Metodele PCR utilizate pentru determinarile de biologie moleculara

Crearea reac iei n lan a polimerazei, de c tre Mullis i colaboratorii s i n 1983, a revolu ionat ramurile moleculare ale biologiei i medicinei (Saiki et al. 1988, n Somma i Querci, 2004b), nainte de apari ia acestei tehnici putnd fi ob inute doar cantit i infime dintr-un fragment de ADN int . Reac ia PCR permite amplificarea enzimatic face posibil multiplicarea unei singure copii a fragmentului de interes n peste un milion de copii, n doar cteva ore.

Tehnica PCR este esen ial pentru multe procedee de analiz molecular : clonarea unor fragmente specifice de ADN; detec ia i identificarea genelor n vederea diagnostic rii sau investig rii criminalistice; analiza modelelor de expresie genic . n ultimii ani, reac ia PCR a f cut posibil ini ierea cercet rilor n domenii noi precum controlul autenticit ii produselor alimentare, prezen ei ADN-ului MG i a comtamin rii microbiologice.

Constituirea catenei de ADN prin ad ugarea nucleotidelor libere

Etapa 1: denaturareaEtapa 2: alipirea (hibridarea molecular ) primerilorEtapa 3: extensiaFig. 40. Etapele amplific rii PCR: denaturarea, alipirea i extensia.Fig. 40. The three steps of a PCR reaction: denaturation, annealing and extension.Dup Vierstraete (1999) n Somma and Querci (2004b).

Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintro gena de interes sau un patogen specific; produsul amplificat Numarul de copii ale secventei tinta creste exponential cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secventa nucleotidica nou sintetizata constituie o matrita pentru o noua copie. Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentratii foarte scazute ale secventei tinta.

Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente: - ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare; - enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq (izolata din Thermophilus aquaticus) pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza pentru o tinta ARN - care are activitate atat de revers-transcriptaza, cat si de ADN polimeraza (permite realizarea in acelasi amestec de reactie, atat o transcriptie inversa a ARN tinta in ADN complementar - ADNc cat si amplificarea ADNc);

- cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+; - primeri (P1 si P2): secvente scurte, monocatenare, cu lungimea maxima 20-30 nucleotide, care se leaga de o matrita monocatenara prin imperecherea complementara a bazelor; servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata;

- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor la capatul primerilor, complementar cu matrita (observatie: ampliconul va contine deoxiuridina in loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ); - amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului care contine deoxiuridina la inceputul primului ciclu de amplificare si nu degradeaza ADN-ul sau ARN-ul tinta.

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape: 1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94C, ADN-ul tinta este separat (denaturat) in 2 catene; 2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70C, primerii se vor atasa complementar la capetele 3 ale celor 2 catene; Temperatura necesar pentru alipirea primerilor depinde n principal de caracteristicile acestora. Teoretic, aceasta este cu cteva grade mai mic dect Tm, ceea ce asigur formarea unor structuri stabile doar ntre primeri i fragmentele int complementare (Kubista et al., 2006). 3. Elongatia: la temperatura de 72C, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN.

Ultima etap bazele complementare secven ei int sunt ata ate n continuarea primerului, la cap tul 3 al acestuia (reamintim c polimeraza adaug nucleotide n direc ia 5-3, citind secven a int de la 3 la 5). Temperatura optim de func ionare a Taq ADN polimerazei este de aproximativ 72 C, acest nivel fiind utilizat n majoritatea protocoalelor PCR (Kubista et al., 2006). De asemenea pentru majoritatea experimentelor PCR, durata de 30-45 secunde a acestei etape asigur extensia complet a fragmentului de interes, fiind necesar un interval de timp mai lung n cazul n care lungimea secven ei int dep e te 1000 pb.

Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN. La randul sau, procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze: - Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de 100% a reactiei); - Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze; - Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta.

Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). In ultimii ani, tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR).

