat prin extinderea

specificitii de substrat (de exemplu kinazele i acetil-transferazele care pot

modifica aminoglicozidele prin fosforilare i adenilare).

2.2. Mecanismele rezistenei dobndite

Rezistena dobndit se traduce prin scderea sau pierderea total a sensibilitii unei

tulpini microbiene la unul sau mai multe antibiotice.

Rezistena dobndit la antibiotice poate fi mediat de (Lazr, 2001):

1. determinani genetici cromosomali;

2. prezena plasmidelorR (de rezisten i multirezisten la antibiotice).

3. secvene de ADN excedentare (transpozoni, integroni), integrate prin

recombinare;

2.2.1. Rezistena mediat cromosomal(rezistena primar) este datorat unei mutaii a genei care

codific fie inta antibioticului, fie sistemul de transport transmembranar care controleaz

ptrunderea antibioticului n celula bacterian (Lazr, 2001).

Rezistena dobndit prin mutaii

Sub presiunea selectiv a antibioticelor se pot produce modificri genetice prin mutaii

punctiforme ce pot modifica sensibilitatea organismelor la unul sau o clas de antibiotice prin

modificarea structural a intei de aciune a antibioticului. Se pot produce i schimbri genetice

macroevolutive care implic rearanjarea unor secvene mari de ADN prin transpoziie; dac


34/200


- 32 -

schimbrile implic deplasarea genelor de rezisten i trecerea lor sub controlul unui nou

promotor organismul devine rezistent (Lazr, 2001).

2.2.2. Rezistena plasmidialGenele de rezisten sunt localizate fie la nivel plasmidial, fie la nivelul elementelor

genetice mobile de tipul transpozonilor sau integronilor, care se pot deplasa de pe o plasmid pe

alta sau pe cromosom n aceeai sau ntr-o alt tulpin microbian (Liebert 2009).

Plasmidele R (de rezisten transmisibil, cu caracter infecios) sunt elemente genetice

extracromosomale care confer celulei purttoare rezisten simultan la numeroase antibiotice,

la sulfamide, la cationii metalelor grele (Pb, Hg), (Watanabe, 1961) sau radiaii ultraviolete

(Herlea, 1998).

Structura molecular a plasmidelor:

Plasmidele R sunt molecule ADN dublu catenar circular covalent nchis sau deschis. La

speciile bacteriene Gram negative plasmidele R prezint dimensiuni mai mari dect cele descrise

la bacteriile Gram pozitive i pot conine peste 100 de gene. n structura plasmidelor R, genele

de rezisten la antibiotice pot fi localizate n structura unui transpozon. Au fost descrise

plasmide R stabile ns i situaii cndplasmidele R sunt instabile i sepot elimina spontan, mai

ales dac presiunea selectiv exercitat de antibiotic scade pn la dispariie (Herlea, 1998).

Plasmidele R cuprind n alctuirea lor urmtoarele categorii de determinani genetici: genele care confer rezisten la diferite antibiotice sau la acelai tip de agent

antimicrobian ( genele ,,r) fac parte din structura unor transpozoni, fiind delimitate de

secvene de inserie (Herlea 1998);

genele care formeaz factorul de transfer al rezistenei - sunt grupate ntr-un transpozon,

se numesc gene tra i codific sinteza proteinelor necesare transferului plasmidei prin

conjugare conferind plasmideiR funcia de conjugon (Lazr, 2001);

secvene de inserie (SI) reprezint cele mai simple elemente genetice transpozabile(


35/200


- 33 -

n prezent peste 30 SI (Siguieri colab., 2006), printre cele mai frecvente fiind ISAba1,

ISAba4 iISAba125.

SRS SRD

tnp

Fig. 10. Reprezentarea schematic a unei secvene de inserie (dup Partidge, 2011).

secvene de iniiere a procesului de replicare (,,ori);

genele ce asigur replicarea autonom a plasmidei.

