Tehnici de Separare Și Concetrare in Biotehnologii (3)

8/18/2019 Tehnici de Separare Și Concetrare in Biotehnologii (3)

1/20

UNIVERSITATEA “VASILE ALECSANDRI” BACĂU

FACULTATEA DE INGINERIE

Specializarea: Inginerie Bioc!ic"

TE#NICI DE SE$ARARE %I C&NCETRARE 'N BI&TE#N&L&GII

($R&IECT(

S)*+en), Coor+ona)or,

An+reea #&RT&L&-EU pro./ *ni0/ +r/ ing/ L*cian GAVRILĂ

An *ni0er1i)ar

Bac"*, 2345(2346

0


2/20

TE#NICI DE SE$ARARE %I C&NCETRARE $ENTRU &B INEREAȚ

$ENICILINEI G 7BEN8IL$ENICILINEI9

4/9 S)ailirea !a)eriilor pri!e i pro+*1*l*i .ini)ș

Penicilina G (benzilpenicilina) face parte din clasa antibioticelor, acestea fiind substan eț

chimice organice produse de microorganisme care în cantită i foarte mici inhibă dezvoltareaț

microorganismelor patogene.

Când a descoperit leming penicilina, acesta a observat inhibarea cre terii bacteriilor înș

!urul unei culturi de mucegai, concluzionând că mucegaiul emană o substan ă care omoarăț

bacterii i le inhibă cre terea în zonă. " crescut o cultură pură i a descoperit că era mucegaiulș ș ș

Penicillium, fiind cunoscut astăzi ca Penicillium Notatum. #nsă chiar de la începutul

cercetărilor penicilina era cel mai eficient medicament împotriva bacteriilor gram$pozitive.

%ezvoltarea mucegaiului se realizează pe un mediu de cultură cât mai pur posibil ce are în

compozi ia sa următorii constituien i&ț ț

$ e'tract de porumb, lactoză, glucoză, făină de soia, fenilacetamină, tiosulfat de sodiu, apă,

, , .

Caracteristicile Penicilinei G (benzilpenicilinei)

Penicilina este un antibiotic derivat din fungii Penicillium. Penicilinele sunt antibiotice

naturale sau semisintetice având la bază un nucleu comun, acidul$$aminopenicilanic. "cesta

este format dintr$un inel tiazolidinic i un inel beta$lactamic, de aici provenind i denumirea

de antibiotic *$lactamic.

1


3/20

+ste un antibiotic ob inut pe cale de e'trac ie (naturală) sau de semisinteză i ac ionează înț ț ț

faza de multiplicare activă a germenilor. unt non$to'ice, bine tolerate, se absorb la nivelul

tubului digestiv. -oate au o ac iune bacteriostatică i bactericidă i sunt active asupraț

germenilor gram$pozitivi i asupra cocilor gram$negativi dar sunt mai pu in active asupraș ț

germenilor gram$negativi.

Penicilinele sunt indicate în tratamentul infec iilor cu germeni sensibili ca& faringita,ț

bron ita, pneumonia, amigdalita, endocardita bacteriană, sifilisul, blenoragia i angina luiș

incent, i în prevenirea crizelor de reumatism articular acut. pectrul penicilinelor este, în

general, îngust.

/acteriile sensibile la aceste medicamente sunt pu0in numeroase& bacilul difteriei,

gonococul, listeria, meningococul, pneumococul, stafilococul, streptococul etc. %e altfel,

bacteriile devin din ce în ce mai rezistente la peniciline1 unele secretă o enzimă, penicilinaza,

capabilă să distrugă mai multe varietă i de penicilină.ț

Penicilina este o substan ă organică solubilă, produsă de unele microorganisme animale iț

vegetale, care are capacitatea de a distruge anumi i microbi sau de a le opri dezvoltarea, faptț

pentru care se utilizează în tratamentul bolilor infec ioase.ț

Figură 1.2.a) Structura chimică generală a penicilinei

Penicilina G face parte din clasa antibioticelor *$lactamice cu ac iune antiinfec ioasă iț ț ș

antifungică.

