Tatiana ALEXANDRU (TOZAR) G IE OBȚINUȚI ÎN ȚIAlsg.inflpr.ro/Picture/Rezumat teza T. Alexandru...

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

Facultatea de Fizică

Școala Doctorală de Fizică

Tatiana ALEXANDRU (TOZAR)

__________________________________________________________________________

GENERAREA ȘI TESTAREA PRODUȘILOR DE FOTOREACȚIE OBȚINUȚI ÎN

URMA EXPUNERII UNOR SOLUȚII DE MEDICAMENTE LA RADIAȚIA

LASER ___________________________________________________________________________

Rezumatul tezei de doctorat

Conducător științific,

Cercetător Științific Gradul I

Dr. Mihail-Lucian PASCU

București, 2015

INVITATIE

Sunteti invitat(a) in data de 30 septembrie 2015, ora 1100, in Amfiteatrul A4 al

Facultatii de Fizica, sa participati la sustinerea publica a tezei de doctorat cu titlul:

GENERAREA ȘI TESTAREA PRODUȘILOR DE FOTOREACȚIE OBŢINUȚI ÎN URMA EXPUNERII

UNOR SOLUȚII DE MEDICAMENTE LA RADIAȚIA LASER

Tatiana Alexandru (Tozar)

in vederea obtinerii titlului stiintific de doctor in domeniul FIZICĂ

Comisia este formata din:

Presedinte: Prof. Dr. Daniela DRAGOMAN Facultatea de Fizica

Universitatea din Bucuresti

Conducator

stiintific: Prof. Dr. Mihail-Lucian PASCU

INCDFLPR

Facultatea de Fizica

Universitatea din Bucuresti

Membri:

Conf. Dr. Marian BURCEA Universitatea de Medicină și

Farmacie "Carol Davila"

Conf. Dr. Mariana Carmen

CHIFIRIUC

Facultatea de Biologie

Universitatea din București

CS I Dr. Angela STAICU INCDFLPR

Cuvânt înainte

O teză de doctorat reprezintă rareori rezultatul activității unei singure persoane, cel mai

des fiind o consecință a muncii unui grup de cercetători. De aceea, aș dori să mulțumesc

celor care, pe diverse căi, au contribuit la finalizarea acestei teze.

Doresc, în primul rând să adresez respectuoase mulțumiri domnului Prof. Dr. Mihail-

Lucian Pascu, conducătorul științific al tezei, pentru toată încrederea, răbdarea și îndrumarea

permanentă acordată pe întreaga perioadă de desfășurare a doctoratului.

Mulțumesc colegilor mei din cadrul colectivului Spectroscopie Laser, Institutul Național

de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizică Laserilor, Plasmei și Radiației, pentru discuțiile

constructive, prietenie și sprijinul acordat în realizarea experimentelor și în special,

domnișoarei cercetător științific grad I Dr. Angela Staicu pentru sprijinul și discuțiile

permanente acordate pe tot parcursul pregătirii tezei de doctorat.

Doresc să exprim sincere mulțumiri doamnei Conf. Dr. Mariana Carmen Chifiriuc și

doctorandei Marcela Popa (Universitatea din București, Facultatea de Biologie) pentru

sprijinul acordat în testarea susceptibilității micro-organismelor la soluțiile de foto-produși

obținuți ca urmare a interacției radiației laser UV cu soluții de non-antibiotice.

Mulțumesc doamnei Elena Radu din cadrul departamentului Bioresurse al Institutului

Național de Cercetare - Dezvoltare pentru Chimie și Petrochimie pentru ajutorul dat prin

facilitarea efectuării unor experimente din teză.

Mulțumesc membrilor comisiei de examinare: Prof. Dr. Daniela Dragoman (Directorul

Școlii Doctorale de Fizică, Universitatea din București), Conf. Dr. Mariana Carmen

Chifiriuc (Universitatea din București, Facultatea de Biologie), Conf. Dr. Marian Burcea

(Universitatea de Medicină și Farmacie "Carol Davila") și Dr. Angela Staicu (Institutul

Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizică Laserilor, Plasmei și Radiației) pentru

sprijinul și încrederea acordată în calitate de referenți.

Mulțumiri soțului meu, pentru încredere, sprijin moral și spiritual și susținere continuă.

Nu în ultimul rând doresc să adresez mulțumiri familiei mele, în special părinților, pentru

sprijinul moral acordat necondiționat pe toată perioada derulării stagiului de doctorat, că m-au

educat și crescut.

Pentru o perioadă de 17 luni (2014 – 2015), studiile de doctorat au fost finanțate din

Programul Operațional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 „Educația și

formarea profesională în sprijinul creșterii economice și dezvoltării societății bazate pe

cunoaștere”, cu titlul Programe doctorale și postdoctorale - suport pentru creșterea

competitivității cercetării în domeniul Științelor exacte, POSDRU/159/1.5/S/137750.

În paralel, activitățile de cercetare și diseminare a rezultatelor au fost finanțate de către

Ministerul Educației și Cercetării Științifice prin: Programul național Nucleu PN 09 39,

Programul IDEI 71/2011 „Activarea de către lumină a unor sisteme purtătoare de

medicamente pentru livrarea localizată și eliberarea controlată” și Programul Parteneriate

85/2012 „Modelarea și simularea activității pompelor de eflux bacteriene prin metode laser

avansate”.

Tatiana Alexandru (Tozar)

Cuprins

Introducere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Aspecte teoretice și metodologice generale

1 Descrierea proprietăților fizico-chimice și spectrale ale fenotiazinelor

studiate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1 Proprietăți fizico-chimice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1.1 Clorpromazina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.1.2 Tioridazina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Proprietăți spectrale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2 Noțiuni generale despre micro-organismele studiate . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1 Morfologie, fiziologie și patogenitate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2 Rezistența la antibiotice a bacteriilor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.3 Activitatea antibacteriană a fenotiazinelor. . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3 Metode și tehnici experimentale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3.1 Laserul cu Nd:YAG. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3.2 Metode spectroscopice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3.2.1 Spectroscopie de absorbție UV-Vis-NIR. . . . . . . . . . . . . . 6

3.2.2 Spectroscopie de fluorescență indusă laser. . . . . . . . . . . . . 6

3.2.3 Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier. . . . . . . . . 7

3.3 Metode fizico-chimice analitice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.3.1 Studiul tensiunii superficiale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.3.2 Cromatografie în strat subțire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.3.3 Cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă. . . . . 8

3.3.4 Analiza pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

3.4 Metode de testare a susceptibilității bacteriilor la agenți antimicrobieni . . 8

3.4.1 Concentrația minimă inhibitorie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.4.2 Concentrația minimă de eradicare a biofilmului. . . . . . . . . . . 9

Contribuții originale

4 Studiul proprietăților fizico-chimice ale amestecului de foto-produși generați

prin expunerea soluțiilor de fenotiazine la radiație laser UV. . . . . . . . . . 10

4.1 Descrierea sistemului experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

4.2 Analiza clorpromazinei expuse la un fascicul laser emis la 266 nm . . . . 12


4.2.2 Studii de fluorescență și fosforescență. . . . . . . . . . . . . . . 13



4.2.5 Cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă. . . . . 15


4.3 Analiza tioridazinei expuse la un fascicul laser emis la 266 nm. . . . . . . 17


4.3.2 Studii de fluorescență . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18




4.4 Concluzii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

5 Studiul stabilității în timp a soluțiilor de fenotiazine, expuse la radiație laser

UV, utilizând spectroscopia de absorbție UV-Vis-NIR. . . . . . . . . . . . . 21

5.1 Studiul stabilității în timp a clorpromazinei. . . . . . . . . . . . . . . . . 22

5.2 Studiul stabilității în timp a tioridazinei. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

5.3 Concluzii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

6 Studiul susceptibilității micro-organismelor la soluțiile de fenotiazine expuse

la radiație laser UV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

6.1 Descrierea metodelor experimentale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

6.2 Susceptibilitatea micro-organismelor la clorpromazina neiradiată și

iradiată între 1 min și 240 min. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

6.2.1 Analiza concentrației minime inhibitorii. . . . . . . . . . . . . . . 27

6.2.2 Analiza concentrației minime de eradicare a biofilmului. . . . . . 29

6.3 Susceptibilitatea micro-organismelor la tioridazina neiradiată și iradiată

între 1 min și 240 min. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

6.3.1 Analiza concentrației minime inhibitorii. . . . . . . . . . . . . . . 30

6.3.2 Analiza concentrației minime de eradicare a biofilmului . . . . . 33

6.4 Evaluarea toxicității soluțiilor de fenotiazine . . . . . . . . . . . . . . . 34

6.5 Posibile căi de acțiune a clorpromazinei și tioridazinei asupra micro-

organismelor studiate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

6.6 Concluzii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

7 Studiul efectelor radiației laser UV asupra soluțiilor de clorpromazină în

picătură suspendată sau în volum. Aplicații asupra pseudotumorilor induse

în ochi de iepure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

7.1 Analiza clorpromazinei expuse la 266 nm și 355 nm sub formă de

picătură suspendată și în volum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

7.1.1 Descrierea sistemului experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . 37

7.1.2 Analiza cromatografică în strat subțire. . . . . . . . . . . . . . . 38

7.1.3 Analiza fluorescenței induse laser. . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

7.2 Aplicație biologică: pseudotumori induse în ochi de iepuri. . . . . . . . . 42

7.2.1 Descrierea metodei experimentale. . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

7.2.2 Analiza microscopică a țesuturilor pseudotumorale . . . . . . . . 43

7.3 Concluzii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

8 Concluzii generale. Contribuții originale și perspective. . . . . . . . . . . . . 46

Referințe bibliografice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

9 Lista contribuțiilor proprii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

9.1 Lucrări publicate în reviste. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

9.1.1 Reviste cotate ISI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

9.1.2 Reviste non-ISI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

9.2 Lucrări prezentate la conferințe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

9.2.1 Conferințe internaționale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

9.2.2 Conferințe naționale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

9.3 Capitole de cărți . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

1

Introducere Tematica lucrării de doctorat face parte dintr-un studiu mai amplu ce are ca scop dezvoltarea de

noi platforme antimicrobiene și antipseudotumorale ce pot fi utilizate în tratarea infecțiilor

bacteriene sau fungice ce au dezvoltat rezistență la tratamente multiple cu antibiotice și de

asemenea, în tratarea pseudotumorilor. Cunoașterea mecanismelor foto-degradării cât și a naturii

interacțiunilor foto-produs – micro-organism prezintă interes atât pentru industria chimică cât și

pentru cea farmaceutică. În acest sens, este necesar să se înțeleagă în primul rând interacția cu

radiația laser a soluțiilor analizate, care conțin clorpromazină și tioridazină, urmată de stabilirea

relației dintre activitatea antimicrobiană și foto-produșii formați.

