1

.D D S.

DIAGNOSTIC Str. Vatra Luminoasa , nr. 45, sect. 2, Bucuresti

telefon: 0213440771, fax: 0214104009,

e-mail: office@ddsdiagnostic.ro

Manual de utilizare

TSH ELISA

Determinarea imunoenzimatica directa a

tireotropinei (TSH) din ser uman

Varianta 2.2

96 teste

LOT TSH018 var. 2.2

2

CUPRINS

Scopul 3

1 Semnificatia clinica 3

2 Principiu 4

3 Componente trusa 4

4 Materiale necesare neincluse in trusa 4

5 Preparare reactivi 5

6 Conditii de pastrare 5

7 Proba biologica 5

8 Precautii 5

9 Procedura de lucru 6

10 Controlul de calitate 8

11 Calculul rezultatelor 8

12 Exemplu de curba standard 8

13 Valori asteptate 9

14 Performante si caracteristici 9

15 Managementul deseurilor 10

16 Bibliografie 11

17 Schema analizei 12

3

Tireotropina – hormon de stimulare tiroidiana (TSH)

Determinarea imunoenzimatica directa a tireotropinei (TSH) din ser

uman

SCOPUL

Acest kit se utilizeaza pentru determinarea cantitativa prin metoda imunoenzimatica,

colorimetrica (ELISA) a TSH din ser.

1. SEMNIFICATIA CLINICA

Sinteza si secretia de hormoni tiroidieni se afla sub controlul unui sistem de feedback

negativ la care participa tireotropina hipofizara (TSH), hormonul hipotalamic eliberator de

tireotropina (TRH) si hormonii tiroidieni circulanti (T3 si T4). Sinteza si secretia de TRH este

controlata de centri nervosi din creier prin intermediul hormonilor tiroidieni din plasma. Nivele

scazute de T3 stimuleaza formarea de TRH care la randul sau determina sinteza si secretia de

TSH. TSH actioneaza asupra tiroidei activand secretia de hormoni tiroidieni in sange. Cresterea

nivelului plasmatic al hormonilor tiroidieni provoaca o actiune inhibitore la nivelul

hipotalamusului si reduce secretia de TSH. Aceasta ultima actiune pare a fi mediate de

somatostatina. T3 si T4 stimuleaza sinteza de stomatostatina care, la randul ei, inhiba eliberarea

de TSH.

TSH este o glicoproteina cu structura dimerica α, β. Subunitatea α din structura TSH se

prezinta sub forma unui lant polipeptidic care se regaseste identic si la alti hormoni hipofizari

glicoproteici: FSH (hormon de stimulare foliculara), LH (hormon luteinizant) si hCG (human

chorionic gonadotropin). Subunitatea β difera de la un hormon la altul. Aceasta similaritate

structurala poate conduce foarte usor la reactii incrucisate cu anumite antiseruri policlonale

TSH. In aceasta trusa au fost utilizati anticorpi monoclonali, pentru a elimina reactiile

incrucisate, respectiv valori fals crescute ale concentratiei TSH.

Determinarea concentratiei TSH in ser este importanta pentru diagnosticarea

hiper/hipotiroidismului, interpretarea rezultatelor realizandu-se si in functie de nivelul

concentratiei hormonilor T3 si T4. De exemplu, valori crescute ale TSH si T3, T4, pot indica

disfunctii ale hipotalamusului si hipofizei. In acest caz, cresterea concentratiei TSH este de

multe ori produsa de un adenom de hipofiza. Valori scazute ale TSH corelate cu valori scazute

ale T3 si T4 indica o functie scazuta a hipofizei. Daca exista simptome clare de hipotiroidism,

dar nivelul de TSH nu este crescut se suspecteaza un hipotiroidism secundar in cadrul unui

hipopituitarism. Valori scazute de TSH se intalnesc in hipertiroidism. Dozarea TSH este utila si

in monitorizarea tratamentului la pacientii hipotiroidieni: valori scazute se intalnesc in cazul

dozelor excesive de hormoni tiroidieni de substitutie. Valorile normale de TSH indica un

tratament echilibrat.

