Tehnica PCR
description
Transcript of Tehnica PCR
Tehnica PCR
• Prin tehnica PCR (polymerase chain reaction, reacţia în lanţ a
polimerazei) se pot amplifica in vitro regiuni specifice dintr-o
secvenţă de ADN.
• Delimitarea secvenţelor amplificate se face cu ajutorul a două
secvenţe oligonucleotidice sintetice denumite primeri, care se vor
ataşa la secvenţele complementare din molecula de ADN template
• Amplificarea se face sub actiunea ADN polimerazei în prezenţa
celor patru deoxinucleotidtrifosfaţi (dNTP) : dATP–deoxiadenozin
trifosfat, dTTP–timidin trifsofat, dGTP–deoxiguanozin trifosfat,
dCTP– deoxicitozin trifosfat.
Teoretic, în fiecare ciclu de PCR are loc dublarea cantităţii de secvenţă ţintă (amplicon). Deoarece ambele catene de ADN sunt copiate, are loc o amplificare exponenţială a numărului de copii de ADN.
Etapele reacţiei PCR
A. Denaturarea ADN se face la 94°C timp de 15 secunde -
2 minute. În această etapă are loc separarea celor două catene de ADN.
B. Hibridizarea (annealing-ul) primerilor la secvenţele complementare de ADN
monocatenar are loc la temperaturi cuprinse între 40-60°C, timp de 15-60
secunde.
C. Sinteza ADN se face sub acţiunea ADN polimerazei la 72°C timp
de 1-2 minute, în funcţie de mărimea secvenţei care se va amplifica şi în funcţie
de viteza de polimerizare a enzimei utilizate.
Factorii care influenţează desfăşurarea reacţiei de PCR
1.Secvenţele primeri
trebuie să fie constituiţi, în general, din 18-25 nucleotide
să conţină un procent de 50-60% G şi C
între temperaturile de topire (melting) ale celor doi primeri nu
trebuie sa fie o diferenţă mai mare de 5ºC
Temperatura de topire (melting temperature) reprezintă temperatura la care
modificarea absorbanţei este 50% din cea totală, corespunzătoare unei
denaturări complete.
Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C
temperatura de annealing se calculează astfel încât să fie mai mică
cu 5ºC sub temperatura de melting a celor doi primeri
se evită complementaritatea primerilor care ar duce la formarea unor dimeri şi implicit la apariţia unor artefacte
eventualele structuri palindromice se vor plasa în interiorul primerilor şi în nici un caz la capete deoarece vor aparea structuri secundare - hairpin
la capete este bine ca primerii să conţină nucleotidele G şi C
2. ADN polimeraza şi concentraţia utilizată
a) polimeraze cu activitate autocorectoare (proofreading) 3'-5' (Pfu polimeraza).
Aceste polimeraze au activitate 3'-5' exonucleazică şi pot să elimine nucleotidele
greşit incorporate dintr-o catenă ADN în curs de sinteză. Produşii de PCR
rezultaţi în urma amplificării cu polimeraze cu proofreading au capete drepte.
b) polimeraze care nu au activitate de proofreading (Taq polimearaza)
3. Concentraţia ionilor Mg2+
Ionii de magneziu formează cu dNTP un complex, esenţial pentru polimerizarea
nucleotidelor, deoarece facilitează interacţia dintre primer şi secvenţa ţintă.
4. Cantitatea de ADN template utilizată în reacţia PCR
Dacă se utilizează o cantitate prea mică de ADN template atunci va avea loc o
amplificare scăzută a secvenţei de ADN. În cazul în care se utilizează
cantităţi prea mari de ADN template va avea loc amplificarea nespecifică a ADN.
5. Prezenţa unor inhibitori sau activatori ai reacţiei PCR
Activator Concentraţie
Formamida 5%
Dimetil sulfoxid (DMSO) <10%
Clorura de tetrametilamoniu (TMAC)
10 - 100µM
Polietilenglicol (PEG) 5 - 15%
Glicerol 10 - 15%
Tween 20 0,1 - 2,5%
Aplicaţiile tehnicii PCR
● clonarea ADN – tehnica PCR permite amplificarea secvenţelor de ADN de interes,
fie că aceste secvenţe sunt gene, secvenţe cu rol reglator, etc
● medicină - diagnosticul unor maladii, descoperirea unor noi medicamente etc.
Tehnica PCR este
utilizată pentru a studia
şi a identifica infecţiile virale (HIV, HBV, HCV, HPV etc.)
● arheologie moleculară - examinarea unor specii dispărute şi determinarea relaţiei acestora cu prezentul. ● criminalistică - pentru a identifica criminalii, investigatorii studiază secvenţe unice de ADN la fiecare individ. Aceste secvenţe se numesc Short Tandem Repeats (STR).
● ecologie - integrarea datelor genetice cu diverse date observate pe teren pentru diferite specii pentru a determina sexul animalelor şi al păsărilor, modul în care migrează etc
● identificarea organismelor modificate genetic - aceste organisme modificate genetic reprezintă organisme la care mesajul genetic a fost alterat într-un mod în care aceste modificări nu apar în mod natural.
Pentru a exemplifica practic reacţia de PCR se va amplifica un fragment de 450 pb din gena cyp2d6 utilizând ca template ADN genomic uman.
P1for : 5'-GGAGTGGGTGGTGGATGGTGG-3'P2rev : 5'-CCTCCTGAGCTAGGTCCAGCAGC-3'
GoTaq Flexi ADN polimeraza de la firma Promega. Kitul de amplificare conţine GoTaq polimerază, MgCl2 25 mM, tampon GoTaq Flexi incolor 5x şi tampon GoTaq Flexi colorat (verde). Tamponul colorat conţine doi coloranţi care vor indica poziţia frontului de migrare al probelor în gel de agaroză, un colorant albastru care migrează corespunzător unei benzi de ADN de 3-5 Kb şi un colorant galben care migrează la aproximativ 50 pb.
Mod de lucru1. În tubuşoare sterile de 0.2 mL se pipetează următorii
reactivi:
ReactivProbă
volum (μl)Control volum
(μl)
ADN template <0,5μg -
P1 0,2 μM 0,1–1,0μM
P2 0,2 μM 0,1–1,0μM
dNTP (10 mM fiecare ) 1μl 1μl
GoTaq Polimerază (5 u/μl)
0,25 0,25
Tampon GoTaq Flexi (5x)
10 10
Soluţie MgCl2 (25 mM) 2 2
Apă fără nucleaze z z
Volum final 50 50
2. Se pun probele în aparatul de PCR şi se setează parametrii de funcţionare.
Se utilizează următorul protocol standard de amplificare:
Etapă Temperatură Timp Nr. cicluri
Denaturare iniţială
95°C 2 min. 1
DenaturareAnnealingExtensie
95°C55°C72°C
0,5 min.0,5 min.0.5 min
25-35
Extensie finală 72°C 5 min. 1
Menţinere probe
4°C Nedefinit 1
P1 P2 P3 M