Biosinteza unor toxine microbiene

Introducere

Termenul de toxine este larg utilizat de către mass-media, fiind atribuit unui număr mare

de substanţe şi factori din mediu, cum ar fi: aditivi alimentari, substanţe poluante, substanţe

iritante şi alţi agenţi. Această utilizare a termenului de toxina este incorectă, ţinând cont că din

punct de vedere ştiinţific, toxinele sunt substanţe secretate doar de organismele vii, substanţe

care prin structura lor antigenică declanşează o reacţie imună.

Toxienele sunt substanţe antigenice periculoase produse de către organismele vii.

Structura lor este formată din lanţuri de aminoacizi, fiind o structură organică proteică ce le

conferă caracter antigenic de non-self. Toxinele sunt produse de foarte multe microorganisme

precum bacterii, fungi, alge şi diverse specii de plante. Majoritatea toxinelor sunt extreme de

periculoase, chiar şi o cantitate mică putând determina decesul organismului cu care au intrat în

contact.

Toxinele microbiene

Toxinele microbiene reprezintă produsul unei evoluţii pe termen lung care acţionează sub

formă unor mecanisme în procesele vitale ale microorganismelor. Acestea sunt facori majori de

virulentă ai microorganismelor, determinând infecţii şi boli prin degradarea ţesutului gazdă şi

slăbirea imunităţii.

Toxinele microbiene sunt capabile să întrerupă sau să hiperstimuleze funcţii sau cai

esenţiale ale celuleor eucariote, atacă componente ale echipamentului de sinteză a proteinelor,

polimerizarea actinei, căile de transductie a semnalelor, traficul intracelular de vezicule, precum

şi răspunsurile imune şi inflamatorii.

Din acest motiv, toxinele microbiene au devenit din ce în ce mai mult utilizate că

instrumente de valoare în cercetarea fiziologiei celulare şi în medicină pentru tratamentul unor

boli. Potenţialul aplicabilităţii a toxinelor se extinde dincolo de simplă combatere a virulentei

agenţilor patogeni, şi include utilizarea acestora că noi medicamente anticancer, dar şi a altor

medicamente de prima linie, instrumente în neurobiologie şi biologie celulară.

Toxinele bacteriene sunt substanţe cu efect toxic asupra organismului. Ele se împart în

exotoxine, pe care bacteriile le secretă în mediul înconjurător că un produs al metabolismului

propriu, şi endotoxine, care fac parte din structura peretelui celular la bacteriile gram-negative şi

sunt eliberate în mediu numai după moartea bacteriei.

Exotoxinele bacteriene sunt proteine biologic active cu o toxicitate de regulă foarte

ridicată. Unele dintre ele sunt cele mai puternice otrăvuri cunoscute.

Endotoxina este lipopolizaharidul (LZP) din membrană externă a peretelui celular al

bacteriilor gram-negative şi joacă un rol important în patogenia infecţiilor produse de aceste

microorganisme. Ea se eliberează numai numai după distrugerea bacteriilor.

Din momentul în care toxina difterică a fost izolată de către Roux şi Yersin în 1888,

toxinele microbiene au fost recunoscute că fiind factori de virulentă primară a multor bacterii

patogene. Toxinele bacteriene au fost definite că “substanţe solubile ce alterează metabolismul

normal al celulelor gazdă şi care determina efecte nocive asupra gazdei”.

Într-adevăr, majoritatea simptomelor asociate bolilor cauzate de Corynebacterium

diphtheriae (dipteria), Bordetella pertussis (tusea măgărească), Vibrio cholerae (holeră), Bacillus

anthracis (antrax), Clostridium botulinum (botulism), Clostridium tetani (tetanus), şi Escherichia

coli (sindromul hemolitic uremic) sunt legate de activitatea toxinelor secretate de aceste

organisme.

Toxinele bacteriene in medicina si cercetare

Odată cu aprecierea rolului central pe care îl ocupă toxinele în cazul acestor boli, dar nu

numai, a fost studiată aplicabilitatea toxinelor inactive în calitate de vaccinuri datorită

proprietăţilor adjuvante ale acestor molecule. Asemena vaccinuri au avut ulterior un important

impact pozitiv asupra sănătăţii publice.