Termenul de foto-disociere a unei molecule este definit ca fragmentarea unei legături din

moleculă prin absorbția unuia sau mai multor fotoni. Energia electromagnetică a fasciculului de

lumină este convertită în energie internă, iar dacă energia transferată este mai mare decât cea mai

mică energie de legătură a celei mai slabe legături, atunci în mod inevitabil molecula se va

degrada [1].

Teza este structurată pe 7 capitole precedate de o introducere și urmate de concluziile generale.

Primele 3 capitole fac referire la aspecte teoretice și metodologice generale ce se regăsesc în

literatura de specialitate, legate de fenotiazinele studiate și micro-organismele investigate. De

asemenea, ele cuprind și o descriere generală a metodelor și a tehnicilor experimentale utilizate în

analizarea și identificarea foto-produșilor. Capitolele 4–7 cuprind contribuțiile personale obținute în

urma experimentelor realizate în cadrul laboratorului de Spectroscopie Laser al Institutului Național

de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației, în colaborare cu

departamentul Bioresurse al Institutului Național de Cercetare-Dezvoltare pentru Chimie și

Petrochimie, cu departamentul Imunitate antiinfecțioasă al Institutului Cantacuzino, cu Institutul de

Cercetări al Universității din București și Universitatea de Medicină și Farmacie "Carol Davila".

În Capitolul 1 sunt prezentate aspectele teoretice legate de proprietățile fizico-chimice și

spectrale ale fenotiazinelor studiate, clorpromazina și tioridazina, iar în Capitolul 2 sunt descrise

noțiuni generale despre micro-organismele studiate, precum morfologia, fiziologia și patogenitatea.

Capitolul 3 cuprinde descrierea metodelor și tehnicilor optice de investigare al amestecului de foto-

produși obținuți în urma iradierii cu un fascicul laser UV, cât și a celor analitice utilizate în

identificarea compușilor din amestec.

Începând cu Capitolul 4 lucrarea raportează rezultatele originale obținute și prezentate în cadrul

tezei.

În Capitolul 4 sunt prezentate studiile de foto-degradare a clorpromazinei și a tioridazinei,

ambele la o concentrație de 2 mg/mL, cu scopul de a evidenția modificările foto-chimice obținute în

urma expunerii soluțiilor la o radiație laser emisă la 266 nm de un laser pulsat Nd:YAG. Amestecul

de foto-produși, generați ca urmare a expunerii la radiație laser UV a soluțiilor apoase de

clorpromazină și tioridazină, a fost analizat prin spectroscopie de absorbție UV-Vis-NIR,

fluorescență indusă laser, măsurători de tensiune superficială, spectroscopie în infraroșu cu

transformată Fourier, cromatografie în strat subțire și cromatografie în fază lichidă cuplată cu

spectrometrie de masă.

În Capitolul 5 sunt discutate aspecte legate de stabilitatea în timp a soluțiilor iradiate, cu scopul

de a determina perioada maximă pentru care amestecul de foto-produși nu își modifică proprietățile

de interes și poate fi utilizat în testele in vitro. Această proprietate a fost investigată prin

spectroscopie de absorbție UV-Vis-NIR.

Capitolul 6 cuprinde analiza in vitro a susceptibilității bacteriilor gram-negative și gram-pozitive

și fungilor la foto-produșii generați prin expunerea la radiație laser UV a soluțiilor de medicamente.

Metodele utilizate sunt concentrația minimă inhibitorie și concentrația minimă de eradicare a

biofilmului. De asemenea cuprinde și o evaluare a toxicității amestecului de foto-produși toxicității

2

a fost efectuat un test metabolic, care se bazează pe reducerea unui unei sări de tetrazoliu galbenă,

în celulele viabile, la un precipitat violet (săruri de formazan) ce pot fi ulterior determinate

spectrofotometric.

Capitolul 7 cuprinde studiul efectelor interacției rezonante dintre un fascicul laser emis la

266 nm sau 355 nm și soluția de clorpromazină sub formă de picătură suspendată sau în volum

mililitric. Soluțiile de clorpromazină expuse la radiație emisă la 266 nm pentru diferite perioade de

timp au fost testate pe pseudotumori induse în ochi de iepure.

În Capitolul 8 sunt raportate concluziile generale și sinteza contribuțiilor originale aduse de către

autoare în ceea ce privește generarea și testarea produșilor de fotoreacție. De asemenea, acest

capitol cuprinde perspectivele tezei la momentul actual, în domeniul dezvoltării de agenți

antimicrobieni și antitumorali cu scopul de a lupta împotriva infecțiilor bacteriene și tumorale.

În final este atașată Lista contribuțiilor proprii, ce cuprinde sintetizarea rezultatelor discutate în

această lucrare sub forma articolelor publicate în reviste de specialitate din țară și străinătate și a

expunerilor orale și/sau sub formă de postere în cadrul unor manifestări științifice naționale și

internaționale. În Anexa 1 sunt prezentate lucrările publicate, în copie, în reviste cotate ISI.

3

Aspecte teoretice și metodologice generale

1. Descrierea proprietăților fizico-chimice și spectrale ale

fenotiazinelor studiate

1.1. Proprietăți fizico-chimice

Fenotiazina, este formată dintr-un sistem de două inele heterociclice unite printr-o grupare –NH–

și printr-un atom de sulf (–S–) în partea centrală a inelului (Figura 1.1), și reprezintă molecula

părinte a mai multor derivați heterociclici bioactivi cu proprietăți de interes biologic și farmaceutic

[2]. Formula chimică a fenotiazinei este S(C6H4)2NH.

Figura 1.1: Structura chimică a fenotiazinei: A) 2D și B) 3D

Timp de mulți ani, derivați simpli, mono- sau di- substituiți ai fenotiazinei au fost folosiți în

principal ca coloranți, indicatori și insecticide, însă în același timp au fost investigate și proprietățile

lor în utilizarea ca medicamente pentru diferite tratamente psihoterapeutice. În cazul acestor

derivați, s-a demonstrat că tipul și intensitatea activității neuroleptice depind de poziția

substituentului și capacitatea lui de a dona sau atrage electroni. [2].

1.1.1. Clorpromazina

Clorpromazina este un derivat al fenotiazinei ce prezintă la poziția 2 un atom de –Cl și la poziția

10 o catenă laterală alchil-amino (Figura 1.2), fiind sintetizată pentru prima dată în anul 1950 de

către Paul Charpentier cu scopul de a găsi noi medicamente antihistaminice [3].

Figura 1.2: Structura chimică a clorpromazinei: A) 2D și B) 3D

Clorpromazina este primul antipsihotic descoperit ce acționează ca un antagonist al dopaminei,

fiind utilizat adițional și ca anticoagulant, antialergic, antiserotonergic sau antihistaminic [4].

1.1.2. Tioridazina

Tioridazina este un derivat piperidinic alchil al fenotiazinei. Medicamentul a fost sintetizat

pentru prima dată în anul 1958 și de atunci un număr mare de publicații au apărut cu privire la

caracteristicile clinice, terapeutice, farmacocinetice și chimice ale medicamentului [5].

S

HN

1

2

3

456

7

8

9 10 B A

Cl

S

N

NBA

4

Figura 1.3: Structura chimică a tioridazinei: A) 2D și B) 3D

Prezintă la poziția 2 și la poziția 10, din structura fenotiazinei, (Figura 1.1) o grupare metiltio –

SCH3 și respectiv, o catenă laterală metil-propil-piperidin (Figura 1.3), fiind un medicament

antipsihotic utilizat în tratarea schizofreniei și psihozei [6].

1.2. Proprietăți spectrale

Proprietățile spectrale de absorbție au fost investigate, în diferiți solvenți (acetonitril, metanol,

soluție tampon de fosfat), pentru derivați fenotiazinici cu substituenți la poziția a 2-a și a 10-a

precum 2-clorpromazina clorhidrat, promazina clorhidrat sau tioridazina clorhidrat. Toți compușii

prezintă două benzi de absorbție între 250-265 nm și 300- 320 nm. Astfel, au loc tranziții π→π* în

cazul maximului situat la lungimi de undă mai mici, iar pentru celălalt maxim au loc tranziții n→π*.

Cel de-al doilea maxim se datorează prezenței unei perechi cu un singur electron al atomului de S

din structura fenotiazinei. De asemenea, deplasarea maximului de la 300-320 nm către lungimi de

undă mai mici, observată în cazul utilizării solvenților polari și valoarea mică a coeficientului de

extincție comparativ cu cel al celuilalt maxim confirmă tranziția n→π* [2].

2. Noțiuni generale despre micro-organismele studiate

Bacteriile sunt entități biologice unicelulare complexe, cu caracteristici celulare și genetice

diversificate și care variază în dimensiune și formă. Acestea pot fi de trei feluri în funcție de forma

lor: sferice, sub formă de tijă, sau curbate [7].

Ca și protozoarele, fungii prezintă o structură celulară eucariotă (spre deosebire de forma

procariotă a bacteriilor), cu un nucleu distinct înconjurat de o membrană nucleară și diferite

organite comune celulelor vii de mamifere. Acestea se pot clasifica în trei tipuri de bază: drojdii,

fungi filamentoși sau ciuperci dimorfice. Cele mai multe infecții fungice sunt din fericire rare, cu

excepția persoanelor al căror sistem imunitar este grav afectat de maladii sau medicamente [8].

2.1. Morfologie, fiziologie și patogenitate

Două categorii majore de bacterii patogene sunt cele gram-pozitive și cele gram-negative. Aceste

două tipuri de bacterii diferă fundamental în ceea ce privește membrana celulară. Bacteriile gram-

negative au atât o membrană exterioară cât și una interioară și un perete celular subțire, în timp ce

bacteriile gram-pozitive au doar o membrană interioară și un perete celular gros. Ca urmare, ele

diferă în ceea ce privește absorbția de antibiotic și, astfel, unele antibiotice sunt mai eficiente în

unul dintre aceste grupuri decât în celelalte. Bacteriile gram-pozitive includ Staphylococcus aureus,

Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium și

Clostridium botulinum, iar cele gram-negative includ Escherichia coli, Salmonella enterică, Vibrio

cholerae și Pseudomonas aeruginosa [7].

B

SCH3

S

N

N

H3C

A

5

2.2. Rezistența la antibiotice a bacteriilor

Deși structurile bacteriilor gram-pozitive și gram-negative sunt similare, există câteva diferențe

esențiale. Aceste diferențe influențează capacitatea unui agent antimicrobian de a inhiba creșterea

bacteriilor gram-pozitive sau gram-negative. Cu toate acestea, unii agenți sunt activi împotriva

ambelor tipuri de bacterii și adesea sunt denumiți agenți cu spectru larg [9]. Antibioticele sunt

molecule mici, de obicei, produse de bacterii sau de ciuperci care distrug bacteriile, fără a afecta

persoana sau animalul tratat. Compușii sintetizați chimic sunt uneori numiți agenți antibacterieni

[7].