Penicilina G de biosinteză este o substan ă chimică produsă cu a!utorul unor specii deț

microorganisme din clasa Penicillium i "spergillius. /enzilpenicilina are în structura sa unș

sistem biciclic tiazolidin$ *$lactamic i o grupare benzil având următoarea structură chimică&ș

igură 2.3. b) tructura chimică a Penicilinei G

2


4/20


5/20

alorile e'acte pentru compozi ia mediilor de cultură depinde de natura su ei producătoare,ț ș

ceea ce constituie secretul de fabrica ie al fiecărei uzine producătoare de peniciline.ț

Pregătirea i sterilizarea mediilor de cultură pentru inoculator i intermediar se poate realizaș ș

direct în fermentatoare. Pregătirea mediului de cultură pentru fermentatorul de regim are locîntr$un aparat prevăzut cu un agitator, conductă pentru abur viu necesar încălzirii i serpentinăș

de răcire.

#n acest aparat se introduce apa, se încălze te la 5$95ș ⁰C, se adaugă e'tractul de porumb iș

se fierbe timp de 75 minute$2 oră.

%upă aceasta solu ia se răce te la 85$5ț ș ⁰C i se adaugă restul componen ilor mediului deș ț

cultură în ordinea următoare& , , lactoză,

glucoză.

>ediul preparat astfel este sterilizat în instala ia de sterilizare cu men inător i coloană, prinț ț ș

încălzire cu abur direct la 23=$23⁰C i men inere la această temperatură timp de 25$23ș ț

minute. #n continuare, mediul este răcit la 5$8⁰C i trimis cu această temperatură înș

fermentatorul de regim, unde se va răci în continuare până la 39⁰C.

Fermenta ia biochimicăț

ermenta ia biochimică este etapa următoare în flu'ul tehnologic i fundamentală aț ș

procesului de biosinteză i se realizează în trei trepte ? inoculator, intermediar i regim$ careș ș

corespund anumitor stadii de dezvoltare a microorganismelor. "stfel că&

$ în inoculator are loc procesul de aclimatizare a microorganismelor producătoare de

antibiotic la noile condi ii de dezvoltare1ț

$ în intermediar începe cre terea e'ponen ială a numărului de microorganisme1ș ț

$ în regim se desăvâr e te procesul de cre tere a microorganismelor i de elaborare aș ș ș ș

penicilinelor.

Procesul de fermenta ie a benzilpenicilinei cuprinde trei faze metabolice&$ț de cre tere;ș

4


6/20

-de producere;

-autolitică.

Faza de cre tereș se caracterizează prin acumularea de masă miceliană i utilizarea intensivăș

a componentelor mediului de cultură.

$ glucoza este asimilată foarte rapid atât pentru formarea materialului celular cât i pentruș

furnizarea energiei necesare1

$ cerin ele de o'igen sunt ma'ime în această perioadă, iar activitatea respiratorie, dega!atăț

prin eliberare de bio'id de carbon, este ridicată.

Faza de producere se caracterizează prin încetinirea cre terii nivelului, scăderea consumuluișde o'igen, men inerea p@$ului la ,4$9,8 i acumularea de penicilină G.ț ș

$ aici lactoza este folosită lent de miceliu i furnizează energia necesară proceselor deș

biosinteză sau pentru formarea constituien ilor celulari.ț

Faza autolitică corespunde stadiului în care microorganismul se epuizează ca urmare a

activită ii metabolice prelungite, iar sursele de carbon din mediu sunt consumate.ț

$ con inutul de gaz al miceliului descre te considerabil i începe procesul de autoliză alț ș ș

acestuia cu eliberare de amoniac i cre terea p@$ului peste 4.ș ș

Cum viteza de utilizare a hidra ilor de carbon se înscrie în ordinea glucoză A acid lactic Aț

lactoză, rezultă că în faza de cre tere a masei celulare se consumă glucoză, iar în perioada deș

formare a penicilinei se consumă lactoză. Prin urmare, mediul de cultură trebuie să asigure

necesarul de glucoză i lactoză pentru desfă urarea normală a întregului proces de biosinteză.ș ș

Filtrarea solu iilor nativeț

Bichidul de cultură ob inut la fermenta ie se separă de miceliu pe filtru tambur cu vid.ț ț

olu ia rezultată se trece printr$un răcitor tubular unde se răce te până la 7$8ț ș ⁰C i seș

depozitează în rezervorul de a teptare, unde este trimisă la e'trac ie.