Exotoxinele sunt puternic imunogene şi se transformă prin învechire şi sub acţiunea

formolului în diverşi imunogeni, dar netoxici, numite anatoxine sau toxoizi. Acestea îşi păstrează

însă capacitatea de a declanşa un răspuns imun dacă sunt introduse într-un organism

imunocompetent. Fiind netoxice, dar imunogene, anatoxienele stau la baza vaccinarii împotriva

bolilor produse de bacterii toxigene (tetanus, difterie).

Prima menţiune despre atenuarea virulenţei unei toxine datează din 1923, când Alexander

Glenny şi Barbara Hopkins arată că virulenţa toxinei difterice se poate elimina prin tratarea

acesteia cu formol. În acelaşi an, Gaston Ramon descoperă că produsul obţinut prin tratarea

chimică a toxinei difterice cu formaldehidă este lipsit de toxicitate, dar îşi păstrează puterea

imunogenă specifică. Vaccinurile obţinute prin acest procedeu chimic de eliminare a virulentei

toxinelor sunt cunoscute sub numele de anatoxine (în ţările de limba engleză se foloseşte

denumirea de toxoid).

Primele vaccinuri cu anatoxină au fost introduse de Gaston Ramon (medic veterinar şi

biolog francez): vaccinul antidifteric (1923) şi vaccinul antitetanic (1927). Utilizarea

anatoxinelor s-a extins ulterior şi la alte tipuri de vaccinuri.

Vaccinuri antitoxice cu anatoxine

o Vaccinul antitetanic

o Vaccinul antidifteric

o Vaccinul cu anatoxină stafilococică

o Vaccinul cu anatoxină streptococică

o Vaccinuri cu anatoxină pertussis

o Vaccinuri conjugate cu anatoxine

Anatoxinele se folosesc în prezent şi pentru a mari răspunsul imun faţă de antigenele

neproteice din vaccinurile fracţionate care conţin doar anumite componente microbiene.

Fracţiunile din învelişul polizaharidic extern al anumitor bacterii sunt prea puţin imunogene.

Legând aceste fracţiuni de anatoxine proteice, sistemul imunitar poate fi determinat să

recunoască polizaharidul că şi cum ar fi un antigen proteic. Vaccinurile care încorporează

anatoxine în acest scop se numesc vaccinuri conjugate. Exemple din această categorie sunt:

vaccinul conjugat împotriva Haemophilus influenzae tip B (care foloseşte anatoxină tetanică),

vaccinul pneumococic heptavalent conjugat (care foloseşte tipul CRM197 de anatoxină

difterică), vaccinul meningococic C conjugat (cu anatoxină difterică) etc. Conjugarea cu

anatoxine proteice le conferă acestor vaccinuri imunogenicitate începând de la vârstă de 2 luni,

permiţând astfel imunizarea sugarilor şi copiilor mici, la care vaccinul neconjugat nu este

imunogen.

Anatoxinele se utilizează şi pentru hiperimunizarea animalelor de laborator, în scopul

obţinerii de seruri antitoxice (seruri imune), care se utilizează fie pentru imunizare pasivă prin

seroterapie în anumite boli infecţioase (tetanos, difterie, botulism etc.), fie că reactivi pentru

anumite metode de diagnostic de laborator.

Unele dintre aceste toxine ce produc boli destul de periculoase au fot studiate mai în

detaliu pentru utilizarea acestora în scop medical sau în biologia celulară. De exemplu toxina

holerei şi labil-toxin de Escherichia coli, precum şi toxina de Bordetella pertussis au fost folosite

că instrumente biologice pentru a înţelege mecanismul de activare al adenilat ciclazei şi rolul de

AMP ciclic că al doilea mesager în celulă eucariotă.

În mod similar, activitatea mai multor citotoxine puternice a fost valorificată că terapii

potenţiale pentru anumite tipuri de cancer. Astfel de toxine pot fi foloite fie direct în tratament

sau că şi componente ale unor imunotoxine.

Toxinele bacteriene într-o oarecare măsură au fost deja testate în tratamentul cancerului.

Toxinele bacteriene pot distruge celule sau la un nivel mai redus pot modifica procesele celulare

care controlează proliferarea, apoptoza şi diferenţierea. Aceste alterări sunt asociate cu

carcinogeneză şi pot stimula fie aberaţii celulare sau inhibă comenzile celulelor normale.