Rezistența bacteriilor la antibiotice se poate datora producerii unor enzime, beta-lactimice ce rup

inelul și dezactivează antibioticul precum în cazul penicilinei sau atașării unor grupări chimice în

lanțurile antibioticului ce previn ancorarea lui la ribozom (streptomicina). Un alt mecanism

important de rezistență la antibiotice este modificarea locului de legare țintă pentru care există două

posibile modalități: are loc o mutație în genă ce codifică locul de legare al antibioticului sau o

enzimă modifică chimic locul de legare al antibioticului. Un alt mecanism de rezistență destul de

răspândit se bazează pe pompele de proteine încorporate în membrană, numite pompe de eflux. În

unele cazuri, pompele de eflux au scopuri multiple, astfel încât o singură proteină transmembranară

este capabilă să elimine în spațiul extracelular mai multe medicamente diferite. [7].

Multe bacterii pot forma structuri agregate numite biofilme, ce reprezintă un alt mecanism de

apărare important. Organismele din biofilme pot avea adesea proprietăți substanțial diferite față de

cele ale aceluiași organism aflat în stare planctonică. Bacteriile care au agregat în biofilme pot

comunica informații despre mărimea populației și despre stările metabolice [10].

2.3. Activitatea antibacteriană a fenotiazinelor

Proprietățile foto-fizice și fizico-chimice remarcabile ale derivaților fenotiazinici oferă o

varietate de activități biologice și de aplicații în medicină. Prezența a doi heteroatomi, atomii de

azot și sulf, între inelele fenotiazinice joacă un rol important în diversele interacțiuni ale acestor

molecule cu sistemele biologice. Mai mult decât atât, sinteza chimică de noi molecule ce au la bază

ciclurile heteroaromatice fenotiazinice a generat domenii de cercetare cu scopul de a le investiga

proprietățile lor biologice și terapeutice [2].

Fenotiazina și mulți dintre derivații săi posedă diverse activități biologice importante și s-a

dovedit că prezintă proprietăți semnificative: insecticide, antifungice, antibacteriene și

antihelmintice [2]. Mecanismul activităților antibacteriene ale fenotiazinelor a fost investigat pe mai

multe sisteme biologice, inclusiv E. coli și pielea de șoarece. De exemplu, în Ref [11], au testat 17

fenotiazine diferite și au demonstrat că acești compuși nu au efect antibacterian asupra E. coli,

utilizând metoda de difuzie a discului, cu excepția clorpromazinei care afișează o acțiune ușoară de

inhibare a creșterii bacteriilor. Clorpromazina și tioridazina pot reduce susceptibilitatea la oxacilină

a tulpinilor de S. aureus meticilino-rezistent (MRSA), dar nu și a celor de S. auresus meticileno-

sensibil (MSSA) [2].

În afară de aceste proprietăți, s-a demonstrat că clorpromazina acționează ca un inhibitor de

pompe de eflux, având un rol important în lupta împotriva rezistenței bacteriilor la tratamente

multiple cu antibiotice [12] și de asemenea, că acționează ca un stabilizator în cazul tulpinilor S.

aureus și Vibrio cholerae [13]. Clorpromazina scade permeabilitatea membranei celulare pentru

molecule de apă, precum și pentru ionii de sodiu și de potasiu, în timp ce transportul glucozei prin

membrană este alterat, explicând astfel efectul său antimicrobian [13].

În linii generale, toți compușii chimici care prezintă proprietăți cu acțiune moderată până la una

puternică antimicrobiană și nu sunt antibiotice sunt grupate împreună sub denumirea de “non-

antibiotice” [14], astfel fenotiazinele se încadrează cu succes în această clasă.

6

3. Metode și tehnici experimentale

3.1. Laserul cu Nd:YAG

Laserii cu solid folosesc ca mediu activ materiale amorfe, cristaline sau semiconductori și sunt

caracterizați, cu excepția celor cu semiconductori, de medii active ce implică ionii unui element,

prezent într-un procent mic, într-un material solid gazdă [15].

Laserul cu Nd:YAG are mediul activ solid, ce poate să emită atât în undă continuă, în regim de

superpuls, în regim declanșat, cât și în regim de cuplare a modurilor [15]. Mediul activ constă dintr-

un cristal de granat de ytriu – aluminiu dopat cu impurități de Nd, prezente sub formă de matrice de

ioni Nd3+

. Formula chimică a acestuia este Nd: Y3-xAl5O12 având ca variante simplificate

următoarele formule Nd3+: YAG sau Nd:YAG [16].

Laserul pulsat cu Nd:YAG poate fi acordat la lungimea de undă fundamentală de 1,064 µm, însă

prin utilizarea unui cristal dublor se poate genera datorită efectelor optice neliniare a doua armonică

de 532 nm. Prin utilizarea cristalului dublor urmat de unul triplor se poate genera prin însumare de

frecvențe a treia armonică de 355 nm și, de asemenea, prin folosirea a două cristale dubloare în

serie se poate genera a patra armonică la o lungime de undă de 266 nm.

3.2. Metode spectroscopice

Spectroscopia este o ramură a fizicii ce se ocupă cu studiul cuantificat al interacției radiației

electromagnetice cu materia și oferă informații despre structura moleculară (simetrie moleculară,

distanța interatomică, unghiurile interatomice), proprietățile chimice (distribuția electronică, tăria

legăturilor) și spectrele intra- și inter-moleculare [17]. Spectroscopia optică studiază absorbția sau

emisia de lumină a materiei și se referă doar la interacția cu radiația electromagnetică din așa

numitul “domeniu optic” ce include domeniul vizibil, o parte din cel ultraviolet și cel în infraroșu,

mai exact de la 200 nm la 3000 nm [18]. Tehnicile experimentale folosite în studiul moleculelor de

fenotiazine neiradiate și iradiate cu un fascicul laser emis la 266 nm sunt: spectroscopie de absorbție

UV-Vis-NIR, spectroscopie de fluorescență indusă laser și în infraroșu cu transformata Fourier.

3.2.1. Spectroscopie de absorbție UV-Vis-NIR

Spectroscopia de absorbție este o tehnică răspândită în domeniul cercetării prin care se pot

efectua analize cantitative și calitative atât pentru compuși organici cât și pentru cei anorganici [5].

Absorbția unei cuante de lumină de către o moleculă implică tranziții ale electronilor periferici

(optici). Aceste tranziții constau în excitarea unui electron de pe un orbital molecular ocupat pe un

orbital de energie mai mare. Astfel, în aceste tranziții există trei orbitali de legătură π, σ și n și doi

orbitali de antilegătură π*, σ* [6].

3.2.2. Spectroscopie de fluorescență indusă laser

Spectroscopia de fluorescență indusă laser (LIF) reprezintă o tehnică performantă utilizată în

detectarea de molecule și atomi, măsurarea concentrațiilor speciilor moleculare și a distribuției

populațiilor de pe nivelele de energie și în testarea proceselor ce implică transfer de energie în

molecule [19].

În experimentele LIF, moleculele sunt excitate prin absorbție de radiație laser de pe nivelul

electronic fundamental pe unul excitat. Odată excitate, moleculele se dezexcită și ajung pe nivelul

electronic fundamental prin emisia spontană a unui foton; intensitatea emisiei spontane este

proporțională cu densitatea numărului de specii aflate în stare excitată [19]. Un montaj LIF constă

dintr-o sursă de radiații, laser sau o lampă flash, a cărei radiație este direcționată către probă printr-

un sistem de lentile și oglinzi, un sistem de colectare al semnalului fluorescenței care include și o

fibră optică ce transmite semnalul către sistemul de detecție și analiză. Sistemul de detecție poate fi

7

un fotomultiplicator deoarece prezintă un câștig mare, este sensibil într-un domeniu spectral larg și

are un răspuns temporal rapid [19]. Sistemul de detecție și analiză poate consta de asemenea și într-

un spectrometru cu cameră CCD [20].

3.2.3. Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier

Spectroscopia în infraroșu este o metodă nedestructivă, larg răspândită, de studiu al

moleculelor, fiind cea mai potrivită tehnică de identificare a vibrațiilor caracteristice grupărilor

funcționale dintr-o moleculă asimetrică. Această metodă se bazează pe studiul interacțiilor dintre

materie și radiațiile electromagnetice din domeniul IR cuprins între 14000 – 50 cm-1

ce prezintă

următoarele subdomenii: infraroșul apropriat, NIR, între 400 – 50 cm-1

, infraroșul mediu, MIR, între

4000 – 400 cm-1

și infraroșul îndepărtat, FIR, între 14000-400 cm-1

.

Spectrele în infraroșu sunt rezultatul tranzițiilor dintre stările vibraționale de energie

cuantificate. Moleculele cu N atomi au 3N grade de libertate, dintre care trei reprezintă mișcări

translaționale pe direcții reciproc perpendiculare (axele x, y și z) și alte trei reprezintă mișcări de

rotație în jurul celor trei axe. Cele 3N-6 grade de libertate rămase reprezintă numărul de moduri în

care o moleculă neliniară poate vibra, fiind numite moduri vibraționale [21].

3.3 . Metode fizico-chimice analitice Tensiunea superficială nu este doar un parametru termodinamic intrinsec, ci se regăsește în

strânsă legătură cu adsorbția la suprafață. Diferite tehnici pot fi folosite pentru a măsura tensiunea superficială a biomoleculelor la interfețele aer-apă și apă-ulei, cum ar fi placa Wilhelmy sau tensiometrul cu inel du Noüy, precum și cele bazate pe volumul, greutatea, sau forma picăturii suspendate [22].

Cromatografia cuprinde un grup divers, dar legat, de metode care permit separarea, izolarea, identificarea și cuantificarea componentelor într-un amestec. Toate metodele implică aplicarea probei într-o zonă inițială, îngusta (mică), pe o placă sau într-o coloană (fază staționară). Componenții amestecului sunt deplasați de-a lungul fazei staționare de către faza mobilă, iar separările se bazează pe diferențele dintre raporturile de migrare ale componentelor probei în timpul unei proces de distribuție în mai multe trepte.

3.3.1. Studiul tensiunii superficiale

După cum sugerează și numele, tensiunea superficială este o forță care ce se produce pe

suprafață și acționează perpendicular și din interiorul limitelelor suprafeței, tinzând să scadă zona de

interfață [23]. Tensiunea superficială depinde de natura lichidului, de mediul înconjurător și de

temperatură și rezultă dintr-un dezechilibru al forțelor moleculare dintr-un lichid. La suprafața

lichidului, moleculele sunt atrase una de celalaltă și exercită o forță de atragere neta ce le apropie.

În interiorul lichidului există forțe de coeziune între molecule si toți vecinii, însă la suprafață, nu au

nici un atom vecin la interfață, astfel incat au loc forțe puternice de atracție între moleculele vecine.

Forțele de atracție produc curbura suprafețelor lichide, și generează o diferență de presiune la

interfață. Valori ridicate ale tensiunii superficiale înseamnă că moleculele tind să interacționeze

puternic, pe cand valorile mai mici sugerează o interacțiune slabă [24].