Instrumentele i componentele necesare reac iilor PCR Dou mari inova ii au permis automatizarea procesului de amplificare PCR (Somma i Querci, 2004b): introducerea ADN polimerazelor termostabile, care nu sunt inactivate la temperaturi ridicate; astfel, cantitatea de ADN polimeraz repartizat ini ial poate ac iona de-a lungul mai multor cicluri PCR; crearea unor blocuri de temperatur a c ror nivel termic poate fi crescut sau cobort rapid, n mod automatizat; un astfel de instrument poart denumirea de thermal cycler sau ma in PCR .

(a)(b)Fig. 41. Thermal cycler-ul. (a) Sistmul de b i marine utilizate pentru experimentele PCR ini iale. (b) Thermal cycler modern (Veriti 384-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems) care permite desf urarea automatizat a amplific rii.Fig. 41. The thermal cycler. (a) The temperature baths used for the initial PCR experiments. (b) Modern thermal cycler (Veriti 384-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems) that allows automatization of the PCR process.Surse: Molecular Station (2009b); Applied Biosystems (2009).

Secven a int Teoretic, amplificarea PCR se poate desf ura dac exist cel pu in o copie intact a secven ei int (Kubista et al., 2006), fiind ns necesar un num r mai mare de copii pentru ca detec ia produsului de amplificare s fie posibil . M rimea acestei secven e poate fi cuprins ntre 0,1 (sau chiar mai pu in, n special pentru realtime PCR) i pn la cteva kilobaze. Cantitatea total de ADN utilizat n mod obi nuit pentru PCR este de 0,05-10 g. De i o prob nu trebuie s fie nalt purificat , cum se impune n cazul altor aplica ii (ex. secven iere), eliminarea unor contaminan i ca polizaharide, polifenoli, lipide, heparin , agen i de chelatizare ai Mg2+, formalin sau detergen i este esen ial pentru desf urarea procesului de amplificare.

Primerii O component foarte important a reac iei PCR este reprezentat de primeri. Secven a acestora influen eaz pozi ia i lungimea produsului de amplificare, temperatura de alipire i cantitatea de produs ob inut (Innis i Gelfand, 1994, n Somma i Querci, 2004b). Proiectarea necorespunz toare a primerilor determin ob inerea unor cantit i reduse de produs sau chiar lipsa produsului de amplificare dorit. Elementele importante pentru construierea primerilor sunt: lungimea; temperatura de alipire; gradul de omologie cu alte secven e dect cea pe care dorim s o amplific m; gradul de complementaritate dintre secven elor primerilor; con inutul G/C; secven ele polipirimidinice (T, C) sau polipurinice (A, G); secven a de la cap tul 3 (Somma i Querci, 2004b).

Lungimea primerilor este cuprins de obicei ntre 16 i 30 nucleotide, iar cu ct aceasta este mai mare alipirea (hibirdarea) se realizeaz mai greu (temperatura de alipire este mai ridicat ), specificitatea reac iei cre te (cu ct secven a este mai lung cu att probabilitatea existen ei unor secven e similare scade), dar se reduce cantitatea de produs acumulat. Temperatura de alipire. O reac ie PCR necesit utilizarea unor primeri cu temperaturi de alipire (hibridare) similare. Dac cele dou temperaturi sunt foarte diferite, amplificarea nu se va desf ura corespunz tor deoarece primerul cu temperatur de hibridare mai ridicat se poate alipi nespecific dac nivelul de temperatur este optim pentru cel lalt primer, iar acesta din urm nu va r mne alipit la temperatura specific primului primer, care este prea ridicat . n practic temperatura de alipire se determin cu ajutorul temperaturii de denaturare (Tm) men ionate anterior.

Regiunile poli-G sau poli-C cresc probabilitatea alipirii nespecifice, iar regiunile poli-T sau poli-A sunt instabile din punct de vedere al leg turilor complexului primer-secven int . Cu toate acestea, trebuie evitat nl n uirea mai multor baze de acela i fel. Ideal, succesiunea nucleotidelor n cadul secven ei primerilor trebuie s fie ntmpl toare, G/C s reprezinte 50%, iar totalul bazelor s fie de aproximativ 20. n aceast situa ie, Tm va fi cuprins ntre 56 i 62 C.