Clasificarea plasmidelor R:

1. dup capacitatea de a media prin conjugare transferul intercelular de material genetic(Herlea, 1998):

plasmidele conjugative (transmisibile) prezint dimensiuni mari (> 30 kb),

capabile s medieze transferul intercelular de material genetic, prezint

operonul tra sau de transfer a mai mult de 25 gene ce codific sinteza pilinei

i asamblarea pililor de sex, replicarea ADN i fenomenul de incompatibilitate

a plasmidelor similare i precum represia expresiei genelor tra; aceste

plasmide auto-transmisibile au un rol n diseminarea genelor ce confer

rezisten la antibiotice, la metale grele, precum i a elementelor genetice

transpozabile i a integronilor (Herlea, 1998);

Bryan i colab., (1973) au propus clasificarea plasmidelor R identificate la tulpinile de P.

aeruginosa n patru grupe de incompatibilitate notate P1, P2, P3, P4. La specia amintit anterior,

un numr extrem de redus de plasmide R conjugative au fost ncadrate ulterior n grupul P sau C

(Sagai i colab., 1976).

plasmide non-conjugative prezint o regiune implicat n mobilizarea lor de

ctre plasmidele conjugative (regiune mob), prin formarea unor cointegrate

structurale (Smillie i colab., 2010), fiind astfel indus caracterul de conjugon;

plasmide mobilizabile nu pot iniia conjugarea ns, datorit prezenei

regiunii mob, pot fi mobilizate i transferate la bacteria receptor, n procesul

de conjugare iniiat de o alt plasmid conjugativ ce coexist n bacteria

tnp


36/200


- 34 -

donor. Pn n prezent au fost descrise ase familii de plasmide MOB:

MOBF, MOBH, MOBQ, MOBC, MOBP, MOBV (Smillie i colab., 2010) . Din

cele 1730 plasmide descrise n 2009 n baza de date GenBank, cele mai multe

familii de plasmide MOB au fost identificate astfel: familia MOBP a fost celmai frecvent identificat (273 plasmide) urmat de familia MOBH. Fiecrei

familii i corespund subfamilii astfel: a fost descris subfamlia MOBF12 ce

corespunde plasmidelor din grupul de incompatibilitate IncF; iar subfamilia

MOBP5 corespunde plasmidelor ColE1-like (Smillie i colab., 2010) .

2. dup capacitatea de a se integra n cromosomul celulei gazd:

Plasmide integrative pot exista n dou stri alternative, integrate reversibil

n cromosomul bacterian (episomi) sau n stare autonom (Herlea, 1998);

Plasmide neintegrative exist n stare autonom neintegrndu-se n

cromosom (Herlea, 1998).

3. dup compatibilitatea de grup: plasmidele asemntoare sunt incompatibile n aceiai

celul; plasmidele incompatibile prezint un grad de omologie de secven (>60%) mai

mare dect cea a plasmidelor compatibile (Herlea, 1998).

Spre deosebire de reprezentanii familiei Enterobacteriaceae, la care plasmidele au fost

clasificate pe baza metodelor moleculare (hibridizare Southern Blot) n 27 de grupe de

incompatibilitate, la genul Acinetobacter informaiile sunt destul de limitate privind plasmideletransferabile, i mai ales laA. baumannii - patogen oportunist, care determin infecii din ce n ce

mai frecvente n ultimii ani n seciile de terapie intensiv. Analiza rezultatelor secvenierii

diferitelor replicaze la A. baumannii, a artat c plasmidele genului Acinetobacterreprezint un

tip particular, total diferit fa de al altor organisme procariote (Towner i colab., 2011). Autorii

au elaborat o schem de clasificare a replicazelorA. baumannii, pe baza metodei PBRT (PCR

Based on Replicon Typing) fiind mprite n 19 grupuri notate de la GR1 - GR19, pe baza

omologiei de secven a nucleotidelor. De cele mai multe ori prezena -lactamazelor dobndite

din clasa D (CHLD) la A. baumannii este asociat cu localizarea la nivelul GR6 (repAci6)

(Bertini i colab., 2010; Towneri colab., 2011).


37/200


- 35 -

2.2.3.Rezistena mediat de elemente genetice transpozabile

Alturi de SI, transpozonii i integronii reprezint principalele categorii de elemente

genetice transpozabile.

