Teză de doctorat

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE HORTICULTURĂ

ING. CALBOREANU (căs. Badea) CARMEN

REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT

SUMMARY

DETERMINAREA VARIABILITATĂŢII LA NIVEL FENOTIPIC ŞI LA NIVEL MOLECULAR A LINIILOR DE PORUMB

ZAHARAT, COMPONENTE ALE PRINCIPALILOR HIBRIZI COMERCIALI CREAŢI LA SCDA TURDA, ÎN VEDEREA

STABILIRII EFICIENŢEI SELECŢIEI ASISTATE DE MARKERI A LINIILOR CONSANGVINIZATE

PHENOTYPIC AND MOLECULAR VARIABILITY OF

SWEET CORN INBRED LINES, COMPONENT OF MOST IMPORTANT COMERCIAL HYBRIDS CREATED AT ARDS

TURDA, IN ORDER TO ESTABLISH THE EFFICIENTCY OF MARKER ASSISTED SELECTION OF INBRED LINES

Conducător ştiinţific:

Prof. univ. dr. MARIN ARDELEAN

1

Teză de doctorat

INTRODUCERE

Porumbul zaharat este o varietate în cadrul speciei Zea mays, şi anume var.

rugosa (Bonaf), convar. Saccharata (Sturt.), (după SĂVULESCU şi ZAHARIDI,

1957) şi se diferenţiază de porumbul normal prin prezenţa uneia sau mai multor gene

mutante, care afectează metabolismul glucidelor din endosperm.

În ţara noastră, cercetările legate de ameliorarea porumbului zaharat au început

la I.C.C.P.T. Fundulea, în anul 1957 (MUREŞAN şi colab., 1966). Porumbul zaharat

apare menţionat în lucrarea “Porumbul - Studiu monografic” publicată de către

SĂVULESCU şi ZAHARIDE în 1957. Primul hibrid de porumb zaharat obţinut în

România, la Fundulea, a fost hibridul simplu Delicios, omologat în anul 1969.

În anul 1971, la Staţiunea de Cercetări Agricole Turda, s-a iniţiat programul de

creare a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor timpurii de porumb zaharat, iar în anul

1988 a fost omologat hibridul triliniar Dulcin (CĂBULEA şi colab., 1994; HAŞ şi

colab., 1994; HAŞ, 2002a). Linii valoroase sugary se regăsesc în prezent ca forme

parentale ale hibrizilor omologaţi Dulcin, Prima, Estival şi Deliciul Verii (HAŞ şi

CĂBULEA, 1998, HAŞ, V. şi colab., 1999).

Identificarea polimorfismului liniilor consangvinizate cu ajutorul

polimorfismului la nivel de ADN este extrem de utilă, datorită faptului că rezultatul

obţinut reflectă direct genotipul şi nu este influenţat de condiţiile de mediu (LODHI şi

colab.1994, POP şi colab., 2003).

Pe baza celor constatate mai sus, în teza de doctorat prezentată ne-am propus să

ducem mai departe cercetările naţionale menţionate mai sus, prin evidenţierea

variabilităţii liniilor consangvinizate de porumb zaharat, nu numai la nivel fenotipic ci

şi la nivel molecular şi stabilirea legăturilor statistice între aceste două tipuri de

manifestare. Astfel de legături ar putea fi folosite la iniţierea unui program de selecţie

asistată de markeri moleculari ai liniilor componente ale hibrizilor comerciali de

porumb zaharat.

2

Teză de doctorat

1. OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA

1.1. SCOPUL CERCETĂRILOR

Orice program de ameliorare îşi propune crearea unei noi variabilităţi genetice

care să poată fi folosită ulterior prin selecţie pentru obţinerea de genotipuri noi mai,

performante.

Sporul de producţie, la porumbul zaharat, reprezintă un câştig modest comparativ

cu cel realizat la porumbul normal, după aprecierea făcută de către TRACY (1990b),

datorită bazei genetice mai înguste a porumbului zaharat, care limitează posibilităţile

câştigului genetic pentru producţie.

Scopul principal al cercetărilor noastre a constat în caracterizarea şi stabilirea

relaţiilor filogenetice între cele 18 linii consangvinizate şi cei 49 de hibrizi de porumb

zaharat, cu ajutorul metodologiei RAPD, precum şi compararea rezultatelor obţinute

prin formule de hibridare elaborate pe baza testării liniilor şi hibrizilor comerciali prin

metode convenţionale şi prin metode neconvenţionale (markeri moleculari).

Cercetările iniţiate de noi, constituie, probabil, primele încercări de identificare

a variabilităţii la porumbul zaharat prin metoda RAPD, în România.

1.2. OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT

În cercetările iniţiale ne-am propus ca, prin experienţele efectuate la 18 linii

consangvinizate şi 49 de hibrizi de porumb zaharat, să identificăm şi să selectăm un

material biologic adecvat pentru obţinerea unor combinaţii performante, care presupun

manifestarea la maxim în cadrul hibrizilor a celor mai valoroase caractere ale liniilor

parentale.

Având ca repere fundamentale cunoştiinţele privind importanţa şi actualitatea

cercetărilor cu privire la difersitatea fenotipică şi genetică a liniilor consangvinizate şi

a hibrizilor simpli, la metodele de analiză, obiectivele urmărite în această lucrare sunt

prezentate după cum urmează, pe două categorii de caracterizare a liniilor

consangvinizate şi a hibrizilor de porumb zaharat studiaţi: fenotipic şi molecular.

