Tehnica ELISA

Universitatea Alexandru Ioan Cuza, Iai

Facultatea de Biologie

TEHNICA IMUNOENZIMATIC

Student: Acostchioaiei Cristina

Anul II

Iai2015

Tehnica ImunoenzimaticELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezint la ora actual, una din cele mai des folosite metode, de indentificare i apreciere cantitativ pentru anticorpi, antigene, hormoni, citokine i o palet larg de alte molecule, inclusiv peptide sintetice.

Tehnica ELISA a fost inventat de un grup de cercettori de la Universitatea din Stokholm condus de Peter Perlmann i Eva Engval, acetia publicnd primul articol despre ELISA n 1971. Articolul descria aprecierea cantitativ a IgG n serul de iepure folosind fosfataz alcalin ca enzim de indentificare. Avantaje de siguran crescut i cele economice, fa de testarea radioimun(RIA) au fcut din tehnica imunoenzimatica ELISA una indispensabil pentru domeniul medicinei clinice, biologiei si al biotehnologiei.

PRINCIPIUL METODEI

Principiul metodei, indiferent de tipul de ELISA ales, este n esen acelai i se bazeaz pe reacia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captur este fixat pe un suport solid dup care este pus n contact cu o imunoglobulin, un antigen sau respectiv orice molecul pentru care are specificitate. O enzim cuplat fie direct de imunoglobulin sau de un alt anticorp anti-imunoglobulin degradeaz un substrat cromogen incolor producnd un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o lungime de und corespunztoare.

PUNCTE CRITICE N PROTOCOLUL ELISAn implementarea oricrei tehnici ELISA nelegerea proceselor de baz i aplicarea corect a acestora reprezint un factor esenial n atingerea obiectivului propus.

Etapele fundamentale ale tehnicii sunt reprezentate de:

Prepararea conjugatului

Conjugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate pentru molecula de determinat, cuplat cu o enzim. Cuplarea enzimei se realizeaz prin cross-linkare sub aciunea unor ageni favorizani cum ar fi glutaraldehida, di-iso-cianat toluen, p-benzochinona, etc.

Dei un grup mai mare de enzime au fost utilizate de-a lungul timpului, fosfataz alcalin i peroxidaz din hrean(HRP-/7orserac//s/) peroxidase) rmn cele mai populare datorit randamenului oferit prin prelucrarea rapid a substratului i a gamei vaste de tehnici de developare existente.

Alte enzime folosite n tehnica ELISA sunt (3-galactozidaza, glucozoxidaza, pirofosfataza, etc.

n cazul n care conjugatul folosit este reprezentat de un grup enzim-anticorp, anticorpul respectiv trebuie s fie ales n aa fel nct s recunoasc alt determinant antigenic al moleculei de determinat cum ar fi fragmentul Fc al imunoglobulinei sau alt epitop al antigenului.

Exist o multitudine de protocoale pentru prepararea conjugatului disponibile n literatur dar realizarea acestora presupune experien n domeniu i timp consumat n plus. Mai convenabil este achiziionarea conjugatului de la firme specializate n domeniu.

Fixarea anticorpului sau antigenului de captur pe plac

Pentru pregtirea unei determinri ELISA, pregtirea plcii de reacie este foarte important.Cu toate c diferite tipuri de plci gata pregtite pot fi achiziionate de la productori, acestea pot fi adesea scumpe aa c prepararea plcilor n laborator reprezint nc un punct cheie n tehnica ELISA.

n general se folosesc plci de microtitrare cu 96 de godeuri fabricate din material plastic.Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafee din plastic datorit interaciunilor hidrofobice ntre structurile proteice nepolare i structurile nepolare ale matricei polimerului.

Exist mai multe protocoale de fixare, dar cele mai des folosite, implic incubarea unei diluii a anticorpului sau antigenului de captur n godeul plcii de microtitrare ntr-un tampon carbonat la pH 9-10.

Incubarea poate fi de cteva ore sau peste noapte i se face la 37C sau la temperatura camerei.

Placa de microtitrare astfel pregtit poate fi pstrat la 4C pn la 6 luni.