3.3.2. Cromatografie în strat subțire

Termenul de "cromatografie în strat subțire" a fost inventat de către Egon Stahl în Germania la

sfârșitul anilor 1950. Cea mai mare contribuție în acest domeniu a fost standardizarea materialelor,

procedurilor și a nomenclaturii și, de asemenea, descrierea sistemelor selective de solvent utilizate

în rezolvarea multor clase importante de compuși. Primul său manual de laborator pentru TLC [25],

a popularizat metoda TLC, ajutând diverși producători de substanțe chimice prin oferirea

materialelor standarde pentru TLC.

TLC a fost considerat în mod tradițional o metodă simplă, rapidă și necostisitoare pentru

separare, fiind folosită pentru identificarea tentativă și semicuantificarea vizuală a unei mari

varietăți de substanțe. Din punct de vedere metodologic, TLC convențional este cea mai simplă

8

tehnică cromatografică, iar materialele pot fi obținute la un cost destul de mic. Cromatografia în

strat subțire este o subdiviziune a cromatografiei lichide, în care faza mobilă este un lichid și faza

staționară este formată dintr-un strat subțire de absorbant pe o suprafață plană.

3.3.3. Cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă

În multe analize, compușii de interes se regăsesc ca parte a unui amestec complex și rolul

tehnicii cromatografice este de a oferi separarea componentelor amestecului pentru a permite

identificarea sau determinarea lor cantitativă. Din punct de vedere calitativ, principala limitare a

cromatografiei este incapacitatea sa de a furniza o identificare clară a componentelor unui amestec,

chiar dacă sunt complet separate unele față de altele. Identificarea se bazează pe compararea

caracteristicilor de retenție si a timpului de retenție, ale unui compus necunoscut cu cele ale

materialelor de referință determinate în condiții experimentale identicei [26].

Puterea de rezolvare a spectrometriei de masă constă în faptul că spectrele de masă ale

compușilor sunt suficient de precise pentru a permite identificarea lor cu un grad ridicat de

certitudine. Dacă analitul de interes este întâlnit ca parte a unui amestec, spectrul de masă obținut va

conține toți ionii compușilor din amestec, iar dacă analitul de interes este o componentă minoră a

acelui amestec, identificarea cu orice grad de certitudine se face mult mai dificil [26].

Combinația dintre capacitatea de separare cromatografică, în care se permite introducerea unor

compuși "puri" în spectrometrul de masă, caracterizat de capacitatea sa de identificare a acestora

este în mod clar avantajoasă în cazul în care compușii prezintă caracteristici de retenție similare sau

identice însă cu spectre de masă destul de diferite, putând fi astfel diferențiați. Această specificitate

suplimentară permite efectuarea cuantificării compușilor, care doar prin utilizarea tehnicii

cromatografice nu ar fi fost posibilă [26].

3.3.4. Analiza pH

Măsurarea și controlarea acidității și alcalinității sunt considerate analize esențiale atât în

cercetare cât și în domeniul industrial. Dispozitive pH-metrice cu electrozi încorporați în sticlă,

dintre care o parte pot măsura valori ale pH cu o reproductibilitate de până la 0,001 unități, sunt

utilizate în majoritatea laboratoarelor în care au loc analize chimice [27].

Definit, pH-ul reprezintă concentrația “efectivă” a ionilor de hidrogen dintr-o soluție,

importanța acesteia bazându-se pe faptul că măsoară reactivitatea chimică a soluțiilor apoase acide

sau alcaline. Determinarea pH se bazează pe principii fizico-chimice și poate fi efectuată utilizând

diferite tehnici precum calorimetrie, conductivitate și potențiometrie [28].

3.4. Metode de testare a susceptibilității bacteriilor la agenți antimicrobieni

De-a lungul anilor s-a stabilit că bacteriile anaerobe pot provoca infecții medicale semnificative.

Odată cu descoperirea antibioticelor și introducerea unor medicamente precum penicilina pentru

profilaxie, incidența infecțiilor anaerobe a scăzut. Din punct de vedere istoric, infecțiile anaerobe au

fost tratate empiric cu antibiotice, deci nu a fost nevoie de teste de rutină pentru a determina

sensibilitatea organismului la antibiotic. Cu toate acestea, cu apariția bacteriilor numite

“superbugs", care sunt rezistente la multipli agenți antimicrobieni, este din ce în ce mai greu să se

prezică susceptibilitatea lor la antibiotice. Deși rezistența la antibiotice a bacteriilor anaerobe a

crescut, medicii aleg în continuare tratamentele cu antibiotice din studiile raportate în literatura de

specialitate sau din datele obținute în propriile instituții pentru a trata infecții anaerobe. În prezent

sunt mult mai dificil de prezis modele de sensibilitate ale bacteriilor anaerobe pe baza datelor din

literatură [29].

Prin urmare, oamenii de știință continuă să dezvolte medicamente eficiente pentru a combate

bolile infecțioase, însă, cu toate acestea, combinația de noi medicamente și noi mecanisme de

rezistență a crescut complexitatea testelor de susceptibilitate [30].

9

3.4.1. Concentrația minimă inhibitorie

Sensibilitatea și rezistența micro-organismelor la medicamente sunt în continuă schimbare, iar

mulți patogeni au dezvoltat rezistență chiar și la cele mai noi antibiotice. Deoarece modelele de

susceptibilitate sunt imprevizibile, este necesară testarea adecvată a agenților antimicrobieni

împotriva patogenilor izolați. Cea mai scăzută concentrație de antibiotic care va inhiba creșterea

organismului testat este cunoscută ca fiind concentrația minimă inhibitorie (CMI). Metoda

tradițională de determinare a CMI este tehnica de diluare a mediului de cultură/”bulion”, unde

diluții seriale de antibiotic sunt încorporate în mediile de cultură, fie în godeurile unor plăci de

microtitrare sau fie în tuburi de cultură. Fiecare tub sau godeu conține o concentrație diferită a

agentului antimicrobian și se inoculează cu o cantitate fixă de organism testat. După incubarea

corespunzătoare, cea mai mică concentrație care nu prezintă o creștere vizibilă a organismului este

considerată ca valoare CMI [29].

3.4.2. Concentrația minimă de eradicare a biofilmului

Metodele standard existente de evaluare a biocidelor, dezinfectanților sau antibioticelor sunt

inadecvate pentru a analiza produșii de inhibare a dezvoltării de biofilm. Metodele concepute pentru

testarea tratamentelor antibiofilm sunt necesare deoarece bacteriile din biofilme răspund diferit la

agenții antimicrobieni comparativ cu cele aflate în suspensie. Aceste diferențe includ următoarele:

1) bacterii din biofilmele pot exprima gene diferite față de cele aflate în suspensie; unele

dintre aceste gene pot exprima rezistența la agenți antimicrobieni.

2) agenții antimicrobienii nu poate pătrunde pe deplin în biofilme.

3) biofilmele sunt caracterizate de eterogenitate, unde organismele care se cresc mai lent pot fi

mai rezistente la antimicrobieni.

4) biofilmele pot acumula contaminanți din mediul înconjurător ce pot afecta activitatea

agentului antimicrobian [31].

Sistemul de testare a concentrației minime de eradicare a biofilmului (CMEB) este ideal fie

pentru screening-ul de noi antibiotice și/sau biocide putative, fie pentru determinarea valorilor CMI

și CMEB în cazurile clinice cu sopul de a ajuta la tratarea infecțiilor cronice, recurente sau legate de

instrumentație. Sistemul de testare CMEB produce 96 biofilme echivalente și constă dintr-un

dispozitiv de plastic din două piese de unică folosință, utilizate pentru formarea biofilmelor.

Componenta de jos constă din 96 de godeuri în care este plasată suspensia bacteriană, iar cea de sus

constă dintr-un capac care prezintă 96 de “cuie” poziționate în centrul fiecărui godeu [31].

10

Contribuții originale

4. Studiul proprietăților fizico-chimice ale amestecului de foto-produși

generați prin expunerea soluțiilor de fenotiazine la radiație laser

UV Raportări recente au arătat că soluțiile de derivați fenotiazinici, și nu numai, atunci când sunt

expuse la radiație laser în ultraviolet (UV) generează foto-produși care prezintă proprietăți și

structuri moleculare diferite comparativ cu compusul parental, ce au fost investigate prin diferite

tehnici spectroscopice și analitice [32-37].

În acest capitol sunt prezentate studiile de foto-degradare a clorpromazinei (CPZ) și a

tioridazinei (TZ), ambele la o concentrație de 2 mg/mL, cu scopul de a evidenția modificările foto-

chimice obținute în urma expunerii soluțiilor la o radiație laser emisă la 266 nm de un laser pulsat

Nd:YAG. Amestecul de foto-produși, generați ca urmare a expunerii la radiație laser UV a soluțiilor

apoase de CPZ și TZ, a fost analizat prin spectroscopie de absorbție UV-Vis-NIR, fluorescență

indusă laser (LIF), măsuratori de tensiune superficială, spectroscopie în infraroșu cu transformată

Fourier (FT-IR), cromatografie în strat subțire și cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie

de masă. Randamentul cuantic al fluorescenței și al generării oxigenului singlet a fost determinat în

raport cu Coumarin 1, respectiv Zn-ftalocianină. De asemenea, sunt prezentate structurile chimice

ale foto-produșilor identificați și propuse două scheme de foto-degradare în urma expunerii probelor

la radiație UV [38].

4.1. Descrierea sistemului experimental

Compușii studiați sunt derivați fenotiazinici, CPZ și TZ, în formă clorhidrat având o puritate de

98.9% (Sigma Aldrich). Pentru studiul foto-chimic, soluțiile de CPZ și, respectiv de TZ având o

concentrație de 2 mg/mL au fost iradiate cu un fascicul laser pulsat având o energie medie pe puls

de 6.5 mJ la lungimea de undă de 266 nm (a patra armonică a laserului Nd:YAG, Excel

Technology, model Surelite II). Caracteristicile laserului Nd:YAG sunt următoarele: 6 ns lărgimea

temporală a pulsului la semi-înălțime și 10 Hz rata de repetiție a pulsurilor. Drumul optic

(dimensiunea internă a celulei spectrofotometrice în care a fost plasată proba) a fost 1 cm, aria

secțiunii transversale a fasciculului la interfața cu cuva de 0,38 cm2 și fluența fasciculului laser de

17,1 J/cm2. Pentru aceste studii au fost folosite cantități de 2 mL de soluție apoasă de CPZ și de TZ,

în celule spectrofotometrice standard (45x12.5x12.5 mm) și au fost amestecate continuu cu o bară

magnetică la 700 rpm pentru a omogeniza în permanență proba și pentru a nu permite formarea de

precipitați. Montajul experimental utilizat este prezentat în Figura 4.1. Procesul de iradiere a

compușilor a fost efectuat pentru diferiți timpi de expunere: 1, 5, 15, 30, 60, 120, 180 și 240 min.