3

Teză de doctorat

La nivel fenotipic s-a urmărit:

caracterizarea liniilor consangvinizate de porumb zaharat pe baza valorii

„per se”a lor dar şi pe baza indicelui fenotipic de diferenţiere;

evaluarea diversităţii genetice a caracterelor cantitative a liniilor

consangvinizate de porumb zaharat forme parentale ale hibrizilor studiaţi

pe baza capaciţăţii generale şi specifice de combinare.

stabilirea gradului de diversitate genetică dintre formele parentale prin

nivelul de intensitate al heterozisului hibrizilor de porumb zaharat;

precizarea influenţei condiţiilor de mediu asupra mecanismelor genetice

implicate în exprimarea caracterelor la porumbul zaharat.

Pentru caracterizarea moleculară a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor de

porumb zaharat studiaţi ne-am îndreptat cercetările în direcţia următoarelor aspecte:

stabilirea protocolului de extracţii de ADN şi utilizarea tehnicii RAPD (Random

Amplified Polymorphic DNA) în vederea identificării polimorfismului genetic

in vivo la 18 linii de porumb zaharat şi 49 de hibrizi simpli;

identificarea primerilor capabili să determine polimorfismul la nivel molecular

între liniile consangvinizate şi între hibrizii analizaţi;

depistarea diversităţii genetice şi a gradului de înrudire între cele 18 linii

consangvinizate, precum şi între hibrizii de porumb zaharat studiaţi, prin

amprenta ADN obţinută cu ajutorul tehnicii RAPD;

De asemenea, urmărim să evidenţiem tipul de legătură existentă între

capacitatea generală şi specifică de combinare calculată la nivel fenotipic pe de o parte

şi amprenta genetică a liniilor consangvinizate de porumb zaharat, pe de altă parte

2. MATERIALE ŞI METODE DE LUCRU

2.1 MATERIALUL BIOLOGIC

Materialul biologic utilizat în cercetările realizate a fost reprezentat de 18 linii

consangvinizate de porumb zaharat (T152 su, T193A su, T209 su, T339R su, LC153

su , LC154 su, TD101 su, T345R su, T346 su, TA25 su, TA26 su, TA27 su, TA28 su,

TA22 su, TA21 su, T233 su, T244 su, TC209 su) forme parentale şi 49 hibrizi simpli

4

Teză de doctorat

realizaţi în cadrul unui sistem ciclic (factorial) de încrucişare de tipul m x n destinat

analizei genetice cantitative, liniile tester fiind liniile T233 su, T244 su şi TC209 su.

Materialul biologic destinat izolării ADN-ului a fost reprezentat de embrionii

genotipurilor de porumb zaharat mai sus menţionate.

Pentru completarea grilajului patrat balansat s-au mai introdus în testare încă

patru hibrizi simpli de porumb zaharat, trei dintre ei omologaţi şi cuprinşi în „Lista

oficială a soiurilor şi hibrizilor” (Prima, Deliciul verii şi Delicios) şi încă un hibrid

simplu de porumb zaharat, forma maternă a hibridului Estival, linia componentă

acestui hibrid simplu SW87 su (a 19 linie), a fost şi ea analizată la nivel molecular prin

tehnica RAPD.

Pentru amplificare s-au utilizat 20 primeri decameri (UBC 281, UBC 241, UBC

245, UBC 561, UBC 286, UBC 599, OPB08, OPB09, OPB10,OPB11OPB17,OPAB

11,OPX O3, AB 11, OPE 14, OPAL 20,OPB03, OPB18, OPC14, OPD19).

Provenienţa primerilor a fost diferită, astfel 6 primeri decanucleotidici sunt produşi de

University of British Columbia (UBC), 14 de Mycroshinth (OPAB, OPA, OPB, OPE,

OPC, OPD, OPAL, OPX, AB,).

2.2. METODE DE LUCRU

2.2.1.Organizarea experienţelor

Cercetările privind determinismul genetic precum şi studiul efectelor capacităţii

generale şi specifice de transmitere a unor caractere de interes specific pentru

porumbul zaharat s-au realizat utilizând datele experimentale dintr-o serie de trei

sisteme ciclice, cuprinzând 45 de hibrizi.

Pe lângă aceştia s-au mai introdus în studiu patru hibrizi simpli (omologaţi) de

porumb zaharat (Prima, Deliciul verii, Delicios şi forma mamă a hibridului Estival),

pentru a completa sistemul de aranjare (49 variante = 7 x 7 şi (7 +1)/2 repetiţii) în

câmp, dar şi pentru utilizarea lor pentru comparare cu restul hibrizilor sistemului în

vederea evidenţierii unui progres genetic.

5

Teză de doctorat

Liniile consangvinizate forme parentale au fost, de asemenea, experimentate în

anii 2005 şi 2006, într-o experienţă cu blocuri randomizate într-o singură localitate

(Turda), în patru repetiţii. Testarea hibrizilor s-a realizat, şi ea, pe parcursul aceloraşi

doi ani: 2005 şi 2006.