4

2. PRINCIPIUL TESTULUI

Metoda consta in formarea unui complex sandwich antigen-anticorp, astfel: in

godeurile placii ELISA acoperite cu anticorp anti-TSH, se introduce proba (ser, controale,

calibratori) care contine antigenul nativ TSH. Se adauga solutia conjugat care contine

anticorp anti-TSH marcat cu peroxidaza din hrean (HRP). Are loc imunoreactia dintre

anticorpii anti-TSH (din placa si din conjugatul enzimatic) si antigenul nativ TSH (din

proba), reactie necompetitiva si fara impiedicare sterica, cu formarea unui complex solubil

sandwich antigen-anticorp. Dupa incubare, godeurile sunt spalate cu solutie de spalare

pentru indepartarea fractiei de anticorp nelegat. Se adauga o solutie substrat de TMB, se

incubeaza si se obtine o coloratie albastra. Reactia este oprita prin adaugarea solutiei de

stopare, cand are loc virarea culorii de la albastru la galben. Concentratia de TSH este

direct proportionala cu intensitatea culorii dezvoltate. Absorbanta este masurata cu

spectrofotometru la 450 nm cu referinta 620-630 nm pentru minimizarea imperfectiunilor

godeurilor.

3. COMPONENTE KIT

3.1 Placa ELISA: 1 x 96 godeuri acoperite cu anticorp anti-TSH, ambalate in folie de

aluminiu. Dupa deschidere, placa se poate pastra la 2-8ºC pana la data de expirare a

trusei.

3.2 Standarde TSH: 6 flacoane, S0 x S5 1ml/flacon.

Concentratii: 0 ; 0,5 ; 2 ; 5 ; 10 si 20 µIU/ml.

Nota: Dupa deschidere, standardele se pot pastra pana la 2 luni la 2-80C in flacoane

bine inchise.

3.1. Control 1: 1 flacon ser control liofilizat, se adauga 1 mL apa distilata.

Control 2: 1 flacon ser control liofilizat, se adauga 1 mL apa distilata.

Concentratiile exacte sunt trecute pe flacon si in Certificatul de analiza. Dupa

reconstituire, controlele se pot pastra pana la 2 luni la 2-80C, in flacoane bine inchise.

3.3 Solutie conjugat: 1 flacon x 6 ml, culoare rosie. Contine anticorp anti-TSH (in

tampon Tris-NaCl) conjugat cu HRP. Contine conservanti: Proclin 300 – 0,1 %; sulfat

de gentamicina – 0,004 %.

Nota. Dupa deschidere, solutia conjugat se poate pastra pana la 2 luni la 2-80C la

intuneric, in flacon bine inchis.

3.4 Solutie substrat-TMB: 1 flacon x 12 ml, culoare roz. Contine tetrametilbenzidina in

solutie tampon de acid citric si H2O2. Nota. Dupa deschidere, solutia substrat se poate

pastra pana la 2 luni la 2-80C la intuneric, in flacon bine inchis.

3.5 Solutie de stopare: 1 flacon x 7,5 ml. Contine acid sulfuric 0.2 M.

5

Nota. Dupa deschidere, solutia substrat se poate pastra pana la 2 luni la 2-80C la

intuneric, in flacon bine inchis.

3.6 Solutie de spalare concentrata (de 40X): 1 flacon x 25 ml. Contine tampon fosfat

(PBS) cu Tween. Nota. Dupa deschidere se pastreaza asa cum este specificat la

punctul 5.2.

4. MATERIALE NECESARE NEINCLUSE IN KIT

4.1. Apa distilata

4.2. Pipete automate cu volum reglabil

4.3. Incubator de microplaci

4.4. Spalator automat pentru sistem ELISA

4.5. Cititor ELISA cu filtru pentru lungime de unda 450 nm si referinta 620-630 nm.

4.6. Hartie de filtru/absorbanta

4.7. Cronometru

4.8. Materiale control de calitate

5. PREPARARE REACTIVI

5.1. Standardele sunt gata de lucru.

5.2. Solutia de spalare: Se dilueaza continutul solutiei de spalare cu apa deionizata sau

distilata in raport 1 volum solutie de spalare concentrata + 39 volume apa (ex. 25 ml

solutie spalare concentrata cu 975 ml apa deionizata/distilata). Solutia preparata se

poate pastra timp de 2 luni la temperatura camerei. Solutia concentrata dupa deschidere

este stabila pana la data de expirare a trusei.

5.3 Preparare controale incluse in trusa. Se adauga 1 mL de apa distilata, se

omogenizeaza usor si se lasa sa se dizolve 30 minute.

5.4 Se seteaza incubatorul la temperatura de 370C.

6. CONDITII DE PASTRARE

Toate componentele trusei se pastreaza la 2-8oC. Nu se utilizeaza dupa data de

expirare.