Concentra ia primerilor. Oligonucleotidele sunt utilizate de obicei n concentra ii de 1 M, suficiente pentru 30 cicluri de amplificare. Prezen a unor concentra ii mai mari poate cauza amplificarea unor secven e nedorite. Dac ns concentra ia primerilor n mediul de reac ie este redus , eficien a reac iei PCR va sc dea.

ADN polimeraza Metoda conceput de Mullis utiliza o ADN polimeraz termosensibil , fiind necesar ad ugarea enzimei n mediul de reac ie naintea fiec rei etape de extensie. Introducerea ADN polimerazelor stabile la temperaturi ridicate a u urat mult metodologia de lucru, ad ugarea enzimei dup fiecare etap de denaturare nemaifiind necesar . . Prima ADN polimeraz termostabil utilizat a fost Taq ADN polimeraza, provenit de la bacteria Thermus aquaticus care tr ie te n izvoarele termale din Yellowstone National Park, SUA, la temperaturi de aproximativ 85 C (Saiki et al., 1988, n Somma i Querci, 2004b).

Datorit mediului din care provine, Taq ADN polimeraza func ioneaz optim la o temperatur de 70-80 C i este, probabil, cea mai utilizat polimeraz n aplica iile PCR. Exist i alte tipuri disponibile (ex. Pfu ADN polimeraza, provenit de la Pyrococcus furiosus) i de asemenea diverse companii produc toare pun la dispozi ie o multitudine de versiuni ale aceleia i enzime (ex. n cazul Taq ADN polimerazei: Taq DNA Polymerase i HotStar Taq DNA Polymerase de la Qiagen; Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase de la Fermentas; TaqDNA Polymerase nativ i recombinant , Platinum TaqDNA Polymerase de la Invitrogen; AmpliTaq DNA Polymerase i AmpliTaq Gold DNA Polymerase de la Applied Biosystems; GoTaq Flexi DNA Polymerase de la Promega), modificate i optimizate pentru diferite aplica ii.

Nucleotidele libere Nucleotidele libere reprezint elementele de baz pentru sinteza ADN-ului. Concentra ia acestora trebuie s fie cuprins ntre 20 i 200 M pentru fiecare din cele patru tipuri, n propor ii echivalente, pentru a reduce erorile de ncorporare n moleculele nou sintetizate (Innis et al., 1988, n Somma i Querci, 2004b). Nucelotide nalt purificate sunt furnizate i utilizate ca stocuri, de obicei n amestec.

Solu ia tampon i ionii de Mg De i nu particip direct la desf urarea reac iei de polimerizare, prezen a unei solu ii tampon n mediul de amplificare este indispensabil , aceasta avnd rolul de a asigura un mediu optim, din punct de vedere chimic, pentru activitatea i stabilitatea ADN polimerazei. Compozi ia solu iei tampon este optimizat pentru enzima c reia i este destinat , cei doi reactivi fiind comercializa i sub form de pachet. Cele mai utilizate solu ii tampon con in 10 mM Tris, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5-2,5 mM MgCl2. Acestor componente li se mai pot ad uga i alte substan e, ca PVP, BSA sau glicerol, adjuvan i ce au rolul de a mbun t i modul n care decurge amplificarea.

Reac ii PCR specializate Nested PCR Un experiment de tip nested PCR presupune utilizarea unui set de primeri localizat ntre al i doi primeri pereche, de-a lungul aceluia i fragment de ADN (Figura 42). ntr-o prim reac ie se realizeaz amplificarea cu primerii externi, urmat de amplificarea cu ceilal i doi primeri (Somma i Querci, 2004b). Deoarece fragmentul mai lung, amplificat n prima etap , este utilizat ca matri n cadrul celei de-a doua reac ii, metoda se caracterizeaz printr-o mare sensibilitate i specificitate (Zimmermann et al., 1998, n Angonesi Brod et al., 2007; Somma i Querci, 2004b).

Detec ia genei lectinei de la soia utiliznd un protocol nested PCR

Sensibilitatea cre te datorit reamplific rii regiunii de interes, iar sporirea specificit ii se bazeaz pe probabilitatea extrem de redus ca eventualele fragmente amplificate nespecific n prima etap s fie amplificate nespecific i n cea de-a doua reac ie. A doua reac ie poate fi considerat o strategie de confirmare a identit ii produsului PCR. Sensibilitatea m rit a acestei tehnici este ns susceptibil poten ialelor contamin ri care pot apare n timpul execut rii protoculului. Trebuie deci acordat o aten ie deosebit acestui aspect, mai ales n cazul laboratoarelor de testare.