Fiecare probă a fost analizată atât prin metode spectroscopice: spectroscopie UV-Vis, FT-IR și LIF

cât și prin alte metode fizico-chimice analitice: măsurători de tensiune superficială, cromatografie în

strat subțire, cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă (LC-TOF/MS) și măsurători

de pH. Pentru determinarea randamentului cuantic de generare a oxigenului singlet și a

randamentului cuantic al fluorescenței s-au utilizat ca standarde Zn-ftalocianina (ZnPc) (Sigma

Aldrich) și Coumarin 1 (Coumarin 460, Exciton).

Spectrele de absorbție au fost înregistrate între 200 și 1200 nm cu spectrofotometrul Perkin

Elmer, model Lambda 950, ce măsoară cu o eroare standard de ±0.004%. Celula spectrofotometrică

utilizată prezintă un drum optic de 1 mm. Spectrele au fost înregistrate și pentru diluții de

0,2 mg/mL ale probelor de 2 mg/mL (concentrație inițială) pentru a evita obținerea unui semnal

saturat în domeniul spectral 200-360 nm.

11

Figura 4.1: Montajul experimental utilizat pentru a iradia și analiza probele de CPZ și TZ la o

concentrație de 2 mg/mL și un volum de 2 mL.

Pentru studiile LIF, fluorescența a fost înregistrată în timp real cu un spectrometru Ocean Optics

(model HR4000) în domeniul spectral 200-1100 nm, la o rezoluție de 0,65 nm, reprezentând o

mediere a semnalelor timp de 10 sec. Pentru determinarea randamentului cuantic al fluorescenței,

CPZ a fost dizolvat în apă ultrapură la o concentrație de 0,1 mg/mL, ceea ce corespunde unei

absorbanțe în valoare de 0,1 la 355 nm. În acest fel, sunt evitate procesele de reabsorbție și de

autostingere a fluorescenței [39].

Fosforescența oxigenului singlet rezolvată în timp a fost înregistrată cu un fotomultiplicator în

domeniul NIR, Hamamatsu model H-10330, al cărui semnal de ieșire este cuplat la un osciloscop

digital Tektronix DPO 7254. Pentru acest studiu, CPZ a fost dizolvat în apa grea la o concentrație

de 0,2 mg/mL și excitarea a fost efectuată utilizând un fascicul emis la 355 nm (a treia armonică a

fasciculului fundamental emis de Nd:YAG). Randamentul cuantic a fost determinat printr-o metodă

ce utilizează un standard, ZnPc dizolvat în DMSO.

Determinarea valorilor pH pentru toate probele, atât iradiate cât și neiradiate, s-a făcut utilizând

un pH-metru Schott Instruments Lab 860 echipat cu un electrod BlueLine 16pH, care poate

înregistra valori ale pH între 0 și 14, la temperaturi cuprinse între -5 și 100ºC, cu o precizie

de ±0,01.

Spectrul IR a fost înregistrat utilizând un spectrometru FT-IR Nicolet™ iS™50, în domeniul

4000 – 750 cm-1

la o rezoluție de 4 cm-1

și o mediere pe 32 de spectre. Probele de CPZ și TZ în

soluții apoase au fost uscate pe un suport KRS-5, aplicându-se 20 µL de probă, iar din spectrul final

s-a scăzut spectrul acestuia.

O analiză calitativă a foto-produșilor generați a fost efectuată prin tehnica cromatografică numită

cromatografie în strat subțire (TLC), unde ca fază staționară a fost utilizată placa de aluminiu pre-

acoperită cu 0,25 mm silicagel 60F254 (DC-Alufolien Kieselgel 60F254; Merck, Darmstadt, DE), de

dimensiuni 10x20 cm. Faza mobilă constă dintr-un amestec de acetonă: metanol: 25% amoniac

(50:50:1, V:V:V) având un volum total de aproximativ 20 mL și care se regăsește într-un tanc de

developare înainte de introducerea plăcii. Programul JustTLC (Sweday) oferă o analiză precisă a

imaginii plăcilor, cu scopul obținerii unei cuantificări cât mai bună a probelor.

Măsurătorile de tensiune superficială au constat în determinarea tensiunii superficiale a soluțiilor

apoase de CPZ și TZ atât pentru probele neiradiate cât și pentru cele iradiate pentru diferiți timpi,

într-o picătură suspendată folosind echipamentul Drop and Bubble Shape Tensiometer PAT-1.

Măsurătorile au fost efectuate în triplicat și apoi mediate.

TLC

Agitator magnetic

Atenuatorde radiatie

Fibraoptica

Teste de susceptibilitate

a micro-organismelor la

compusii iradiati.

12

Soluțiile de CPZ și de TZ la o concentrație de 2 mg/mL au fost analizate, pentru intervalele de

timp de iradiere menționate mai sus, prin LC-TOF/MS utilizând un sistem LC 1200 Infinity Series,

Agilent Technologies. Pentru modulul MS, sursa ESI a fost utilizată în modul pozitiv.

4.2 Analiza clorpromazinei expuse la un fascicul laser emis la 266 nm


Spectrul de absorbție UV-Vis-NIR al CPZ neiradiat din Figura 4.2 este caracterizat de două

benzi de absorbție cu maxime la 254 nm și respectiv 307 nm. Banda de la 254 nm reprezintă

maximul principal și se datorează unor tranziții n→π*. Banda de la 307 nm reprezintă maximul

secundar și este prezentă datorită unor tranziții π →π* dar și perechilor de electroni neparticipanți în

structura atomului de S din structura fenotiazinei [2].

În urma iradierii, spectrul de absorbție suferă atât deplasări hipocromice, hipercromice cât și

batocromice. Astfel, intensitatea benzii de la 254 nm prezintă un efect hipocromic pe parcursul

iradierii până la 120 min și apoi unul hipercromic până la sfârșitul iradierii. Maximul benzii de la

307 nm suferă o deplasare batocromică până la 344 nm pe parcursul iradierii și în același timp,

forma începe să se modifice, observându-se o lărgire a benzii.

Figura 4.2: Spectrele de absorbție ale CPZ neiradiat și iradiat între 1-240 min A) pentru o

concentrație de 0,2 mg/mL măsurată în domeniul spectral 200-500 nm; B) pentru o concentrație de

2 mg/mL măsurată în domeniul spectral 280-1200 nm

Modificările produse spectrului inițial indică faptul că substituenții inelului fenotiazinic se

modifică și au loc modificări structurale, noi foto-produși fiind formați. Datorită interacției

fasciculului laser cu proba, alte două benzi apar la 503 nm și 540 nm la timpi de iradiere mai mari

de 30 min (Figura 4.3A) ce se pot datora producerii formelor oxidate ale CPZ și promazinei (PZ)

[40].

Figura 4.3: A) Spectrele de absorbție ale CPZ neiradiat și iradiat între 1-240 min pentru o

concentrație de 0,2 mg/mL măsurate în domeniul spectral 400-800 nm;B) Derivata de ordinul I a

spectrului de absorbție a CPZ iradiat 240 min, în domeniul spectral 450-560 nm

O metodă de a rezolva suprapunerea celor două benzi ce apar în spectrul de absorbție al probei

iradiate timp de 240 min, se bazează pe generarea derivatei de ordinal I, cu scopul de a le evidenția.

13

Figura 4.3B prezintă derivata de ordinul I a spectrului de absorbție, în domeniul 450-570 nm

pentru proba iradiată 240 min, utilizând algoritmul Savitzky–Golay [41]. Astfel sunt evidențiate

cele două benzi, prin suprapunerea cărora se obțin maximele de la 503 nm și 540 nm.

4.2.2. Studii de fluorescență și fosforescență

Spectrul LIF al soluției de CPZ ( concentrație 2 mg/mL) iradiate la timpi de până la 240 min

prezintă o bandă cu un maxim la 504 nm (Figura 4.4 A). Intensitatea fluorescenței crește în primele

5 min de iradiere și apoi începe să descrească.

Figura 4.4: A) Spectrele LIF a 2 mg/mL CPZ, înregistrate în timp real, între 10 sec și 240 min în

domeniul spectral 400-750 nm; B) Deplasarea batocromică a maximului central din spectrele LIF

În același timp maximul de intensitate suferă o deplasare batocromică de 38 nm până la sfârșitul

timpului de iradiere (Figura 4.4B), sugerând formarea de noi foto-produși. Intensitatea spectrului de

fluorescență nu este dependentă de substituentul de la poziția 10 din structura CPZ, însă poate fi

influențată de schimbări ale substituentului de la poziția 2 [40]. Deplasarea către lungimi de undă

mai mari ale benzii de fluorescență sugerează modificări structurale produse în molecula de CPZ în

cazul substituentului de la poziția 2.

Factorii care pot influența spectrul LIF sunt pH-ul și timpul de iradiere [40]. Schimbarea

valorilor pH-ului afectează reconfigurarea ce are loc în urma protonării sistemului de electroni π al

fluoroforului. Se observă o scădere a pH pe durata iradierii de la 5,75, în cazul CPZ neiradiat, până

la 2,23, în cazul soluției de CPZ iradiate 240 min. Acest comportament poate fi justificat de

formarea cationului de hidroniu ca rezultat al ruperii legăturii C–Cl. De asemenea, stingerea totală a

fluorescenței în 120 min de iradiere poate fi corelată cu faptul că CPZ nu mai există în proba

iradiată.

Randamentul cuantic al fluorescenței CPZ a fost determinat prin raportarea la un standard, în

acest caz Coumarin 1. CPZ a fost dizolvat în apă ultrapură la o concentrație de 0,1 mg/mL și

Coumarin 1 în etanol la o concentrație de 5,2 µM. Pentru CPZ se obține valoare de 0,15. Această

valoare sugerează că 15% din procesele de dezexcitare care au loc în timpul iradierii se datorează

emisiei de fluorescență.

Randamentul cuantic al generării de oxigen singlet a fost determinat prin raportarea la un

standard, în acest caz folosindu-se ZnPc dizolvat în DMSO (67% [42]). Din evoluția temporală a

fosforescenței oxigenului singlet a CPZ și a ZnPc excitate cu radiație laser emisă la 355 nm, în

cazul CPZ, s-a obținut un timp de viață al stării excitate a oxigenului singlet de 8,67 µs și respectiv,

6,68 µs în cazul ZnPC. Randamentul cuantic al generării oxigenului singlet prin iradierea CPZ-ului

dizolvat în D2O este de 3,3%.


Soluțiile de CPZ neiradiate și iradiate au fost analizate prin spectroscopie FT-IR și au fost

identificate vibrațiile corespunzătoare diferitelor legături chimice ale moleculei. Spectrul CPZ

14

neiradiat a fost comparat cu cel al soluției iradiate timp de 240 min, iar diferențele dintre cele două

au fost evidențiate (Figura 4.5).