7/20


8/20

F;g/4/9 !? l@= ? pr@=>*l*; > @ ;n>r> ? $>n;=;l;n>; G pr;n ;@;n)> "ƅ ԁ ƅ ƅ ᴢ

7

+'tract de porumbBactozăGlucoză

ăină de soiaăruri nutritive

"pă

"-+


9/20


10/20

/9 $roce1e, ecipa!en)e i *)ilae pen)r* realizarea 1epar"rilor nece1are nș

o inerea $enicilinei Gț

Filtrarea solu ii lor nativeț

iltrarea lichidelor de fermenta0ie care con0in masă celular ă cu caracter fibros (culturide fungi din clasa Penicillium ) este o opera0ie relativ uoară, miceliul necolmatând materialulfiltrant i desprinzându$se uor de pe acesta.

Ba nivel de operare industrială se recomandă filtrele rotative cu vid (filtrele Lliver)

deoarece& ? conferă o suprafa0a mare de filtrare, ? posibilită0i de spălare a miceliului pe filtru pentru, recuperarea avansată a produselor

utile, ? se pretează la automatizare.

Figura 2 Schema filtrului rotativ celular cu vid (!liver)

1- tambur; 2- capul distribuitorului; 3- cu it răzuitor; - buncăr; !- cu"a; #- conducta de apă pentru spălare;ț

$- celule %iltrante;&- strat depus; I- zona %iltrării; II i I'- zonele uscării; III-zona de spălare; '- zona deș(ndepărtare a sratului depus.

iltrul rotativ cu vid, denumit filtru celular Lliver, poate fi construitd in o el $c ar bo n, o e l i n o' id ab il , o el că pt u i t c u c au ci uc s au t ef lo n, d inț ț ț șdife ri te a lia!e . "legerea mate ria lu lui de const ruc ie este determinată dețcaracterul agresiv al lichidelor supuse filtrării.

iltrul constă dintr$un tambur rotativ, cu lungimea 2$=.8 m, i diametrulș2.98$7m, construit din doi cilindrii orizontali co$a'iali. Cilindrul e'terior este

perforat i acoperit cu material filtrant, iar spa iile dintre cei doi cilindri esteș țîmpăr i t în 25$23 celule e tan e care func ionează succesiv i independent .ț ș ț ș


11/20

Begătura d int re aces te ce lule i conductele de v id sau aer comprimat seșrealizează prin intermediul capului de dis tr ibu ie . uprafa a tamburului es teț țîmpăr i tă în mai multe zone corespunzătoare opera ii lor de f i l t rare , spălare ,ț țuscare i îndepăr tare a s tra tu lui de mice l iu depus . #n t impul unei ro ta i i aș țtamburului, fiecare celulă trece prin toate aceste zone.

#ndepărtarea miceliului se realizează cu a!utorul unui cu it răzuitor fi'.țolu ia rezultată se trece printr$un răcitor tubular unde se răce te până la 7$8NC i seț ș șdepozitează în rezervorul de a teptare, de unde este trimisă la e'trac ie.