PCR multiplex PCR-ul clasic presupune utilizarea unei singure perechi de primeri n cadrul unei reac ii, avnd ca rezultat ob inerea unui singur amplicon specific. n cadrul unei reac ii PCR multiplex sunt utilizate mai multe perechi de primeri, fiind amplificate simultan mai multe secve e int . Acest tip de aplica ie s-a dezvoltat n ultimii ani, mai ales dup introducerea unor noi tipuri de polimeraze (Germini et al., 2004). Prezen a mai multor perechi de primeri n acela i mediu de reac ie determin sporirea num rulului de hibrid ri nespecifice i construc ii primer-dimer, amplificarea preferen ial a fragmentelor de ADN mai scurte (Atlas i Bey, 1994, n Somma i Querci, 2004b), precum i reducerea limitelor de detec ie (Germini et al., 2004), f cnd destul de dificil optimizarea protocoalelor de acest tip. Cu toate aceastea, metoda genereaz mult mai mult informa ie, ntr-un timp mai scurt i cu costuri mai reduse dect amplific rile PCR clasice (singleplex) (Germini et al., 2004).

Perechile de primeri trebuie s aib temperaturi de alipire ct mai apropiate. De asemenea este necesar ca lungimea fragmentelor amplificate s fie similar , cele mai scurte fiind amplificate preferen ial. Utilizarea solu iilor tampon cu aditivi speciali reduc de asemenea problemele generate de prezen a unui num r mai mare de primeri.

PCR-ul ARNm prin intermediul revers transcriptazei Amplificarea prin PCR necesita o matrita de ADN bicatenar. Materialul de start pentru aceasta tehnica este ARN. Acesta trebuie intai convertit in ADN bicatenar. Acest rol este indeplinit prin actiunea revers transcriptazei (RT), o enzima izolata din virusurile ARN. Aceasta enzima copie mai intai ARN-ul monocatenar in molecula hibrid ARN:ADN si foloseste o formatiune ac de par la sfarsitul ADN-ului nou sintetizat, inlocuind ARN-ul original din hibrid. Catena dubla de ADN rezultata este numita cADN pentru ADN-ul copiat sau complementar. Ca si alte ADN polimeraze, revers transcriptaza necesita primeri. Primerii specifici, oligo dT sau hexamerii aleatori, sunt adesea folositi ca primeri in sinteza catenei de ADN initiala.

Primerii oligo dT au secvente polyT monocatenare de 18-b-lungime ce vor prima sinteza cADN doar din ARN-ul mesager cu cozi polyA. Legarea cADN va fi mai mare cu primerii oligo dT si pot include tot mARN-ul din specimen. Cea mai reusita legare este indeplinita de hexameri aleatori sau decameri. Acesti sunt oligomeri monocatenari in lungime de 610b se ataseaza de ARN-ul tinta, cu o anumita frecventa. Secventele de 6-10b se vor potrivi cu secventele din ARN-ul tinta cu o anumita frecventa. Hibridarea aleatorie va genera cADN din toate ARNurile (si ADN) din specimen. Pentru toate strategiile de preparare a cADN, specificitatea produsului final este inca determinata de primerii PCR.

RT PCR-ul este utilizat pentru quantificarea expresiei genelor. In detectarea rARN, in analizarea regiunilor genelor intrerupte de intronii lungi, si de detectarea microorganismelor cu genomuri ARN. Pentru analizele de expresie a genelor, cantitatea de cADN reflecta cantitatea de transcript din proba.

