Biotehnologii in alimentatia animalelor

IOAN MIRCEA POP

____________________________________________

BIOTEHNOLOGII N ALIMENTA}IA ANIMALELOR___________________________________________MATERIAL DE LUCRU

I.D.

CUPRINS1. BIOTEHNOLOGII: TRECUT, PREZENT [I VIITOR................................................... 7 1.1. Revolu]ia biotehnologic\..................................................................................... 7 1.2. Biotehnologii clasice: istoric [i evolu]ie............................................................ 10 1.3. Biotehnologiile moderne ..................................................................................... 12 1.4. Definirea no]iunii de biotehnologie.................................................................... 13 1.5. Varietatea proceselor biotehnologice [i a domeniilor de implicare a biotehnologiilor.......................................................................................... 15 1.6. Probleme [i perspective n utilizarea biotehnologiilor .................................... 17 2. UTILIZAREA MICROORGANISMELOR N SCOPURI UTILE OMULUI ................... 19 2.1. Diversitatea produc]iilor microbiene ................................................................. 21 2.2. Avantajele produc]iilor microbiene.................................................................... 26 3. PRODUSE OB]INUTE PRIN BIOTEHNOLOGII, UTILIZATE N ALIMENTAIA ANIMAL ............................................................................................ 29 3.1. Proteine de origine microbian\ (POM)............................................................... 30 3.1.1. Aspecte generale referitoare la producerea [i folosirea POM ......................... 30 3.1.1.1. Importan]a, istoricul [i definirea POM .......................................................... 31 3.1.1.2. Avantajele producerii POM........................................................................... 31 3.1.1.3. Materii prime utilizate n producerea POM................................................... 32 3.1.1.4. Factori de cultur\ importan]i n producerea POM........................................ 35 3.1.1.5. Condi]ii cu privire la folosirea POM n scop furajer...................................... 36 3.1.2. Biomas\ proteic\ din drojdii............................................................................... 39 3.1.3. Biomas\ proteic\ din bacterii ............................................................................ 51 3.1.4. Biomas\ proteic\ fungic\ .................................................................................. 55 3.1.5. Biomas\ proteic\ din microalge ........................................................................ 59 3.2. Aminoacizi ............................................................................................................. 62 3.2.1. Definire, istoric, importan]\, producere ............................................................ 62 3.2.2. Utilizare practic\, produse comercializate........................................................ 69 3.3. Enzime furajere ..................................................................................................... 72

3.3.1. Definire, istoric, importan]\ ............................................................................... 72 3.3.2. Principii de ac]iune, factori de influen]\............................................................ 74 3.3.3. Utilizare practic\: recomand\ri, produse comercializate, rezultate ob]inute................................................................................................ 78 3.4. Antibiotice furajere [i ionofori ............................................................................ 94 3.4.1. Definire, istoric, importan]\, acceptare............................................................. 94 3.4.2. Principii de ac]iune, factori de influen]\............................................................ 98 3.4.3. Utilizare practic\: recomand\ri, produse comercializate, rezultate ob]inute................................................................................................ 99 3.4.4. Cazul special al rumeg\toarelor. Ionoforii...................................................... 100 3.5. Probiotice............................................................................................................. 104 Definire, istoric, importan]\ ............................................................................. 104 Importan]a microflorei digestive ..................................................................... 107 Microorganisme probiotice ............................................................................. 108 Principii de ac]iune, factori de influen].......................................................... 111 Utilizare practic\: recomand\ri, produse comercializate, rezultate ob]inute.............................................................................................. 115 3.5.6. Utilizarea combinat\ a antibioticelor furajere [i a probioticelor ..................... 133 3.6. Prebiotice............................................................................................................. 136 3.6.1. Definire, rol, importan]\................................................................................... 136 3.6.2. Oligozaharide prebiotice: disponibilit\]i, activitate, avantaje ......................... 137 3.7. Acizi organici.................................................................................................... 141 3.7.1. Acidifierea hranei la animale: importan]\, principii........................................ 141 3.7.2. Utilizare practic\: recomand\ri, produse folosite, rezultate ob]inute............................................................................................................. 142 3.8. Agen]i de cre[tere a palatabilit\]ii .................................................................... 148 3.8.1. Arome furajere ................................................................................................ 148 3.8.2. ndulcitori (edulcoran]i) ................................................................................... 150 3.9. Alte produse biotehnologice de uz furajer...................................................... 152 3.9.1. Vitamine [i pigmen]I........................................................................................ 152 3.9.2. Hormoni........................................................................................................... 157 Bibliografie..................................................................................................................... 160 Anexe ............................................................................................................................ 165 3.5.1. 3.5.2. 3.5.3. 3.5.4. 3.5.5.

I.M. POP- Biotehnologii n alimentaia animalelor

"Industria biologic\ va constitui al patrulea grup de industrii din economia de mine, poate cu cea mai mare influen]\ asupra dezvolt\rii viitoare a omenirii" (Alvin TOFFLER - Al treilea val)

1. BIOTEHNOLOGII: TRECUT, PREZENT I VIITOR

1.1. Revolu]ia biotehnologic\Omenirea are `n fa]a sa cteva probleme fundamentale ale c\ror rezolv\ri sunt prea importante pentru a nu fi c\utate: unele ]in mai mult de trecut - cum ar fi elucidarea apari]iei vie]ii [i a procesului evolu]iei biologice - `n timp ce altele vizeaz\ prezentul [i viitorul - `ndeosebi asigurarea condi]iilor necesare existen]ei [i perpetuarii umanit\]ii (hran\, energie, materii prime industriale, mediu, s\n\tate). Acestea din urm\ sunt evident mai presante, deja aproape `n cazul fiec\rui element amintit aparnd o anumit\ stare de criz\: criza alimentar\ determinat\ de rata extraordinar\ de cre[tere demografic\ `n unele ]\ri slab dezvoltate (mai ales din Asia [i Africa), criza energetic\ determinat\ de rezervele limitate `n combustibili conven]ionali, criza ecologic\ mondial\, apari]ia unor boli/epidemii noi etc. Cunoa[terea [tiin]ific\ actual\ [i strategia de dezvoltare a societ\]ii pe calea industrializarii [i a consumului resurselor clasice nu ofer\ solu]iile necesare rezolv\rii acestor probleme; oamenii de [tiin]\ apreciaz\ c\ numai o nou\ revolu]ionare a tuturor cuno[tin]elor referitoare la lumea `nconjur\toare ar permite

- 7 -


g\sirea r\spunsurilor dorite [i c\ aceast\ nou\ revolu]ie `n [tiin]\, de care va depinde chiar supravie]uirea [i viitorul omenirii, va fi posibil\ pornind de la o revolu]ie biologic\ [i biochimic\, numit\ [i revolu]ie biotehnologic\ sau bioindustrial\ (20). Se apreciaz\ c\ revolu]ia biotehnologic\ se va baza pe dezvoltarea procedeele de fermenta]ie, inginerie enzimatic\, inginerie genetic\ [i fuziune celular\, implicnd o evolu]ie tehnologic\ corespunz\toare reflectat\ `n dezvoltarea industriilor biotehnologice. Aceste considerente explic\ interesul major existent pe plan mondial pentru cercetarea [i aplicarea biotehnologiilor, ct [i volumul deosebit al resurselor umane, materiale [i financiare alocate acestui domeniu, `n special `n ]\rile puternic dezvoltate: ca exemplu, Japonia a alocat `ntre anii 1982-1990 circa 26 miliarde de yeni pentru cercetarea [i dezvoltarea biotehnologic\ (`n condi]iile `n care numai valoarea produselor microbiologiei industriale japoneze, la `nceputul anilor '80, a fost de circa 11-12 trilioane de yeni / aprox. 50 miliarde $ SUA / ceea ce reprezenta cca. 5 % din produsul na]ional brut al Japoniei [i echivala cu valoarea produc]iei de echipamente electrice [i electronice din aceast\ ]ar\). Pe plan mondial, desigur c\ cheltuielile globale efectuate pentru cercetare [i dezvoltare `n domeniul biotehnologiilor ating sume [i mai impresionante; unele date estimative referitoare la volumul acestor cheltuieli sunt prezentate `n tab. 1 (46), eviden]iindu-se ponderea major\ a sectorului privat [i faptul c\ sumele De asemenea, este deosebit de relevant\ evolu]ia pie]ei produselor realizate prin intermediul biotehnologiilor (inclusiv a ingineriei genetice) cu aplica]ii `n zootehnie: analiza unor date disponibile `n acest sens, referitoare la SUA, eviden]iaz\ o sugestiv\ multiplicare valoric\ a acestei pie]e, de peste 53 de ori `n destinate aplica]iilor biotehnologice `n agricultur\ reprezint\ circa 25% din total.

- 8 -


numai 10 ani (1981-1990), ce continua sa se mentina si in acest mileniu (estimare):anul: 1981 1982 mil.$ SUA: 8 14 Tabelul 1 Cheltuieli mondiale pentru cercetare [i dezvoltare `n domeniul biotehnologiilor (estimare, `n mil.$ SUA/an)(dup\ Lindner)(46) DOMENIUL BIOTEHNOLOGII N AGRICULTUR Semin]e Privat Public TOTAL 350 250 600 Microbiologie 200 100 300 Total 550 350 900 2150 950 3100 2700 1300 4000 ALTE TOTAL GENERAL 1984 33 1986 100 1988 220 1990 430 (2000) (20000)

In ceea ce prive[te activitatea de cercetare [i dezvoltare `n domeniul biotehnologiilor, la nivel mondial pot fi remarca]i trei poli principali: SUA, Japonia [i Uniunea European\. Primul program european comunitar (denumit BEP - Biomolecular Engineering Programme) s-a desf\[urat `n perioada 1982-1986, cu un buget de 15 milioane ECU (100 mil FF.), viznd aplica]ii ale ingineriei genetice [i enzimatice `n agricultur\ [i agroindustrie [i a fost continuat `n anii 1986-1989 cu un alt proiect beneficiind de un buget de cinci ori mai mare (denumit BAP - Biotechnology Action Programme).

- 9 -


Uniunea European\ a finantat un proiect comun de cercetare [i dezvoltare biotehnologic\ (552 milioane ECU acorda]i pentru perioada 1994-1998) prin Federa]ia European\ de Biotehnologie, antrennd peste 80 de societ\]i [tiin]ifice cu profil biotehnologic, `n urm\toarele domenii: biologie celular\ [i structural\ (38% din fonduri), biotehnologia plantelor [i animalelor (24%), analiza genomului (16%), imunologie [i vaccinuri transgenice (7%), biodiversitate [i acceptare social\ (9,5%) (la care se adaug\ 5,5% - infrastructur\)(102).

1.2. Biotehnologii clasice: istoric [i evolu]ieBiotehnologiile, `n forma lor empiric\, au fost practicate de milenii, cu ajutorul microorganismelor producandu-se diverse alimente [i b\uturi fermentate. De pild\, `nc\ acum 5000 de ani sumerienii cuno[teau fabricarea a peste 20 de tipuri de bere; mai mult chiar, modul de preparare a berii apare descris pe o tabli]\ babilonian\ datat\ ca fiind din anul 6000 `.e.n. (descoperit\ `n anul 1981); de asemenea, s-a stabilit faptul c\ babilonienii cuno[teau bioconversia alcoolului etilic `n acid acetic, procedeul fiind folosit `n producerea o]etului, `n timp ce drojdiile erau folosite pentru fabricarea pinii [i a vinului. microorganisme `n scopuri folositoare omului. A urmat o perioad\ de dezvoltare a biotehnologiilor sub forma unor tehnologii simple, artizanale, a unor procese controlate `n mare m\sur\ prin intermediul condi]iilor de mediu, microorganismele utile activnd al\turi de altele care nu puteau fi eliminate. n aceast\ etap\, conducerea unei fermenta]ii era considerat\ o art\ transmis\ de catre cunosc\tori de la o genera]ie la alta. Brnzeturile fermentate [i diferitele produse din lapte de tipul iaurtului au fost [i ele, rezultatul utiliz\rii unor

- 10 -


Primele progrese pe baze [tiin]ifice `n cercetarea procesului de fermenta]ie au `nceput s\ apar\ dup\ descoperirea microscopului (secolul XVII); astfel, olandezul Anthony van Leeuwenhoek a fost primul care a relevat omenirii existen]a lumii microbiene, descoperind "animalicule" cu forme diferite (sferice, spiralate, bastona[e) `n apa de ru, `n infuzii de fn sau `n saliv\ [i ar\tnd c\ `n berea `n curs de fermentare se g\sesc celule de drojdii). `n secolul urm\tor, Karl Linn - `n celebra sa lucrare "Sistema naturae", din anul 1735 `ncadra organismele microscopice `n genul "Chaos", caracterizndu-le ca avnd puteri infernale ("furia infernalis"). Progrese mai `nsemnate s-au realizat `n secolul al XIX-lea, cnd Louis Pasteur (1822-1895) - fondatorul microbiologiei ca [tiin]\ - a demonstrat, printre altele, c\ `n procesul de fermenta]ie are loc transformarea zaharurilor `n alcool [i dioxid de carbon, ceea ce furnizeaz\ energia necesar\ celulelor de drojdii, care se pot dezvolta `n absen]a oxigenului; mai ales `n cea de-a doua jum\tate a secolului al XIX-lea s-au f\cut progrese `n studierea [i cunoa[terea microorganismelor utile, reu[indu-se izolarea unor bacterii [i drojdii [i cre[terea lor `n cultur\ pur\ - a[a a `nceput producerea industrial\ a drojdiei de panifica]ie (`n anul 1880). Cele mai mari progrese `n domeniul biotehnologiilor au fost f\cute, `ns\, `n secolul XX - `n special `n cea de-a doua jum\tate a sa. Un mare pas l-a constituit dezvoltarea microbiologiei industriale gnotobiotice, cristalizat\ conceptual `n perioada anilor 1940-1950, legat\ de industria antibioticelor, a metaboli]ilor secundari `n general [i a proceselor de bioconversie, care necesit\ participarea exclusiv\ a microorganismelor utile active [i excluderea celor "parazite", nedorite.