Reactivii sunt stabili timp de 2 luni dupa deschiderea trusei, daca sunt pastrati la 2-8oC

si la intuneric.

Placa este stabila dupa deschidere, pana la data de expirare a trusei.

6

Ambalajul placii ELISA se deschide NUMAI dupa ce a ajuns la temperatura camerei,

se scoate numarul de godeuri necesar, dupa care se reambaleaza IMEDIAT si se introduce

la frigider. Godeurile se lucreaza IMEDIAT.

7. PROBA BIOLOGICA

Recoltarea de probe de sange se implementeaza in acord cu practicile curente. Proba folosita

poate fi doar ser. Separarea serului se face cat mai rapid dupa recoltare pentru a evita hemoliza,

care poate afecta performantele testului. Fibrina din probe poate da rezultate fals positive.

Probele de ser pot fi pastrate la temperatura camerei (18-250C) nu mai mult de 8 ore, la 2-8oC nu

mai mult de 7 zile sau la -20 oC pana la 30 zile. Probele de ser cu concentratii mai mari dacat

standardul de 20 µIU/ml trebuie diluate 1:2 cu standard 0. Rezultatul probei se calculeaza

inmultind cu factorul de dilutie.

Atentie! Serul decongelat se lucreaza imediat si NU se recongeleaza! Folosirea

probelor hemolizate, lipemice precum si cele cu fibrina pot da rezultate false.

8. PRECAUTII

8.1 Trusa se utilizeaza NUMAI pentru diagnostic in vitro in laboratoare medicale si NUMAI

de catre personal specializat.

8.2 Pentru informatii privind substantele chimice si componentele biologice din trusa va rugam

sa solicitati Fisa Tehnica de Securitate.

8.3 Toti reactivii din trusa care contin ser/plasma umane au fost testate si gasiti non reactivi

pentru HBsAg, HIV1/2 si anticorpi HCV. Cu toate acestea se recomanda utilizarea lor ca si

cum ar fi potential infectate.

8.4. Evitati ca Solutia de stopare sa vina in contact cu pielea sau mucoasele (contine acid

sulfuric 0,2 M), deoarece poate provoca iritatii sau arsuri. In caz de contact accidental se

recomanda spalarea zonei cu cantitati mari de apa si neutralizarea cu solutie diluata de

bicarbonat de sodiu. Se va solicita consult medical.

8.5 Evitati ca Solutia substrat sa vina in contact cu pielea sau mucoasele (contine

tetrametilbenzidina si peroxid), deoarece poate provoca iritatii sau arsuri. In caz de contact

accidental se recomanda spalarea zonei cu cantitati mari de apa. Se va solicita consult

medical.

8.6 Evitati ca Solutia substrat sa vina in contact cu lumina directa, metale sau oxidanti.

8.7 Nu se va pipeta cu gura.

8.8 Nu se mananca, bea sau fumeaza in zona de lucru.

8.9 Este obligatorie purtarea echipamentului de protectie: halat, manusi latex. Contaminarea

microbiana a reactivilor si a probelor poate conduce la rezultate false.

7

8.10 Manipularea reactivilor si a probelor, precum si indepartarea reziduurilor se va face

respectand legislatia nationala in vigoare.

8.11 Pentru a obtine rezultate optime se recomanda respectarea protocolului de lucru, precum si

calibrarea pipetelor si a cititorului.

8.12 Este interzisa utilizarea componentelor kit-urilor de la loturi diferite.

8.13 A nu se lasa godeurile sa se usuce dupa spalare pana la adaugarea solutiei substrat.

8.14 Etapa de spalare a godeurilor este o etapa importanta de aceea se impune respectarea

numarului de cicluri de spalare si asigurarea ca in timpul spalarii godeurile sunt complet

umplute cu solutie de spalare si apoi complet golite. O spalare incorecta poate conduce la

rezultate false.

8.15 A fost demonstrat efectul heparinei (atat in vivo cat si in vitro) asupra concentratiei de TSH.

De aceea probele nu vor fi recoltate in prezenta acestui anticoagulant.

8.16 Trusa NU se va folosi pentru screening-ul noilor nascuti.

9. PROCEDURA DE LUCRU

9.1 Instructiuni generale:

Reactiile imunoenzimatice sunt puternic influentate de temperatura si timpul de

reactie.

Reactivii, materialele de control trebuie sa fie la temperatura camerei inainte de

inceperea testului;

Pentru a evita contaminarea se vor folosi varfuri de pipeta separate pentru fiecare

standard, control, proba.