Formarea de noi produși poate fi confirmată și de măsurătorile FT-IR. În cazul soluției de CPZ

dizolvată în apă ultrapură, la o concentrație de 2 mg/mL și iradiată 240 min, apare o nouă bandă la

1265 cm-1

, atribuită vibrației de întindere a legăturii C–O din cadrul unei grupări fenol. Acest lucru

indică formarea unui foto-produs ce cuprinde o grupare hidroxil. Banda de la 1085 cm-1

se

datorează vibrației de întindere a legăturii S–O din cadrul unei grupări sulfoxid, indicând generarea

unor forme oxidative a foto-produșilor. Banda de la 804 cm-1

desemnată vibrației legăturii C–Cl nu

se mai regăsește în spectrul CPZ iradiat 240 min, acest lucru sugerând formarea PZ în timpul

iradierii.

Figura 4.5: Spectrele IR pentru 2 mg/mL CPZ neiradiat și iradiat 240 min în domeniul

3600-750 cm-1

Deplasarea de 6 cm-1

către lungimi de undă mai mari se datorează dispariției CPZ din probă și

formării de foto-produși. În Tabelul 4.1 sunt prezentate în detaliu vibrațiile corespunzătoare

legăturilor moleculei de CPZ neiradiat.

Prin urmare, modificările benzilor observate în spectrul IR sugerează foto-degradarea completă a

compusului parental CPZ și generarea de foto-produși ce conțin grupări fenol și sulfoxid.


Măsurătorile de tensiune superficială au ca scop determinarea caracteristicilor suprafeței la

interfața lichid-aer pentru soluții de CPZ neiradiate și iradiate între 1 min și 240 min. Astfel, pentru

fiecare timp de iradiere s-a măsurat tensiunea superficială la interfața lichid-aer prin determinarea

valorii de echilibru a probelor analizate.

Figura 4.6: Valorile tensiunii superficiale la echilibru pentru soluțiile de CPZ neiradiat și iradiat

între 1 min și 240 min

Astfel, CPZ neiradiat prezintă o tensiune superficială mai mică decât cea a apei ultrapure (71-

72 mN/m), respectiv 65,65 mN/m și odată cu creșterea timpului de iradiere tensiunea scade la

57,79 mN/m în cazul CPZ iradiat 240 min. Datorită acestor rezultate se poate afirma că pe parcursul

0 50 100 150 200 250

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

Te

ns

iun

e s

up

erf

icia

la (

mN

/m)

timp (min)

15

iradierii numărul compușilor hidrofobi crește având loc un proces de migrare spre interfața lichid-

aer urmat de adsorbția lor la suprafață.

4.2.5. Cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă

Măsurătorile extrem de precise (<5ppm) ale maselor moleculare obținute prin detecție TOF au

fost folosite pentru a obține informații calitative rapide și precise cu scopul de a identifica foto-

produșii. Pe baza măsurătorilor de masă ale ionilor generați și a fragmentelor ulterioare de ioni din

cadrul analizei TOF/MS, ca urmare a disocierii prin coliziune indusă, au fost evaluate

cromatogramele ionilor extrași și s-au identificat foto-produșii generați în urma expunerii CPZ la un

fascicul laser emis la 266 nm.

În cazul soluției de CPZ (concentrație 2 mg/mL), iradiate la diferite intervale de timp, de la

1 min la 240 min, cromatogramele sugerează existența a șapte foto-produși și o scădere graduală a

CPZ. Figura 4.7 prezintă spectrele LC-TOF/MS ale CPZ neiradiat și iradiat, iar în graficele inset

sunt prezentate modificările ce au putut fi observate. Astfel poate fi identificat ionul molecular la

319 u.a.m care este asociat moleculei de CPZ (Figura 4.7 A).

Figura 4.7: A) Spectrele LC-TOF/MS a 2 mg/mL CPZ neiradiat și iradiat între 1 min si 240 min;

B) Structurile propuse a foto-produșilor rezultați din interacția radiației UV cu soluțiile de CPZ

Din cromatograma de ioni extrași s-au putut detecta următoarele valori [M+H]+ = 285.1473,

292.1371, 300.1360, 301.1440, 308.1321, 317.1370, 319.1114 și 335.1044 u.a.m. Se poate observa

că după 120 min de iradiere nu mai există CPZ în probă iar concentrațiile foto-produșilor formați

cresc sau scad pe parcursul iradierii. Acest fenomen se datorează timpului de iradiere dar și

competitivității foto-reacțiilor care au loc.

În Figura 4.7 B sunt prezentate structurile propuse ale foto-produșilor rezultați în urma interacției

probei de CPZ cu radiația laser UV. În general, primele reacții foto-chimice de transfer ce au loc

într-o structură aromatică sunt: fragmentarea legăturii α, fragmentarea legăturii β și adiția, însă de

asemenea, pot avea loc și reacții de substituire directă sau ciclo-adiție [43]. În cadrul fotolizei,

halidele aril suferă o homoliză și produc radicali sau atomi de halogen, astfel încât foto-produșii

formați să conțină hidrogenul din solvent în locul halogenului.

Foto-produșii identificați sunt: promazină (PZ), promazină sulfoxid (PZ–SO ), 2-hidroxi

promazină (PZ-OH), 2-hidroxi promazină sulfoxid (PZ–OH–SO), clorpromazină sulfoxid (CPZ–

SO) și alți 3 compuși care se regăsesc la valorile m/z de 292, 308 și 300 u.a.m notate cu P1, P2 și P3.

În cazul foto-produșilor P1 și P2, structurile chimice se regăsesc în Figura 4.7 B, iar structura

chimică a foto-produsului P3 nu a fost încă identificată.

Din cromatograma totală de ioni, concentrația procentuală a fiecărui compus a fost extrasă

pentru fiecare timp de iradiere și este prezentată în Figura 4.8 A. Abundența cea mai mare până la

60 min de iradiere, în afara de CPZ, este dată de prezența PZ, însă după foto-disocierea completă a

CPZ, la 120 min, compusul majoritar devine PZ-OH/PZ–SO. Cea mai importantă modificare,

referitoare la concentrație, este cea a PZ-OH/PZ–SO care de la începutul până la sfârșitul iradierii

200 225 250 275 300 325 350 375 400

0

5

10

15

20

25

30

280 285 290 295 300 305 310 3150

1

2

3

4

5

6

7

8

308

300

301

317292

285

330 332 334 336 338 340 342 344 346 348 3500,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

335

301

317

308

Inte

ns

ita

te (

x1

06

inre

gis

tra

ri/s

)

292

335285

300

m/z

neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 240 min

319

16

prezintă o creștere semnificativă ajungând la 240 min de expunere la radiație a probei la valoarea de

63,41%.

După absorbția fotonilor de către CPZ, posibilele căi de dezexcitare ale moleculelor excitate sunt

emisia de fluorescență și de fosforescență, transformările fotochimice, modificările

conformaționale, transferul de energie, conversia internă și generarea de oxigen singlet. Toate

aceste procese sunt în competiție. Stingerea fluorescenței este un rezultat al combinării mai multor

procese cum ar fi generarea de oxigen singlet, emisia de fosforescență, foto-degradarea compusului

parental dar și modificarea pH-ului.

Figura 4.8: A) Concentrația procentuală a foto-produșilor pentru fiecare timp de iradiere,

extrasă din cromatograma totală de ioni; B) Schema cu posibile căi de foto-descompunere a CPZ,

ca rezultat al interacțiunii sale cu fasciculul laser emis la 266 nm

În Figura 4.8 B sunt prezentate posibile căi de foto-degradare a CPZ ca rezultat al interacțiunii sale

cu fasciculul laser emis la 266 nm. Schema cu posibile căi de foto-descompunere a CPZ a fost

elaborată pe baza rezultatelor experimentale, precum și pe baza datelor raportate în literatură. Apa

ultrapură a fost aleasă ca solvent, datorită compatibilității sale cu sistemele biologice. Expunerea

CPZ a fost realizată în soluție apoasă, fără extracție de oxigen molecular, astfel încât, în acest sens,

prezența sa poate duce la formarea de radicali liberi și de oxigen singlet [44].


Analiza cromatografică în strat subțire (TLC) permite vizualizarea și compararea directă a foto-

produșilor generați prin iradierea cu fascicul laser emis la 266 nm. Fiecare placă TLC a fost

vizualizată la două lungimi de undă, 254 nm și 366 nm (Figura 4.9 A și B). Fiecare coloană din

plăcile TLC corespunde unui timp de iradiere specific: prima coloană reprezintă proba neiradiată,

apoi de la stânga la dreapta sunt prezentate probele de CPZ iradiate 1, 5, 15, 60, 120 și 240 min.

Figura 4.9: Vizualizarea plăcilor TLC pentru probele de CPZ neiradiat și iradiate 1, 5, 15, 60, 120

și 240 min, la două lungimi de undă: A) 254 nm și B) 366 nm

0’ 1’ 5’ 15’ 60’ 120’ 240’ 0’ 1’ 5’ 15’ 60’ 120’ 240’

A B

CPZ

CPZ

hν

@2

66

nm

CPZ*(S)

Flo

resc

en

ta

CPZ*(T)1O2

3O2

PZ.

+ Cl-

PZ + .OH

+H

2 O

PZ-SO

PZ-S+OH*(S,T)

PZ+.+

.OH

+PZ.

PZ-OH

PZ-OH-SO

CPZ+.+ e-

CPZ-SO

+ 2e- + 2H+

CPZ+.+

.OH

CPZ-S+OH*(S,T)

12

70 n

m

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

20

40

60

80

100

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

CPZ

Co

ncen

treti

e r

ela

tiva

timp (min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

10

20

30

40

50

60

70

PZ-OH/PZ-SO

timp (min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

1

2

3

4

5

6

7

8 CPZ-SO

timp (min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

10

20

30

40

50

60 PZ

timp (min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

1

2

3

4

5

6

7 P2

timp (min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

1

2

3

4

5

6

7 PZ-OH-SO

t imp (min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

1

2

3

P1

timp (min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

0

1

2

3 P3

timp (min)

A B

17

Toți foto-produșii vizualizați în urma analizei sunt mai polari decât CPZ (exemplificat în

Figura 4.9A), polaritatea lor crescând de sus în jos, evidențiată de săgeata din Figura 4.9 A, cei mai

polari foto-produși fiind cei care se regăsesc la linia de start (linia punctată) începând cu 5 min de

iradiere.

Din Figura 4.9 A rezultă că după iradierea soluției timp de 60 min în probă nu se mai regăsește

CPZ și după doar 1 min de iradiere, sunt prezenți alți trei compuși, numărul și intensitatea lor

crescând sau scăzând pe parcursul iradierii. De asemenea, în Figura 4.9 B, se pot observa compușii

ce absorb la 366 nm și care nu se regăsesc în placa expusă la 254 nm, spre exemplu foto-produși sau

clase de foto-produși (de aceeași polaritate) prezenți pentru timpii de expunere de 60 min, 120 min

și 240 min, marcați prin săgețile orizontale de culoare roșie.