2.2.2. Observaţii şi analize

Observaţiile şi analizele realizate, la variantele experimentale în anii 2005 şi

2006, au vizat pentru un număr de 25 de caractere. Măsurătorile au fost efectuate la

maturitatea fiziologică (aproximativ 21 zile de la apariţia stigmatelor) la câte 10 plante

şi 10 ştiuleţi din ficare parcelă repetiţie, totalizând 40 de plante şi 40 de ştiuleţi /

variantă (hibrid simplu)/an:

• caracterele vegetative ale plantei :înălţimea plantei, înălţimea de inserţie a

ştiuletelui principal, numărul de frunze/plantă, numărul de ramificaţii la panicul,

lungimea frunzei ştiuletelui principal, lăţimea frunzei ştiuletelui principal, numărul

de lăstari / plantă;

• caracterele ştiuletelui :greutatea ştiuletelui, greutatea pănuşilor, lungimea

ştiuletelui, lungimea pănuşilor, lungimea bracteelor, numărul de rânduri de boabe/

ştiulete, profunzimea, grosimea rahisului, indicele de conicitate;

• caracteristici fiziologice: vigoarea vegetativă timpurie, suprafaţa foliară

2.2.3. Metodologia analizelor RAPD utilizate în evidenţierea variabilităţii la nivel

molecular la porumbul zaharat

2.2.3.1. Metode de extracţie a ADN-ului

Pentru analiza RAPD a ADN-ului, la porumbul zaharat (bogat în glucide), s-a

încercat extracţia acestuia prin două metode: din embrioni şi din endosperm. Au fost

testate două tipuri de protocoale, apoi s-a optimizat protocolul de extracţie a ADN-ului

ales prin care se obţine o puritate cât mai mare. Materialul biologic destinat izolării

6

Teză de doctorat

ADN a fost reprezentat de embrionii boabelor de porumb zaharat a materialului

biologic prezentat mai sus.

Pentru a obţine un ADN de calitate care să poate fi utilizat în tehnica RAPD- lui

a fost utilizat protoculul descris de LODHI şi colab., 1994, modificat (POP şi colab.,

2003).

2.2.3.2. Cuantificarea ADN-ului

După extracţia ADN-ului, probele au fost cuantificate spectofotometric cu

ajutorul aparatului BioPhotometer Eppendorf.

2.2.3.3. Protocol de amplificare RAPD

Amplificarea probelor s-a realizat în aparatul Eppendorf Mastercycler gradient

programat astfel:

3 minute la 950C – predenaturare, urmată de 45 de cicluri cu următorul profil

de temperatură :

1 minut la 930C – denaturare

1 minut la 340C – fixarea primerilor

1 minut la 720C – extensie

extensia finală 10 minute la 720C.

2.2.3.4. Analiza imaginilor

Analiza gelurilor s-a făcut cu ajutorul programului Total Lab TL 100,

obţinându-se matricea binară.

Matricea binară s-a utilizat apoi pentru calcularea distanţelor genetice. Pentru

calcularea distanţelor genetice şi realizarea dendrogramei s-a utilizat programul

RAPDistance 1.04, utilizând cu aplicarea coeficientului Nei Li şi a metodei UPGMA

(Un-weighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) pentru distanţele genetice,

respectiv metoda Neighbor Joining Tree pentru dendrogramă.

7

Teză de doctorat

2.2.4. Metode statistice utilizate în evidenţierea variabilităţii fenotipice şi genetice

la porumbul zaharat

Pentru a putea evalua diversitatea fenotipică a celor 18 linii consangvinizate

implicate în sistemul de încrucişări experimentat la SCDA Turda, s-a calculat indicele

de diferenţiere fenotipică (IDF) după HERBERT şi VINCOURT (1985).

unde Xm, Xn – mediile caracterelor liniilor parentale m şi n.

La nivelul caracterelor cantitative diversitatea genetică s-a estimat pe baza

capacităţii generale de combinare (CGC) şi a capacităţii specifice de combinare (CSC)

caracteristice fiecărei linii, fiecărei interacţiuni dintre linii, şi pentru sistem ciclic

(factorial) de încrucişare.

Estimarea diversităţii poligenice s-a realizat:

- la nivelul locilor homozigoţi prin calcularea efectelor genice aditive (ĝ )

,

în care

Xm/n = media valorilor părintelui m sau n;

.

- la nivelul interacţiunilor intra şi interalelice prin calcularea efectelor genice

neaditive (ŝmn )

), unde

ŝmn = efectul genetic al interacţiunii genelor celor doi părinţi;

2.2.5. Metode statistice utilizate în evidenţierea variabilităţii la nivel molecular

Interpretarea gelurilor obţinute s-a făcut prin analiza statistică a imaginilor.

Markerii moleculari sunt trataţi ca variabile binare, în procesarea datelor

luându-se în considerare următoarele:

8

Teză de doctorat

- se foloseşte analiza mai multor variante, formându-se matrici de similaritate

sau diferenţiere între posibilele perechi de indivizi sau unităţi taxonomice

operaţionale;

- doi indivizi similari au simultan valoarea minimă a distanţei şi maximă a

similitudinii;

- distanţa şi similitudinea sunt invers proporţionale;

- similaritatea este estimată în funcţie de numărul coincidenţelor.

3. REZULTATE ŞI DISCUŢII

3.1. CARACTERIZAREA FENOTIPICĂ ŞI MOLECULARĂ A LINIILOR

CONSANGVINIZATE DE PORUMB ZAHARAT LUATE ÎN STUDIU

3.1.1. Exprimarea fenotipică a caracteristicilor liniilor consangvinizate de

porumb zaharat

Valorile medii calculate a caracterelor de interes pentru ameliorarea porumbului

zaharat acoperă biometrizările pe o perioadă de doi ani (2005 şi 2006), perioadă pe

parcursul căreia s-au efectuat experienţele. Aceste valori redau valoarea “per se “ a

caracterului respectiv la liniile consangvinizate studiate. Caracterizarea fenotipică a

liniilor consangvinizate forme parentale de porumb zaharat luate în studiu la SCDA

Turda este redată în tabelele 1 prin calcularea valorilor medii a biometrizărilor a şase

caractere la plantă şi a 12 caractere la ştiulete.