- 11 -


1.3. Biotehnologiile modernePe la jum\tatea anilor '60 se vorbea, tot mai des, despre na[terea unei "noi biologii". nmul]irea descoperirilor din biochimie, biologie, genetic\, microbiologie [i enzimologie a creat premisele apari]iei biotehnologiilor moderne. Se consider\ c\ aceast\ etap\ nou\ a fost deschis\ prin cteva descoperiri de referin]\, intre care descoperirea structurii ADN de c\tre Watson [i Crick (`n anul 1953) [i a tehnicii de manipulare a materialului genetic (1973); legat de aceasta din urm\, descoperirea endonucleazelor de restric]ie, a ligazelor [i a ac]iunii lor specifice, a permis ca, pe baza cercet\rilor lui Smith, Nathans [i Arber, s\ se ajung\ la era "geniului genetic", astfel reu[indu-se dep\[irea barierelor dintre specii sau crearea unor noi grup\ri de gene [i chiar de organisme noi, reprogramate genetic (organisme "tailor-made" / "croite" prin inginerie genetic\ special pentru un anumit scop util). Exist\ opinii conform c\rora stabilirea structurii ADN a oferit biologiei dimensiunea cunoa[terii [i perspectivele oferite fizicii [i chimiei prin descoperirea atomului [i a structurii acestuia. Utilizarea tehnicilor moderne a permis atingerea unor performan]e extraordinare, unele greu de b\nuit. O singur\ exemplificare ar fi crearea sintetizatorului de gene ("ma[ina de gene"), comercializat `nc\ din anul 1981 [i care face posibil\ sinteza rapid\ a unor fragmente relativ mari de gene, ce pot fi apoi reunite pe cale enzimatic\. Patentarea bioorganismelor produse pe cale artificial\ a fost permis\ de c\tre Tribunalul Suprem al S.U.A., `nc\ din anul 1980. Ingineria genetic\ este considerat\ a fi tehnica ideal\ capabil\ s\ amelioreze cantitativ [i calitativ capacit\]ile biosintetizante ale unor

- 12 -


microorganisme utilizate in biotehnologiile moderne, `n scopul intensific\rii ob]inerii unor produse utile.

1.4. Definirea no]iunii de biotehnologieN\scut\ din interferen]a [tiin]elor biologice cu tehnologia, biotehnologia ocup\ o pozi]ie priveligiat\ nu numai prin performan]ele sale actuale [i mai ales, prin cele posibil de realizat, ci [i prin perspectivele exploat\rii industriale (bioindustria), cu efecte economice [i sociale determinante pentru viitorul omului. Strict etimologic, termenul de "biotehnologie" apare ca fiind compus din trei elemente cu origine greac\, respectiv "bios" (via]\), "technos" (meste[ug, tehnic\) [i "logos" (cuvnt, studiu, [tiin]\), `n]elesul s\u imediat fiind deci de "[tiin]a folosirii viului". Conceptul modern de "biotehnologie", de[i dominat `nc\ de ambiguitate [i folosit `n accep]iuni diferite, se deosebe[te de cel al "biotehnologiilor conven]ionale", fa]\ de care reprezint\ o faz\ de progres, specificat\ tocmai prin termenul de "biotehnologii moderne"; mai mult chiar, `n ultimii ani a ap\rut [i termenul de "biotehnologii avansate", delimitnd cele mai noi [i mai de viitor tehnici [i procese specifice acestui domeniu, cum sunt cele bazate pe tehnicile de recombinare genetic\, pe folosirea enzimelor, a celulelor sau a organismelor celulare imobilizate. Federa]ia European\ de Biotehnologie - creat\ `n anul 1978 - a propus definirea biotehnologiei ca fiind "utilizarea integrat\ a biochimiei, microbiologiei [i ingineriei chimice pentru realizarea de aplica]ii tehnologice folosind microorganisme, culturi de celule [i enzime".

- 13 -


Diver[i autori au `ncercat o definire ct mai exact\ [i complet\ a biotehnologiilor; red\m mai jos doar cteva dintre defini]iile propuse. Dup\ Headon (32), biotehnologia este cel mai bine definit\ ca fiind "folosirea unor organisme, sisteme sau procese biologice `n industrii", aria sa [tiin]ific\ cuprinznd activitatea fermentativ\, cultura de celule, ingineria genetic\ [i cea enzimatic\ [i `n general microbiologia industrial\. Cristescu (16) a definit biotehnologia ca fiind "acea ramur\ a [tiin]elor cu aplicabilitate `n tehnologia industrial\, `n care organismele (bacterii, mucegaiuri etc.) sau produ[ii lor de biosintez\ provoac\, `n condi]ii bine determinate, un efect tehnologic distinct [i eviden]iabil analitic, cum ar fi ob]inerea de substan]e biologic active (vitamine, enzime) sau inactive (alcooli, acizi), degradarea unui substrat sau orice alt efect tehnologic inexistent `n absen]a microorganismelor sau a produ[ilor lor". Trebuie remarcat faptul c\ aceste defini]ii extind cadrul conceptual al biotehnologiilor de la sfera de activitate a microorganismelor la ansamblul sistemelor biologice. `n opinia noastr\, biotehnologiile ar putea fi definite sintetic ca fiind un complex de tehnici [i procese ce utilizeaz\ organisme vii `n scopuri utile omului, ac]ionnd la scar\ microscopic\ [i la nivel de celul\. Aceast\ defini]ie general\ indic\ faptul c\ biotehnologiile sunt deosebit de variate [i complexe, att ca metod\ [i ac]iune, ct [i ca agent biologic care - sau asupra c\ruia -ac]ioneaz\ [i `n fine, ca obiectiv urm\rit. Astfel, biotehnologiile includ nu numai procese productive - cum ar fi ob]inerea unor substan]e utile produse de anumite microorganisme cultivate - ci [i diferite tehnici de cercetare [i de lucru specifice (de exemplu, crearea de noi vaccinuri prin recombinare genetic\, fuziunea de celule somatice, clon\ri de celule, bioconversia unor de[euri

- 14 -


etc.), agen]ii biologici putnd fi reprezenta]i att de microorganisme, ct [i de celule vegetale sau animale. Aplicarea la scar\ industrial\ a biotehnologiilor a dat na[tere "bioindustriei" - ce cuprinde activit\]i industriale `n care biotehnologiile fie `nlocuiesc tehnologii conven]ionale, fie au un rol promotor esen]ial; de asemenea, tehnicile specifice biotehnologiilor poart\ denumirea de "biotehnici", iar ingineria realiz\rii [i conducerii proceselor biotehnologice constituie "bioingineria". Un sistem biotehnologic complet necesit\ urm\toarele patru elemente componente de baz\: agentul biologic, substratul folosit de acesta, un produs sau alt rezultat util ob]inut [i aparatura necesar\ (bioreactorul).

1.5. Varietatea proceselor biotehnologice [i a domeniilor actuale de implicare a biotehnologiilor

Varietatea proceselor biotehnologice este foarte mare, sfera domeniilor de aplica-bilitate a biotehnologiilor fiind `n continu\ extindere [i ca urmare, greu de delimitat. `n cele ce urmeaz\ prezent\m o tentativ\ de schematizare a domeniilor de implicare a biotehnologiilor, f\r\ a avea preten]ia unei cuprinderi complete a acestora (prelucrare dup\ Nicu)(56):BIOTEHNOLOGII: A) BIOTEHNOLOGII INDUSTRIALE: - Tehnologii de producere [i cre[tere a microorganismelor (microbiologie industrial\) - Tehnologii de producere [i conversie a biomasei - Tehnologii pe baz\ de catalizatori enzimatici - Tehnologii farmacologice (producerea de antibiotice, vaccinuri)- 15 -


- Producerea de substan]e cu valoare terapeutic\ prin tehnici specifice geneticii celulare [i moleculare (insulin\, interferon, somatostatin\ etc.) - Tehnici de introducere, depozitare [i dirijare a medicamentelor `n organism - Tehnologii noi de prezervare [i depoluare a mediului - Extragerea din minereuri a substan]elor utile B) INGINERIE GENETIC: - Ob]inerea de linii celulare noi, pentru medicin\, agricultur\, zootehnie, industria alimentar\ - Utilizarea mutagenezei, a transferului de gene, a hibrid\rii somatice [i a clon\rii pentru ob]inerea unor noi tipuri de celule [i organisme - Incorporarea unor gene dorite, utile pentru ob]inerea unor produse de interes medical sau industrial - Conservarea unor resurse genetice vegetale [i animale - Crearea unor sisteme de diagnostic rapid [i eficient a maladiilor sau deregl\rilor func]ionale la om, animale [i plante - Producerea unor sisteme biologice de combatere a bolilor (anticorpi monoclonali, vaccinuri, virusuri [i bacterii antagoniste) C) BIOTEHNICI AGROZOOVETERINARE: - Producerea global\ de biomas\ - Producerea de proteine, aminoacizi, vitamine, enzime [i alte componente organice pentru consum uman sau animal - Cre[terea rezisten]ei plantelor [i animalelor la atacul factorilor patogeni [i a toleran]ei fa]\ de factori de mediu defavorabili - Implementarea de sisteme simbiotice la diferite specii de plante [i animale - Utilizarea tehnicii de clonare la plante [i animale - Biotehnici de reproduc]ie artificial\ [i de predeterminare a sexului la animale.

Principalele direc]ii viitoare de dezvoltare a biotehnologiilor sunt determinate de mai mul]i factori: cerin]ele societ\]ii fa]\ de anumite produse biotehnologice, criza energetic\ [i cea ecologic\ (`n condi]iile acumul\rilor crescnde de de[euri [i materii conven]ional neutilizabile) [i apari]ia noilor descoperiri `n cercetarea fundamental\.

- 16 -


1.6. Probleme [i perspective privind utilizarea biotehnologiilorO problem\ major\ care `i preocup\ `n ultimii ani pe sociologi, ecologi [i biotehnologi se refer\ la impactul `ntre om / societate [i rezultatele biotehnologiilor; pe aceast\ linie, cteva probleme sunt `n prim-planul aten]iei, [i anume: - c\utarea unui mod de promovare adecvat\ a biotehnologiilor `n via]a societ\]ii, pe baza accept\rii sociale, avnd `n vedere factorii care afecteaz\ imaginea publicului asupra biotehnologiilor (considerente economice, sociale, medicale, ecologice etc.); exist\ [i o opozi]ie fa]\ de biotehnologii, conform c\reia acestea pot fi o periculoas\ "cutie a Pandorei"; - evaluarea posibilelor realiz\ri biotehnologice [i a efectelor antrenate de acestea; - necesitatea reducerii costurilor sub nivelul celor determinate de produsele sau tehnologiile clasice `nlocuite; - transferul cuceririlor din domeniul biotehnolgic dinspre ]\rile puternic dezvoltate spre ]\rile `n curs de dezvoltare, astfel `nct [i acestea din urm\ s\ poat\ beneficia de avantajele utiliz\rii biotehnologiilor; un rol major `l poate juca `n acest sens Organiza]ia Na]iunilor Unite pentru Dezvoltare Industrial\ (ONUDI), prin cele dou\ "Centre Interna]ionale de Inginerie Genetic\ [i Biotehnologie" deja create, unul `n Europa (la Trieste), iar al doilea `n Asia (India). Se pare c\ unul dintre obstacolele majore ce stau `n fa]a accesului ]\rilor lumii a treia la binefacerile biotehnologiilor `l reprezint\ barierele legale [i financiare - mai ales -, legate de drepturile de proprietate (patentele) privind noile cuceriri `n domeniul biotehnologiilor; `n general proprietate a unor corpora]ii private din ]\rile industrializate, acestea reprezint\ o important\ surs\ de venituri pentru recuperarea imenselor cheltuieli de cercetare efectuate.