4.3. Analiza tioridazinei expuse la un fascicul laser emis la 266 nm


Pentru a analiza spectrele de absorbție ale TZ neiradiat și ale probelor de TZ iradiate 1, 15, 30,

60, 120, 180 și 240 min s-au făcut măsurători atât pentru concentrația de 2 mg/mL cât și pentru o

diluție la 0,2 mg/mL. Spectrele au fost înregistrate pentru concentrația de 0,2 mg/mL cu scopul de a

putea vizualiza domeniul 200-290 nm deoarece la concentrația de 2 mg/mL semnalul în acest

domeniu este saturat. Spectrul de absorbție UV-Vis al TZ neiradiat din Figura 4.10 A este

caracterizat de două benzi de absorbție cu maxime la 262 nm și respectiv 315 nm.

În urma iradierii, spectrul de absorbție suferă atât deplasări hipocromice, hipsocromice cât și

batocromice. Astfel, intensitatea benzii de la 262 nm prezintă o deplasare hipocromică până la

sfârșitul iradierii, intensitatea absorbanței scăzând astfel: 1 min – 1%, 15 min – 13%, 30 min – 21%,

60 min – 34%, 120 min – 36%, 180 min – 41% și 240 min – 45%. Acest efect este însoțit și de o

deplasare hipsocromică de 1 nm în cazul probei iradiată 60 min urmată apoi de o deplasare

batocromică de 1 nm pentru probele iradiate 180 min și 240 min, comparația fiind făcută cu proba

de TZ neiradiat.

Modificări semnificative au loc în domeniul 290–335 nm, unde se regăsește cel de-al doilea

maxim, respectiv cel la 315 nm (Figura 4.10 A). Astfel, după doar 1 min de iradiere apare o

deplasare hipocromică de 24% din intensitatea probei neiradiate, urmată de o deplasare batocromică

de 3 nm după primele 15 min și de 4 nm după 30 min.

Figura 4.10: Spectrele de absorbție ale TZ neiradiat și iradiat între 1-240 min: A) pentru o

concentrație de 0,2 mg/mL măsurat în domeniul spectral 200-500 nm; B) pentru o concentrație de

2 mg/mL măsurat în domeniul spectral 280-500 nm

Pentru proba iradiată 60 min se produce o scădere a absorbanței pentru maximul de la 315 nm de

90%, însoțită și de apariția unui nou maxim de absorbție la 297 nm. Odată cu creșterea intervalului

de iradiere, în Figura 4.10 B sunt evidențiate noi maxime, ca urmare a interacției TZ cu radiația UV.

Astfel, proba iradiată 120 min prezintă o bandă de absorbție la 302 nm și o bandă largă având

maxime la 309 nm, 314 nm, 318 nm și 321 nm.

18

Pentru probele iradiate 180 min și 240 min benzile menționate anterior sunt evidențiate mult mai

bine, având maxime la 301 nm, 304 nm, 307 nm, 313 nm, 319 nm și 323 nm și respectiv, 300 nm,

303 nm, 306 nm, 312 nm, 317 nm și 322 nm (Figura 4.11A şi B). Dinamica maximelor identificate

în spectrele de absorbție ale substanțelor iradiate arată o dependență a absorbanței de timpul de

iradiere: cu cât proba absoarbe mai multă radiație cu atât valoarea absorbanței benzilor crește.

Figura 4.11: Spectrele de absorbție ale TZ (2 mg/mL)neiradiat și iradiat între 1-240 min în

domeniul 290-340 nm pentru: A) soluția neiradiată și iradiată între 1 min și 240 min; B) soluția

iradiată între 30 min și 240 min

Prin urmare, toate aceste modificări produse spectrului inițial sugerează foto-degradarea

compusului parental, TZ, ce rezultă în formarea de noi produși de reacție ce absorb în domeniul

200–335 nm.

4.3.2. Studii de fluorescență

Spectrul LIF al soluției de TZ, având o concentrație de 2 mg/mL, iradiată timp de 240 min este

caracterizat de prezența unei singure benzi cu un maxim la 504 nm (Figura 4.12 A).

Figura 4.12: A) Spectrele LIF ale TZ (2 mg/mL), înregistrate în timp real, între 10 sec și 240 min în

domeniul spectral 300-800 nm; B) Deplasarea batocromică a maximului central din spectrele LIF

Intensitatea fluorescenței crește în primele 10 sec de iradiere și apoi începe să descrească. În

același timp maximul de intensitate suferă o deplasare batocromică de 20 nm până la sfârșitul

timpului de iradiere (Figura 4.12 B), sugerând formarea de noi foto-produși. Deplasarea către

lungimi de undă mai mari ale benzii de fluorescență sugerează modificările structurale produse în

molecula de TZ doar în cazul substituentului de la poziția 2.

Ca și în cazul CPZ, factorii care pot influența spectrul LIF sunt pH-ul și timpul de iradiere [41].

Scăderea pH-lui pe parcursul iradierii poate afecta reconfigurarea moleculară ce are loc în urma

protonării sistemului de electroni π al fluoroforului.

Analiza pH arată o scădere pe durata iradierii de la 5,47, în cazul TZ neiradiat, până la 3, în cazul

soluției de TZ iradiate 240 min, o scădere semnificativă între doi timpi de iradiere consecutivi

având loc între 1 min și 15 min, de la 5,47 la 4,38. În cazul TZ, nu există o stingere totală a

19

fluorescenței la sfârșitul celor 240 min de iradiere și de asemenea, banda este mult mai largă decât

în cazul celei înregistrate în primele 10 sec. În concluzie, analiza LIF sugerează, ca și în cazul

spectroscopiei de absorbție, foto-degradarea compusului parental și generarea de foto-produși ce

prezintă proprietăți spectrale diferite față de TZ.


Soluțiile de TZ neiradiat și iradiate au fost analizate prin spectroscopie FT-IR și vibrațiile

corespunzătoare diferitelor legături ale moleculei au fost identificate. Spectrul IR al TZ neiradiat a

fost comparat cu cel al soluției iradiate timp de 240 min și sunt prezentate în Figura 4.13.

Figura 4.13: Spectrele IR pentru 2 mg/mL TZ neiradiat și iradiat 240 min în domeniul 3600-

700 cm-1

Pentru soluția de TZ dizolvată în apă ultrapură, la o concentrație de 2 mg/mL, și iradiată

240 min, se pot observa modificări semnificative față de spectrul IR al soluției neiradiate.Astfel,

banda de la 1405 cm-1

atribuită vibrației de deformare C–H ( N − CH3/\

) în cazul probei neiradiate,

nu se mai regăsește în spectrul celei iradiate 240 min sugerând clivarea legăturii N–CH3. De

asemenea, scăderea în intensitate și modificarea formei benzilor din domeniul 1354-1266 cm-1

atribuite vibrației de alungire simetrică a legăturii S–C din S–CH3 sugerează clivarea legăturii S–

CH3. Apariția unei noi benzi la 1050 cm-1

poate fi atribuită vibrației de întindere a legăturii S–O din

cadrul unei grupări sulfoxid, indicând generarea unor forme oxidative a foto-produșilor. În același

timp are loc și o deplasare batocromica de 4 nm sugerând și în acest caz, formarea de noi foto-

produși cu proprietăți optice în domeniul IR asemănătoare cu cele ale TZ.

Dispariția din spectrul probei neiradiate a benzilor de la 1404 cm-1

și 1388 cm-1

și apariția unei

noi benzi în spectrul probei iradiate 240 min la 1385 cm-1

, caracterizată de vibrația de deformare O–

H și vibrația de alungire C–O din cadrul unei grupări fenol, sugerează atașarea unei astfel de grupări

la structura moleculară a TZ.


Măsurătorile de tensiune superficială la interfața lichid/aer au fost efectuate pentru picături

suspendate de TZ, 2 mg/mL, neiradiat și iradiat între 1 min și 240 min. Dinamica în timp (1000 sec)

a tensiunii superficiale pentru fiecare timp de expunere este prezentată în Figura 4.14. S-a

considerat valoarea de echilibru pentru toate probele la 1000 sec.

Valorile tensiunii superficiale la echilibru scad odată cu creșterea timpului de iradiere

(Figura 4.14). Astfel, pentru TZ neiradiat tensiunea superficială este mai mică decât cea a apei

ultrapure (71-72 mN/m), respectiv 55,93 mN/m și odată cu creșterea timpului de iradiere tensiunea

începe să scadă până la 53,44 mN/m în cazul TZ iradiat 240 min.

20

Figura 4.14: Valorile tensiunii superficiale la echilibru (1000 sec) pentru proba de TZ având o

concentrație de 2 mg/mL, neiradiată și iradiată pentru intervale de timp între 1 min și 240 min

Datorită acestor rezultate se poate afirma că pe parcursul iradierii numărul compușilor hidrofobi

crește având loc un proces de migrare spre interfața lichid/aer urmat de adsorbție lor la suprafață.


Vizualizarea și compararea foto-produșilor generați în urma iradierii TZ pentru diferite perioade

de timp poate fi realizată prin analizarea plăcilor TLC la două lungimi de undă, 254 nm și 366 nm

(Figura 4.15). Fiecare coloană din plăcile TLC corespunde unui timp de iradiere specific: prima

coloană reprezintă proba neiradiată, apoi de la stânga la dreapta sunt prezentate probele de TZ

iradiate la diferiți timpi de iradiere.

Majoritatea foto-produșilor vizualizați atât la 254 nm cât și 366 nm, sunt mai polari decât TZ

(Figura 4.15 A). Polaritatea lor crește de sus în jos și este evidențiată de săgeata din Figura 4.15 A,

cei mai polari foto-produși fiind cei care se regăsesc la linia de start (linia punctată) începând cu

15 min de iradiere. Se poate observa, în cazul TZ, că acesta absoarbe la ambele lungimi de undă

(Figura 4.15 A și B) și există o micșorare a “petei” după 60 min de iradiere, scăderea intensității

fiind mult mai accentuată la timpi de iradiere mai mari. Dacă în cazul CPZ iradiat, compusul

parental nu mai este prezent în probă după 60 min de iradiere, TZ este prezent și la sfârșitul celor

240 min de expunere la radiație UV. După doar 1 min de iradiere, în soluție sunt prezenți alți trei

compuși, numărul și intensitatea crescând pe parcursul iradierii.

Figura 4.15: Vizualizarea plăcilor TLC pentru probele de TZ neiradiat și iradiat 1, 5, 15, 30, 60,

120, 180 și 240 min la două lungimi de undă: A) 254 nm și B) 366 nm

În Figura 4.15 B, se pot observa compușii ce absorb la 366 nm și care nu se regăsesc în placa

expusă la 254 nm, spre exemplu foto-produși sau clase de foto-produși (de aceeași polaritate)

exemplificați prin linia întreruptă de culoare galbenă. De asemenea, în proba iradiată se poate

observa un foto-produs sau o clasă de foto-produși mai puțin polar/ă decât TZ, marcat/ă prin linia

întreruptă de culoare albă, fiind mai pronunțat/ă în cazul vizualizării la 366 nm, deci emit mai

puternic la această lungime de undă decât la 254 nm.