Inhibitorii ciclului celular, asemeni toxinei citoletala distensiva şi a factoruuil ciclului de inhibare

blochează mitoză, considerându-se pentru a inhibă expansiunea clonală a limfocitelor. În schimb,

stimulatorii ciclului celular, cum ar fi factorul citotoxic necrozant contribuie la proliferarea

celulară şi intervine în diferenţierea celulară. Toxinele bacteriene în combinaţie cu medicamente

anticancer sau iradiere ar putea creşte eficacitatea tratamenului pentru cancer.

Tulpina de Clostridium perfringens de tip A, agentul patogen ce determina gastroenterită

produce enterotoxină Clostridium perfringens (CPE). Studiile au arătat că CPE purificată

exercită un efect citotoxic acut asupra celulelor cancerului de pancreas şi a dus la necroza

tumorii şi inhibarea creşterii tumorii în vivo . Acesta este cercetat de asemeni pentru cancerul de

colon, cancerul de sân şi cancerul gastric . Mai mult decât atât, înainte de a evalua CPE pentru

tratamentul cancerului sistemic, eficienţa pe termen lung şi lipsa de toxicitate în vivo trebuie să

se demonstreze.

Studiile din ultimii ani au demonstat că neurotoxina botulinum (BoNT) deschide vasele

tumorale permiţând distrugerea mai eficientă a celulor canceroase prin radioterabie şi

chimioterapie. În acest mod s-a dorit că BoNT să acţioneze asupra micromediului tumorii decât

printr-un efect citotoxic asupra celulelor tumorale.

De exemplu Stx se leagă de suprafaţă glicolipidului CD77 care este exprimat de celulele

B în anumite limfoame cu celule B. Această constatare a condus la studii care au arătat că Stx

poate „curaţă” murine ale măduvei osoase de celulele maligne CD77+B înaintea unui transplant

autolog de măduva osoasă.

Alte toxine care inhibă sinteză proteinelor, precum toxina difterică, exotoxină A

Pseudomonas sunt frecvent proiectate că şi componente „cell-killing” ale imunotoxinelor. Aceste

„magic bullets”, hibrizi ai unei porţiuni enzimatic active a moleculei de toxina şi a anticorpilor

monoclonali au fost supuse studiilor clinice pentru tratamentul de limfoame cu celule B,

leucemie şi transplant de măduva osoasă.

Mai multe aplicaţii clinice au fost găsite şi pentru neurotoxină botulinica de tip A

(BoNT/A). Tulburările care răspund la BoNT/A implică hiperactivitate musculară. O cantitate

mică de toxina purificată injectată în anumite regiuni duce la reducerea activităţii musculare.

Aceasta toxina interfera cu transmisia neuronală prin blocarea eliberarea de acetilcolinei,

principalul neurotransmițător de la nivelul joncțiunii neuromusculare, provocând paralizie

musculară. Acest lucru va slabi eficient musculatura pentru o perioada de timp. Prima dată

BoNT/A a fost folosită pentru a trata strabismul, iar valoarea să terapeutică a fost demonstrată

mai târziu şi în cazul distoniei cervicale, spasm hemifacial, tremur, ticuri, dureri de cap, tulburari

determinate de hipersecretia glandelor.

Utilizarea in scop cosmetic a toxinei botulinice (Botox) a cunoscut un mare avânt

in ultimii ani si presupune injectarea toxinei botulinice pentru tratamente estetice, reducerea

ridurilor si a cutelor, dar dermatologice, cum ar fi hiperhidroza. Injectiile cu toxina botulinica

sunt in general bine tolerate, iar efectele secundare sunt putine.

Unele toxine bacteriene (toxina alfa de la Stapylococcus aureus, toxina AC de la

Bordetella pertussis, toxina shiga like, şi toxina holerei) sunt supuse cercetării pe două linii de

celule: celule mezoteliom şi celule mici ale cancerului pulmonar. Rezultatele preliminarii au

arătat că toxina AC prezintă o creştere a toxicitătii odată cu mărirea dozei pentru ambele linii

celulare, iar toxina holerei nu induce apoptoza.