- 17 -


Dac\ `n anul 1983 existau `n `ntreaga lume circa 450 de societ\]i de biotehnologie, dup\ zece ani erau `nregistrate numai `n SUA circa 700 [i `n Europa circa 300 de noi "SSB" - "Societ\]i specializate `n biotehnologii" (103). Romnia s-a aliniat tendin]ei existente pe plan mondial de dezvoltare a biotehnologiilor. Astfel, `n cadrul Academiei Romne a luat fiin]\ `n anul 1985, Comisia de Bioinginerie [i Biotehnologie, iar `n anul 1992 a fost creat\ Societatea Romn\ de Biotehnologie Aplicat\ (ARBA), ambele afiliate la Federa]ia European\ de Biotehnologie. O serie de alte institu]ii desf\[oar\ o intens\ activitate de cercetare `n domeniul biotehnologiilor. n cadrul Institutului de Energetic\ Chimic\ [i Biochimic\ Bucure[ti func]ioneaz\ o sec]ie de biotehnologii, care dezvolt\ cercet\ri `n special `n urm\toarele direc]ii: a) Elaborarea unor tehnologii industriale chimice avnd la baz\ catalizatori enzimatici; b) Biotehnologii de producere a biomasei [i de conversie a acesteia; c) Biotehnologii de producere biosintetic\ (prin fotosintez\) a hidrogenului; d) Biotehnologii de epurare a apelor uzate `n procesele industriale etc. Institutul de Cercet\ri Chimico-Farmaceutice (ICCF) Bucure[ti este angajat `n cercet\ri pentru ob]inerea proteinelor din metanol [i pentru producerea de enzime (au fost ob]inute produse enzimatice ca: Subtilaza Z, Celulaza tip ICCF, Proteaza tip ICCF [.a); totodat\, ICCF Bucure[ti este interesat `n producerea de antibiotice, probiotice [i de aminoacizi. Deasemenea, exist\ preocup\ri privind utilizarea produselor ob]inute prin biotehnologii, `n diferite domenii de activitate. Astfel, la Facultatea de Zootehnie din cadrul Universit\]ii Agronomice [i de Medicin\ Veterinar\ Ia[i exist\ deja, o tradi]ie `n cercetarea cu privire la utilizarea unor produse ob]inute prin biotehnologii, `n special `n alimenta]ia animalelor.- 18 -


Perspectivele biotehnologiilor moderne - incluznd [i tehnicile de inginerie genetic\ -sunt spectaculoase, de acestea legndu-se [i speran]ele oamenilor de [tiin]\ de a rezolva unele probleme majore ale umanit\]ii cum ar fi: asigurarea hranei [i a energiei necesare `n conditiile exploziei demografice [i industriale, prezervarea [i depoluarea mediului, noi tehnici medicale [i producerea de preparate anticanceroase [i antivirale etc. Firma american\ de marketing "Predicasts" aprecia pia]a biotehnologic\ pentru anul 1995 la peste 20 miliarde dolari SUA, `n timp ce `n domeniul agricol, firma "Policy Research Corporation" f\cea estim\ri - privitor la aceea[i pia]\ - `n jurul a 10 miliarde $ SUA (56). `n concluzie, impactul noilor biotehnologii `n sferele activit\]ii umane este deja semnificativ, iar importan]a acestora va cre[te `n continuare. Biotehnologiile pot fi considerate un pas al umanit\]ii necesar pentru a trece `n pragul mileniului trei [i a exista dincolo de acesta, un pas ce trebuie f\cut dar numai dup\ o foarte bun\ preg\tire - constnd `ntr-o asidu\ cercetare fundamental\ [i aplicativ\ -, pentru a fi evitate poten]iale riscuri ecologice, economice [i sociale cu consecin]e greu de anticipat.

2. UTILIZAREA MICROORGANISMELOR N SCOPURI UTILE OMULUI`n prezent sunt cunoscute ca existente `n natur\ peste 100 000 de specii de microorganisme; dintre acestea, numai cteva sute au fost sau sunt utilizate de om pentru producerea de substan]e utile. Cele mai importante grupe de microorganisme utilizate ca agen]i biotehnologici sunt bacteriile, drojdiile, mucegaiurile [i algele.- 19 -


Folosirea la nivel industrial a microorganismelor pentru a produce substante utile a dat na[tere microbiologiei industriale, care, avnd la baz\ studiile lui Pasteur asupra fermenta]iilor alcoolic\, butiric\ [i lactic\ [i studiile lui Weizmann `n timpul primului razboi mondial - asupra fermenta]iei acetono-butanolice, s-a consacrat definitiv dup\ anii '40, sintetizarea prin fermenta]ie a penicilinelor [i apoi a altor antibiotice, deschiznd era microbiologiei industriale moderne. Folosirea microorganismelor `n scopuri utile omului nu se limiteaz\, `ns\, numai la producerea diverselor substan]e prin microbiologie industrial\, ci include [i domenii ca industria sau alimentar\, tratarea de[eurilor, apelor uzate / de poluate, biogaz, biotransformarea biodegra-darea producerea

producerea de biomas\, recuperarea metalelor, implementarea de sisteme simbiotice la plante [i la animale, inginerie genetic\ etc. Bioconversiile reprezint\, de asemenea, importante aplica]ii biotehnologice, una dintre cele mai cunoscute fiind bioconversia alcoolului etilic `n acid acetic (fabricarea o]etului), realizat\ cu ajutorul bacteriei Gluconobacter suboxydans [i folosit\ `nc\ acum 7000 de ani `n Babilon. Bioconversiile constau `n transformarea de c\tre celulele microbiene a unui metabolit `ntr-un compus cu structur\ asemanatoare, fiind foarte specifice `n ceea ce prive[te reac]ia [i compu[ii implica]i. Una dintre aplica]iile moderne ale bioconversiilor este biosinteza unor hormoni steroizi (cortizon, aldosteron) pornind de la steroli vegetali (74). Combaterea biologic\ a d\un\torilor apare ast\zi, ca fiind o solu]ie promi]\toare pentru a `nlocui utilizarea abuziv\ de produse chimice - adesea cu efecte negative - `n agricultur\, avnd `n vedere [i rezisten]a dobndit\ de unii d\un\tori [i parazi]i la pesticidele uzuale; actualmente se folosesc tot mai mult biopesticide, microorganisme care paraziteaz\ d\un\torii culturilor, respectiv bacterii (de ex. Bacillus thuringiensis, varietatea Israeliensis, care produce `n- 20 -


mod obi[nuit proteine toxice pentru larvele unor insecte), virusuri [i ciuperci - de tipul celor din genul Beauveria, care provoac\ micoze teribile d\un\torilor culturilor agricole, sau Arthrobotris, care secret\ un mucilagiu vscos ce efectiv "diger\" nematodele atinse.

2.1. Diversitatea produc]iilor microbieneEste dificil de prezentat, cu garan]ia cuprinderii `n totalitate, marea diversitate de specii microbiene implicate `n biotehnologii, domeniile de utilizare a acestora [i `ntreaga palet\ a produselor ob]inute prin biotehnologiile actuale.Tabelul 2 Principalele produse ob]inute prin biotehnologieMedicin\ [i ind. farmaceutic\ Antibiotice Anticorpi monoclonali Alcaloizi Acizi nucleici Coenzime Compu[i antihelmintici Factori de transfer ai fierului Hormoni Inhibitori enzimatici Interferon Nucleotide, nucleozide Probiotice Reactivi de diagnostic Substan]e antitumorale Substan]e farmacodinamice Vaccinuri Vitamine Agricultur\ [i ind. alimentar\ Aminoacizi Acizi organici Alimente fermentate Arome Biopesticide Biomas\ Conservan]i biologici Clone Enzime Furaje neconven]ionale Genotipuri noi Ionofori Linii izogene Proteine monocelulare Pigmen]i Poliozide Stimulatori de cre[tere Alte industrii Aceton\ Acetaldehid\ Butanol Biogaz (metan) Biopolimeri Coloran]i Etanol Etilen\ Emulsifian]i Hidrocarburi Hidrogen R\[ini Metale recuperate Solven]i Substan]e tensioactive Sisteme depoluante

O list\ (ce r\mne deschis\) cuprinznd principalele produse ob]inute prin biotehnologiile moderne este prezentat\ `n tab. 2, `n timp ce `n tab. 3 este redat\ (dup\ Sasson)(74) o prezentare destul de vast\ a principalelor specii de- 21 -


microorganisme utilizate industrial, avnd `n vedere domeniile de utilizare a lor sau a produselor lor.Tabelul 3 Domenii de utilizare a microorganismelor [i principalele specii microbiene folosite (dup\ Sasson)(74) =========================================== FERMENTAIA ALCOOLIC: Bere (Saccharomyces cerevisiae, Sacch. carlsbergensis, Sacch. uvarum); cidru (Sacch. cidri); vin (Sacch. cerevisiae); sake (Aspergillus oryzae, Lactobacillus [i Leuconostoc spp., Sacch. cerevisiae) [i alte fermenta]ii de suc de fructe, alcooluri albe etc. UTILIZAREA CELULELOR MICROBIENE I PRODUCEREA DE SUBSTANE FIZILOGICE ACTIVE N INDUSTRIA ALIMENTAR I FARMACEUTIC: Prepararea de vaccinuri [i de bioinsecticide microbiene (Bacillus popilliae, Bacillus thuringiensis); drojdie pentru panifica]ie (Saccharomyces cerevisiae, Candida milleri); drojdii pentru furajarea animalelor (Candida utilis, Saccharomycopsis lipolytica); spiruline, chlorelle [i alte alge unicelulare; proteine de organisme monocelulare (Methylophilus methylotrophus, Candida tropicalis, Candida utilis, Saccharomycopsis lipolytica); aminoacizi, mononucleotide (Corynebacterium glutamicum); vitamine: riboflavin\ (Eremothecium ashby), vit. B 12 (Propionibacterium sp., Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricans); carotenoizi: beta-caroten (Blakeslea trispora), astaxantin\ (Phaffia rhodozyma); gibereline (Gibberella fujikuroi). PRODUCEREA DE SOLVENI I DE ACIZI ORGANICI: Alcool etilic (Kluyveromyces fragilis, Sacch. cerevisiae, Zymomonas mobilis); nbutanol [i aceton\ (Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoacetobutylicum); acizi organici: acetic (Acetobacterium woodi, Clostridium aceticum), citric (Aspergillus niger, Saccharomycopsis lipolytica), fumaric, lactic (Lactobacillus delbrueckii). PRODUCEREA DE POLIZAHARIDE: Dextrani (Leuconostoc mesenteroides), levani, manani, xantani (Xanthomonas campestris). PRODUCEREA DE ANTIBIOTICE: Peniciline (Penicillium chrysogenum); cefalosporine (Cephalosporium acremonium); streptomicin\, kanamicine, tetracicline (Streptomyces spp.); gramicidin\ S (Bacillus brevis); polimixina B (Bacillus polymyxa); bacitracin\ (Bacillus subtilis).