2.2.3.1. Transpozonii sunt secvene de ADN mobile (cu poten ial de transpoziie), care includ n

structura lor gene structurale delimitate la extremiti de SI, a cror mrime variaz ntre 2,1-

9,3kb (Mihescu i colab., 2007). Transpozonii, prin procesul de transpoziie, pot produce

mutaii la nivelul genei n care se inser, pot media rearanjamente genetice, pot dobndi noi

gene contribuind astfel la variabilitatea materialului genetic ntr-o populaie bacterian. Studiul

transpozonilor s-a amplificat odat cu semnalarea faptului c genele de rezisten la antibiotice

pot sa treac de pe o plasmid pe alta. Relocarea transpozonilor duce la instabilitate genetic,

asociat cu modificri fenotipice, dac transpoziia are ca rezultat inseria unui elementtranspozabil ntr-o gen structural (Mihescu i colab., 2007). Dac transpoziia are loc ntr-o

gen reglatoare, o gen care este represat n mod normal, poate fi exprimat constitutiv i la un

nivel superior celui obinuit. Pentru ca un element transpozabil s se insere ca o entitate de sine

stttoare, este necesar ca transpozaza s recunoasc extremittile sale, caracterizate prin

prezena SRI (secvene repetate invers) ce au rolul de situsuri de recunoatere pentru

transpozaz, enzim ce catalizeaz procesul de transpoziie. Datorit capacitii de mobilizare,

transpozonii sunt factori majori ai reorganizrii informaiei genetice i pentru acumularea de

gene de rezisten ntr-o singur plasmid (Poirel i colab., 2012). Transpoziia este o cale rapid

i eficient pentru transferul concomitent al rezistenei la anumite antibiotice sau clase de

antibiotice.

Transpozonii bacterieni pot fi clasificai n dou clase dup complexitatea genetic

(Poirel i colab., 2012)

Clasa I include transpozoni compui ce poart o varietate de gene de

rezisten sub form de secvene centrale delimitate de secvenele de inserie

ce le flancheaz; Clasa II transpozoni compleci;

Clasa I - Transpozonii compui sunt n mod normal integrai n cromosomul bacterian. Se pot

transpoza dintr-un situs n altul, iar mecanismul de transpoziie se realizeaz printr-o secven

intermediar circular covalent nchis i nu copiaz situsul int in momentul integrrii n ADN.


38/200


- 36 -

Transpozonii compui conin o serie de gene structurale, delimitate la extremiti de secvene de

inserie (SI) (fig. 11 A), a cror exprimare confer proprieti noi celulei purttoare (rezisten la

antibiotice, sintez de toxine, factori de virulen)

Clasa II Transpozonii compleci prezint secvene SRI terminale mai lungi decttranspozonii compui, dar nu prezint secvene de inserie. Pot fi localizai la nivelul unor

plasmide cu spectru larg de gazd i mediaz transferul orizontal i vertical al genelor de

rezisten multipl. Transpozonii compleci poart elemente genetice mobile de tipul

integronilor, ce prezint un sistem de integrare situs specific, responsabil de dobndirea de

multiple elemente genetice mici, denumite casete de gene, care conin gene de rezisten la

antibiotice sau codific gene de virulen. Tn compleci sunt grupai n familia Tn3 care include

dou subfamilii: Tn3like i Tn21like (Poirel i colab., 2012).

O categorie separat, din punct de vedere al structurii genetice, o reprezint transpozonii

simpli (Tn), care sunt asemntori SI, dar se deosebesc de acetia prin faptul c secvena

central poart gene a cror expresie fenotipic este decelabil i confer proprieti noi

celulei purttoare (Jury i colab., 2010). Genele structurale sunt flancate de secvene

repetate lungi (1-2 kb), cel mai adesea n ordine inversat (fig. 11 A).

Fig. 11. Reprezentarea schematic a transpozonilor compui Tn2006(A), Tn2008 (B) i Tn2007(C) (dup Mugnier

i colab., 2010).

SI ISAba1 (1180bp) a fost identificat la A. baumannii (Corvec i colab., 2003). Iniial

aceast SI a fost raportat doar la tulpinile acestei specii (Partridge i colab., 2011). Aceast SI


39/200


- 37 -

este localizat n amonte fa de gena blaOXA-23, n structura transpozonului Tn2008 (fig.11 B),

n structura transpozonul compus Tn2006 gena blaOXA-23 este flancat de dou copii ale SI

ISAba1 orientate n direcie opus (fig.11 A), iar n structura Tn2007 gena blaOXA-23 este

precedat de SIISAba4 (fig. 11 C) ce difer funcional deISAba1 (Mugnieri colab., 2010).

2.2.3.2. Integronii sunt structuri modulare cu rol major n evoluia rezistenei la antibiotice.

Integronii sunt secvene de ADN capabile s nglobeze i s medieze deplasarea unor secvene

mobile, scurte de ADN denumite casete genice (Hall; Collis, 1995; Hall; Collis, 1998).