12/20

lu'ul general al separării penicilinelor de biosinteză este alcătuit din = etape&2. filtrarea lichidului de fermenta ie cu a!utorul filtrelor rotative cu vid, în scopulț

separării biomasei de lichidul care con ine penicilinele1ț

3. e'trac ia penicilinelor din filtrat cu un solvent organic în două sau mai multeț

stadii, în func ie de concentra ia lor în solu ie1ț ț ț

7. ree'trac ia penicilinelor din solventul organic cu o solu ie de carbonat de sodiuț țsau de potasiu1

=. cristalizarea i purificarea, în func ie de tipul de penicilină.ș ț

E)rac ia penicilineiț G folose te ca mediu supus e'trac iei fizice, lichidul deș țfermenta ie filtrate, iar ca solventț ace)a)*l +e *)il (deoarece este un solvent nepolar) la p@

cu valoarea 3.+'trac ia penicilinei G în acetat de butil decurge cu randamente ma'ime numai înțcondi iile în care acest antibiotic se va găsi în solu ia apoasă supusă e'trac iei în formăț ț țnedisociată. %in analiza procesului de e'trac ie fizică a penicilinei G cu acetat de butil s$ațconstat că&

$ în solvent sunt e'trase numai molecule de penicilina nedisociată,$ între molecule de penicilinaă, în condi iile în care se realizează e'trac ia, nu are locț țformarea unor asocia iiț $ în acetatul de butil penicilina G nu disociază.

chema de opera ii pentru separarea penicilinelor prin e'trac ie este prezentată înț țschema următoare&

Fig $) Schema de principiu a procesului de e#trac ie a benzilpenicilinei ț

11


13/20

Pentru e'trac ia penicilinei G se folose teț ș e)rac)or*l Podbielnia% . "cesta este construit

dintr$o foaie metalică înfă urată în spiral în !urul unui arbore care se rote te cu 3555$8555ș șrota iiminut.


14/20

-ot pentru stabilizarea penicilinei G e'trac0ia decurge la temperaturi scăzute (7$8 NC), îne'tractoare cu timp de contact scurt între faze (e'tractoare Podbielnia).

%upă separarea fazelor, pentru stabilizarea produsului, se neutralizează urmele de acidantrenate în faza organică prin adăugare de solu0ie apoasă de acetat de sodiu sau potasiu, pânăla p@ de , când penicilina este ree'trasă i stabilizată sub formă de sare în solu0ia apoasă.

Purificarea se poate realiza printr$o nouă e'trac0ie la p@ 3 ? 3,8 urmată de neutralizare cufosfat de potasiu 3D până la p@ .olventul epuizat este recirculat la e'trac0ie, împreună cu solventul recuperat din rafinat

prin distilare. Fmpurită0ile organice coe'trase împreună cu penicilina pot fi îndepărtate prinadsorb0ie pe cărbune activ.

&istilarea azeotropă (Cristalizarea)

#n prezent pentru separarea sărurilor penicilinei G din solu ia apoasă rezultată de lațree'trac ia în carbon de :a (;), se folose te procedeul antrenării azeotrope a apei cuț ș

butanol, la vid, astfel încât, odată cu îndepărtarea apei are loc cristalizarea săriirespective, apoi, acesta se filtrează si se spală cu butanol i cloroform. Etilizareaș

butanolului, de i prezintă avanta!ul unui timp relativ scurt al fazei de cristalizare i alș șunei solubilită i relativ bune a impurită ilor are o serie de inconveniente cum ar fi&ț ț$ conduce la pierderi mari de butanol, datorită solubilită ii ridicate a acestuia în apăț

(9,=8D), precum i datorită solubilită ii mari a apei în butanol (35,8D)1 acestș țaspect determină i cheltuieli sporite cu recuperarea solventului.ș

$ posibilitatea degradării termice a penicilinei, datorită temperaturii necesareevaporării amestecului butanol$apă.

$ posibilitatea degradării chimice a penicilinei în butanol.

Pentru ob inerea Penicilinei G sub formă de cristale se utilizează metoda dețcristalizare prin răcire.

%e obicei, această metodă se folose te pentru substan e a căror solubilitate nu variazăș țmult cu temperatura. olu ia nesaturată este introdusă într$un evaporator unde este supusățfierberii1 prin evaporarea solventului solu ia atinge satura ia necesară cristalizării. %inț ț

momentul începerii cristalizării concetra ia solu iei nu se mai schimbă deoarece, pe de o parteț ț

se evaporă solventul iar pe de altă parte, din solu ie se separă faza solidă.ț

13


15/20

Figura ') "vaporator cu cristale

scarea

Escarea es te o opera ie prin care se îndepărtează umiditatea dintr$unțmaterial cu a!utorul energiei termice. -ermenul de uscare se mai utilizează ișîn cazul îndepărtării unui component în stare lichidă sau de vapori dintr$ungaz sau dintr$un amestec lichid.