RT-PCR a fost realizat original in doua etape: cADN sinteza si PCR. Tth ADN polimeraza are activitate mixt RT si de ADN polimeraza, etape ale procedurii RT-PCR. Programul de amplificare este modificat astfel incat sa includa o incubare initiala de 45-50 grade C pentru 30-60 minutes, timp in care RT, face cADN-ul din ARN. Activitatea RT va fi apoi inactivata in primul pas al denaturarii din procedura PCR. Desi RT PCR-ul este frecvent folosit si este de ajutor analizelor moleculare, este subiectul vulnerabilitatii degradarii ARN. Au fost descrise metode pentru amplificarea RTPCR a specimenelor de interes ca tesuturile incluse in parafina; totusi specimenele fixate sunt dificil de analizat. (17)

Introducerea analizei real-time PCR Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de posibilitatea de a detecta produ ii de amplificare odat cu formarea i acumularea acestora (Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004). Sistemul de analiz n timp real folosea EtBr pentru detec ia ADN-ului i un thermal cycler adaptat s iradieze mediul de reac ie cu lumin UV i s nregistreze fluorescen a emis de fluorocrom. Excita ia moleculelor de EtBr i nregistrarea fluorescen ei se realizau la sfr itul fiec rui ciclu de amplificare, dup etapa de extensie. Valoarea intensit ii fluorescente nregistrate i num rul ciclurilor PCR au fost introduse ntr-un grafic care a oferit o imagine a procesului de amplificare, prezentnd acumularea produsului de amplificare n func ie de timp.

Metodologia real-time PCR utilizat ast zi este o mbun t ire a tehnicii ini iale create de Higuchi et al. i reprezint cea mai performant strategie de cuantificare a acizilor nucleici (Cankar et al., 2006; Miraglia et al., 2004, i Anklam et al., 2002, n Engel et al., 2006; Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004; Alary et al., 2002). Pe lng precizia cuantific rii, a crescut i capacitatea de analiz , iar inciden a erorilor i a rezultatelor fals pozitive este mult redus (Cankar et al., 2006; Alary et al., 2002). Deoarece amplificarea i detec ia sunt combinate ntr-o singur analiz (sistem nchis), riscul de contaminare este de asemenea redus. Tehnica este utilizat n special pentru detec ia patogenilor, analiza expresiei genice, analiza polimorfismului determinat de o singur nucleotid (single nucleotide polymorphism/SNP), analiza abera iilor cromozomiale etc.

Real-time PCR este de asemenea cea mai utilizat i mai precis metod de cuantificare a con inutului MG al diferitelor materii prime sau procesate de origine vegetal destinate consumului alimentar al oamenilor sau animalelor (Cankar et al., 2006; SR EN SO 21570:2006, Kubista at al., 2006; Deisingh i Badrie, 2005).

Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea conventionala: - acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se realizeaza in faza precoce a reactiei, respectiv in faza de crestere exponentiala a amplificarii, cand se produce o dublare exacta a cantitatii de amplicon la fiecare ciclu;

-detectia in acest moment este optima in sensul ca rezultatele se coreleaza mai bine cu nivelul initial al tintei, comparativ cu tehnica PCR conventional, unde detectia are loc in faza de platou, dupa ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze; - domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor); - limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta, avantaj esential, spre exemplu, in evaluarea raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C.

Principiul real-time PCR Tehnica real-time PCR utilizeaz primeri specifici pentru amplificarea secven ei int , iar n tandem cu ace tia, constructe oligonucleotidice (sonde) speciale sau alte tipuri de molecule incluse n mediul de reac ie indic acumularea produsului PCR (Burns et al., 2004). Astfel, de-a lungul mai multor cicluri de amplificare, constructele oligonucleotidice care sunt de asemena specifice secven ei int vor determina modificarea semnificativ a semnalului fluorescent (Burns et al., 2004).

Teoretic, n cadrul amplific rii, acumularea produ ilor PCR se desf oar exponen ial. n practic ns , reac ia nu atinge niciodat eficien maxim . Mai mult, dup 30-40 cicluri de amplificare intervine fenomenul de plafonare (Ahmed, 2002) care afecteaz reac iile n mod independent i diferit (Figura 49).

Daca numarul de copii tinta in PCR sunt dispuse pe un grafic in comparatie cu numarul de cicluri, rezultatul ar fi o curba exponentiala unde numarul de copii tinta = 2N, N fiind numarul de cicluri. Daca numarul de copii este masurat prin detectarea fluorescenta, curba arata similar cu o curba de crestere bacteriana, cu o faza de lag, o faza exponentiala (log), o faza liniara si o faza stationara.