Piaţa prezintă cerinţe esenţiale legate de aspectul ştiuletelui. Astfel, pentru

consum proaspăt, se preferă porumbul cu cel puţin 16 rânduri de boabe mici, profunde,

rândurile să fie drepte, ştiuletele de 25-30 cm, acoperit cu boabe până la vârf iar forma

ştiuletelui să fie cilindrică (TRACY, 1994).

În tabelul mai sus menţionat se poate observa că între liniile consangvinizate de

porumb zaharat studiate există diferenţe asigurate statistic privind fiecare caracter în

parte.

9

Teză de doctorat

Înălţimea plantelor s-a exprimat prin valori cuprinse între 97,40 cm (TA27su) şi

155,53 cm (T244 su). Înălţimea de inserţie a ştiuletelui principal a avut valori cuprinse

16,21 cm (TA 27 su) şi 53,62 cm (T152 su).

Tabelul 1 Caracterele vegetative ale plantei şi ştiuletelui la liniile consangvinizate parentale

de porumb zaharat (valori medii Turda, 2005 şi 2006)

Agronomic assessments of sweet corn inbred lines studied (average values Turda 2005 and 2006)

Linia

Line

Înălţime plantă

Plant height

(cm)

Înălţime inserţie ştiulete

Height ear insertion

(cm)

Număr ramificaţii la

panicul

Branch of tassel no.

Greutate ştiulete fără pănuşi

Dehusked ear

weight (g)

Lungime ştiulete

Ear lenght

(cm)

T152su 143,62 *** 53,62 *** 5,51 ooo 87,93 15,88*** T193Asu 147,26 *** 50,78 *** 9,75 oo 80,75 12,65 T209su 123,35 36,49 8,48 ooo 87,11 13,50 T339Rsu 137,87 *** 42,66 10,05 o 87,95 16,90*** LC153su 117,39 ooo 44,18 36,21 *** 80,60 11,47 ooo LC154su 120,48 oo 41,23 17,70 *** 71,87o 13,40 TD101su 128,68 38,99 22,56 *** 82,70 16,44*** T345Rsu 122,00 o 41,58 9,79 oo 89,96 13,46 T346su 152,70 *** 51,59 *** 10,48 81,69 16,19*** TA25su 106,27 ooo 32,33 o 13,97 * 90,48 12,12 oo TA26su 131,38 * 35,97 10,73 78,32 12,04 oo TA27su 97,40 ooo 16,21 ooo 7,42 ooo 90,06 14,53 TA28su 108,11 ooo 29,48 ooo 6,16 ooo 115,78*** 11,38 ooo TA22su 134,51 ** 36,99 8,86 ooo 89,79 12,21 oo TA21su 104,44 ooo 29,41 ooo 13,36 61,65ooo 11,61 ooo T233su 110,77 ooo 30,86 oo 9,48 oo 87,27 12,71 T244su 155,53 *** 47,44 ** 8,84 ooo 90,03 13,35 TC209su 141,19 *** 41,16 9,81 oo 91,56 16,07*** Media 126,83 38,94 12,18 85,86 13,66

DL/LSD 5% 4,52 5,46 1,72 11,9 1,03 DL/LSD 1% 6,01 7,24 2,29 15,8 1,37 DL/LSD 0,1% 7,74 9,34 2,95 20,36 1,76

Numărul de ramificaţii la panicul este un caracter cu o amplitudine destul de

largă de la 5,51 (T152 su) la 36,21 (LC153 su).

10

Teză de doctorat

Greutate ştiuletelui fără pănuşi, caracter de producţie deosebit de important, a

înregistrat variaţii ale valorilor medii între 61,65 grame (TA21 su) şi 115,78 grame

(TA28 su).

Mărimea ştiuletelui, caracter important atât pentru producţie cât şi pentru

aspectul comercial, a prezentat variaţii ale valorilor medii calculate pe cei doi ani de

studiu, (tabelul 1), de la 11,38 cm (TA28 su) până la 16,90 cm (T339R su).

Porumbul zaharat pentru consum în stare proaspătă trebuie să prezinte boabe

mici şi profunde (TRACY, 1994). Dimensiunea bobului, după cum se observă în fig.1,

variază în limite de la 0,5 cm (LC153 su) la 0,76 cm (T346 su).

Fig.1. Grosimea boabelor la cele 18 linii consangvinizate de porumb zaharat forme

parentale (valori medii anii 2005 şi 2006)

Porumbul zaharat pentru consum proaspăt trebuie să prezinte boabe mici şi

profunde (TRACY, 1994). La cele 18 linii parentale studiate, se înregistrează valorii

medii pe cei doi ani de la 0,40 cm (T152 su) la 0,89 cm (TA27 su, TA28 su).

Prin calaculul indicelui de diferenţiere fenotipică (IDF) (HERBERT şi

VINCOURT, 1985 se pot compara valorile medii ale caracterelor fenotipice a două

genotipuri (linii parentale) (fig.2 şi 3).

11

Teză de doctorat

Fig.2. Indicii de diferenţiere fenotipică (IDF) pentru caracterele plantei la 18

linii consangvinizate de porumb zaharat (anii 2005 şi 2006)

Fig.3. Indicii de diferenţiere fenotipică (IDF) pentru caracterele ştiuletelui la 18

linii consangvinizate de porumb zaharat (anii 2005 şi 2006)

Valoarea ridicată a acestui indice calculat ne indică gradul de diferenţiere dintre

linii în timp ce valorile mai scăzute, gradul de asemănare.

