Tehnica PCR

•Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase

chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care

imita capacitatea naturala de replicare a ADN.

•Tehnica consta  in generarea rapida a unor copii

multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau

ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific.

•Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special, iar

amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele

elemente:

- ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei

de prelucrare

- O enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar

de acid nucleic (ADN polimeraza Taq pentru o tinta ADN

sau RTth ADN polimeraza pentru o tinta ARN)

- Cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+

- Primeri (P1 si P2): sunt secvente scurte de20-30

nucleotide; ei servesc ca punct de plecare pentru sinteza

lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei,

marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie

amplificata;

- Deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP):

folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor

la capatul primerilor;

- Amperaza: enzima care promoveaza amplificarea

selectiva a tintei si distrugerea produsilor de

contaminare din cursul reactiilor de amplificare

anterioare

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:

1.Denaturarea

2. Hibridizarea primerilor

3. Elongatia

DENATURAREA ADN-ULUI

• 94-98 ºC, timp de 20-30 de secunde

• ADN-ul dublu catenar este desfasurat in doua

lanturi complementare, de care se vor lega apoi

primerii

• La sfarsitul acestei etape in mediul de reactie

vor fi prezente doua lanturi ADN mono-catenare

HIBRIDIZAREA PRIMERILOR

• Se scade temperatura la 50-65 ºC, timp de 20-

40 de secunde

• Primerii sunt in exces in mediul de reactie

• Se vor atasa complementar la capetele 3’ ale

celor 2 catene

ELONGATIA

• Temperatura depinde de ADN-polimeraza (de

obicei 72ºC)

• ADN-polimeraza:

– Se leaga de lantul hibrid

– „Citeste” secvenţa lantului ADN-tinta

– Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP, pe

baza regulii complementaritatii

Procesul global de amplificare este divizat in 3 faze:

- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de

amplicon ADN;

- Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt

consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii

PCR incep sa se degradeze;

- Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza

alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult

produsii PCR vor suferi o degradare importanta.