- 22 -


DEPOLUARE: Tratarea efluen]ilor industriali, a apelor uzate, a de[eurilor [i gunoaielor; recuperarea [i recircularea de[eurilor biodegradabile. SPLAREA MINEREURILOR I RECUPERAREA METALELOR: Tratarea unor minereuri cu con]inut redus (ex. uraniu) cu solu]ii ce con]in su[e bacteriene litoautotrofe (Thiobacillus thiooxidans, Leptospirillum ferroxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans). MICROORGANISME UTILIZATE LA FABRICAREA BRINZETURILOR: Brnz\ alb\ (Streptococcus lactis, Strept. cremoris, Strept. diacetilactis, Leuconostoc citrovorum); brnzeturi moi: Brie (Strept. lactis, Strept. cremoris, Penicillium camambertii, Brevibacterium linens, Penicillium candidum), Camembert (Strept. lactis, Strept. cremoris, Penicil. candidum, Penicil. camembertii); brnzeturi semitari: Bleu d'Auvergne (Strept. lactis, Strept. cremoris, Penicil. glaucum), Roquefort (Strept. lactis, Strept. cremoris, Penicil. roquefortii), Gorgonzola (Strept. lactis, Strept. cremoris, Penicil. glaucum, Penicil. roquefortii), Munster (Strept. lactis, Strept. cremoris [i Brevibacterium linens); brnzeturi tari: Cheddar (Strept. lactis, Strept. cremoris, Strept. durans, Lactobacillus casei), Edam [i Gouda (Strept. lactis, Strept. cremoris), Gruyere (Strept. lactis, Strept. thermophilus, Lactobacillus helveticus, Propionibacterium shermanii sau Lactobacillus bulgaricus [i Propionibacterium freudenreichii); brnzeturi foarte tari: Parmesan (Strept. lactis, Strept. cremoris, Strept. thermophilus, Lactobacillus bulgaricus). ENZIME I APLICAIILE LOR: Amilaze bacteriene [i fungice : (Bacillus sp., Aspergillus niger, Asp. oryzae) hidroliza amidonului `n dextrine, maltoz\ [i glucoz\; `ndep\rtarea amidonului; zaharificarea substan]elor amilacee pentru fermenta]ia alcoolic\; Proteaze bacteriene [i fungice (Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Aspergillus spp., Sacch. cerevisiae) - liza proteinelor de origine animal\ [i vegetal\, prepararea brnzeturilor, fabricarea sosului de soia [i de condimente pe baz\ de aminoacizi, tratarea pieilor, activan]i digestivi, eliminarea depozitelor de proteine `n b\uturile fermentate, fr\gezirea carnii; Cheag fungic (Endothia parasitica, Mucor sp.) - `nchegarea laptelui; Lipaz\ (Saccharomycopsis lipolytica) - fabricarea untului, activan]i digestivi; Pectinaze fungice (Aspergillus sp.) - limpezirea sucului de fructe, a vinului; Celulaz\ fungic\ (Trichoderma reesii) - hidroliza celulozei; Hemiceluloza fungic\ - hidroliza hemicelulozelor; Inulaz\ bacterian\ [i fungic\ - hidroliza inulinei `n fructoz\; Invertaz\ (Sacch. cerevisiae) - producerea zah\rului invertit pornind de la zaharoz\; Glucozo-izomeraza bacterian\ (Bacillus spp.) - izomerizarea glucozei `n fructoz\, pornind de la amidonul de porumb;- 23 -


Naringinaza fungic\ - `nl\turarea gustului amar; Antocianaza fungic\ - decolorarea sucurilor de fructe; ADN-aza, ribonucleotidaza bacterian\ [i fungic\ - hidroliza ADN, producerea de monodezoxiribonucleotide [i de ribonucleotide, fabricarea de acid inozinic; Glucoz-oxidaza [i catalaza (Corynebacterium spp.) - `nl\turarea oxigenului [i antisepsia alimentelor, fabricarea prafului de ou deshidratat; Uricaz\ de drojdie [i de Streptomyces - descompunerea ac. uric; Aspartaz\ [i fumeraz\ bacterian\ - producerea de acid aspartic, pornind de la acid fumaric [i de acid malic, pornind de la acid fumaric. ===========================================

Produ[ii metabolismului microbian, respectiv produ[ii rezulta]i `n timpul proceselor fermentative pot fi grupa]i `n: metaboli]i primari, metaboli]i secundari, enzime, poliozide capsulare [i biomasa `ns\[i a celulelor microbiene. Metaboli]ii primari sunt compu[i cu greutate molecular\ mic\ (sub 1500 daltoni) absolut necesari dezvolt\rii microbilor, printre cei mai importan]i industrial fiind: aminoacizi, nucleotide, acizi organici, vitamine, alcooli. Ac]ionnd asupra regl\rii metabolice sau/[i efectund modific\ri genetice corespunzatoare, se poate determina producerea de c\tre microbi a unor cantit\]i anormal de mari dintr-un anumit metabolit primar, acest surplus fiind inutil celulei microbiene - care, de altfel, `l [i elimin\ `n mediul de cultur\ - dar util omului. Spre exemplu, s-au ob]inut su[e de Ashbya gossyppii care pot sintetiza de 20 000 de ori mai multa riboflavin\ dect necesarul lor pentru cre[tere, sau su[e de Pseudomonas denitrificans care produc de 50 000 de ori mai mult\ vitamina B12 dect su[ele s\lbatice. Metaboli]ii secundari, numi]i [i "idioli]i", sunt compu[i cu grutate molecular\ redus\ [i care nu sunt indispensabili dezvolt\rii microbilor `n cultur\ pur\, ca: antibiotice (inclusiv substan]e antifungice [i antitumorale), alcaloizi, toxine. Nu toate microorganismele produc metaboli]i secundari. Cele care produc astfel de metaboli]i se caracterizeaz\ printr-o faz\ de cre[tere rapid\ (tropofaza),- 24 -


`n cursul c\reia sinteza substan]ei secundare este neglijabil\; pe masura epuiz\rii uneia dintre substan]ele nutritive esen]iale din mediul de cultur\, cre[terea este tot mai `ncetinit\, tropofazei urmndu-i o noua faz\: idiofaza, `n care se sintetizeaz\ idiolitul. Microbii se pot autoinhiba prin proprii idioli]i: spre exemplu, majoritatea microorganismelor sunt sensibile la antibioticele produse chiar de ele `nsele `n timpul tropofazei, dar devin rezistente `n cursul idiofazei, astfel `nct, dac\ vrem s\ `mpiedic\m microbii s\ se autodistrug\ cu antibioticele produse de ei, trebuie s\ se ajung\ foarte repede la idiofaz\ [i s\ se men]in\ aceast\ faz\ de dezvoltare. Poliozidele capsulare sunt produ[i polimerici microbieni de tipul dextranilor (polimeri ai glucozei) [i xantanilor (asem\natori gumei, utiliza]i `n industria alimentar\, industria textil\, cosmetic\) [i care pot fi sintetiza]i `n cantit\]i `nsemnate de c\tre unele microorganisme (bacterii lactice, Leuconostoc mesenteroides, Xanthomonas campestris) `n condi]ii specifice de mediu. Enzimele sunt macromolecule proteice a c\ror activitate (de biocatalizare) depinde de structura lor primar\, respectiv de secven]a aminoacizilor constitutivi, ceea ce face ca sinteza lor chimic\ s\ nu fie `ntotdeauna posibil\ sau de dorit. Biosinteza enzimelor presupune producerea lor de catre microorganisme aceasta fiind modalitatea cea mai folosit\ - sau extragerea din celule animale sau vegetale - foarte rar. Microbii se preteaz\ foarte bine la producerea enzimelor deoarece cantit\]ile [i concentra]iile acestora pot fi sporite considerabil prin controlarea factorilor de mediu sau prin modificarea genomului microbian. Biomasa proteic\ microbian\ este alc\tuit\ din `ns\[i masa celulara microbian\, fie separat\ din mediul de cultur\, fie `mpreun\ cu acesta. Biomasa proteic\ produs\ prin cultivarea intensiv\ a unor microorganisme poate fi destinat\ att consumului uman ct [i celui animal, `n scopul `mbun\t\]irii valorii proteice a alimenta]iei.- 25 -


Enzimele microbiene [i biomasa proteic\ microbian\ fac obiectul unor urm\toare capitole mai ample, dup\ cum se va putea vedea `n continuare.

2.2. Avantajele produc]iilor microbieneAvantajele produc]iilor microbiene sunt multiple, `ns\ reliefante sunt cele dou\ laturi majore ale acestora: cea economic\ [i cea ecologic\. La acestea se adaug\ un aspect deosebit de important: resursele practic nelimitate, att `n ceea ce prive[te speciile de microorganisme utilizate, materiile prime necesare [i chiar energia utilizat\ (tehnologii energoeconomice), ct [i sub aspectul poten]ialului productiv. Considerentele de natur\ economic\ pot fi hotartoare `n alegerea `ntre sinteza chimic\ sau biosintez\, `n producerea unei substan]e. O importan]\ deosebit\ o are, de la bun `nceput, costul materiei prime; or, dac\ `n sinteza chimic\ materia prim\ este preponderent petrolul (scump [i nu `ntotdeauna la `ndemn\), `n cazul biosintezei prin procese de fermenta]ie, aceast\ materie prim\ este `nlocuit\ de poliozide (amidon, celuloz\) sau de unele reziduuri de la diferite industrii (melase, zer, de[euri celulozice etc.), mult mai ieftine [i mai disponibile. Trebuie luat\ `n considera]ie [i eficacitatea (randamentul) procesului: propor]ia de substrat transformat `n produs final, durata sintezei, gradul de puritate [i costul de recuperare al produsului final; deasemenea, trebuie s\ se ]in\ seama de reducerea costului elimin\rii reziduurilor sau a de[eurilor rezultate din procesele conventionale de fabrica]ie, precum [i de posibilit\]ile de utilizare ulterioar\ a acestora. n majoritatea acestor aspecte, biosinteza se arat\ a fi superioar\ sintezei chimice.

- 26 -


Astfel, microbii se preteaz\ - a[a cum am mai ar\tat -

extraordinar la nu

producerea enzimelor, deoarece concentra]iile acestora pot fi sporite considerabil prin dirijarea factorilor de mediu sau/[i prin modificarea genomului lor; trebuiesc uitate [i alte avantaje: viteza de cre[tere rapid\ a microorganismelor, proprietatea lor de a se dezvolta pe medii ieftine [i ob]inerea de produse practic naturale. `n cazul producerii de aminoacizi, unul dintre avantajele biosintezei rezid\ `n producerea izomerului activ (L-aminoacid), `n timp ce sinteza chimic\ duce la ob]inerea de cantit\]i egale din cei doi izomeri - levogir [i dextrogir; ace[tia sunt greu de separat [i `n consecin]\, produsul ob]inut prin sintez\ chimic\ are o valoare biologic\ mai redus\. Ca urmare, `n prezent, pe plan mondial, peste 80% din cantitatea de lizin\ este produs\ prin biosintez\, iar acidul glutamic este sintetizat numai folosind culturi de Corynebacterium glutamicum [i de Brevibacterium flavum. Datorit\ celor dou\ aspecte amintite ca majore - cel economic, respectiv costuri competitive, [i cel ecologic, respectiv produse a[a-zis "verzi", naturale produsele ob]inute prin biosintez\ microbian\ iau tot mai mult locul celor sintetizate chimic. Mai mult chiar, enzimele de origine microbian\ le `nlocuiesc pe cele de origine animal\ sau vegetal\; astfel, amilazele produse de Bacillus [i de Aspergillus le-au `nlocuit pe cele ob]inute din gru [i orz germinat, `n fabricile de bere, `n panifica]ie [i `n industria textil\, proteaza de Aspergillus a `nlocuit enzimele animale [i vegetale utilizate pentru fr\gezirea c\rnii, proteaze de Aspergillus [i Bacillus licheniformis le `nlocuiesc pe cele pancreatice `n t\b\cirea pieilor [i fabricarea detergen]ilor, reninele de Mucor au `nlocuit cheagul `n prepararea brnzeturilor etc. Faptul c\ utilizarea microorganismelor pe scar\ industrial\ tinde a fi nepoluant\ - ba mai mult, poate participa la bioremedierea mediului `nconjur\tor - 27 -


iar produsele ob]inute pot fi considerate naturale, este un aspect deosebit de important `n condi]iile `n care `n lume, a[a-numitul "eco-business" [i protec]ia mediului au devenit elemente de baz\ ale strategiei intreprinderilor [i ale concuren]ei, iar pia]a este acaparat\ tot mai mult de a[a-numitele "eco-produse" (produse "bio" sau "verzi"). Unii autori consider\ "eco-businessul" ca un posibil nou motor al economiei mondiale, cu cel pu]in dou\ motiva]ii: pe de o parte sensibilitatea crescnd\ a consumatorilor fa]\ de "con]inutul ecologic" a ceea ce cump\r\, deci noua orientare a cererii pie]ei [i adaptarea intreprinderilor la aceasta, iar pe de alt\ parte, cheltuielile enorme pentru `ntre]inerea mediului `nconjurator, excesiv poluat. Ca exemplu, costul diferitelor polu\ri (`n aer, `n ap\, zgomot etc. - apreciate prin consecin]ele asupra san\t\]ii popula]iei, degradarea construc]iilor, daunele forestiere etc.) a fost evaluat pentru anul 1986 la circa 170 de miliarde FF pentru Germania, `n timp ce pentru Fran]a acela[i cost a fost estimat la circa 150 de miliarde FF (echivalentul a circa 3-4 % din produsul na]ional brut al acestei ]\ri) (74). Astfel, o firm\ belgian\ care a adoptat criterii foarte severe pe plan ecologic (firma "Ecover"), [i-a multiplicat pe aceast\ baz\ cifra de afaceri de 10 ori `ntre anii 1988 [i 1989, dublndu-[i-o apoi `n 1990, constituind un exemplu semnificativ pentru bunele perspective ale activit\]ilor economice care ]in cont de preten]iile ecologice moderne.