Deoarece fixarea anticorpilor de plac nu este una specific este necesar blocarea situsurilor de legare nespecific pentru a preveni fixarea celorlali reactani de plac n locul interaciunii acestora cu anticorpul fixat. Blocarea se realizeaz de obicei prin incubarea cu un tampon de blocare, format de obicei dintr-o protein inert i un detergent neionic.

Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat n plac

Adugarea diluiei de antigen sau anticorp n placa de reacie reprezint prima etap efectiv a tehnicii ELISA i nu un pas pregtitor.

n aceast etap molecula de determinat se ataeaz prin legturi de hidrogen, ionice, interaciuni hidrofobice i fore de interaciune van der Waals, de anticorpul/antigenul completentar, de captur.

Incubarea se realizeaz de obicei la temperatura camerei timp de 2 ore.

Cu toate c numrul de legri specifice n timp de 2 ore este de obicei suficient pentru a obine un semnal puternic n reacia cromogen, saturarea situsurilor de legare(starea de echilibru) este atins n aproximatix 5-10 ore, aa c o incubare mai lung poate duce la rezultate mai bune.

ndeprtarea reactanilor liberi din plac (Splarea)

Un pas foarte important n tehnica ELISA l reprezint etapele de splare. Moleculele nefixate fie n timpul aderrii la plac fie n timpul legrilor specifice cu anticorpii de captur trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu inhiba legarea reactanilor ce urmeaz a fi adugai ceea ce ar conduce la un rezultat eronat.

O etap de splare presupune ncrcarea godeurilor cu o anumit cantitate de tampon de splare i ndeprtarea tamponului de splare dup o perioad scurt de timp.

Tamponul de splare este reprezentat n general de o soluie de tampon fosfat salin(TFS) la care se poate adaug 0,05% azid de sodiu(NaN3). Pentru a asigura o splare bun a plcii i implicit o ndeprtare eficient a reactanilor liberi din plac sunt necesare mai multe splri ntre etapele determinrii. La sfritul fiecrei etape de splare, indiferent de numrul de splri din respectiva etap, este bine s se elimine orice urm de tampon de splare din godeuri. Pentru aceasta, placa este ntoars i scuturat energic pe un prosop de hrtie.Foarte importante rmn splrile dup fixarea antigenului pe plac, dup prima incubare i dup incubarea cu soluia de conjugat.

Numrul de splri ntr-o etap poate fi cuprins ntre 2 i 5 dar att timp ct splrile nu sunt fcute ntr-o manier brutal" un numr mai mare de splri nu poate dect s creasc calitatea tehnicii.

Splarea se poate face manual folosind o pipet multichannell sau cu un spltor automat ELISA.La folosirea spltorului automat trebuie acordat atenie deosebit folosirii unor plci recunoscute de aparat i ajustarea setrilor aparatului la tipul de godeuri - cu fundul plat, conic, rotund.

Incubarea conjugatului n plac

n funcie de tipul de ELISA aplicat, adugarea conjugatului n reacie presupune legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific. Ca i n etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat prelungirea timpului de reacie poate oferii un semnal mai puternic. Dup incubare, plcile sunt splate i pot fi pstrate la 4C cteva luni pn la adugarea substratului cromogen.

Adugarea substratului cromogen

Adugarea substratului cromogen reprezint o etap critic n tehnica ELISA deoarece este etapa n care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este de asemenea prima etap n care putem semnala dac vreo etap n protocol a fost executat greit sau unul dintre reactivi nu funcioneaz.

Substratul cromogen este adugat n godeuri i placa este incubat la ntuneric o anumit perioad de timp, n funcie de caracteristicile enzimei i ale substratului, i reacia este oprit prin adugarea unei soluii de stopare.

Timpul de incubare al substratului cromogen n proba cu conjugatul fixat se determin empiric prin observarea modificrii culorii amestecului de reacie pn la o intensitate comparabil cu cea teoretic a produsului final.

Conjugatul poate fi reprezentat de o enzim cuplat cu straptavidin, o protein tetrameric obinut din bacteria Streptomyces avidinii, ce are o afinitate foarte mare pentru biotin(vitamina H). Biotina poate fi cuplat prin diverse procedee la un aticorp i astfel, pe baza afinitii streptavidinei pentru biotin, conjugatul se poate cupla la anticorpul biotinilat fr a fi nevoie de un conjugat enzim-anticorp specific. Aceast procedur este deosebit de important n cazul tehnicilor ELISA sandvi n care se dispune de o cantitate mic de anticorpi monoclonali, folosirea complexului stravidin-biotin amplificnd sensibilitatea analizei de 2-5 ori.

