Tema 2. Morfologia si ultrastructura bactertiilor. Examenul Microscopic.

1. Metodele de diagnostic in microbiologia medicala. Esenta lor. Metoda microscopica.Metode microbiologice de diagnostic: diagnostic direct (detectare agent patogen sau a produselor lui)1. microscopic (orientativ) prezenta bct, nr, forma, structuraa)opticab) pe fond intunecatc) prin contrast de fazad) cu luminiscentae) electronica2. bacteriologic izolare culturi pure de bct, identificare si testare la AB3. biologic (experimental) inoculare produs patologic la animale de laborator, provocare maladie tipica4. depistare Ag mi/o in lichide biologice5. identificare AN mi/o prin tehnici de biologie moleculara diagnostic indirect (imunologic)1. serodiagnostic detectare si titrare Ac specifici in serul bolnavului2. intradermoreactie introducere alergen microbian epidermal/intradermal; reactie pozitiva = aparitie eritem hipersensibilitate specifica (intilnire repetata cu Ag)

2. Morfologia si ultrastructura bacteriilorBct = mi/o, unicelular, procariot, autonomGrupe morfologice de bct: coci:1. micro2. diplo (neisseria=bob de cafea, pneumococi=lanceolati)3. tetra4. strepto (lant) + enterococcus, lactococcus5. stafilo (gramezi)6. sarcine (pachete 8-16-32 coci) bastonase1. bacterium capete rotunjite, nu formeaza spori (ex. E. coli)2. bacillus capete retezate, formeaza spori ce nu depasesc diametrul celulei (ex. B. anthracis); posibilitate formare lanturi = streptobacili3. clostridium capete rotunjite, formeaza spori ce depasesc diametrul celulei (ex. C. perfringens) spiralate/incurbate1. vibrio (ex. V. cholarae)2. campylo-/helico- bacter = 2 apire. aspect de pasare in zbor (ex. C. jejuni)3. spirillum = cel. spiralate rigide4. spirochaeta = cel. spiralate flexibile, 5-25 spire (ex. Treponema, Leptospira, Borrelia) polimorfe (Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma)

Elemente permanente: PC, MCt, Ct, nucleoid, ribosomi, mezosomi G+ (E, citocromi)Elemente nepermanente: capsula, spor, flageli, fimbrii, plasmide, incluziuni celulareMCt: mozeic fluid Singer lipsa colesterol, contin sterol-like molecules hopanoizi mai bogata in prot. decit eucariotele fctii multiple (la eucariote indeplinite de organite) PBP catalizare transpeptidare si sinteza PC permeaze transport prot. sist. de secretie receptori E lant respiratorRol MCt:1. Bariera semipermeabila, selectiva difuziune simpla, facilitata2. Permeaze transport activ3. E activitate metabolica4. Metabolism energetic5. Participa la diviziunea celulara6. Sinteza PG si fosfolipidelor7. Chemotaxis (R specifici)Mezozomi: cresc S MCt cresc activitatea metabolica, energeticaCt: Lipsesc organitele Prezenta: ribozomi, nucleoid, inclusiuni, plasmide pH acidRol Ct: sediul proceselor metabolice

3. Etapele si tehnica de pregatire a micropreparatelor din culturi bacteriene, crescute pe medii lichide si solide, din produs biologic : sputa, puroi, singe, fragmente de tesuturi.Pregatirea frotiurilor examen microscopic. Pe masa trebuie sa se afle numai materialele si obiectele necesare pentru investigatia data. La pregatirea frotiului in prealabil se flambeaza lama. Etape in pregatirea frotiului:

Medii compacte se aplica o picatura de solutie izotopica de clorura de Na sau apa pe lama.Ansa bacteriologica se sterilizeaza la flacara spirtierei. Ansa rece se introduce in eprubeta, se atinge cultura de microorganisme si se extrage. Marginile eprubetei se flambeaza si se astupa cu dopul. Cultura se depune pe o lama.Medii lichide se aplica o picatura de cultura cu ansa sau pipeta la mijlocul lamelei.Puroi/sputa se folosesc 2 lamele. O portiune mica de material steril se transfera la mijlocul lamei cu ansa si se acopera cu alta lama in asa mod, casa ramina libere cote o 1/3 din ambele. Lamelele se departeaza in parti opuse, obtinind 2 frotiuri identice.Singe :1) uscare2) fixare oamoara bct, mareste afinitatea pt colorant3) colorare asigura contrast intre mi/o si fundal4) examinare (microscop optic cu imersie)Caracter tinctorial = capacitatea mi/o de a fixa colorantul

4. Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Colorantii utilizati in microbiologie. Metoda simpla de colorare si importanta ei practica.