- 28 -

I.M. POP - Biotehnologii n alimentaia animalelor

3. PRODUSE OBINUTE PRIN BIOTEHNOLOGII, UTILIZATE N ALIMENTAIA ANIMALELORBiotehnologiile ce pot fi aplicate `n cre[terea animalelor sunt de o mare diversitate, `ns\ pot fi eviden]iate dou\ grupe cu importan]\ deosebit\: grupa biotehnologiilor ce intervin `n procesul de reproducere, inclusiv tehnicile de inginerie genetic\ [i respectiv, grupa biotehnologiilor implicate `n producerea de resurse furajere sau de alte substan]e utilizabile `n alimenta]ia animalelor. Din prima grup\ fac parte: biotehnica `ns\mn]\rilor artificiale, a `ns\mn]\rii in vitro [i a transferului de embrioni, biotehnicile de conservare a materialului seminal [i a embrionilor, tehnicile de determinare a sexului embrionilor cu ajutorul anticorpilor monoclonali marca]i, transferul de gene `n celula animal\ [i ob]inerea de animale transgenice, multiplicarea indivizilor valoro[i `ntr-un num\r mare de exemplare identice genetic ("copii") prin clonare etc. Cea de-a doua grup\ men]ionat\ cuprinde biotehnologii ce asigur\ producerea de biomas\ furajer\, proteine neconven]ionale monocelulare, aminoacizi, vitamine, preparate enzimatice, antibiotice, probiotice, acizi organici [i alte substan]e (hormoni, arome, edulcoran]i, coloran]i, etc.) ce-[i g\sesc aplica]ia `n alimenta]ia animal\ modern\. Se consider\ c\ necesarul crescnd de produse de origine animal\ care se manifest\ la nivel mondial este factorul principal care influen]eaz\ [i va influen]a `n continuare cererea de furaje `n mod global, `n timp ce costul diferitelor furaje [i eficien]a utiliz\rii lor determin\ structura cererii de furaje. Or, este sigur c\ biotehnologiile pot [i vor aduce o contribu]ie important\ `n domeniul alimenta]iei animale, fiind implicate att `n m\rirea diversit\]ii, cantit\]ii [i calit\]ii resurselor

- 29 -


furajere, ct [i `n problematica sporirii eficien]ei produc]iei animale [i a ob]inerii de produse animale "naturale" destinate alimenta]iei omului.

3.1. Proteine de origine microbian\ (POM)3.1.1. Aspecte generale privind producerea [i folosirea POMPenuria mondial\ de proteine alimentare este o realitate a timpurilor noastre. Cu toate c\ se are `n vedere o anumit\ cre[tere cantitativ\ a resurselor proteice conven]ionale, ca urmare a dezvolt\rii agriculturii [i zootehniei, `n condi]iile actualei explozii demografice, cnd se estimeaz\ c\ la sfr[itul acestui mileniu popula]ia globului va fi de cel pu]in 6,2 miliarde de locuitori, deficitul proteic se consider\ ca se va accentua. Diverse studii au ar\tat c\ necesarul de proteine pentru asigurarea unei alimenta]ii umane normale este de circa 100 kg/locuitor, ceea ce conduce la estimarea unui necesar mondial anual de peste 500 milioane tone proteine furajere; `n prezent `ns\, produc]ia mondial\ se apreciaz\ c\ nu dep\[e[te 75 milioane tone anual, rezultnd un deficit de peste 425 milioane tone ce trebuie asigurat prin noi tehnologii. Acoperirea acestui deficit de protein\ printr-o produc]ie proteic\ de tip nou, folosind noi resurse, altele dect acelea de care omul s-a servit pn\ acum, reprezint\ o preocupare s-a actual\ de prim ordin. Astfel, cu ajutorul microorganismelor reu[it producerea unor proteine neconven]ionale:

proteinele furnizate de drojdii, bacterii, mucegaiuri sau alge, denumite generic proteine de origine microbian\ (POM).

- 30 -


3.1.1.1. Importan]a, istoricul [i definirea POM Cultura de microorganisme la scar\ industrial\ `n scopul ob]inerii de proteine microbiene care s\ poat\ fi consumate de om sau de animalele domestice, a fost proiectat\ ca o solu]ie a penuriei alimentare existente `n Germania `n timpul primului r\zboi mondial; la Berlin, Delbruck [i colab. - au pus atunci la punct primele procedee de cultivare intensiv\ a drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae), folosit\ la ob]inerea unor preparate alimentare; ulterior, preparate ob]inute din Candida arborea [i Candida utilis au fost folosite `n alimenta]ia germanilor `n timpul celui de-al doilea r\zboi mondial (74). `n cursul anilor '60, expresia "proteine monocelulare" ("proteine de origine unicelular\" - POU), sau "single-cell proteins" (SCP), a fost pentru prima dat\ utilizat\ pentru a desemna produse proteice de origine microbian\ provenind din cultura `n mas\ de levuri sau de bacterii, destinate alimenta]iei animale sau umane. Deoarece majoritatea produselor finite con]in al\turi de proteine [i 25-60 % substan]e neproteice, se consider\ `n prezent, c\ este mai corect a se utiliza pentru acest tip de produse proteice termenul de "single-cell biomass", cel de "single-cell proteins" urmnd a fi folosit numai pentru proteina microbian\ pur\. Majoritatea produselor de acest fel sunt de uz furajer, introducerea lor `n ra]iile de hran\ ale animalelor f\cndu-se, `n primul rnd, `n scopul echilibr\rii proteice a ra]iilor [i cre[terii valorii biologice a acestora. 3.1.1.2. Avantajele producerii POM Utilizarea microorganismelor [i a microalgelor `n scopul producerii de protein\ ofer\ numeroase avantaje, `ntre care [i urm\toarele: - se folosesc materii prime disponibile `n cantit\]i mari, deseori reprezentnd subproduse sau de[euri industriale ieftine (melase, zer, de[euri celulozice, stuf, ape reziduale etc.);- 31 -


- suprafa]a de teren necesar\ ob]inerii unor cantit\]i mari de proteine este foarte mic\; teoretic, ar fi necesari numai 2,5 km2 de suprafa]\ de cultivare microorganic\ pentru a asigura necesarul mondial anual de proteine (79); - se ob]ine un randament net superior oric\ror altor procedee de sintez\ proteic\, datorit\ vitezei mari de multiplicare a microorganismelor; viteza de reproducere [i cre[tere a celulei microbiene este exploziv\, astfel `nct cantitatea de proteine se dubleaz\ `n fiecare or\ (sau chiar mai rapid) [i prin aceasta se realizeaz\ fenomenala rat\ de produc]ie (spre compara]ie, `n cultur\ celulele bacteriene se divid `n 20-60 de minute, celulele de drojdii `n 1,5-2 ore iar celulele animale la aproximativ 24 de ore; pentru a-[i dubla greutatea plantele necesit\ de la una la [ase s\pt\mani de cre[tere, iar broilerul de g\in\ cteva zile); - procesul de produc]ie este controlabil `n cele mai stricte condi]ii, pretndu-se la utilizarea tehnologiilor de vrf, cum sunt automatizarea [i produc]ia asistat\ de calculator; astfel, se poate garanta calitatea produsului finit; - produsele proteice finite ob]inute au un con]inut ridicat `n proteine, cu valoare biologic\ destul de ridicat\; - prin selec]ie [i inginerie genetic\ se pot ob]ine microorganisme cu propriet\]i utile complexe, produsele ob]inute din cultura pur\ a acestora sau din biomasa de cultur\ (inclusiv mediul impur) putnd avea valoare `n nutri]ia animal\ [i din alte puncte de vedere dect aportul de protein\; - este o solu]ie ecologic\, participnd chiar la depoluarea mediului prin utilizarea diferitelor reziduuri industriale. 3.1.1.3. Materii prime utilizate `n producerea POM Materiile prime utilizate `n produc]ia microbian\ de biomas\, proteic\, pot fi grupate `n patru categorii: produse petroliere, metan, alcooli [i glucide. Produsele petroliere (petrol, motorin\, cear\ de parafin\) con]in hidrocarburi saturate aciclice (n-alcani sau n-parafine), care pot fi folosite de unele- 32 -


microorganisme ca unic\ surs\ de carbon [i energie. Dintre microorganismele capabile s\ foloseasc\ astfel de materii prime fac parte: bacteriile din genurile Mycobacterium, Corynebacterium, (C.lipolytica, Micrococcus, Arthrobacter; C.zeylanoides), Brevibacterium, unele drojdii din Torulopsis (T.famata), Pseudomonas, genurile Candida Rhodotorula,

Debaromyces, Pichia ;

mucegaiurile din genurile Penicillium, Aspergillus,

Fusarium, Mucor, Cephalosporium (65). Metanul este un substrat disponibil la un pre] de cost foarte sc\zut `n unele regiuni ale Terrei. Fiind un substrat gazos, metanul ridic\ probleme de construc]ie a bioreactoarelor, dar prezint\ `n schimb, avantajul de a nu l\sa `n produsul finit reziduuri care s\ pun\ probleme sub aspect alimentar, a[a cum este cazul n-parafinelor. Este stabilit prin conven]ie interna]ional\, ca toate microorganismele capabile s\ utilizeze ca unic\ surs\ de carbon [i energie compu[ii cu un singur atom de carbon (cum sunt metanul, metanolul [i metilamina [i exceptnd bioxidul de carbon), s\ poarte denumirea generic\ de "metilotrofe". `n aceast\ categorie intr\ att bacterii ct [i drojdii. Bacteriile metilotrofe sunt Gram-negative, bacilare, nesporulate, strict aerobe [i pot fi `mp\r]ite `n dou\ grupe: - bacterii obligat metilotrofe, care se dezvolt\ numai pe metan, metanol sau metilamin\, grup\ ce include genurile: Methylomonas, Methylosinus, Methylocystis, Methylococcus, Methylobacter, Methylophilus; - bacterii facultativ metilotrofe, capabile s\ utilizeze [i alte surse de carbon [i energie, mai numeroase dect cele din prima grup\ [i apar]innd unor genuri comune, ca: Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces (82).- 33 -


Alcoolii pot fi utiliza]i de numeroase microorganisme, mai curent folosi]i fiind metanolul [i etanolul. Metanolul este o materie prim\ ideal\ pentru producerea de proteine, deoarece este perfect miscibil cu apa, metabolizarea lui necesit\ un consum mai redus de oxigen dect `n cazul hidrocarburilor, nu las\ reziduuri `n celula microbian\ [i poate fi ob]inut la un pre] relativ sc\zut; toate acestea explic\ de ce `n ultimii ani a crescut considerabil interesul pentru utilizarea metanolului ca materie prim\ `n producerea de protein\ microbian\. Pe metanol se dezvolt\ nu numai bacterii metilotrofe ci [i levuri, care nu pot folosi metanul [i metilamina, ci numai metanolul; `n plus, acestea din urm\ mai pot folosi [i alte surse de carbon [i energie (fiind deci, facultativ metilotrofe). Aceste levuri apar]in urm\toarelor cinci genuri: [i Pichia (P.pinus) (82). Glucidele utilizate ca materie prim\ pentru producerea de biomas\ proteic\ microbian\ sunt, `n general, subproduse [i de[euri glucidice de la diferite industrii, ca de exemplu: - subproduse de la industria zah\rului (melasa [i borhotul de melas\). Con]in ca surs\ de carbon zaharoza [i pe acestea se dezvolt\ `n special drojdiile din genul Candida (C.utilis, C.arborea, C.tropicalis) [i mucegaiurile din genul Fusarium; - subproduse de la industrializarea laptelui. Zerul, de exemplu, con]ine ca surs\ de carbon lactoza [i permite cultivarea de drojdii ca: Penicillium roquefortii, Rhizopus oligosporus; Kluyveromyces (Saccharomyces) fragilis, Candida pseudotropicalis [i de mucegaiuri, ca: Candida (C. boidinii, C. methanolica), Hansenula (H. capsulata), Torulopsis (T. glabrata), Kloeckeria