Dei aceast incursiune presupune adugarea de pai la protocolul iniial, efortul este unul recompensat printr-o imbuntire considerabil a sensibilitii analizei. Interpretarea rezultatelor

Const n aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciaz mai nti vizual, pentru determinarea virrii de culoare dup adugarea substratului i stabilirea timpului de meninere a lui pn la stoparea reaciei.

Densitatea optic a fiecrei probei se apreciaz la stectrofotometru, la o lungime de und corespunztoare.Aprecierea rezultatelor se face prin dou metode :

1. Metoda calitativa de apreciere a pozitivitii probelor, prin calcularea valorilor prag (cut off) fa de care se raporteaz absorbanta fiecrei probe. Aceast valoare este determinat corform formulei:

COX+ 2 DS unde CO este valoarea prag (cutt off), X - media valorilor negative, DS este deviaia standard. Probele cu valoarea absorbantei sub limita prag sunt considerate negative iar cele peste aceast valoare sunt considerate pozitive.

2. Metoda cantitativa presupune folosirea unor probe standard, de concentraii cunoscute, cu ajutorul crora se traseaz o curba standard. Aceasta se realizeaz prin introducerea concentrailor probelor standard pe axa X a unui grafic, a valorilor densitilor optice respective pe axa Y i stabilirea punctelor de intersecie. Curba standard se definete ca cea mai apropriat ecuaie liniar care s intersecteze ct mai multe din punctele de pe grafic.

Folosindu-ne de valorile cunoscute putem extrapola o funcie, a relaiei dintre densitatea optic i concentraia probei, prin regresie liniar. Ecuaia obinut fiind de forma:

DO=C*k + DO0 unde DO este densitatea optic a probei, C - concentraia probei, k - constanta, DO0-valoarea absorbantei la o concentraie a probei egal cu 0.Valoarea lui DO0 poate fi calculat n orice program de calcul computerizat printr-o funcie ce returneaz valoarea unei curbe n punctul de intersecie cu axa Y. n Microsoft Excel putem folosi funcia INTERCEPT avnd ca parametri pe de-o parte valorile concentraiilor probelor standard i pe de alt parte valorile densitilor optice respective.

Dup calcularea lui DO0 putem afla valoare lui k i de aici prin rezolvarea ecuaiei obinem formula de calcul a concetraiei probelor n funcie de valoarea densitii optice :

C = (DO - DO0)/k

CLASIFICAREA TEHNICILOR ELISA

Datorit multiplelor aplicaii ale metodei imunoenzimatice ELISA, au aprut diferite protocoale pentru executarea acesteia n funcie de particularitile moleculei de determinat i de modul n care procesele fundamentale ale metodei ELISA se desfoar.

O prima clasificare a tehnicilor ELISA se poate face referitor la modul de fixare al anticorpului la antigenul de captura, astfel facandu-se distincia intre fixare competitiva i necompetitiva.

O alt clasificare se face n funcie de modul direct sau indirect n care conjugatul se fixeaz de antigenul sau anticorpul de captura.

O categorie separat de tehnici ELISA o reprezint tehnicile sandvi, n care un antigen este prins intre 2 sau chiar 3 anticorpi, dintre care primul este cel de captur i ultimul este cel din conjugat.

Tehnica ELISA celular, denumit de unii autori i cELISA reprezint o determinare n care antigenul sau anticopul fie el de determinat sau de captur este o molecul exprimat la suprafaa membranei celulare.Tehnici ELISA folosite curent:ELISA INDIRECT

Aceast tehnic este util pentru determinarea concentraiei anticorpilor serici sau din supernatantul celulelor de tip hibridoma. Metoda se preteaz situailor n care cantiti de ordinul miligramelor din antigenul purificat sau semipurificat sunt disponibile.