O altă abordare este de a produce toxine modificate genetic sau recombinante . Prin

tehnica ADN- recombinat, genele care codifică proteinele (antigenele) componente ale

vaccinului sunt selecţionate, izolate şi introduse ȋn genomul unei celule vector: bacterie (E.coli),

levură (Saccharomices cerevisiae) capabile apoi să le sintetizeze ȋn cantităţi industriale. Acest

lucru a făcut posibil producerea unor incredibile toxine care distrug celule pe baza unei noi

activităţi dobândite.

În ultimii ani, s-a cercetat recombinarea exotoxinei interleukin-4-Pseudomonas (ÎL4-PE)

pentru tratamentul de glioblastoma. Experimentele în vivo pe şoareci au demonstrate că ÎL-4-PE

are activitate antitumorală semnificativă împotriva unui tip de glioblastom întâlnit la oameni.

Administrarea intratumorală de ÎL-4-PE este investigat pentru tratamentul de astrocitom malign

într-un studiu clinic.

Insecticidele chimice sintetice oferă multe beneficii în producţia alimentară şi sănătate

publică dar cu toate acestea prezintă unele dezavantaje şi riscuri. În multe cazuri, metode

alternative de gestionare a insectelor oferă niveluri adecvate de combatere a dăunătorilor şi

prezintă mai puţine riscuri . O astfel de alternativă este utilizarea de insecticide microbiene,

insecticide care conţin microorganism sau producţii ale acestora, cum ar fi toxinele. Insecticidele

microbiene sunt deosebit de valoroase datorită toxicitătii lor asupra oamenilor şi a animalelor

extreme de scăzută.

Organismele utilizate în insecticidele microbiene sunt în esenţă nontoxice şi nepatogene

pentru fauna, oameni şi alte organisme, activitatea for fiind strâns firectionata asupra

dăunătorilor. De asemenea, acţiunea toxică a insecticidelor microbiene este adesea specifică unui

singur grup sau unei specii de insecte, şi această specificitate se referă la faptul că cele mai multe

insecticide microbiene nu afectează în mod direct insectele benefice (inclusive paraziţi sau

prădători ai dăunătorilor) prezente în zonele tratate.

Această metodă este avantajoasă deoarece rezidurile lor nu prezintă nici un fel de pericol

pentru om sau animale, insecticdele microbiene pot fi applicate chiar şi atunci când o cultură este

aproape gata de recoltare.

Bacteriile patogene utilizate pentru contolul insectelor sunt specii din genul Bacillus ce

formează spori. Ele se întâlnesc de regulă în sol iar tulpinele cele mai insecticide au fost izolate

din probe de sol. Bacillus thuringiensis este o bacterie gram-pozitiva, facultative aeroba.

Caracteristica sa principal este sinteza in timpul sporularii a unei incluzii cristaline ce contine

proteine cunoscute ca endotoxine δ sau “cry proteins” ce au proprietati insecticide. Diversitatea

considerabila a acestor toxine, eficacitatea lor si obţinerea lor relativ convenabil financiar au

facut ca Bt sa fie cel mai utilizat pe scara larga biopesticid in lume. Este folosit in lupta

impotriva daunatorilor culturilor agricole (in special lepidoptere si larve de coleoptere) in

special in crearea unor plante noi care poarta expresia genor Cry Bt.

Insecticidele bacteriene trebuie să fie consumate pentru a fi eficiente. Insecticidele care

cuprind o singură specie de Bacillus pot fi active împotriva unui ordin întreg de insect, sau pot fi

eficiente împotriva doar a uneia sau câteva specii. De exemplu , produsele care conţin Bacillus

thuringiensis var . kurstaki ucide o gama largă de fluturi şi molii aflaţi în stadiul de omidă. În

schimb, Bacillus papillae distruge larvele gândacului japonez, dar nu este eficace în cazul

anualelor larve albe (genul Cyclocephala ) cu care este înrudit.

Insecticidele microbiene utilizate cel mai des în USA încă din anii 1960 sunt preprate

folosind bacteria Bacillus thurungiensis (Bt). Produsele Bt sunt obţinute în scop commercial în

rezervoare de fermentaţie. Deoarece bacteriile trăiesc şi se multiplică în condiţii potrivite, fiecare

celulă produce (intern) un spor şi o toxina proteică cristalină numită endotoxină. Cele mai

comerciale produse obţinute cu ajurorul Bt conţin toxina proteică şi spori, dar unele sunt

cultivate într-un mod prin care se produce doar componentă toxică.