- 34 -


- ape reziduale de la fabricile de amidon. Con]in amidon [i pe acestea se dezvolt\ diferite drojdii [i mucegaiuri (`n cazul drojdiilor, amidonul trebuie `n prealabil hidrolizat cu un preparat enzimatic amilolitic); - de[euri celulozice. Acestea pot fi: a) de[euri celulozice ca atare, cum sunt paiele cerealelor, cocenii de porumb, cojile de floarea soarelui, rumegu[ul de la industrializarea lemnului etc. [i pe care se dezvolt\ fie bacterii celulozolitice din genul Cellulomonas, fie mucegaiuri ca Chaetomium cellulolyticum; b) hidrolizate celulozice, ca de exemplu hidrolizatele de[eurilor celulozice din categoria precedent\, hidrolizatele din stuf, le[iile sulfitice; pe acestea din urm\ se cultiv\ `n special drojdiile din genul Candida (C.utilis, C.tropicalis) (65). 3.1.1.4. Factori de cultur\ importan]i `n producerea POM Produc]ia de proteine cu ajutorul organismelor unicelulare este condi]ionat\ de diver[i factori de cultur\ a acestora, distingndu-se ca importan]\ urm\torii: - utilizarea de specii [i su[e specializate, selec]ionate; - existen]a apei (reprezint\ circa 75% din masa celuei microbiene) [i a unei surse de energie, `n cantit\]i suficiente `n mediul de cultur\; - asigurarea `n mediul de cultur\ a elementelor nutritive `n concentra]ii adecvate (carbon, azot, elemente minerale [i eventuali factori de cre[tere specifici - vitamine sau aminoacizi); - asigurarea factorilor fizico-chimici (pH, temperatur\, concentra]ie ionic\) la valori optime; - asigurarea necesarului de oxigen - pentru bacterii, drojdii, ciuperci, printr-o aerare [i agitare intens\ [i uniform\ a mediului - [i respectiv, de CO2 solubilizat pentru microalge;

- 35 -


- asigurarea unei ilumin\ri optime [i uniforme `n ceea ce prive[te lungimea de und\ [i intensitatea (pentru microalge); - prevenirea spum\rii (exceptnd cazul microalgelor); - prevenirea fenomenelor de infec]ie a mediului cu germeni nedori]i. 3.1.1.5. Condi]ii privind folosirea POM `n scop furajer Utilizarea proteinelor neconven]ionale pune, `ns\, cteva probleme, cele mai importante fiind: 2. eventuala accesibilitatea acestora. Valoarea nutritiv\ este dat\, `n primul rnd, de con]inutul `n protein\ brut\. De regul\, con]inutul `n protein\ brut\ al acestor produse proteice este `n jurul a 50%, minimul acceptat fiind de 35%. Valoarea biologic\ a proteinei de origine microbian\ este, deasemenea, destul de ridicat\; comparativ cu proteina de referin]\ FAO sau cu proteinele din surse clasice (f\in\ de soia, f\in\ de pe[te), proteina microbian\ este bogat\ `n lizin\, dar mai s\rac\ `n aminoacizi cu sulf (tab. 4 [i 5); valoarea biologic\ a proteinei microbiene poate fi crescut\ prin suplimentarea cu metionin\ sintetic\, relativ ieftin\ [i u[or disponibil\. n ceea ce prive[te toxicitatea, Uniunea Interna]ional\ de Chimie Aplicat\ (IUPAC) a stabilit c\ nici o surs\ nou\ de proteine nu poate fi admis\ `n hrana animalelor dect dac\ se constat\ absen]a oric\rei toxicit\]i. toxicologice includ determinarea toxicit\]ii acute, subcronice [i cronice. Deoarece, unii compu[i aromatici policiclici prezen]i `n petrol sunt cunoscu]i ca substan]e cancerigene, dozarea con]inutului biomasei microbiene `n ace[ti compu[i devine absolut necesar\.- 36 -

1. determinarea valorii lor nutritive [i biologice; 3. digestibilitatea; 4. acceptabilitatea [i

toxicitate;

Testele


Tabelul 4 Con]inutul `n aminoacizi esen]iali al proteinelor din fungi, bacterii [i drojdii, comparativ cu alte proteine (`n g/100 g protein\)(dup\ Stancu [i Segal)(79)PROTEINA F.A.O. 2,0 2,8 4,2 4,8 4,2 2,8 2,8 1,4 4,2 FAINA DE SOIA 1,4 5,1 5,4 7,7 6,5 1,4 4,0 1,5 5,0 P R O T E I N A DIN: FUNGI 2,9-3,5 3,6-3,9 3,1-3,6 6,3-8,7 3,3-7,0 2,0-2,8 3,1-5,3 5,0-6,9 DROJDII 3,7 3,6 5,9 7,0 1,2 3,9 0,5 4,0 BACTERII 0,6 2,9 3,6 5,6 6,5 2,0 4,0 0,9 4,5

AMINOACID Cistina Fenilalanin\ Izoleucin\ Leucin\ Lizin\ Metionin\ Treonin\ Triptofan Valin\

Tabelul 5 Compara]ie `ntre con]inutul `n aminoacizi esen]iali al proteinei din drojdia furajer\ BP (British Petroleum) [i al proteinei din f\ina de pe[te (dup\ Dexamir)(18) Aminoacizi (g/ 16 g N) Lizin\ Metionin\ Metionin\ + Cistin\ Triptofan Arginin\ Histidin\ Izoleucin\ Leucin\ Fenilalanin\ Treonin\ Valin\ Protein\ BP 7,8 1,6 2,5 1,3 5,0 2,1 5,3 7,8 4,8 5,4 5,8 F\in\ de pe[te 7,7 2,8 3,6 1,1 5,5 2,5 5,0 7,7 4,3 4,3 5,5

S-a constatat faptul c\, totu[i, drojdiile cultivate pe n-alcani puri con]in cantit\]i minime de compu[i aromatici policiclici [i anume mai pu]in de 5 ppb., respectnd standardele IUPAC - prezentate `n tab. 6.- 37 -


Tabelul 6 Standarde IUPAC privitor la toxicitatea biomasei microbiene (dup\ Raicu)(65) ========================================== Benzopiran (ca indicator al prezen]ei hidrocarburilor aromatice policiclice) ....................maxim 5 ppb. Formaldehid\, metanol ..........................................maxim 20 ppb. Pentru biomasa derivat\ din alcani: - hidrocarburi totale ............................................ maxim 0,5 % - hidrocarburi aromatice totale ............................maxim 0,05 % ========================================== Tabelul 7 Standarde microbiologice IUPAC pentru POU de uz furajer (dup\ Einsele/Raicu)(65) ========================================== Microorganisme num\r/gram produs ========================================== Bacterii viabile (aerobe, total) 100 000 Streptococi grup D 10 000 Clostridia (total) 1 000 Clostridium perfringens 100 Mucegaiuri viabile 100 Enterobacteriacee 10 Staphylococcus aureus 1 Salmonella sp. 1/50 grame ==========================================

n afara toxicit\]ii chimice, din punct de vedere sanitar intereseaz\ [i aspectul microbiologic, respectiv absen]a unor microorganisme patogene `n produsul finit. IUPAC a stabilit [i standarde microbiologice pentru proteina microbian\ folosit\ `n nutri]ia animal\ (tab. 7). Din punct de vedere al digestibilit\]ii, este important de [tiut c\ peretele celular microbian este greu digerabil. Acesta trebuie `n prealabil degradat pentru a favoriza accesul enzimelor digestive. n plus, pere]ii celulari microbieni nedegrada]i pot provoca unele deranjamente gastrointestinale. n cazul drojdiilor, spre exemplu, degradarea peretelui celular se face, uzual, prin plasmoliz\ la 64oC.

- 38 -


Acceptabilitatea `n consum este o problem\ major\ `n utilizarea proteinei microbiene `n hrana omului, `n timp ce la animale conteaz\ mai pu]in, `ndeosebi sub aspectul mirosului [i al gustului. Spre exemplu, proteina furajer\ ob]inut\ din Candida arborea are gustul cel mai pl\cut, urmat\ fiind de Candida utilis, iar dac\ culoarea verde [i gustul de spanac sunt obstacole `n calea accept\rii ca atare a prafului de Chlorella `n alimenta]ia omului, proteina din alge este acceptat\ f\r\ probleme la animale. Accesibilitatea are `n vedere att disponibilitatea, `n cantit\]i mari, a acestor proteine, ct [i aspectul economic, respectiv un cost suficient de redus pentru a putea fi la indemana cat mai multor utilizatori. aspecte. Se apreciaz\ c\ dezvoltarea tehnologic\ a microbiologiei industriale va rezolv\ cu succes aceste

3.1.2. Biomas\ proteic\ din drojdiiDintre toate microorganismele, drojdiile se pare c\ au fost cele mai studiate `n vederea ob]inerii de biomas\, respectiv de proteine. La baza procesului producerii de biomas\ de c\tre drojdii, st\ fenomenul cunoscut sub denumirea de "efect Pasteur", deci inhibarea fermenta]iei prin respira]ie (aerare). Pentru aceasta, drojdia se cultiv\ `n condi]ii de aerare intens\, concentra]ia `n zaharuri din mediu fiind men]inut\ la un nivel sc\zut, pentru a se evita formarea de alcool, `n favoarea producerii de biomas\. Acest principiu a fost aplicat pentru prima dat\ la producerea drojdiei comprimate din Saccharomyces cerevisiae [i st\ [i `n prezent la baza procedeelor folosite `n fabricile de drojdie furajer\ [i alimentar\, care folosesc glucide ca surs\ de carbon.- 39 -


Mai apoi, tehnologiile de cultivare a drojdiilor pe produse petroliere s-au dezvoltat `n dou\ direc]ii: cultivarea pe petrol brut, conform procedeului de la Lav ra, realizndu-se totodat\ [i deparafinarea petrolului [i respectiv, cultivarea pe n-parafine purificate, dup\ procedeul laboratorului Grangemouth din Sco]ia (65). Randamentul de transformare a n-parafinelor `n biomasa culturii de drojdii este apreciat a fi de pn\ la 100%, fa]\ de numai 50% `n cazul glucidelor (76). Societatea British Petroleum (BP) a fost prima care a manifestat interes c\tre sfr[itul anilor 1950 - pentru producerea de biomas\ proteic\ microbian\ pe baz\ de hidrocarburi, prin cercet\rile `ntreprinse la Lav ra [i care vizau `n egal\ m\sur\ deparafinarea motorinei [i producerea de proteine. ntradev\r, petrolul brut care era rafinat la Lav ra con]inea 10-25% parafine; acestea erau degradate de o levur\ din genul Candida, `n fermentatoare `n care era injectat amoniac (ca substrat azotat) [i care men]inea pH-ul `n mediul nesteril. Dup\ faza de cre[tere activ\, levura era separat\ [i recoltat\ iar motorina rezidual\ eliminat\ la fel ca [i lipidele (care reprezentau cca. 10% din biomas\). Uzina din Lav ra ajunsese `n anul 1976 la o capacitate de produc]ie de 20000 de tone anual, produsul comercializat fiind denumit "Toprina" (74). `nc\ din anul 1970, autorit\]ile franceze au eliberat autoriza]ia de folosire `n alimenta]ia animal\ a proteinelor din drojdii crescute pe n-parafine. La sfr[itul anului 1975 a intrat `n func]iune la Sarroch, `n Sardinia, prima uzin\ de mare capacitate (100 000 de tone pe an), apar]innd societ\]ii Italproteine creat\ prin asocierea firmei BP cu o companie italian\; uzina utiliza procedeul de metabolizare a n-parafinelor de c\tre levuri pus la punct `n unitatea BP de la Grangemouth (74). ncepnd din anul 1975, interesul pentru acest domeniu a crescut pe plan mondial, mai ales `n SUA [i `n Japonia, aceasta din urm\ contribuind la- 40 -


construc]ia `n Romnia a unei societ\]i cu o capacitate de produc]ie de 60 000 de tone anual ("Roniprot"). n anul 1980, `n Romnia func]ionau opt uzine, care produceau `n medie, fiecare, circa 1500 tone de proteine anual, pornind de la de[euri industriale, cele mai importante fabrici de drojdie furajer\ fiind cele de la Z\rne[ti, Pite[ti [i Arad - pe le[ii sulfitice -[i cea de la Curtea de Arge[ - pe n-parafine [i metanol. Importan]a produc]iei de gaz natural (metan) din z\c\mintele M\rii Nordului a determinat societatea Shell s\ utilizeze acest substrat ca materie prim\ pentru producerea de proteine POU. Metanul era transformat prin oxidare `n metanol, acesta fiind practic adev\ratul substrat de cultur\ a drojdiilor. Din anul 1973, compania Shell a pus la punct un procedeu de cultur\ microbian\ mixt\ dezvoltat\ direct pe metan, mediul con]innd un microorganism dominant [i alte cteva cu rol simbiont, temperatura (42oC) permi]nd eliminarea majorit\]ii contaminan]ilor bacterieni (74). Producerea de proteine pe baz\ de drojdii folosind ca materie prim\ metanolul a fost dezvoltat\ [i de firmele Hoechst AG (Germania) [i Imperial Chemical Industries (Marea Britanie), iar mai apoi [i de altele. n Fran]a, `nc\ `n anul 1979 trei unit\]i cu o capacitate de 6000 de tone pe an furnizau proteine rezultate din valorificarea lactoserului ca substrat pentru dezvoltarea levurilor, alte dou\ uzine cu capacit\]i de 10 000 de tone proteine din drojdii fiind `n construc]ie. Tot `n Fran]a, o firm\ din Pau a pus la punct un procedeu de cultur\ de levuri pe baz\ de manioc; levura utilizat\, Candida tropicalis, se dezvolta pe amidonul nehidrolizat, cu perioade de cre[tere de circa o or\, putndu-se ob]ine `n acest interval de timp `mbog\]iri ale masei de levur\ de 20-30%. Ca urmare, maniocul avea la sfr[itul opera]iunii un con]inut de proteine crescut la 19%, cu o compozi]ie mult mai bun\ `n lizin\ (7,7%) [i aminoacizi sulfura]i (2,7% metionin\, 2% cistin\)(75).- 41 -


