Secventiere ADN
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Identification, analyse et squenage de dADN recombinant
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Squenage dADNLa caractrisation fine dun gne passe par son squenage la connaissance de la composition et de lordre des nuclotides qui le composent.Techniques de squenage:
Maxam et Gilbert squenage chimique;
Sanger squenage enzymatique par incorporation de didoxinuclotides (ddNTPs);
Le squenage sur puces technique davenir pour la biologie clinique.
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Hybridation molculaireLhybridation molculaire permet de reprer ou de rechercher une molcule dADN ou dARN spcifiques dans une population htrogne. Les techniques dhybridation reposent sur: le proprits physico-chimiques des acides nucliques comme la complmentarit des bases constitutives de lADN et de lARN; la rversibilit du processus de sparation des deux brins dune molcule dADN (dnaturation) et de r-association (renaturation).
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Dnaturation thermique de lADN
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Courbe de dnaturation thermique de lADNLa fusion de lADN se droule pour une gamme troite detempratures. La temprature correspondant la moitie de laugmentation de labsorbance est reprsente par Tm.
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Mthode Maxam et Gilbert squenage chimique (a)
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Principe mthode Sanger - la raction chimique
squenage enzymatique par incorporation de dsoxyribonucliques (ddNTPs)
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Mthode Sanger squenage enzymatique par incorporation de dsoxyribonucliques (ddNTPs)Sont ralises quatre ractions de polymrisation
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Principe de la mthodeSanger
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Mthode Sanger
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Autoradiographie
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Principe du squenage automatique
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Diffrents types de polymresutilises en squenage automatique
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Comparaison entre les ractions de squenage sans/avec marquage par un fluorophore
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Squeneur ABI Prism 310
Types danalyses
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Figure 1.23x Two examples of DNA technology
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Figure 1.23x1 Biotechnology laboratory
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Figure 1.23x2 Analyzing DNA
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Secvenierea ADNr 16S o modalitate de identificare fiabilPrincipiul identificrii prin secvenierea ADNr-16SToate microorganismele posed cel puin o copie a genelor care codific pentru ARNr. Regiunea numit ADNr-16S este majoritar folosit pentru determinarea genului i speciei prin PCR
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Secvenierea ADNr-16S bacterian :modalitate de identificare fiabilMetoda permite :Identificarea oricrui tip de germenSpre deosebire de tehnicile clasice, aceast metodologie nu necesit cunoaterea caracteristicilor germenilor studiai, sufucient-izolarea unei simple colonii Identificarea de germeni "stresai sau leniGraie PCR-tehnic care poate fi aplicat pe microcolonii bacteriene.Identification genului i speciei germenilor "dificili "Anumii germeni pun probleme de identificare prin tecnicile clasice (ex:Pseudomonas spp.,Legionella ). Secvenierea ADNr-16S permite depirea acestei dificulti.Identificarea de germeni "atipici"Numeroi germeni din mediu evolueaz i sunt "atipici".Tehnicile clasice nu permit identificarea, secvenierea ADNr-16S devine metoda preferat pentru analiza acestor tulpini
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Studiul speciilor genului PseudomonasSecvenierea unei colonii isolat de Pseudomonas spp.Comparaie (BLAST) ntre secvena obinut cu ansamblul secvenelor ADNr-16S stocate n bancile de date
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Figure 20.9 Using restriction fragment patterns to distinguish DNA from different alleles
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Figure 20.10 Restriction fragment analysis by Southern blotting
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Figure 20.11 Chromosome walking
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Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 1)
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Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 2)
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Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 3)
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Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 4)
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Figure 20.13 Alternative strategies for sequencing an entire genome
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Table 20.1 Genome Sizes and Numbers of Genes
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Figure 20.14a DNA microarray assay for gene expression
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Figure 20.14b DNA microarray assay for gene expression
*L identification des bactries par les mthodes molculaires reprsente un complment indispensable aux mthodes traditionnelles d analyse des caractristiques morphologiques et physiologiques.Parmi ces nouvelles techniques,celle base sur le squenage direct apparat comme la plus efficace : elle consiste squencer ("lire")une rgion spcifique du chromosome bactrien (appele ADNr-16S)et comparer cette squence avec les squences connues et stockes en banques de donnes.Ceci permet de dterminer avec certitude le genre et l espce de la souche tudie.
Tous les micro-organismes possdent au moins une copie des gnes codant pour les ARN ribosomaux (ARNr),molcules indispensables toute cellule pour la biosynthse des protines.Parmi ces gnes (ADNr),la rgiondite "ADNr-16S"est principalement utilise pour la dtermination du genre et de l espce :Aprs lyse des cellules d une colonie isole,l ADN bactrien extrait est purifi.La rgion "ADNr-16S"estspcifiquement amplifie par une mthode enzymatique (mthode dite de PCR ,pour "Polymerase ChainReaction").La squence de l ADN amplifi est alors lue l aide d un automate.L identification est ralise par comparaison de cette squence avec les bases de donnes des squencesconnues (plus de 3500 squences dans EMBL et GenBank).Le Principe de l identification par le squenage de l ADNr-16S