Trebuie remarcat c n ciclurile ini iale semnalul generat este slab i nu poate fi deosebit de semnalul de fond (background signal/fluorescence). Odat cu acumularea unei cantita i mai mari de produs semnalul cre te semnificativ, ridicndu-se deasupra celui de fond (Figura 51). Din acest moment acumularea produsului de amplificare este evident , putndu-se face colectarea datelor pentru analiza cantitativ .

Etapa de plafonare

Curbe de amplificare Faza liniar , semnal de fond

Pentru estimarea eficien ei amplific rii este utilizat tot curba standard Aceasta este construit ntr-un grafic folosind valorile CT (ob inute prin amplificare) aferente probelor standard, n func ie de logaritmul concentra iei num rului ini ial de copii ale secven ei int sau logaritmul factorului de dilu ie (Applied Biosystems, 2001). Pentru fiecare curb standard este calculat i ecua ia de regresie asociat , care descrie rela ia dintre variabilele x (logaritumul concentra iei secven ei int ) i y (CT):

Odat cu desf urarea amplific rii n cadrul unui sistem real-time PCR, semnalul fluorescent din mediul de reac ie este m surat, iar pe baza acestor date se va realiza o reprezentare grafic a acumul rii produ ilor PCR n func ie de num rul ciclurilor de amplificare (Figura 52). Scala pentru fluorescen poate fi normal sau logaritmic , cea de-a doua facilitnd distingerea celor trei faze ale amplific rii, men ionate i n Figura 51: faza ini ial , n care intensitatea fluorescen ei variz foarte pu in, corespunznd semnalului de fond; faza liniar , n care reac ia se desf oar exponen ial iar acumularea ampliconilor este evident ; stadiul de platou (plafonare), n care rata amplific rii se reduce considerabil.

Pragul limit reprezint punctul de echivalen pentru toate reac iile incluse ntr-o analiz ; pragul limit (definit de software) este punctul n care semnalul fluorescent dep e te de zece ori devia ia standard a mediei intensit ii m surate ntre al treilea i al 15-lea ciclu. n acest moment, ntre valoarea CT i logaritmul concentra iei moleculei int exist o rela ie liniar (Burns et al., 2004). n practic , alegerea pragului limit este f cut de c tre operator, reprezentnd unul dintre elementele subiective al analizei real-time PCR. Punctul n care acesta este plasat trebuie ales foarte atent (Figura 52b). n primul rnd trebuie s fie situat n cadrul fazei exponen iale i deasupra semnalului de fond.

Pe scal logaritmic , faza de cre tere exponen ial apare sub forma unei drepte, n timp ce pe o scal normal corela ia ntre rata de acumulare a ampliconilor i alura curbei este mai greu de f cut. De asemenea nivelul de pozi ionare al pragului trebuie ales astfel nct, n acel punct, graficele probelor s fie liniare i paralele, iar cele ale repeti iilor s coincid ct mai mult.

Dup pozi ionarea pragului limit , software-ul calculeaz automat valorile CT. Ciclul pragului limit (threshold cycle/CT) reprezint ciclul PCR n care semnalul fluorescent generat prin amplificarea moleculei int atinge pragul limit definit de software sau de c tre operator (Burns et al., 2004; Rott et al. 2004). Practic, CT reprezint o valoare zecimal , ce exprim num rul de cicluri PCR la care curba de amplificare generat de modificarea intensit ii semnalului fluorescent intersecteaz pragul limit (Corbett Research, 2004; Vatilingom et al., 1999). Corela ia dintre num rul ini ial de copii ale secven ei int i valoarea CT este urm toarea: cu ct cantitatea ini ial de ADN int este mai mare, cu att produsul PCR se acumuleaz i este detectat mai repede, iar valoarea CT este mai mic .

. In cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5 nucleaza-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora (reporter dye R) si la celalat capat cu o molecula blocanta (quencher dye Q). Cat timp sonda este intacta, fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. In cazul in care amplificarea este eficienta, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; in cursul etapei de elongatie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5 endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul.

Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata la sfarsitul fiecarui ciclu de amplificare, fiind proportionala cu cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in momentul respectiv. Inregistrarile sunt folosite pentru generarea unei curbe de amplificare cu 3 regiuni: o regiune de latenta in care acumularea de ADN nu atinge inca punctul limita de detectie a semnalului; o regiune de amplificare exponentiala si o regiune de platou, in care amplificarea secventei tinta inceteaza in special datorita epuizarii enzimei si inhibitiei prin cantitatea mare de ADN.

In cazul determinarii ARN viral hepatita C, procesul se desfasoara intr-un mod similar, dar se adauga si etapa de transcriere inversa a ARN-ului tinta pentru a genera ADN-ul complementar (ADNc). Aceasta etapa este realizata tot de ADN polimeraza, ceea ce permite ca atat transcrierea inversa cat si amplificarea PCR sa se produca impreuna cu detectia in timp real a ampliconului.

SECVEN IEREA ADN Secven ierea const stabilirea compozi iei i ordinii nucleotidelor care compun i caracterizeaz o gen . Acest aranjament permite, cunoa terea de exemplu a amplas rii diferitelor situsuri de restric ie a genelor cu scopul manipul rii lor. n sfr it, traducerea pe calculator a secven elor nucleotidice n secven e de aminoacizi permite eventual, s se confirme sau s se stabileasc func ia proteinei codat prin gen . Exist mai multe tehnici de secven iere a ADN dar se descriu ca principiu de secven ialitate enzimatic prin ncorporare de didezoxinucleotide.

Principiu Sanger Materialul de pornire este un produs PCR purificat. Se utilizeaz o amors de secven complementar cu nceputul secven ei ADN de determinat. Poate fi marcat amorsa n 5' cu dATP cu 32P, 33P, 35S prin intermediul T4 polinucleotidkinazei. Marcarea se mai poate face n timpul reac iei de secven ializare caz n care amorsa nu este marcat dar se utilizeaz un nucleotid marcat.

Pentru secven ializare se pot utiliza dou enzime T7 ADN polimeraza i Taq ADN polimeraza. Principiul de baz este asem n tor pentru ambele enzime. T7 ADN polimeraza Amorsa de seven ializare se hibrideaz prin complementaritate. Amestecul reac ional este repartizat n 4 tuburi marcate GATC. n fiecare tub se adaug T7 ADN polimeraza, cele 4 deoxinucleotide (dATP ...) i cte un dideoxinucleotid diferit (ddATP ...).

T7 ADN polimeraza va ad uga nucleotidele complementare de la extremitatea 3' a amorsei i va continua de la 5' la 3' (la 37C). n timpul acestei polimeriz ri vor fi ncorporate uneori ddNTP n loc de dNTP. Cnd se ncorporeaz un ddNTP polimeraza nu mai poate continua polimerizarea. Didezoxinucleotidele (ddNTPs) sunt dezoxinucleotide (baze) modificate capabile de a se integra ntr-un lan de ADN n sintez , care s mpiedice ncorporarea nucleotidei urm toare. Reac ia se opre te pentru c ddNTP nu posed grupul 3'OH necesar n reac iile de polimerizare cu enzime. Reac ia se va opri pentru cte un ddNTP diferit n fiecare tub. Se ob in n tub produ i de m rime diferit .

Se analizeaz , se depun rezultatele reac iilor de secven ializare pe un gel de poliacrilamid de mari dimensiuni n condi ii denaturante (uree sau formaldehid ). Fiecare tub de reac ie A, G, T, C, va fi depus ntr-un godeu diferit. Deci 4 godeuri pentru o reac ie de seven ializare. Migrarea se face pe gel vertical ntre 2-4 ore, uneori mai mult dup lungimea fragmentelor. Apoi gelul este uscat i expus pentru autoradiografie. Pentru eliminarea urmelor de acrilamid nepolimerizat este necesar o premigrare de 15-30 minute. Fragmentele mai scurte sunt cele mai apropiate de amors . Citirea se face de la fragmentele scurte din partea de jos, c tre cele mai lungi. Sensul de citire este al catenei sens.