Drojdia furajer\ produs\ pe le[ii bisulfitice se ob]ine prin cultivarea drojdiei Monillia murmanica pe le[iile rezultate de la dezincrustarea acid\ a materiilor celulozice destinate fabric\rii hrtiei, `n timp ce drojdia furajer\ produs\ pe ape reziduale lemnoase se ob]ine prin cultivarea speciei respective `n apele de sp\lare provenite de la industrializarea lemnului; `n ambele cazuri, `ns\, microorganismele se dezvolt\ folosind [i medii nutritive sintetice (50). n SUA au fost definite [i autorizate (`n 1976) de c\tre Association of American Feed Control Officiall (AAFCO) ca ingrediente de uz furajer, opt produse pe baz\ de drojdii (29): 1. Drojdii primare uscate 2. Drojdii brute active uscate 3. Drojdii iradiate uscate 4. Drojdie de bere uscat\ 5. Drojdie uscat\ de la distileriile ce utilizeaz\ cereale 6. Drojdie uscat\ de la distilerii ce utilizeaz\ melas\ 7. Drojdie Torula uscat\ 8. Cultura de drojdie vie ("Yeast Culture") Trebuie remarcat faptul c\ toate aceste produse sunt sub form\ deshidratat\, iar dou\ dintre ele con]in celule viabile de drojdii, capabile de fermenta]ie. F\cnd o trecere `n revist\ a acestor opt produse furajere pe baz\ de drojdii, se eviden]iaz\ urm\toarele aspecte mai importante: - numai circa 1% din produc]ia de drojdie primar\ uscat\ ajunge `n hrana animalelor, mai ales deoarece cost\ prea mult; - drojdia brut\ activ\ uscat\, unul dintre cele dou\ produse cu capacitate cu capacitate de fermenta]ie, este comercializat\ `n principal pentru uz uman sau ca "s\mn]\/maia" folosit\ pentru ini]ierea procesului de cultur\ industrial\ a drojdiilor; - drojdia iradiat\ uscat\, destul de larg utilizat\ anterior anilor '70, inclusiv ca surs\ de vitamine D, este `n prezent mai pu]in produs\ [i folosit\ `n SUA;- 42 -


- drojdia de bere, uscat\, este, probabil, una din cele mai r\spndite surse proteice [i de vitamine din grupa B utilizat\ pentru producerea nutre]urilor combinate, `n special a celor pentru p\s\ri, `n unele cazuri fiind folosit\ chiar ca supliment natural de seleniu. Aceast\ drojdie, considerat\ subprodus al industriei berii, este separat\ [i apoi, pasteurizat\ [i uscat\ la temperaturi ridicate, `n instala]ii speciale. Practic, nu toat\ drojdia de bere este recuperat\ [i uscat\ `n forma izolat\, `ntruct o cantitate redus\ este eliminat\ odat\ cu reziduurile nefolosibile, iar o alt\ parte, destul de `nsemnat\, se amestec\ cu cerealele "uzate", ajungnd `n uzul furajer `mpreun\ cu acestea (gen borhot de bere etc.). Defini]ia din manualul AAFCO precizeaz\ pentru drojdia de bere uscat\, un nivel al proteinei brute de minimum 35 %, insernd [i condi]ia conform c\reia "produsele trebuie s\ fie etichetate `n conformitate cu con]inutul lor `n protein\ brut\"; - drojdia uscat\ provenind de la distileriile de cereale [i cea de la distileriile pe baz\ de melas\ nu sunt att de u[or disponibile industriei de nutre]uri (fiind practic imposibil\ separarea drojdiilor de substrat), astfel c\ aceste drojdii pot ajunge `n hrana animalelor numai `mpreun\ cu masa cerealelor "uzate" rezultate `n urma procesului de distilare; practic, produsul este un concentrat impur din celule de drojdie de panifica]ie cultivate pe melas\, iar cantit\]ile disponibile pentru industria nutre]urilor sunt foarte mici; - drojdia uscat\ Torula, dup\ defini]ia AAFCO, este drojdia din clasificarea botanic\ Torulopsis, nefermentat\ [i uscat\; mai trziu, aceast\ drojdie a fost reclasificat\ `n genul Candida. nutritiv\ de drojdia uscat\ de bere; - "cultura de drojdie" ("Yeast Culture") este definit\ oficial de c\tre AAFCO ca fiind un produs alc\tuit din drojdii [i din mediul pe care acestea s-au dezvoltat, uscat de o asemenea manier\ `nct s\ p\streze activitatea fermentativ\ a- 43 -

Produsul `n cauz\ este apropiat ca valoare


drojdiilor.

Producerea "culturii de drojdie" implic\ `ns\mn]area cu drojdie vie a

gr\un]elor de cereale, incubarea acestui amestec de cultur\ `n condi]ii optime de dezvoltare a drojdiei [i apoi uscarea `ntregii biomase pn\ la un nivel acceptabil de umiditate, f\r\ a se distruge drojdia, enzimele, vitaminele B [i al]i subprodu[i de fermenta]ie, termolabili. Spre deosebire de celelalte produse prezentate, `n cazul "culturii de drojdie" celulele de drojdie nu sunt izolate din mediul lor de cre[tere, produsul finit re]innd tot ceea ce este util (celule vii de drojdie, vitamine, enzime, arome, factori de cre[tere neindentifica]i etc.), fiind `ndep\rtat numai excesul de ap\. Dac\ celelalte produse alc\tuite din celule de drojdii izolate, moarte [i uscate (deci, f\r\ poten]ial fermentativ) sunt folosite `n hran\ numai ca surse de nutrien]i (`ndeosebi de protein\ / aminoacizi), "cultura de drojdie", con]innd drojdii vii, are un poten]ial fermentativ considerabil [i un nivel proteic mai redus (con]ine aproape `ntreg mediul de cultur\), fiind administrat\ mai ales ca adjuvant digestiv, pentru a `mbun\t\]i valorificarea `ntregii ra]ii de hran\; aceste "culturi de drojdii" determin\ efecte benefice mai mult prin influen]area florei tubului digestiv al animalelor `n hrana c\rora sunt administrate, dect prin aportul de protein\, putnd fi catalogate ca probiotice. Exemple de asemenea "culturi de drojdii" sunt produsele denumite comercial "Diamond V Yeast Culture" [i "Diamond V XP Yeast Culture" ale firmei Diamond V Mills, din SUA. (95; 100). Sub aspectul caracteristicilor chimice [i nutritive, produsele proteice ob]inute pe baz\ de drojdii au o variabilitate destul de mare, dependent\ mai ales de substratul utilizat ca mediu de cultur\. Astfel, `n urma unui amplu studiu efectuat pe drojdii furajere provenite din cinci ]\ri (inclusiv Romnia) [i ob]inute pe diverse medii de cultur\, s-a constatat c\ acestea au, `n medie, un con]inut ridicat de proteine (peste 45%), `ns\ o digestibilitate a proteinelor relativ sc\zut\ (cca. 70%) [i o valoare biologic\ a- 44 -


proteinelor deasemenea modest\ (`n jur de 60), ceea ce impune `mbun\t\]irea calit\]ii acestor produse, astfel `nct s\ corespund\ unor indici minimi de calitate (prezenta]i `n tab.8)(70).Tabelul 8 Indici de calitate pentru drojdiile furajere (70)SU % 80 Cenu[\ % 10 Protein\ brut\ % 45-50 Lizin\ % din PB 7 Metionin\ % din PB 1-5 Valoare biologic\ minim 55 CD % proteine 75-80

Tabelul 9 Con]inutul unor produse de uz furajer pe baz\ de drojdii (dup\ Peppler & Stone)(57) CONINUT Substan]\ uscat\ (%) Protein\ brut\ (%) Gr\sime brut\ (%) Fibr\ brut\ (%) Cenu[\ brut\ (%) Extract de azot liber (%) Calciu (%) Fosfor (%) Magneziu (%) Potasiu (%) Tiamin\ (mg)3) Riboflavin\ (mg)3) Niacin\ (mg)3) Ac. pantotenic (mg)3) Colin\ (mg)3) Biotin\ (mg)3) Acid folic (mg)3) Drojdie de bere, uscat\1) 93,7 44,7 0,9 2,7 6,6 38,8 0,1 1,4 0,2 1,7 41,9 16,0 204,0 50,0 1771,3 0,4 4,4 Drojdie Torula uscat\1) 92,7 47,0 1,6 2,5 8,1 33,4 0,5 1,6 0,1 1,8 2,8 20,2 227,5 30,8 1311,8 0,5 10,5 "Yeast Culture"2) 88,5 14,0 2,5 8,0 4,0 60,0 0,2 0,7 1,0 1,6 3,6 3,1 82,2 49,3 1687,9 0,6 0,6

1) - valori din "Canadian Feeds" [i "NAS-NRC Atlas for Nutritional Data of U.S." (1971) 2) - valori raportate de produc\tori 3) - mg/pound (1 pound = 453 g)

- 45 -


Tabelul 10 Caracterizarea chimic\ [i nutritiv\ a drojdiilor furajere (dup\ Milo[ [i Dr`nceanu)(50) MEDIUL DE CULTUR SPECIFICAIE Con]inut chimic brut: Ap\ % Cenu[\ brut\ % Subst. organic\ % Protein\ brut\ % Grasime brut\ % Celuloz\ brut\ % S.E.N. % Lizin\ % Metionin\ % Cistin\ % Triptofan % Treonin\ % Arginin\ % Histidin\ % Fenilalanin\ % Tirozin\ % Glicin\ % Izoleucin\ % Valin\ % Calciu % Fosfor % Vit. B1 mg/kg Vit. B3 mg/kg Valoare nutritiv\ /kg: S.U. kg U.N. P.B.D. - p\s\ri g - porci g - rumeg. g E.M. - p\s\ri kcal - porci kcal - rumeg. kcal E.N. - p\s\ri kcal - porci kcal - rumeg. kcal 0,907 1,23 415 425 411 2179 3391 2898 1453 2024 1733 - 46 0,90 1,21 382 382 3228 2850 1955 1701 0,908 1,04 333 333 3036 2536 1851 1471 0,898 1,30 413 423 3060 1864 9,3 7,5 83,2 47,2 1,4 1,2 33,4 3,6 0,53 0,38 0,42 2,42 1,95 0,90 1,85 0,99 3,18 1,52 2,92 10,0 6,7 83,3 46,5 1,1 35,7 2,65 0,60 0,45 2,97 2,83 0,79 0,76 1,44 3,21 2,70 3,06 77,6 25,7 9,2 8,1 82,7 40,7 0,2 41,8 3,2 0,45 0,29 0,4 1,93 2,38 0,69 1,85 1,48 2,63 2,55 2,34 0,39 1,45 13,6 45,0 10,2 12,3 77,5 50,6 3,4 23,5 2,2 0,4 0,4 3,4 2,08 3,1 0,92 1,5 1,2 1,1 1,2 0,88 0,86 Material lemnos Melas\ Le[ii bisulfitice N-parafine