Se vor respecta cu strictete timpul si temperatura de incubare. Testul odata inceput,

nu poate fi intrerupt. Asigurati-va ca aveti pregatiti toti reactivii si consumabilele necesare,

precum si aparatura.

Se recomanda ca standardele, controalele si probele sa se lucreze in duplicat.

Pentru fiecare set de probe lucrate se recomanda sa se realizeze curba de calibrare.

9.2 Modul de lucru:

1. Se scoate numarul de godeuri necesar din ambalaj. Godeurile care nu se utilizeaza, se

introduc in folia aluminizata (cu desicator), apoi in punga de plastic cu fermoar si se

inchide bine.

2. Se pipeteaza 50 µL din fiecare standard, control si proba (cu varf nou) in godeul

corespunzator. Pipetarea probelor nu trebuie sa depaseasca zece minute pentru evitarea

erorilor de procedura.

8

3. Se pipeteaza 50 µL solutie conjugat in fiecare godeu. Se roteste placuta cu grija, timp

de 30 sec. pentru omogenizare si se acopera godeurile cu folie sau o bucata de hartie.

4. Se incubeaza 60 minute la 37oC.

5. Se indeparteaza tot continutul godeurilor, prin aspirare.

6. Se spala godeurile de 5 ori cu 350 µL solutie de spalare diluata. Se preseaza energic

placuta cu godeurile in jos pe o hartie absorbanta de 2-3 ori, pentru a indeparta cat mai

bine picaturile de lichid ramase dupa spalare. Nu se lasa godeurile sa se usuce intre

etapa de spalare si adaugarea solutiei substrat.

Atentie! Etapa de spalare si indepartare a lichidului din godeuri este esentiala in obtinerea unor

rezultate corecte!

7. Se adauga 100 µL solutie substrat TMB in fiecare godeu.

8. Se acopera godeurile si se incubeaza 20 minute la temperatura camerei (22-28oC),

la intuneric. Nota: Sa nu se agita microplaca dupa pipetarea substratului.

9. Se adauga 50 µL solutie de stopare in fiecare godeu.

10. Se roteste usor 30 sec. pentru omogenizare.

11. Se citeste densitatea optica (OD) la 450 nm cu referinta 620-630 nm pentru

minimizarea imperfectiunilor godeurilor.

Citirea trebuie sa se efectueze in maxim 15 minute de la adaugarea solutiei de stopare.

Atentie! Atat la pipetare cat si la manipularea godeurilor se evita atingerea partii inferioare atat

pe interior cat si pe exterior! Pipetarea reactivilor trebuie facuta in aceeasi ordine a godeuri.

10. CONTROLUL DE CALITATE

Pentru validarea rezultatelor se recomanda ca fiecare laborator sa utilizeze probe de

control, cu valori cunoscute, pentru nivel normal si patologic. Probele de control vor fi lucrate

ca si probele de pacient cu valori necunoscute. Pentru a urmari performantele metodei, valorile

controalelor se vor inregistra si interpreta statistic. Daca valorile controalelor nu se incadreaza in

limitele acceptabile stabilite de laborator, va rugam sa verificati urmatoarele: modul si timpul de

pipetare, modul de spalare, conditiile de incubare, modul de pastrare si data de expirare a

reactivilor.

9

11. CALCULUL REZULTATELOR

11.1 Se calculeaza media absorbantelor pentru standarde, controale si probe (daca s-au lucrat in

duplicat). Se scade din media absorbantelor standardelor, controalelor si probelor, media

absorbantelor blank-ului.

11.2 Se realizeaza curba de calibrare astfel: pe axa Y (verticala) se inregistreaza absorbanta, iar

pe axa X (orizontala) se inregistreaza concentratia. Se reprezinta grafic valorile

standardelor – absorbanta functie de concentratie, obtinandu-se astfel, o curba . Valoarea

absorbantei probei (ser) se extrapoleaza pe curba de calibrare, aflandu-se astfel, valoarea

concentratiei probei. Valorile se pot obtine automat cu ajutorul soft-ului cititorului de placi

ELISA, se recomanda pentru analizele de imunologie, de exemplu, utilizarea tipului de

curba 4PL (Four Parameters Logistic).

11.3 Concentratia probelor se poate obtine direct de pe curba de calibrare. Pentru probele cu

concentratii mai mari decat concentratia celui mai mare standard, se recomanda diluarea

acestor probe cu standard S0. Pentru calculul concentratiilor probelor diluate se va tine cont

de factorul de dilutie.