Escătoarele se pot clasifica în func ie de mai multe criterii&ț2) după regimul de fuc ionare pot fi&ț$ continue$ discontinue

3) după presiunea de lucru pot func iona&ț$ la presiune atmosferică$ la vid

7) după procedeul de uscare pot fi&$ cu agent termic gazos$ cu încălzirea materialului

=) după sensul de circula ie a solidului i a gazului pot fi înț ș &

$ echicurent,$ contracurent,$ curent mi't$ curen t înc ruc i a tș

8) din punct de vedere constructive sunt&$uscătoare cu strat fi',$cu strat mobil,$cu strat fluidizat,$cu pulverizare,$de contact

Penicilina G precipitată se filtrează pe filtrul :uce i se usucă în uscător șdulap la 78$=8NC sub vid de 255$338 mm@g, timp de 2$35 ore.

14


16/20

Figura ) Filtrul *uce1-recip ientu l % i l t ru lu i , 2-suport de suspensie , 3-supra%a ă % i l trantăț

iltrul :uce este un recipient de formă cilindrică (paralelipipedică) cu sau fără capacsuperior i care are în interior, deasupra fundului, un grătar cu strat filtrant a ezat în pozi ieș ș țorizontală. tratul filtrant este format din esătură metalică, te'tile sau de altă natură,țcompletat uneori cu azbest, vată de sticlă.

%easupra stratului filtrant e'istă presiunea coloanei de lichid, iar sub fa a inferioară ațstratului filtrant apare o depresiune datorită unui sistem de produs în vid. %atorită acesteidiferen e de presiune este accelerată filtrarea, după care precipitatul este spălat. Eneori sețfolose te o baterie de mai multe filtre.ș

>aterialul de construc ie al filtrului se alege în func ie de proprietă ile substan ei care seț ț ț țfiltrează i poate fi & lemn, o el, cupru, fontă emailată, material ceramic.ș ț

Fig +) scător cu cameră sau t ip dulap

#n încăperea 2, a cărei mărime variază de la aceea a unui dulap până lad imensiun ile une i c amere, mater ia lu l e ste a eza t în s tive , pe s te la !e , peș

platforma unor cărucioare sau în tăvi spri!inite pe poli e. "e rul estețtransportat de ventilatorul 3 printre elementele de încălzire ale caloriferului 7i apoi circulă paralel cu materialul. Eneori aerul străbate stratul de material.ș

%upă preluarea umidită i i aerul iese din uscător ca aer uzat1 de cele maițmul te o ri o par te d in aerul uza t s e ames tecă cu aerul p roaspă t i e steșrecirculat. %upă uscare, materialul este evacuat din uscător printr$un sistem

15

1

23


17/20

de u i . Escătoarele cu cameră func ionează discontinuu& sunt folos i te pentruș țuscarea în a r!e mic i a mater iale lor sub formă de pas tă , g ranula re sau înș

bucă i.ț

/9 Elaorarea 1ce!ei +e . l* )enologic pen)r* o inerea $enicil ineițG

16


18/20

Fig , ) Schema instala iei de biosinteză a Penicil inei G ț

1-rezer"or ex trac t de porumb; 2-pompă cu ro i d in ate; 3-dozator; -omoenizator; !-"asț ț pre ăt ire mediu pentru inoculator; #-"as solu ie Na/0; $-dozator; &-aparat pre ăt ireț

mediu pentru intermediar; -rezer"or so lu ie de * idra i de carbon;ț ț 1-aparat preătire mediu pentru %ermentator de reim; 11-pompă centri %uă;

12-coloane de s teri l i zare; 13-men inător de temperatură; 1-răc i tor; 1!- %ermentator ț inoculator; 1#-%i l tru aer; 1$-%ermentator intermediar; 1&-%ermentator de reim;