Protocolul presupune fixarea antigenului pe fundul plcilor de microtitrare i blocarea situsurilor de legare nespecific, incubarea soluiilor de testat i splarea anticoprilor necuplati din plac dup incubare. Soluia de conjugat (conjugat enzim-anticorp anti-anticorpul de determinat) se adaug n reacie, se incubeaz i o noua etap de splare inlatur conjugatul nefixat din plac. Se adaug substratul cromogen i dup parcurgerea timpului de incubare reacia este stopata. Cantitate de substrat descompus de enzim este determinat prin citire la spectrofotometru. Valorile densitilor optice vor fi direct proporionale cu cantitatea de anticorpi din soluia testata.ELISA COMPETITIV DIRECTAceast tehnic se poate folosii pentru a detectarea calitativa i cantitativa a antigenelor solubile i este indeosebi util cand att antigenul ct i anticorpii specifici sunt disponibil n cantiti de ordinul miligramelor.

Protocolul presupune fixare antigenului de captur pe fundul plcii i adugarea n acelai timp a conjugatului enzim-anticorp specific i a soluiei de testat care conine antigene solubile. Cuplarea conjugatului la antigenul de captur este inhibat de cuplarea la antigenul solubil. Dup incubarea cu amestecul de conjugat i antigen solubil inhibitor, reactanii nefixati sunt indepartai prin splare. Se adaug subtratul cormogen i dup incubare reacia este stopata. Cantitatea de antigen din soluia de testat este direct proporional cu gradul de inhibare al transformrii substratului i poate fi cuantificat prin intrapolare pe o curba de inhibare generat prin realizarea unor diluii seriale ale soluiei standard de antigen.ELISA SANDWICHTehnicile care folosesc principiul anticorpi-sandwich ar putea reprezenta unele din cele mai utile determinri imunoenzimatice pentru determinare antigenelor deoarece frecvent ofer o sensibilitate de 2-5 ori mai mare dect alte tehnici de determinare a antigenului.Protocolul presupune folosirea unor anticorpi specifici de captur fixai pe placa de microtitrare peste care se adaug soluiile de antigen de testat. Dup incubare antigenul nelegat este inlaturat prin splare iar n plac se adaug soluia de conjugat(conjugat enzim-anticorp specific pentru alt epitop al antigenului), etap creia ii urmeaz o noua incubare. Conjugatul nelegat este inlaturat prin splare. Se adaug substratul cromogen i dup parcurgerea timpului de incubare reacia este blocata. Cantitatea de substrat hidrolizat este direct proporional cu cantitatea de antigen din soluia de testat.

ELISA DUBLU-SANDWICH

Tehnic folosit n special pentru detectarea anticorpilor specifici n cazul n care se dispune de o cantitate mic de anticorp specific i nu se dispune de antigen purificat. Tehnica se poate folosi i pentru investigarea poziiei epitopilor diferiilor anticorpi monoclonali formai impotriva unui antigen comun.

Suportul solid este acoperit cu anticorpi anti-imunoglobulina (imunoglbulina provenit de la speciile imunizate). Soluia de anticorpi de testat se incubeaz n plac i la sfrit anticorpii nelegai sunt inlaturai prin splare. Se adaug soluia de antigen i se incubeaz. Dup inc o etap de splare se adaug conjugat enzim-antigen specific i se incubeaz din nou. Conjugatul nelegat este indepartat prin splare i se adaug substratul cromogen.

Probele din godeurile n care apare reacia de culoare sunt desemnate posibil pozitive adic ar putea s conin anticorpi specifici. Verificarea rezultatelor fals pozitive sau a probelor cu o pozitivitate incert se poate face prin retestarea probelor respective. Probele vor fi lucrate n patru exemplare n godeuri n care s-a fixat anticorpul de captura. n doua dintre godeuri se va adaug antigenul iar n celelalte doua doar un tampon de blocare. n toate cele patru godeuri se continua cu adugarea conjugatului i a substratului cromogen. Plcile vor fi citite dup o ora. Acesta procedur va elimina rezultatele fals pozitive obinute pe fondul reaciei dintre anticorpii de testat cu anticorpii din conjugat.

Pentru a distinge rezultatele pozitive dar cu o concentraie mic de anticorpi specifici plcile pot fi citite din nou dup cteva ore sau zile de la adugarea substratului cromogen.ELISA CELULAR DIRECTTehnica este folosit pentru evaluarea prezenei antigenelor sau a receptorilor de suprafaa pe membrana celulelor de testat folosind anticorpi existeni sau ali liganzi specifici antigenelor membranare.