Controlul sintezei şi a eliberării de toxine

Reglarea sintezei şi secreţia de toxine bacteriene este strâns controlată de elemente de

reglare care sunt sensibile la semnalele din mediu. De exemmplu producerea de toxina difterică

este total reprimată de prezenţa unor cantităţi necesare de fier în mediul de dezvoltare a

bacteriilor. Numai în condiţiile în care cantităţile de fier sunt limitate în mediu producţia de

toxine devine facilitată. Expresia toxinei holerei şi factorii de virulentă aferenţi sunt controlaţi de

osmolaritatea de mediu şi de temperature. Atunci când are loc infecţia, în cazul B. pertussis,

inducerea diferitelor elemente de virulentă este eşalonată, astfel încât mai întâi factorii de atasare

sunt produşi iniţial pentru a stabili infecţia iar mai apoi toxinele sunt sintetizate şi eliberate

pentru a contracara răspunsul de apărare al gazdei.

Procesele prin care toxinele proteice sunt ansamblate şi secretate de celulele bacteriene

sunt variabile. Multe dintre exotoxinele clasice sunt sintetizate cu o secvenţă NH terminal leader

(semnal) care constă din câţiva (1-3) aminoacizi şi o porţiune de aminoacizi hidrofobi (14-20).

Secvenţă semnal se poate lega şi insera în membrane citoplasmatică în timpul translatiei astfel

incat polipeptida este secretată în timp ce este sintetizată.

Concluzii

Toxinele microbiene sunt capabile sa modifice echilibrul normal al unui organism datorita hiperstimularii sau intreruperii unor functii vitale. Cu toate acestea, activitatile toxinelor microbiene au fost exploatate ca probe in scopul aplicabilitatii in medicina.

Nevoia de tratamente alternative anticancer a aparut din cauza rezistenţei tumorilor, sau a acelor tumori avansate la terapia convenţională aplicată. Multi ani dupa cercetarea si studiul lui Coley o multitudine de bacterii nepatogene modificate genetic sunt analizate ca potenţiali agenţi antitumorali. Vii, attenuate sau modificate genetic, speciile de bacterii nepatogene sunt capabile de a se multiplica selectiv şi de a inhiba creşterea. Datorită selectivităţii lor pentru ţesuturile tumorale, aceste bacterii şi spori sunt vectori ideali pentru furnizarea de proteine terapeutice tumorilor. Toxinele bacteriene reprezintă o strategie promiţătoare ȋn tratamenul cancerului.

Utilizarea toxinelor microbiene a revoluţionat tratamentul diferitelor tulburări şi boli. O cunoaştere precisă şi ȋnţelegerea fiziologiei umane este absolut necesară ȋn utilizarea toxinelor in practica clinică. În viitor, dezvoltarea de noi toxine si creşterea eficienţei va ajuta ȋn continuare la expansiunea acestui domeniu.

Bibliografie

1. Patyar S. et all., 2010 – Bacteria in cancer therapy: a novel experimental strategy, Journal of Biomedical Science

http://www.jbiomedsci.com/content/17/1/21

2. Schmitt Clare K. et all., 1999 – Bacterial Toxins: Friends or Foes?, University of the Health Sciences, Bethesda, Maryland, USA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2640701/pdf/10221874.pdf

3. Hunsberger Adrian, 2000 – Bt (Bacillus thuringiensis), A Microbial Insecticide

http://miami-dade.ifas.ufl.edu/pdfs/fyn/bt.pdf

4. Nigam P. K. et all., 2010 – Botulinum Toxin, Indian J Dermatol.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2856357/

5. Sachis Vincent et all., 2008 – Bacillus thuringiensis: applications in agriculture and insect resistance management

https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00886454/document

6. http://textbookofbacteriology.net/proteintoxins.html

7. http://anatomie.romedic.ro/toxinele

8. http://www.dspjneamt.ro/informatii-utile/prevenire-si-control-boli- transmisibile/vaccinarea/definitii/definitii-vaccinari/anatoxina