Ca urmare, privind caracterele plantei, linia consangvinizată T152su se

diferanţiază foarte mult de toate cele trei linii consangvinizate utilizate în sistemul de

12

Teză de doctorat

încrucişare ca formă maternă (T233 su, T244 su şi TC209 su) prin valorile cele mai

mari ale indicelui de diferenţiere fenotipică (54,9, 82,1 şi respectiv 71). Cele mai

apropiate din punct de vedere fenotipic s-a constatat că sunt liniile TA28 su cu T233 su

(6,8), T346 su cu T244 su (8,1), TA22 su cu TC209 su (9,0).

Indicele de diferenţiere fenotipică calculat pentru caracterele ştiuletelui de

porumb zaharat la liniile consangvinizate studiate sunt prezentate în figura 4. Astfel, se

poate observa pe baza acestui calcul că cel mai mare grad de diferenţiere fenotipică la

nivelul caracterelor ştiuletelui s-a înregistrat între linia TA21 su şi T244 su (62,6)

precum şi între linia T346su şi T233su (58,1), şi respectiv TC209 su (50,2). Foarte

asemănătoare din punct de vedere al caracterelor ştiuletelui s-au remarcat liniile

T345su şi TC209 su (6,1), T339R su şi T244 su (8,1) precum şi LC153 su şi T233su

(8,4).

3.1.2. Caracterizarea liniilor cu ajutorul capacităţii generale de combinare (CGC)

Diversitatea genetică la nivelul caracterelor cantitative o putem estima pe baza

efectelor capacităţii generale de combinare caracteristice liniilor consangvinizate de

porumb zaharat. Diferenţele existente între liniile comparate reflectă diferenţierile la

nivelul locilor homozigoţi cu efecte cumulative. Dintre cele trei linii consangvinizate de porumb zaharat utilizate în încrucişări

ca forme materne, a rezultat faptul că ele pot fi utilizate ca surse de gene favorabile,

av�nd capacitatea de a transmite aditiv pozitiv caracterele după cum urmează:

• capacitatea de producţie, reprezentată prin greutatea ştiuletelui este transmisă

aditiv pozitiv cel mai bine de linia „su” TC209 (ĝ =17,19), în timp ce liniile

T244 şi T233 transmit negativ aditiv acest caracter;

• talia plantei este transmisă aditiv pozitiv de linia zaharată TC209 (ĝ=3,21), în

timp ce înălţimea mai redusă poate fi transmisă de linia zaharată T244 (ĝ=1,39;

Din cadrul liniilor consangvinizate de porumb zaharat, utilizate ca linii paterne

putem afirma că:

13

Teză de doctorat

talia plantei este transmisă aditiv pozitiv de liniile zaharate T339R (16,26),

T346 (14,34), T152 (7,09), TA22 (6,12) şi T209 (5,30) în timp ce

înălţimea mai redusă poate fi transmisă de liniile zaharate LC153, T193A

şi T345R;

liniile consangvinizate TD101su (4,39), LC153su (4,06), LC154su (3,25) au

o capacitate generală de transmitere a unui panicul cu număr mare de

ramificaţii în timp ce liniile zaharate TA21, T339R, TA25 şi T345R

transmit la hibrizi un număr mai redus de ramificaţii la panicul;

Rezultatele privind efectele genetice aditive pentru caracteristicile ştiuletelui de

porumb zaharat s-a putut constata că:

pentru transmiterea la nivel aditiv a caracterului de producţie exprimat

prin greutatea ştiuletelui, pot fi remarcate liniile zaharate LC153 (18,66),

T339R (12,76) şi TA25(6,37) în timp ce liniile TA28 (5,51) şi T346 (2,53)

transmit o greutate mai redusă a ştiuletelui în descendenţă;

caracterul lungimea ştiuletelui este transmis aditiv pozitiv de liniile

T209su (2,24), T339Rsu (1,40) şi TD101su (1,34), în timp ce liniile

zaharate T346 (0,40), LC154 (0,39) şi T152 (0,38) transmit un ştiulete mai

scurt la hibrizi;

3.1.3. Caracterizarea liniilor cu ajutorul capacităţii specifice de combinare

Interacţiunile genice intra şi interalelice s-au determinat cantitativ prin efectele

capacităţii specifice de combinare (ŝmn) calculate în cadrul sistemului de încrucişări

ciclic. Pentru exprimarea cantitativă a nivelului de diferenţiere genică intra şi

interalelică, s-a calculat suma acestor efecte specifice pentru caracterele analizate

(Σŝij). Astfel s-a reuşit identificarea diferenţierilor între liniile consangvinizate de

porumb zaharat la nivel genetic neaditiv, atât pentru trasnmiterea caracteristilor plantei

cât şi ale ştiuletelui.

Cele mai pronunţate diferenţieri pentru (Σŝij ), pentru caracteristicile plantei,

manifestă linia T233su în combinaţie cu T193Asu (32,79) ( cea mai pronunţată

dierenţiere la nivel genetic neaditiv), TA26su (4,87) şi T152su (4,25).

14

Teză de doctorat

Linia consangvinizată de porumb zaharat T244 se diferenţiază la nivel genetic

neaditiv de linia TA27su (11,9), dar şi de liniile LC154 su (9,68), TA21 su (9,42),

LC153su (8,88), TA22su (8,61), TA28su (8,58), T339Rsu (8,12), TA26su (4,67). Cea

mai apropiată, pentru linia zaharată T244, la nivel intra şi interalelic pentru caracterele

plantei s-a constatat a fi linia T193Asu (-49,30).