12. EXEMPLU DE CURBA STANDARD

Absorbanta fiecarui standard citita la lungimea de unda de 450 nm cu referinta 620-630 nm

este reprezentata pe axa Y în functie de concentratia reprezentata pe axa X. Aceasta curba

standard este doar un exemplu si nu trebuie folosit pentru a calcula concentratiile probelor

necunoscute. Fiecare laborator trebuie sa-si foloseasca propriile rezultate obtinute si curba

standard proprie.

TSH (µIU/ml) Absorbanta (450 nm cu

ref. 630 nm)

0 0,018

0,5 0,200

2 0,502

5 1,175

10 2,257

20 2,690

13. VALORI ASTEPTATE. Un studiu efectuat pe un lot de 140

persoane clinic sanatoase la momentul testarii, a condus la obtinerea urmatoarelor

valori (pentru metoda ELISA):

Grup Interval (µIU/ml)

Adulti 0,4 – 5,5

10

Se recomanda ca fiecare laborator sa isi stabileasca propriul domeniu de valori normale, in

functie de populatie.

14. PERFORMANTE SI CARACTERISTICI

a. Precizia

Variatia intra-serie

S-a determinat prin masurarea concentratiei de TSH in replicat (20x) utilizand 2 seruri de

control pe nivele diferite intr-o singura analiza.

Control

n

Concentratia medie (mIU/mL)

CV (%)

1 20 1,96 5,46

2 20 10,59 6,8

Variatia inter-serie

S-a determinat prin masurarea concentratiei de TSH in replicat (10x) utilizand 2 seruri de

control si trei loturi diferite de reactivi, testate o data pe zi timp de 20 zile.

Control n Concentratia medie

(mIU/mL)

CV%

1 40 2,21 4,97

2 40 10,02 5,18

b. Sensibilitatea.

Determinarea sensibilitatii s-a realizat prin utilizarea standardului zero (S0) in replicat

(20X) in cadrul aceleiasi analize. Concentratia minima de TSH detectata a fost de 0,01 µIU/mL.

c. Specificitatea anticorpilor (Reactivitatea incrucisata).

Reactivitatea incrucisata a anticorpilor tireotropina este prezentata in tabelul urmator:

11

Substanta Reactivitate

incrucisata, %

TSH 100 %

hCG 0 %

hGH 0 %

LH 0,021 %

FSH 0,014 %

d. Corelarea cu alte metode

Trusa a fost comparata cu Roche Cobas TSH folosind probe de la 121 pacienti. Corelarea s-a

realizat prin metoda regresiei liniare:

y =0.094+1.0138x cu un coeficient de corelare de 0,991.

15. MANAGEMENTUL DESEURILOR

Reactivii si deseurile trebuie utilizate si eliminate din circuitul laboratorului conform

normelor legislative in vigoare.

16. BIBLIOGRAFIE

1. Dinu V., Trutia E., Cristea-Popa E., Popescu A., Biochimie Medicala – Mic tratat, Ed.

Medicala, 1996.

2. Analize de laborator si alte explorari diagnostice, Ed. MedicArt, 2007.

3. Cucuianu, M., Crisnic I., Plesca-Manea L., Biochimie Clinica, Ed. Dacia, 1998.

12

SCHEMA ANALIZEI TSH

Pregatirea testului

Pregatirea reactivilor si probelor conform procedurii descrise.

Selectarea numarului de godeuri si inserarea lor în suportul special destinat.

Procedura de lucru

Standard

0-5

Control Proba

Standard

0-5

50 µl - -

Control - 50 µl -

Proba - - 50 µl

Solutie

conjugat

50 µl 50 µl 50 µl

Se agita usor placa 30 secunde pentru omogenizare.

Se acopera godeurile cu folie.

Se incubeaza 60 min. la 370C.

Se spală de 5 ori cu 350 µL de solutie de spalare preparata ca la punctul 5.2.

Standard

0-5

Control Proba

Substrat

TMB

100 µl 100 µl 100 µl

Se acopera godeurile.

Se incubeaza 20 minute la temperatura camerei 22-280C, la intuneric.

Standard

0-5

Control Proba

Solutie

stopare

50 µl 50 µl 50 µl

Se agita usor placa 30 secunde pentru amestecarea completa a solutiilor.

Se citeste absorbanta solutiei din godeuri la 450 nm cu referinta 620-630 nm,

in maxim 15 minute de la stoparea reactiei, cu un spectrofotometru de

microplaci.