Protocolul presupune determinarea densitii optime a suspensiei celulare per godeu prin analiza intersectat a diluiilor seriale i obinerea suspensiei celulare prin centrifugare i resuspendare n volumul determinat. Un volum fix de suspensie celular este adugat n godeurile plcii de microtitrare, placa este centrifugat i supernatantul este inlaturat. Etapele urmtoare presupun desprinderea butolunul celular i resuspendarea celuleror n conjugatul enzim-anticorp specific anti-molecule membranare. Dup incubare plcile sunt centrifugate i conjugatul nelegat este inlaturat printr-o splare blnda. La acest moment se adaug substratul cromogen.

In timpul etapelor de incubare n prezena conjugatului sau a substratului cromogen placa va fi agitat uor la interval de 15 minute pentru a asigur o buna interaciune intre reactani. Nivelul de exprimare antigenic la suprafaa celular este direct proporional cu nivelul de transformare a substratului.

Celulele eucariote secret cantiti variabile de fosfataz alcalina cea ar putea interfera n tehnica ELISA din aceast cauz o evaluare a cantitii de fosfataz alcalina exprimat de celulele de testat va fi efectuat intr-un experiment preliminar. Dac celulele secret fosfataz alcalina la un nivel ce ar putea interfera cu protocolul de analiza, enzim din conjugat va fi inlocuit cu o alta, cum ar fi 3-galactozidaza.

Celulele folosite pot fi fixate inainte de analiz dar numai dac se poate demonstra c celulele fixate ii pstreaz antigenicitatea membranare. Fixarea se poate face prin suspendarea celulelor intr-o soluie de glutaraldehid 0,5% timp de 30 de minute i splare ulterioare.

Aceast tehnic poate fi la fel de sensibil ca i citometria n flux n cuantificarea nivelului de exprimare antigenic al unei populaii celulare dar spre deosebire de metoda citometric aceast metoda nu face distincia intre populaiile celulare i prin urmare nu poate fi aplicat unei populaii heterogene de celule.ELISA CELULAR INDIRECTAceast tehnic este conceput pentru detectarea anticorpilor specifici impotriva antigenelor mebranare.

Anticorpii anti-antigene membranare sunt detectai prin incubarea celulelor cu o soluie de anticorpi primari de testat. Dup centrifugare i splare pentru inlaturarea anticorpilor nelegai, celulele sunt incubate cu o soluie de conjugat enzim-anticorp secundar(anticorp anti-anticorpul primar). Plcile sunt centrifugate i conjugatul nelegat este inlaturat prin splare. Se adaug substratul cromogen.

Cantitatea de anticorpi primari din soluia de testat este direct proporional cu cantitatea de substrat transformat.

MATERIALE l REACTIVI NECESARI N TEHNICA ELISA

Tehnicile ELISA, indiferent de tipul folosit, necesit n general acelai set de materiale i reactivi, exceptnd evident soluiile de testat i anticorpii, respectiv antigenele, complementare care definesc fiecare protocol n parte.

Lista de materiale i reactivi necesari pentru executarea unei analize ELISA de rutina MATERIALE:

- pipete automate de volume diferite(1 -500ul) i vrfuri corespunztoare;

- pipet multichannel i vrfuri corespunztoare;

- placi de microtitrare corespunztoare modelului experimental;

- piset de plastic;

- spectrofotometru;

- cuve plastic pentru pipeta multichannel; REACTIVI:

- soluie agent de developare (conjugat enzim-anticorp/antigen);

- soluie antigen;

- soluie anticorpi de testat;

- TFS (tampon fosfat salin);

- ap distilat sau deionizata;

- substrat cromogen NPP(p-nitrofenil fosfat) sau TMB(tetrametilbenzidina);

- tampon de blocare a legrilor nespecifice;

- soluie de stopare (NaOH, H2S04)

- tampon de splare;

- tampon de fixare a anticorpilor/antigenelor pe plac;

n cazul tehnicilor ELISA celulare(cELISA) la lista de materiale i reactivi se adaug:

- soluie de suspensie celulare;

- soluie de conjugat enzim-anticorp specific

- tampon de splare, inut pe gheaa;

- placi de microtitrare cu fundul rotund sau conic;

SURSE DE EROARE

Teoretic, orice etap din protocolul ELISA poate reprezenta o sursa de eroare, dar studiile au demonstrat c numai o parte din proceduri pot fi considerate ca surse semnificative de eroare. Aceste proceduri critice sunt pipetarea soluiei de testat i a substratului cromogen i absorbanta inerent a plcilor de microtitrare. Acestea sunt totui probleme de finee pe care le pot intampina pana i cei cu experiena n tehnica ELISA.