Faţă de linia consangvinizată de porumb zaharat TC209, din punctul de vedere

al acţiunilor genice intra şi interalelice, după valoarea (Σŝij ), se diferenţiază la nivelul

de transmitere neaditive a caracterelor plantei, liniile zaharate de tip sugarry: T193A

(16,51), T345R (7,85), TD101 (6,52), TA22 (5,21), T209 (3,71).

Analiza genetică la nivel neaditiv pentru cele trei linii consangvinizate de

porumb zaharat, forme materne din cadrul sistemului factorial de încrucişări, reflectă

că cele mai pronunţate diferenţieri pentru valorile sumei efectelor calculate, pentru

caracterele ştiuletelui îl manifestă:

linia T233su în combinaţie cu T193Asu (105,91);

linia T244su în combinaţie cu liniile T339Rsu (37,64), TA27su (37,07),

TA22su (23,85), TA21su (19,35), TA28su (15,14);

Linia TC209su în combinaţie cu T193Asu (42,84), TA25su (20,62),

LC154su (16,21), TA22su (16,72), T345Rsu (9,72).

3.1.4. Exprimarea heterozisului la hibrizii simpli de porumb zaharat aflaţi

în studiu la SCDA Turda

Pentru greutatea ştiuletelui, în medie pe sistemul experimental, la liniile

parentale s-a înregistrat o greutate medie a ştiuletelui de 85,86 grame în timp ce la

combinaţiile hibride aceasta este de 168,45 grame. Amplitudinea valorilor înregistrată

la hibrizi este cuprinsă între 92,4 grame (T244su x T193Asu) şi 206,69 grame la

hibridul (TC209su x LC153su) în timp ce la linii se înregistrează valori cuprinse între

61,65 grame şi 115,78 grame. În toate cazurile, combinaţiile hibride depăşesc media

formelor parentale. Totuşi există şi cazuri în care diferenţele între valoarea medie a

părinţilor şi a hibrizilor este relativ redusă (T244su x T193Asu, 85,39 respectiv 92,4).

Ca urmare, heterozisul este şi el slab manifestat (8,2%).

15

Teză de doctorat

O explicaţie ar fi aceea că liniile forme parentale ale hibrizilor simpli sunt

obţinute prin autopolenizare şi selecţie din hibrizi simpli. Astfel, aceste linii au

încorporate blocuri poligenice aparţinând la grupe heterotice diferite, ceea ce le

conferă o valoare a caracterului „per se” dar există şi o probabilitate ridicată de lipsă

de diferenţiere (HAŞ, 1999).

Heterozisul producţiei cu cele mai ridicate valori procentuale s-a înregistrat în

general la hibrizii a căror mamă a fost TC209su: TC209su x LC153su (140,10%),

TC209su x TA26su (127,35%), TC209su x TA27su (125,14%), dar şi la hibrizii care

au avut ca formă maternă linia sugary T233 (T233su x T346su – 118,09%; T233su x

LC153su – 117,33%, T233su x T3339Rsu – 101,34%) sau linia T244su (T244su x

LC153su -108,5%; T244su x T339Rsu – 106,8%; T244su x TA26su – 103,03%).

Valori superioare ale heterozisului s-au înregistrat şi în cazul profunzimii

bobului (14,53% şi 138,57%).

3.1.5.Exprimarea unor caractere de producţie ale genotipurilor în relaţie cu

condiţiile de mediu la hibrizii simpli de porumb zaharat aflaţi în

studiu la SCDA Turda

Datele privind influenţa hibridului, a anului asupra greutăţii ştiuletelui au fost

prelucrate statistic. Din analiza statistică rezultă că ambii factori experimentali (an,

genotip), precum şi interacţiunile simple şi duble dintre aceştia au avut influenţe

semnificative asupra greutăţii ştiuletelui, greutăţii pănuşilor, lungimii ştiuletelui,

numărului de rânduri de boabe/ştiulete.

După cum se remarcă din imaginea de mai sus (fig.4), greutatea pănuşilor este

mai mult influenţată de condiţiile pedoclimatice, anul având o pondere mai mare în

manifestarea acestui caracter.

Lungimea ştiuletelui este un caracter important în ceea ce priveşte producţia dar

şi aspectul ştiuletelui (foarte important pentru comercializare).

16

Teză de doctorat

Fig.4. Cota de participare (%) a unor factori implicaţi în exprimarea greutăţii ştiuletelui şi a greutăţii pănuşilor la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiaţi în anii 2005 şi 2006

Influenţa factorilor şi a interacţiunii simple şi duble dintre aceştia este

semnificativă. Din figura 5 putem observa că ponderea factorului B (genotipul) este ce

mai mare (61%), ceea ce denotă că anii au avut o influenţă mai puţin pregnantă în

manifestarea acestui caracter (lungimea ştiuletelui).

Fig.5. Cota de participare (%) a unor factori implicaţi în exprimarea lungimii ştiuletelui şi a numărului de rânduri de boabe pe ştiulete la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiaţi în anii 2005 şi 2006

Şi în cazul numărului de rânduri de boabe/ştiulete (fig.5), genotipul a avut

ponderea de influenţă cea mai mare (84%), faţă de an (7%) sau interacţiunea acestor

doi factori (3%).

Ponderea majoritară a contribuţiei genotipului în exprimarea caracterelor

analizate ne sugerează faptul că hibrizii de porumb zaharat au o comportare relativ

stabilă, în condiţii diferite de mediu, în privinţa caracterelor şi a genotipurilor analizate

(HAŞ, 1999).