CARACTERELE TINCTORIALE (de colorare) - permit diferentierea bacteriilor in gram pozitive si gram negative.Frotiul se coloreaza cu coloranti de anilina. Deosebim coloranti acizi, bazici si neutri. Colorantii bazici, la care partea activa a moleculei poseda o incarcatura pozitiva, reactioneaza mai activ cu celula bacteriana, care are incarcatura negativa.Colorarea bacteriilor reprezinta un proces fizio-chimic compus. La interactiunea colorantului cu substantele celulei microbiee se formeaza saruri, care asigura stabilitatea coloratiei. Reactia diverselor specii microbiene fata de coloranti se numeste propietate tinctoriala. Mai frecvent sint utilizati urmatorii coloranti: 1) rosii (fucsina bazica/acida, safranina, rosu neutru, rosu de Congo); 2) albastri (albastru de metil/de toluidina/de tripan); 3) violeti (violet de gentiana, violet de metil sau cristal violet); 4) galbeni bruni (vezuvina, crizoidina).Colorantii utilizati au aspect de pulbere sau cristale. Din astfel de coloranti ca fucsina bazica, violetul gentian albastru de metil se pregatesc in prealabil solutii alcoolice concentrate (1 gr de colorant la 10 ml de alcool de 96%). Din solutiile concentrate de coloranti alcoolici si fenolici se prepara solutiile apoase, folosite pt colorarea simpla/compusa.Metodele simple de colorare permit determinarea formei bacteriilor, la ele se foloseste un singur colorant. Exemplu : a)Fucsina bazica se intrebuinteaza pt pregatirea fucsinei fenicate Zienl, in particular stabila la pastrare. Cu fucsina se coloreaza in rosu microorganismele acidorezistente si sporii.

Coloratia microorganismelor vii se face cu albastru de metil, rosu neutru si alti coloranti slab toxici in diluatia 1 la 10000.

5. Metodele diferentiale de colorare : Gram, Ziehl- Neelsen, Aujeszky, Burri- Hinss, Neissner. Mecanismele, componentii si tehnica de colorare. Importanta.