Se apreciaz\ c\ drojdiile furajere produse pe frac]iuni petroliere au un con]inut `n proteine mai ridicat (65-67%), egalnd f\ina de pe[te att din acest punct de vedere, ct [i prin prisma con]inutului `n aminoacizi (cu excep]ia metioninei). Con]inutul chimic brut al unor produse furajere pe baza de drojdii este prezentat `n tab.9, iar `n tab.10 se prezint\ o caracterizare chimic\ [i nutritiv\ a drojdiilor furajere (dup\ surse bibliografice). Proteina drojdiilor din genul Candida/Torula prezint\ un nivel mai sc\zut `n metionina [i cistin\, acest deficit `n aminoacizi cu sulf determinnd valoarea biologic\ mai redus\ a proteinei drojdiilor comparativ cu proteina laptelui, f\inii de pe[te [i a [roturilor de soia; astfel, de[i digestibilitatea proteinei din drojdii poate ajunge la 90% [i chiar peste, propor]ia de azot re]inut `n corp, din partea digestibil\, este apreciat\ la numai 55% (76). Unele date referitoare la con]inutul `n aminoacizi esen]iali al proteinei din drojdii furajere au fost deja prezentate `n tab. 4 [i 5, `n completare prezentndu-se datele din tab. 11.Tabelul 11 Con]inutul `n aminoacizi al proteinei unor drojdii de uz furajer (dup\ Peppler & Stone)(57)Con]inut: Protein\ brut\ % din care (% din PB) : Lizin\ Metionin\ Cistin\ Arginin\ Glicin\ Histidin\ Izoleucin\ Leucin\ Fenilalanin\ Tirozin\ Treonin\ Valin\ Drojdie de bere, uscat\1) 44,7 6,7 1,5 1,1 4,9 3,8 2,4 4,7 7,1 4,0 3,3 4,7 5,1 Drojdie Torula uscat\1) 47,0 8,1 1,7 1,3 5,5 5,3 3,0 6,3 7,4 6,4 4,4 5,5 6,2 "Yeast Culture"2) 14,0 5,0 2,1 2,1 6,4 5,0 3,5 5,0 10,0 5,0 3,5 4,3 5,7

1) - valori preluate din "NAS-NRC Atlas for Nutritional Data of US" [i "Canadian Feeds" (1971) 2) - valori raportate de produc\tori

- 47 -


Prin degresare se poate m\ri att stabilitatea produselor finite, ct [i propor]ia proteinei brute (pn\ la 78% din substan]a uscat\ a acestor produse). Comparnd compozi]ia chimic\ a f\inii de pe[te cu cea a drojdiilor ob]inute pe substrat de n-parafine separate [i respectiv, pe substrat de motorin\, se constat\ c\ drojdiile crescute pe motorin\ sunt cele mai bogate `n proteine (68,5% PB), cele de pe n-parafine (65,5% PB) fiind apropiate f\inii de pe[te (65% PB); aceea[i ierarhie se constat\ [i `n privin]a con]inutului proteinei `n lizin\, `n timp ce proteina f\inii de pe[te este mai bogata `n metionin\, urmata sub acest aspect de proteina drojdiilor din n-parafine [i apoi de cea a drojdiilor din motorin\ (76). Unii autori (76) afirm\ c\ drojdiile cultivate pe n-parafine au un con]inut mai redus de Ca, P [i Na si mai ridicat de fosfor (disponibil `n totalitate) [i de vitamine B - comparativ cu alte nutre]uri proteice - dar [i c\ pot con]ine substan]e cancerigene, `n timp ce al]ii (18) arat\ c\ drojdiile furajere ob]inute pe medii de hidrocarburi nu con]in vitamina B12, dar au un con]inut ridicat `n celelalte vitamine B [i c\ s-a dovedit prin cercet\ri am\nun]ite faptul c\ sunt inofensive pentru organismul animal [i nu influen]eaz\ calit\]ile gustative ale produselor alimentare de origine animal\. Un caz special `l reprezint\ drojdia Phaffia rhodozyma, o drojdie ro[ie cultivat\ pentru a servi ca surs\ de protein\, dar [i de energie [i pigmen]i carotenoizi, `n alimenta]ia p\str\vilor; extractul ob]inut din aceasta drojdie con]ine 25-3o % protein\ [i 15-25 % gr\sime (`n substan]a uscat\), precum [i o mare cantitate de astaxantin\ (pigment carotenoid cu influen]\ benefic\ asupra culorii c\rnii p\str\vilor). Valoarea nutritiv\ a drojdiilor furajere este apreciata (pe kg) la 1,15-1,20 UN [i 250-500 g protein\ digestibil\, recomandndu-se utilizarea lor `n hrana porcinelor [i p\s\rilor, `n propor]ii limitate la 2-8% din structura nutre]urilor combinate, alaturi de alte surse de proteine; rezultatele ob]inute `n experien]e pe- 48 -


animale de laborator au dovedit faptul c\ folosirea drojdiilor ca unic\ surs\ de protein\ poate duce la necroze, leziuni hemoragice [i infiltrarea gr\soas\ a ficatului. Numero[i autori prezint\ rezultatele unor cercet\ri care atest\ posibilitatea substituirii - par]iale sau totale - `n hrana porcinelor de diferite categorii de vrst\, a nutre]urilor proteice conven]ionale (`n special a [roturilor de soia [i a f\inii de pe[te) cu drojdii furajere ca atare sau suplimentate cu metionin\, f\r\ vre-o influen]\ negativ\ asupra performan]elor productive. Rezultate avnd acelea[i semnifica]ii au fost ob]inute [i la p\s\ri, indicndu-se posibilitatea substituirii par]iale a f\inii de pe[te `n re]etele pentru pui de carne `n prima faz\ de crestere, cu drojdii furajere obtinute pe petrol, f\r\ a se modifica performan]ele puilor, `ndeosebi `n cazul echilibr\rii aminoacizilor sulfurati cu metionin\ sintetic\. Testele de calitate a c\rnii de pui broiler `n hrana c\rora s-au administrat sau nu drojdii furajere ob]inute pe petrol, nu au pus `n eviden]\ diferen]e de aspect, gust, miros sau structur\. Rezultatele unor experien]e indic\ faptul c\ `n cazul substituirii par]iale cu drojdii furajere a f\inii de pe[te [i a [roturilor de soia `n nutre]ul combinat administrat la p\rin]i de g\ini din rase grele, a fost influen]at\ negativ capacitatea de reproduc]ie a coco[ilor, dar nu a fost influen]at\ capacitatea de reproduc]ie a g\inilor [i nici poten]ialul de eclozionare [i de cre[tere al puilor, `n timp ce la g\ini ou\toare (ou\-consum) s-a ob]inut aceea[i produc]ie de ou\ (sau chiar mai mare) ca [i `n cazul utiliz\rii nutre]ului standard, f\r\ a diferi calitatea ou\lor (76). Exist\ [i p\rerea c\ nivelurile mari de drojdii furajere (sub form\ de pulbere) introduse `n nutre]urile combinate favorizeaz\ pr\fuirea acestora [i sf\rmarea granulelor, ceea ce diminueaz\ apetitul (palatabilitatea), respectiv ingesta de furaj [i, `n consecin]\, productivitatea animalelor; acest inconvenient poate fi `nlaturat prin granularea furajului combinat.- 49 -


n fosta U.R.S.S. erau folosite diverse produse proteice furajere pe baz\ de drojdii. Un astfel de produs, denumit "Paprin", bogat `n protein\ (50-60 % PBD), aminoacizi (3,8-4 % lizin\ si 2,5 % treonin\) [i vitamine din complexul B, introdus `n ra]iile monogastricelor (`n propor]ii de 2-3 %), acoper\ integral cerin]ele `n vitamine B [i `n acizi gra[i esen]iali, cu un aport important de P, Fe, Zn, Mn, Cu, Co; valoarea nutritiv\ a "Paprin"-ului era apreciat\ la 1,08 UN/kg (13,28 Mj EM). Un alt asemenea produs, denumit "Eprin", se aprecia c\ poate substitui `n ra]ia animalelor 10-20 % din proteina asigurat\ prin [roturi sau f\in\ de pe[te, f\r\ a influen]a negativ performan]ele de produc]ie. n Romnia, I.B.N.A. Balote[ti a pus la punct tehnologia de producere a unui preparat proteic furajer pe baz\ de drojdii, denumit "Protamid", prin `nmul]irea drojdiei Candida utilis - tulpina 508, pe un mediu avnd la baz\ f\ina de porumb. Produsul ob]inut este de consisten]a laptelui, cu culoare alb-g\lbuie, gust acri[or, avnd 12,37 % SU (din care proteina reprezint\ 18-22 %, dublu fa]\ de gr\un]ele de porumb; de asemenea, con]ine de 3-4 ori mai mult\ lizin\, de peste 2 ori mai mult\ metionin\, glicin\, acid glutamic, tirozin\ [i fenilalanin\, de peste 3 ori mai mult acid aspartic [i mai mult\ tirozin\). Zerul este un mediu de cultur\ foarte bun pentru drojdii, fapt care a determinat utilizarea sa `n scopul producerii de drojdii cu utiliz\ri furajere. Societatea "Bell" din Fran]a a brevetat [i aplicat un procedeu de ob]inere a drojdiilor lactice din zer, pe baza propriet\]ii drojdiei Saccharomyces fragilis de a utiliza lactoza [i acidul lactic `n propriul lor proces de cre[tere [i `nmul]ire, `n anumite condi]ii controlate. nc\ la `nceputul anilor '70, aceast\ societate prelucra zilnic `n brnzeturi fermentate (`n fabrica din Vendome), circa 250000-300000 de litri de lapte de vac\, realiznd `n sec]ia anex\ circa 1500 tone/an drojdii lactice [i lacto-proteine din zer [i zar\. Procesul tehnologic aplicat permitea ob]inerea `n paralel a dou\- 50 -


produse, [i anume: lactoproteine praf (con]innd 60% lactoglobulin\ [i 30% lactalbumin\, cu un randament de 4 kg la 1000 l zer) [i drojdii lactice (ob]inute dup\ separarea proteinelor prin `nmul]irea unor su[e selec]ionate ale drojdiei Saccharomyces fragilis `n mediul (deproteinizat) de zer sau/[i zar\, cu un randament de 17 kg la 1000 litri zer. Drojdiile lactice ob]inute prin acest procedeu, se prezint\ sub form\ uscat\ (94% S.U.), ca o pulbere, con]innd 47% proteine, 9,2% gr\sime, 29,8% glucide [i 8% substan]e minerale. Analizele efectuate `n cadrul INRA - Paris au ar\tat c\ aceste drojdii con]in acizi gra[i esen]iali, vitamine termostabile din complexul B [i vitamina C (77 mg/ 100 g produs). Testarea biologic\ pe vi]ei [i purcei a eviden]iat influen]a pozitiv\ asupra performan]elor productive ale acestora, f\r\ a se constata efecte secundare nedorite (75). Un alt procedeu, denumit "Devos" (dup\ numele inventatorului), const\ `n `mbog\]irea zerului sau zarei cu drojdii ca Saccharomyces cerevisiae, `ns\mn]ate dup\ o prealabil\ pasteurizare a mediului, cu sau f\r\ adaos de [roturi de soia [i `n condi]ii de aerare intens\; produsul finit ob]inut, deasemenea uscat prin pulverizare, are un con]inut `n proteine de circa 3 ori mai redus dect produsul prezentat anterior, fiind inferior [i din punctul de vedere al con]inutului `n aminoacizi esen]iali [i `n vitamine.

3.1.3. Biomas\ proteic\ din bacteriiRitmul extraordinar de reproducere [i cre[tere al bacteriilor (biomasa acestora dublndu-se `n 30 de minute), con]inutul mare `n proteine (aproximativ 50 % din S.U. a biomasei bacteriene), valoarea biologic\ `nalt\ a proteinelor (apreciat\ la 86), digestibilitatea ridicat\ (peste 92 %), ct [i rolul antipoluant jucat- 51 -


de bacterii `n circuitul materie mineral\ - materie organic\ - materie mineral\, au atras aten]ia cercet\torilor asupra posibilit\]ii dirij\rii tehnologice, la nivel industrial, a `nmul]iri

Biotehnologii in alimentatia animalelor

Documents

Transcript of Biotehnologii in alimentatia animalelor