Urmeaz o trecere n revist a condiiilor de indeplinit i posibilelor surse de eroare:

Toi reactivii i plcile de microtitrare se aduc la temperatura camerei inainte de utilizare;

Dei tehnica ELISA nu impune condiii de sterilitate, sticlria i consumabilele (vrfuri, cuve, etc.) trebuiesc s fie ct mai curate i far urme de detergeni;

Concentraia reactivului ce urmeaz a fi adsorbit pe suportul solid trebuie determinat pentru fiecare cuplu suport-proteina i pH-ul soluiei trebuie s fie unul adecvat.

Blocarea situsurilor de legare nespecific este o etap foarte important n protocol. Tamponul de blocare asigur att saturarea suprafeei godeului, prevenind astfel fixarea anticorpilor de detecie sau a conjugatului de faza solida, ct i inhibarea legrii anticorpilor specifici la antigenul/anticorpul de captura.

Aranjamentul probelor n plac poate influena rezultatul determinrii. Pentru un protocol de mare precizie este bine s lsam marginile placii(randurile A i H) libere pentru a msura absorbanta plcii iar probele de control, pozitiv i negativ, pot fi distribuite aleatoriu n zone diferite ale plcii (Caciagli i Verderio, 2003).

Diluia probei pozitive cercetate trebuie s corespund unei valori a absorbantei semnificativ pozitive.

Enzima utilizat n conjugat trebuie s aibe o specificitate ridicat i un randament ridicat n transformarea substratului. Este de asemenea important ca problele de testat s nu conin substane care ar putea intefera cu stabilitatea sau activitatea enzimei.

Concentraia conjugatului enzimatic trebuie s corespund celei mai mici valori care asigur vizualizarea complexului format.

Pentru rezultate mai bune, probele se lucreaz n duplicat sau chiar triplicat. Media valorilor absorbantei este folosit pentru determinarea concentraiei probei.

Manevrarea brusc a plcii sau adugarea prea rapid a probelor, tamponului de splare n plac poate duce la desprinderea moleculei de captur de pe suportul solid.

Dac folosii spltorul automat, asigurai-v c aparatul este potrivit pentru tipul de plac folosit i acordai atenie adncimii la care coboar acul de splare n plac. Setarea neadecvat a aparatului poate duce la aspirarea anticorpilor de captura, zgarierea fundului plcii sau chiar la stricarea aparatului. Este de preferat s folosii spltorul automat doar n cazul folosirii unor kituri ELISA cumprate al cror protocol prevede folosirea unui astfel de aparat. Plcile pregtire n laborator pot fi mai sensibile la mecanica spltorului automat i astfel rezultatul protocolului are de suferit.

In cazul folosirii tehnicii cELISA, etapele de splare necesit o atenie deosita. Plcile vor fi mai intai centrifugate la parametrii specificai n protocol i supertanatul trebuie inlaturat cu grija pentru a nu desprinde butonul celular. Adugarea tamponului de splare se va face intr-un mod blnd. La finalul unei etape de splare, placa va fi agitat pentru desprinderea butonulu celular i celulele vor fi resuspendate n reactivul aferent etapei urmtoare. Tamponul de splare trebuie s fie inut pe gheata.

Concentraia soluiei de captur va fi invers proporional faa de concentraia teoretica a soluiei de testat pentru a prevenii legarea conjugatului sau anticorpilor secundari la molecula de captura.

BIBLIOGRAFIE John Wiley and Sons, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Unit 11.2 in Current Protocols in Molecular Biology Supplement 34,1996 Olinescu A., Dolganiuc A., Imunologia practica n clinica i experiment, subcapitolul: Analiza imunoenzimatica ELISA, Ed. Viaa Medicala Romaneasca, Bucureti, 2001