17

Teză de doctorat

3.1.6. Caracterizarea liniilor consangvinizate pe baza analizelor RAPD

3.1.6.1. Rezultate privind extracţia şi cuantificarea ADN-ului

După extracţia ADN-ului s-au făcut cuantificările la spectofotometru Eppendorf

BioPhotometer, la lungimea de undă de A260/A280.

În cazul liniilor de porumb analizate se constată că cele mai bune rezultate, în

ceea ce priveşte cantitatea şi puritatea de ADN se obţin din embrioni prin aplicarea

protocolului după metoda Lodhi modificat de extracţie.

În ceea ce priveşte cantitatea de ADN obţinută, cele mai mari valori s-au

înregistrat în cazul utilizării ca material biologic embrionii, prin utilizarea primului

protocol de extracţie (Lodhi modificat). Astfel din embrioni s-au obţinut cantităţi de

7893 – 12000 ng/μl, în timp ce din endosperm valorile au fost mai mici respectiv între

3450-4370 ng/ μl. În acest caz puritatea a avut valori de 1,5 şi 2.

Extracţia realizată cu protocolul după metoda Barry Miller, din endosperm, a

reuşit obţinerea unui ADN a cărui puritate a avut valori între 1,45 - 1,5, iar din

extracţiile din embrioni puritatea ADN-ului s-a situat între valorile 1,2-1,7.

Ca urmare, extracţia de ADN s-a realizat la toate celelalte genotipuri numai din

embrioni şi utilizând protocolului elaborat de LODHI şi colab, modificat (POP şi

colab., 2003).

Cantitatea de ADN obţinută a fost corespunzătoare (1275 ng/μl şi 10593 ng/μl),

având în vedere că pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Puritatea ADN-ului a fost, de

asemenea, corespunzătoare fiind cuprinsă între 1,52 şi 2,01.

Extracţia de ADN s-a făcut, la liniile consangvinizate de porumb zaharat, din

embrioni, în tabelul 20 fiind prezentate rezultatele numerice privind cantitatea de ADN

şi puritatea acestuia.

3.1.6.2. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie

Pentru amplificarea probelor s-au folosit cei 20 primeri care au dat benzi

polimorfice în cazul extracţie de ADN doar 6 dintre ei (OPB10, OPAB11,

UBC241UBC 286, OPB 17, AB 11).

18

Teză de doctorat

Amplificarea probelor s-a făcut în trei repetiţii pentru fiecare primer.

Interpretarea gelurilor obţinute s-a făcut prin analiza statistică a imaginilor. În

analiza statistică s-au inclus doar benzile cu o intensitate luminoasă mare. ADN-ul

standard utilizat constă din 40 de fragmente cuprinse între 100 şi 4000 pb. În urma

comparării cu ADN-ul standard s-a putut stabili mărimea fiecărui fragment amplificat.

Fig. 6. Produşii de amplificare obţinuţi cu primerul UBC286, 1–T346; 2- TA21; 3–TC209; 4–TA25; 5-TA28; 6–T339R; 7–T193A; 8–T209; 9–TD101; 10-TA26, 11–SW87; 12-T152; 13–T233, 14–T345R, 15–T244, 16–LC153; 17-TA22, 18–LC154, 19-TA27.

Primerii care au relevat polimorfism între genotipuri sunt: OPB 10 cu 7 benzi

polimorfice, OPAB 11 cu 9 benzi polimorfice, UBC 241 cu 10 benzi polimorfice,

UBC 286 cu 12 benzi polimorfice, OPB 17 cu 8 benzi polimorfice, AB 11 cu 10 benzi

polimorfice.

Cele mai multe benzi polimorfice s-au obţinut cu primerul UBC 286 (figura 6).

Fragmentele rezultate prin amplificarea cu primerii polimorfici au avut lungimea

cuprinsă între 200 şi 2000 pb, majoritatea având între 300 şi 1200 pb.

Din figurile prezentate reiese în mod clar că, la toate liniile consangvinizate de

porumb zaharat analizate, există diferenţe notabile de structură genetică, relevate de

markeri RAPD.

Cu cât valorile distanţelor genetice calculate sunt mai mici, cu atât liniile

consangvinizate sunt mai strâns înrudite (mai apropiate genetic). Ca urmare, liniile

TA27su şi TD101su prezintă cel mai mare grad de apropiere genetică, având valoarea

distanţei genetice cea mai mică (0,02), conform analizei moleculare. La fel şi liniile

zaharate LC153 şi TA22 sunt foarte îndepărtate filogenetic, având distanţa genetică

calculată, cu ajutorul markerilor moleculari RAPD, cea mai mare (0,32). De asemenea

19

Teză de doctorat

distanţe genetice mari se înregistrează cu ajutorul acestor markeri moleculari şi între

liniile zaharate LC153 şi SW87 (0,3), T233(0,3), TC209 (0,28), T193A (0,27) precum

şi între LC154 şi TA22 (0,28), SW87 şi T233 (0,26).

În cadrul dendrogramei (figura 7) se constată că liniile LC153su şi LC154su

formează un grup separat faţă de celelalte linii consangvinizate studiate, cea mai mare

depărtare filogenetică fiind înregistrată faţă de liniile TA22su, T346su, TC209su.

Faptul că liniile TA25su, TA26su şi TA27su se găsesc în acelaşi grup al

dendrogramei, iar distanţele genetice sunt mici, nu fac decât să confirme acurateţea

rezultatelor experimentale obţinute, aceste linii consangvinizate de porumb zaharat

fiind de provenienţă comună. Mai mult, analizând originea liniilor, constatăm

veridicitatea analizelor moleculare, liniile TA26su şi TA27su fiind mai apropiate în

cadrul aceluiaşi grup, cu atât mai mult cu cât originea lor (genealogia) este mai

apropiată.