1-"as l ic* id ant ispumant; 2-pompă; 21- % i l t ru tambur; 22-rezer"or so lu i i % i l t ra te ;ț 23-pompă; 2-răc i tor; 2!-"as de colec tare so lu i i nat i"e; 2#-pompă; 2$-rezer"or so lu i iț ț nati"e; 2&-separator picături; 2-"as tampon; 3-pompă de "id; 31-pompă centri %uă;

32-"as de măsură ac id su l %uric ; 33-"as ace ta t de but i l ; 3-"as ce tazol ;3!-ex tractor; 3#-"as neutral izare ape; 3$-dozator ace ta t de but i l ; 3&-"as so lu ie %os%a t ;ț

3-"as so lu ie ace ta t cu penic il ină; -"as de măsură ac id su l %uric ; 1-"as ace ta t deț but i l ; 2-"as ace tat de but i l cu penic i l ină; 3-"as (n*e are; - %i l t ru; !-"as colector;ț

#-% i l tru druc; $-%i l tru seitz; &-"as precipitare penicil ină potasică;-"as solu ie a lcool ică; !- % i l t ru nuce; !1-"as so lu i i mume; !2-"as butanol;ț ț

!3-"as cloro%orm; !-"as spălare produs; !!-%i l tru nuce; !#-"as butanol rezidual; !$-"ascloro%orm rezidual; !&-uscător

Concluzii

17


19/20

#n cadrul acestui proiect am constatat că pentru a ob0ine Penicilina G printr$un proces biotehnologic es te necesară uti lizarea anumitor materii prime ișau'il iare i , to todată , de urmat anumite procese de separare i concetrareș ș

pentru a rezulta un antibiotic de calitate superioară, în conformitate cuce ri n e le p ie e i.ț ț

"stfel că, pentru realizarea fiecărui procedeu de separare, concetrare sau purificare se va lua în considerare tipul de utila! necesar procedeuluirespect iv i condi i i le op time de lucru pentru o bună des fă urare a tu turor ș ț ș

proceselor biotehnologice. Conform s tudiului efectuat , am consta tat că pentru opera ia de f il t rare aț

biomasei este necesară utilizarea filtrului rotativ celular cu vid, fiind utilizatla nivel industrial pentru separarea acestui tip de material de faza apoasă. %eas eme ne a, p en tr u e 't ra c i a b en zi lp en ic il in ei s e f ol os e t e e 't ra ct or ulț șPodbielnia deoarece, datorită câmpului de for e centrifugal i a diferen ei deț ș țdensita te , are loc o curgere radia lă în contracurent a celor două faze . Badist i larea azeotropă es te indicată metoda de crista lizare prin răcire , prin

intermediul evaporatorului cu cristale, utilizat pentru tipurile de substan e cețnu variază mult cu temperatura. Pentru filtrarea cristalelor de penicilină seutilizează filtrul tip :uce iar pentru uscarea acestora, uscător cu cameră sautip dulap deoarece func ionează în mod discontinuu, folosit pentru uscarea înțar!e mici a materialului finit.ș

18


20/20

BIBLI&GRAFIE

-ehnici de separa re i conce tra re în b iotehnologi i $Cursur i , autor &șGavrilă Bucian.

/iotehnologii industriale$ :ote de curs, autor& :istor Fleana %enisa, editura "lma

>ater /acău, 3559.

"nca Frina Galaction, %an Ca caval Q>etaboli i secundari cu aplica ii farmaceutice,ș ț ț

cosmetice i alimentareR,ș +ditura /it, Fa i, 355=.ș

Corneliu Lniscu, ,,Chimia i tehnologia medicamentelorR, editura /ucure ti, 2O9.ș ș

Fndustria chimică$ Lpera ii i utila!e de bază, autor& tan "le'andru, >ămăligă Foan,ț ș

editura Gheorhe "sachi, Fa i, 2OO9.ș

1

Tehnici de Separare Și Concetrare in Biotehnologii (3)

Documents

Transcript of Tehnici de Separare Și Concetrare in Biotehnologii (3)