6. Microscopul optic cu imersie. Constructia si modul de utilizare.

Microscopul are in componenta sa :a) Parte mecanica Piciorul F. Asigura stabilitate Bratul microscopului Corpul Tubul microscopului Masa portobiectb) Sistem optic Obiective cu imersie obiective la care mediul interpus intre obiect si lentila frontala are un indice de refractie mai mare decit al aerului si apropiat de cel al sticlei, de exemplu uleiul de cedru. Apertura numerica maxima practica = 1,4c) Sistem de iluminare.7. Protoplastii. Sferoplastii. Formele L de bacterii. Importanta.8. Studierea bacteriilor vii. Metodele indirecte de evidentiere a cililor. Pregatirea preparatelor picatura suspendata si picatura strivita.9. Microscopiile contemporane : optic cu sistemul de imersie, contrast de faza, fond obscur, luminiscent si electronic. Constructia, principiile si tehnica microscopiei.Microscopul optic = dispozitiv cu ajutorul caruiasepotexaminastructuri cu dimensiuni mult sub puterea de rezol 12212t1921m utie a ochiului umanComponenete microscop optic:n1. SURS DELUMINAn2. CONDENSORn3. DIAFRAGMn4. MASAn5.DISPOZITIV DE DEPLASARE A LAMEIn6. REVOLVERn7. OBIECTIVEn8. SISTEM DE PRISMEn9. OCULARn10.MACROVIZAn11MICROVIZAModul de formare al imaginii la MO:nObiectivul formeaza o imagine marita , reala si rasturnata a obiectuluinOcularul- are ca obiect imaginea data de obiectiv si va forma imaginea finala mult marita , rasturnata si virtuala , la infinit deci nu necesita efort de acomodarePerformanteleMOsunt :nPuterea de marirenPuterea de rezolutiePUTEREA DE MARIRE:nPuterea de marire = produsul dintre puterea de marire a obiectivului si cea a ocularuluinPuterea de marire maxima x1500 orinPuterea de marire - 4, 10;- 20, 40 - diagnostic histologic;- 60, 100 - diagnostic citologicPUTEREA DE REZOLUTIE =Cea mai mica distanta dintre doua puncte la care acestea pot fii percepute distinctnDe ea depinde claritatea si bogatia n detalii a imaginiinDepinde de lentila obiectivuluinFORMULA LUI ABB:nd=l/ n sinnl= lungimea de unda a radiatiei electromagnetice ( 0,55 m)nn= indicele de refractie al mediului dintre preparat si obiectivna= din aperura unghiulara a obiectivuluiLimitarile puterii de rezolutie amicroscopului optic in practicanleste oconstantanaturala ce nu poate fi influentata (0,55)nMediul dintre preparat si obiectiv este de obicei aer (n = 1)nObiectivul cu imersie - intre obiectiv si preparat se interpune o picatura de lichid cu un indice de refractie supraunitar, cum este uleiul de cedru (n=1,51)nApertura unghiulara maxima teoretica este 180 , decia=90, limita teoretica maxima a sina=1Rezolutia maxima a microscopului optic= 0,2mSTUDIUL CELULELOR VII NECOLORATEn1.MICROSCOP CU CMP NTUNECATn2. M. CU CONTRAST DE FAZn3. M. CU INTERFERENn4. M. TIP NOMARSKIn5. MICROSCOPUL RANVERSATn1.MICROSCOP CU CMP NTUNECATnPRINCIPIU - exista un diafragm in condensor care selecteaza doar lumina laterala iar imaginea finala este formata de catre razele reflectate de componentele din preparatn2. M. CU CONTRAST DE FAZnPRINCIPIUn- lumina care trece prin medii cu indici de refractie diferiti si modifica directia si vitezan- micoscopul transforma aceste diferente n diferente de intensitate luminoasan3. M. CU INTERFERENnPRINCIPIUn- mai foloseste nca o raza de lumina care nu traverseaza tesutul analizat ,dar interfera cu raza provenita de la sursa de luminan-ofera informatii despre densitatea obiectului analizei4. M. TIP NOMARSKInUn tip modificat al microscopului cu contrast de faza, oferind imagini aparent tridimensionalen5.MICROSCOPUL RANVERSATn- pentru examinarea celulelor din flacoane sau placi Petrin- obiective sub masutan- sursa de lumina deasupraMICROSCOPUL CU FLOURESCENTALUMINISCENTA =proprietatea unor substante de a emite lumina atunci cand sunt stimulate luminos =FOTOLUMINISCENTAnFLUORESCENTA - proprietatea unei substante de a emite radiatii lumioasedoar in timpulstimulariinFOSFORESCENTA -proprietatea unei substante de a emite radiatii lumioasesi dupa incetarea stimulariiTERMOFLUORESCENTA = proprietatea unor substante de a emite lumina atunci cand sunt stimulate termic.Aplicatii practice MICROSCOP CU FLOURESCENTA:1.AUTOFLUORESCENAcapacitatea tesuturilor vii de a absorbi radiatii luminoase cu oanumita lungime de unda si de a o emite ulterior alte radiatii, cu o alta lungime de unda, mai mare2.FLUORESCENTA SECUNDARA- dupa marcare cu compusi fluorescenti:na. Acridine orange - ADN-verde/ ARN-rosunb. Quinacrina - cromozomi = bandareMICROSOPUL CU FLORESCENTAIMUNOFLUORESCENA: punerea n evidenta a diferitilor antigeni cu ajutorul unor anticorpi specifici marcati cu un compus fluorescent IZOTIOCIANAT DEFLUORESCEINA (FITC)-2 tipuri: directa si indirectaIMUNOFLOUESCENTA DIRECTA=Ag+ Ac specific marcatIMUNOFLOURESCENTA INDIRECTAAg + Ac specific + Ac sec. marcat- are o sensibilitate mai mare ca metoda a-se foloseste in cazul in care antigenele se gasesc in cantitate mica in tesutn4.SONDE FLUORESCENTE , molecule care detecteaza concentratia i.c. a ionilor , a rad. liberi , a variatiilor de pH i.c. si isi modifica proprietatile in functie de valorilor acestora.