Se poate afirma, pe baza rezultatelor discutate în acest subcapitol că analizele

RAPD reprezintă un instrument sensibil de identificare, la nivel molecular, a

variabilităţii între liniile consangvinizate de porumb zaharat.

20

Teză de doctorat

0.1

TA22

T346

TC209

T209

TA28

TA21

TA25

T193A

T339R

TA27

TA26

TD101

SV87

T152

T345R

T233

T244

LC153

LC154

Fig. 7. Dendrograma obţinută la liniile consangvinizate de porumb zaharat studiate

3.1.7. Eficienţa selecţiei asistate de markeri a liniilor consangvinizate de porumb

zaharat

În scopul ilustrării selecţiei asistate de merkeri a liniilor consangvinizate de

porumb zaharat s-au calculat coeficienţii de regresie lineară dintre distanţele genetice

între liniile parentale şi performanţele hibrizilor obţinuţi din liniile respective. S-a

pornit de la idea că un coeficient de regresie semnificativ indică o legătură de

creştere/descreştere reală între valorile distanţelor genetice şi performanţele hibrizilor

pentru caracterele luate în studiu.

În cazul testării capacităţii specifice de combinare, selecţia asistată de markeri

RAPD s-a dovedit eficientă pentru caractere ce constituie importante elemente de

productivitate la porumbul zaharat (greutatea ştiuletelui, lungimea ştiuletelui şi

numărul de boabe/rând) şi mai puţin sau total ineficientă pentru înălţimea plantei,

21

Teză de doctorat

numărul de rânduri/ştiulete şi profunzimea bobului. Este clar că, în funcţie de testerii

folosiţi, trebuie găsiţi markerii RAPD a căror eficienţă în selecţia asistată de markeri să

fie maximă, pentru toate caracterele de interes în ameliorarea acestei varietăţi de

porumb.

4. CONCLUZII

Pe baza rezultatelor obţinute s-au putut formula câteva concluzii şi recomandări

asupra anumitor aspecte, cu privire la variabilitatea liniilor consangvinizate analizate,

importante pentru procesul ameliorării porumbului zaharat.

1. Pentru caracterele vegetative ale plantei (înălţimea plantei, înălţimea de inserţie a

ştiuletelui, numărul total de frunze pe plantă, suprafaţa foliară, numărul de

ramificaţii la panicul, numărul de lăstari pe plantă) cu efecte genice care pot fi

transmise aditiv, pot fi remarcate liniile: T244, TC209, T339R, LC153, LC154,

T346 şi T345R.

2. Liniile care pot transmite efecte genice aditiv pentru caracterele vegetative ale

ştiuletelui (greutatea ştiuletelui, lungimea ştiuletelui, greutatea pănuşilor,

diametrul ştiuletelui, număr rânduri de boabe pe ştiulete, profunzimea bobului)

sunt: T339R, LC153, T346, TA27 şi TA28.

3. Interacţiunile genice intra şi interalelice s-au determinat cantitativ prin efectele

capacităţii specifice de combinare, astfel că cele mai pronunţate diferenţieri la

nivel genetic neaditiv le manifestă liniile:

• T233 în combinaţie cu T193A , TA26 şi T152;

• T244 în combinaţie cu TA27, LC154, TA21, LC153, TA22, TA28,

T339R, TA26;

• TC209 în combinaţie cu T193A, T345R, TD101, TA22, T209.

4. În studiul realizat asupra 49 de hibrizi simpli direcţi, valorile superioare ale

heterozisului s-au înregistrat în cazul greutăţii ştiuletelui la combinaţiile hibride:

TC209 x LC153 (140,10%), TC209 x TA26 (127,35%), TC209 x TA27

(125,14%) dar şi la combinaţiile: T244 x LC153 (108,5%); T244 x T339R

(106,8%); T244 x TA26 (103,03%)

22

Teză de doctorat

23

5. Alegerea primerilor s-a dovedit destul de dificilă, din cei 20 primeri doar 6 au

relevat polimorfism între genotipuri;

6. Distanţele genetice cele mai mari au fost înregistrate între liniile consangvinizate

de origini diferite (LC153 şi TA22), în timp ce distanţele genetice mici arată o

înrudire mai mult sau mai puţin apropiată între liniile respective (TA27 cu

TD101, LC153 cu LC154 dar şi TA26 cu TA27) analiza RAPD fiind în general

în concordanţă cu datele cu privire la originea materialului analizat.

7. Pentru importante elemente de productivitate la porumbul zaharat, precum

greutatea ştiuletelui, lungimea ştiuletelui şi numărul de boabe/rând, selecţia

asistată de markeri RAPD poate înlocui cu succes testarea capacităţii specifice de

combinare a liniilor parentale. Această afirmaţie este susţinută prin rezultate

pozitive, asigurate statistic, a coeficienţilor de regresie liniară dintre distanţele

genetice între liniile parentale şi performanţele hibrizilor obţinuţi din liniile

respective pentru caracterele de interes.

8. Pe baza acestor rezultate se poate conchide că selecţia asistată de markeri

moleculari nu poate, în mod eficient, să înlocuiască testarea capacităţii generale

de combinare. Pe de o parte, testerii au capacităţi diferite de a reliefa valoarea

liniilor consangvinizate testate, iar pe de altă parte, testarea CGC constituie un

mod eficient de a elimina din etapele următoare de lucru liniile care, la modul

general, au o slabă capacitate combinativă.