Secven ializarea cu Taq polimeraza Acela i principiu dar enzima folosit este diferit , Taq ADN polimeraza. Taq ADN polimeraza nu T7. Tehnica se bazeaz pe principiul PCR asimetric. Se utilizeaz o singur amors n loc de dou , care poate fi intern sau una din cele dou utilizate pentru PCR (n ultimul caz nu trebuie s avem benzi parazite pentru evitarea hibrid rilor nespecifice de amors cu banda anormal ). Reac ia PCR nu este exponen ial , PCR fiind asimetric. Se porne te de la produsul PCR dublu catenar dar produsul monocatenar devine repede majoritar.

Avantaje evit structurile secundare ale ADN de secven ializat. Reac ia ncepe cu denaturarea la 95C nainte de hibridarea amorsei la temperaturi ridicate (40-70C). Reac ia de secven ializare se face ca i pentru PCR, dar cu o singur amors n 30-40 cicluri care constau n denaturare, hibridare, extensie. Este posibil secven ializarea produ ilor subclona i n vectori (plasmide sau fagi). Produsul subclonat va fi secven ializat dup principiul anterior. Amorsa de secven utilizat poate fi complementar vectorului i orientat c tre produsul de secven ializat.

Secven ializarea manual Secven ializarea manual prezint numeroase inconveniente: - riscurile radioactivit ii, necesitatea depunerii probei n mai mul i timpi 2-4 ore ceea ce limiteaz locul pe gel, necesit depozitarea de noi probe. Gelul nu permite depozitarea pentru analize dect a 200 pb. Pentru un fragment de 400 pb este necesar a doua reac ie. pentru autoradiografie este necesar a teptarea revela iei n cazul 35P 48-72 ore. este necesar citirea vizual a gelului care poate da erori. Aceste inconveniente a f cut necesar automatizarea. Un alt mijloc de migra ie n plin dezvoltare este electroforeza capilar

Electroforeza capilar Tehnica de secven ializare este aceea i dar se modific suportul de migrare al produsului de secven ializat. Avantajul major este cre terea considerabil a vitezei de separa ie electroforetic a fragmentului. Gelurile sunt ultrafine i n cmp electric intens permit migra ia n 2,5 ore pentru circa 500 pb n timp ce pe gel clasic necesit 4-6 ore. Se utilizeaz fie geluri de poliacrilamid cu sau f r Bis, fie geluri cu al i polimeri: polivinilalcool, alkilceluloz . n plus aceste geluri pot fi reutilizate de mai multe ori (unii autori au utilizat acela i capilar de 19 ori).

Automatizarea secven ialializ rii Tehnica descris anterior este manual . Se poate nlocui marcajul radioactiv cu cel nereactiv folosind markeri ca rhodamina i deriva ii s i, care emit semnal fluorescent (numi i fluorofori). Se marcheaz fluorescent fie o amors , fie un precursor nucleotidic ad ugat n amestecul reac ional polimeraza va introduce nucleotida fluorescent n reac ia de secven ializare. La sfr itul reac iei amestecurile din fiecare tub sunt depuse n secven ializator autormat fie n acela i godeu (dac markerul fluorescent este diferit pentru cele 4 tuburi, sistemul de detec ie recunoscnd fluorescen ele diferite), fie n 4 godeuri dac markerul este acela i. Gelul este acela i ca i la secven ializare manual opus p r ii inferioare a gelului se g sesc diode sensibile la fluorescen a emis .

Fluorescen a emis este nregistrat automat de calculator. n cazul depunerii ntr-un godeu rezult semnale cu lungimi de und diferite. Secven a d un aspect de succesiune de picuri de culori diferite, fiecare corespunznd unei nucleotide. Odat nceput reac ia, migrarea se poate derula pn a II-a zi. Citirea se face imediat pe grafic i anomaliile se eviden iaz rapid. Rezultatul secven ializ rii poate fi nregistrat ntr-un fi ier de calculator i p stat sau arhivat. Secven ializatorul automat este foarte scump. Odat secven a cunoscut se pot utiliza programe de calculator pentru compararea secven elor, cercetarea exonilor, a situsurilor de restric ie i chiar pentru a prefigura structura proteic cnd s-a secven ializat o gen .