Structura genetic. Un integron conine o secven ce codific integraza (Int1) localizat

la nivelul regiunii conservate 5' i o secven adiacent de recombinare (att), care recunoate

situsul specific de recombinare; regiunea promotor (P) care activeaz expresia genelor situate n

regiunea din aval situsului de recombinare (fig. 12), iar n regiunea conservat 3' , cu o lungimevariabil, se gsesc genele de rezisten la un antibiotic (gena qacE ce confer rezisten la

antiseptice i gena sul1, care codific o dihidropteroat-sintetaz ce mediaz rezistena la

sulfonamide) (Skold 2000). 59 bp

59 bp 59 bp

Fig. 12. Reprezentarea schematic a integronilor din clasa 1. Gena int1 codific pentru tirozin-recombinaz

(integraz), ce catalizeaz recombinarea ntre secvena adiacent de recombinare (59 bp) i situsul de

recombinare (att) rezultnd integrarea sau excizia casetelor genice din regiunea din aval; ORF1, ORF2

( open reading frameshift)=secven cadru de citire (dup Csilla, 2011).


40/200


- 38 -

Dup integrare, secvenele de recombinare sunt refcute, permind astfel integrarea

ulterioar a altor casete genice. Structura integronilor faciliteaz gruparea pe acelai element

genetic mobil a mai multor gene de rezisten care pot fi ulterior transferate simultan npopulaiile bacteriene. Prin intermediul casetelor genice, complementul genelor de rezisten

poate fi permanent rearanjat i deplasat de pe un replicon pe altul. Un integron poate grupa i

integra casete genice multiple conducnd astfel la apariia multirezistenei la antibiotice (Jury i

colab., 2010).

Pn n prezent au fost descrise 9 clase principale de integroni (Gu i colab., 2007), dintre

care cei din clasa 1 sunt cel mai frecvent semnalai laP. aeruginosa iA. baumannii, localizai la

nivel plasmidial sau n structura unor transpozoni, avnd rol n transferul orizonal al genelor de

rezisten la antibiotice i n procesul evolutiv al multirezistenei i rezistenei extinse la

antibiotice.

Integronii de clas 2 i 3 prezint integraza Int2 respectivInt3 care prezint omologie de

61% cuInt1 (Gu i colab., 2007). Clasa 2 de integroni deriv din Tn7; integronii din clasele 4 i

5 sunt asociai cu genele de rezisten la trimetoprim a speciilor de Vibrio (Mazel i colab.,

2006).

Dup Mazel, 2006 integronii sunt clasificai n dou grupe:

Integronii de rezisten poart majoritatea casetelor genice ce conferrezisten la antibiotice i sunt de cele mai multe ori localizai n structura

unui transpozon;

Super-integronii sunt integroni de dimensiuni mari, localizai exclusiv

cromosomal, ce conin gene cu o varietate de funcii.


41/200


- 39 -

2.3. REZISTENA BGNNF LA PRINCIPALELE CLASE DE ANTIBIOTICE

2.3.1 REZISTENA LA ANTIBIOTICELE -LACTAMICE

Substanele antimicrobiene acioneaz prin urmtoarele mecanisme de aciune (fig. 13)(Chifiriuc i colab., 2011):

- inhibiia sintezei peretelui celular;

- inhibiia transportului transmembranar;

- inhibiia sintezei proteinelor respectiv a proceselor de transcriere i traducere a materialului

genetic;

- inhibiia sintezei acizilor nucleici;

- blocarea unei ci metabolice prin inhibiie competitiv.

Fig 13. Principalele inte de aciune ale substanelor antimicrobiene(http://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/micro%20resources.htm).

Antibioticele -lactamice reprezint prima i cea mai utilizat clas de substaneantimicrobiene, cuprinznd un numr mare de compui, naturali, semi-sintetici sau sintetici. Sunt

clasificate pe baza structurii chimice n peniciline, cefalosporine, carbapeneme, monobactami

(Buiuc i colab., 1992; Mihescu i colab., 2007) (Tabelul 3).

7/25/2019 UB Doctorat

UB Doctorat Biologie 2014 Gheorghe Irina PDF (1)

Documents

Transcript of UB Doctorat Biologie 2014 Gheorghe Irina PDF (1)