0 50 100 150 200 250

53.0

53.5

54.0

54.5

55.0

55.5

56.0

TS

(m

N/m

)

timp (min)

A B

TZ

0’ 1’ 5’ 15’ 30’ 60’ 120’ 180’240’0’ 1’ 5’ 15’ 30’ 60’ 120’ 180’ 240’

21

4.4. Concluzii

În urma expunerii la radiație laser UV, respectiv 266 nm, emisă de către un laser pulsat

Nd:YAG, atât CPZ cât și TZ suferă modificări structurale, fiind formați foto-produși. Soluțiile

obținute prin iradierea între 1 min și 240 min au fost analizate prin metode spectroscopice:

spectroscopie UV-Vis-NIR, spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier și fluorescență

indusă laser, dar și prin metode fizico-chimice analitice: tensiune superficială, cromatografie în

strat subțire, cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă și măsurători de pH.

Aceste tehnici se dovedesc a fi mijloace analitice potrivite în cadrul studiului amestecurilor de

compuși formați în timpul iradierii. Combinarea acestora oferă o imagine de ansamblu asupra

transformărilor care apar în structura moleculară a CPZ și a TZ în timpul iradierii:

1) Scăderea intensității benzilor maximelor și apariția de noi benzi în spectrul de absorbție

sugerează foto-disocierea moleculei de CPZ și de TZ și formarea foto-produșilor.

2) Deplasarea batocromică din spectrul LIF sugerează adăugarea unor grupări funcționale

structurii moleculare.

3) Spectrul FT-IR oferă informații despre formarea de noi legături chimice.

4) Spectrul LC-TOF/MS oferă informații despre masele moleculare ale foto-produșilor.

5) Analiza TLC sugerează numărul de foto-produși existenți în soluțiile iradiate, iar utilizare

programului de analiză JustTLC oferă informații cantitative.

Astfel, au fost sugerate schemele foto-chimice de foto-descompunere a CPZ în timpul iradierii și

au fost propuse structurile moleculare a foto-produșilor generați. Ratele de formare ale foto-

produșilor sunt influențate de generarea de oxigen singlet și de emisia de fluorescență de către CPZ.

Chiar dacă TLC nu este o metodă de analiză extrem de precisă precum LC-TOF/MS, poate fi

folosită cu succes în cuantificarea soluțiilor obținute în urma iradierii dacă nu există posibilitatea

efectuării unei analize LC-TOF/MS.

În concluzie, procesul de formare a foto-produșilor prin iradierea soluției de CPZ și TZ cu un

fascicul laser emis la 266 nm, nu este unul liniar, existând o competitivitate între procesele foto-

chimice evidențiată de ratele de formare a compușilor.

5. Studiul stabilității în timp a soluțiilor de fenotiazine, expuse la

radiație laser UV, utilizând spectroscopia de absorbție UV-Vis-NIR Stabilitatea reprezintă o caracteristică importantă a calității produselor farmaceutice, prin urmare,

testarea ei joacă un rol crucial în procesul de dezvoltare de medicamente. Scopul testării stabilității

este de a furniza informații cu privire la felul în care calitatea unei substanțe de medicament variază

în timp sub influența factorilor de mediu, cum ar fi temperatura, umiditatea și lumina, și de a stabili

o perioadă optimă de testare și condițiile de depozitare recomandate pentru substanțele

medicamentoase [45-46]

Spectroscopia UV-Vis-NIR este adesea folosită pentru evaluarea identității, purității și

concentrației privind substanțele farmaceutice, fiind aplicată, de asemenea, în studiile de evaluare a

stabilității [47-50].

Studii privind stabilitatea derivaților fenotiazinici au fost efectuate pentru diferite concentrații,

temperaturi de depozitare a probelor atât pentru soluțiile expuse la lumină ambientală cât și la

radiație laser emisă la diferite lungimi de undă. S-a demonstrat că spectroscopia de absorbție UV-

Vis-NIR poate fi considerată o metodă adecvată de investigare a stabilității în timp a soluțiilor

analizate [32-34].

22

Înainte de a utiliza fenotiazine iradiate pe culturi de celule, este necesară efectuarea unui studiu

de stabilitate în timp a probelor cu scopul de a identifica intervalul de timp în care, după iradiere,

soluțiile rămân stabile și pot fi utilizate.

Stabilitatea în timp a soluțiilor neiradiate și iradiate de CPZ și TZ a fost determinată prin

spectroscopie de absorbție UV-Vis-NIR. Soluțiile de CPZ și TZ având o concentrație de 2 mg/mL

au fost iradiate utilizând același sistem experimental ca cel descris în Capitolul 4: fascicul laser

emis la 266 nm, energie medie pe puls de 6,5 mJ, perioade de expunere la radiație laser cuprinse

între 1 – 240 min.

Studiile de stabilitate în timp au fost realizate prin înregistrarea spectrelor de absorbție UV-Vis-

NIR, imediat (0 h), la 24 h, 48 h, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni și la 4 săptămâni după

terminarea procesului de iradiere. Probele de CPZ și TZ au fost păstrate la întuneric, la o

temperatură de 4oC.

Spectrele de absorbție au fost înregistrate între 200-1200 nm cu spectrofotometrul Perkin Elmer,

model Lambda 950, ce măsoară cu o eroare standard de ±0,004%, unde se adaugă și eroarea

utilizatorului și se obține o eroare standard de ±2,174%. Celula spectrofotometrică prezintă un drum

optic de 1 mm.

5.1. Studiul stabilității în timp a clorpromazinei

În urma expunerii soluției de CPZ, având o concentrație de 2 mg/mL, la un fascicul laser emis la

266 nm se poate observa încă după primele 5 min o schimbare a culorii, de la o soluție transparentă

în cazul CPZ neiradiat la o soluție de culoare galben deschis. Odată cu creșterea timpului de

expunere la radiație se observă o schimbare graduală a culorii, ajungând după 240 de min de

iradiere la maro închis.

Figura 5.1: Modificarea culorii soluțiilor produse prin expunerea la radiație laser a 2 mg/mL CPZ

pentru perioade de timp cuprinse între 1 – 240 min

Acest aspect, reflectă formarea unor foto-produși ce absorb în domeniul vizibil și pentru care

pe parcursul procesului de iradiere concentrația crește. Spectrele de absorbție a 2 mg/mL CPZ

neiradiat și iradiat între 1 – 240 min, înregistrate imediat și la 24 h după terminarea procesului de

iradiere sunt prezentate în Figura 5.2. Banda responsabilă de maximul de la 306 nm suferă atât o

deplasare batocromică cât și una hipercromică (Figura 5.2 AI). Aceste modificări sunt însoțite de

apariția altor două benzi în domeniul spectral 400-600 nm, cu maxime la 503 nm și 540 nm, a căror

intensitate crește odată cu expunerea prelungită la radiație UV (Figura 5.2 AII).

De asemenea, se poate observa din spectrele de absorbție înregistrate imediat după expunerea la

fasciculul laser, apariția unei benzi largi cu maxim la 956 nm pentru proba iradiată 30 min. Aceasta

bandă este însoțită de încă una cu maxim la 831 nm pentru soluția expusă la radiație UV timp de

60 min, având o intensitate maximă a aborbției după o expunere de 120 min, urmată de o scădere a

intesității la 180 min și în final, pentru CPZ iradiat 240 min cele două benzi dispar (Figura 5.2 AIII).

În urma analizei spectrelor de absorbție înregistrate după 24 h de la terminarea procesului de

iradiere, poate fi afirmat că în domeniul spectral 270-600 nm nu sunt vizibile modificări, însă în

domeniul 600-1200 nm benzile cu maxime la 831 nm și 956 nm dispar (Figura 5.2 BIII). Iradierea

CPZ produce o varietate de radicali liberi, inclusiv radicalul cation corespunzător, radicalul

promazil neutru, atomul clor (Cl) (prin clivaj homolitic) și un radical peroxi cu atom de sulf centrat.

Radicalul cation al clorpromazinei este probabil responsabil pentru unele dintre efectele citotoxice

observate in vitro ale acestui medicament. Cu toate acestea, este puțin probabil ca radicalul cation

să fie implicat în citotoxicitatea in vivo, deoarece foto-degradarea apare numai atunci când CPZ este

excitată pe nivelul S2 (λexcitare < 280 nm) [51].

0’ 1’ 5’ 15’ 30’ 60’ 120’ 180’ 240’

23

Figura 5.2: Spectrele de absorbție ale CPZ neiradiat și iradiat între 1-240 min la o concentrație de

2 mg/mL înregistrate A) imediat după terminarea procesului de iradiere, în domeniul spectral: I)

270-600 nm; II) 400-600 nm și III) 600-1200 nm; B) după 24 h de la terminarea procesului de

iradiere, în domeniul spectral: I) 270-600 nm; II) 400-600 nm și III) 600-1200 nm;

Pentru a determina stabilitatea în timp a probelor de CPZ neiradiat și iradiate, pe parcursul celor

4 săptămâni, pentru fiecare soluție în parte s-au analizat spectrele de absorbție la 0 h, 24 h,

1 săptămână, 2, 3 și la 4 săptămâni. Astfel, în Figura 5.2 este prezentat studiul stabilității soluției de

CPZ neiradiat, unde modificările semnificative au loc în domeniul spectral 270-400 nm. În urma

acestei analize se observă faptul ca proba este stabilă până la 4 săptămâni deoarece valorile

absorbanței înregistrate se încadrează în limita erorilor.

În urma analizei stabilității în timp s-a observat că soluțiile de CPZ neiradiat și iradiate între 1 –

240 min pot fi utilizată 4 săptămâni, respectiv 2 săptămâni fără să-și modifice proprietățile. Benzile

cu maximele situate la 809 nm și 956 nm ce se regăsesc în spectrele de absorbție ale soluțiilor de

CPZ iradiate între 30 min și 60 min, se datorează radicalilor liberi generați în urma procesului de

expunere a CPZ la radiație UV și au un timp de viața de până la 24 h.

5.2. Studiul stabilității în timp a tioridazinei

În urma expunerii soluției de TZ dizolvat în apă ultrapură, având o concentrație de 2 mg/mL, la

un fascicul laser emis la 266 nm se poate observa încă după primul minut o schimbare a culorii

(Figura 5.3), de la o soluție transparentă, în cazul TZ neiradiat, la o soluție de culoare turcoaz

deschis, soluția devenind și mai închisă la culoare dupa 5 min de iradiere. După o expunere de

15 min a TZ la radiație UV, culoarea probei se schimbă semnificativ observându-se o trecere de la

turcoaz la galben deschis. Odată cu creșterea timpului de expunere la radiație se observă o

schimbare graduală a culorii, ajungând de la un gaben deschis, la 30 min de iradiere a TZ, la un

maro deschis după 240 de min.

Figura 5.3: Modificarea culorii soluțiilor produse prin expunerea la radiație laser a 2 mg/mL TZ

pentru perioade de timp cuprinse între 1 – 240 min

Acest aspect, reflectă formarea unor foto-produși ce absorb în domeniul vizibil și care pe

parcursul procesului de iradiere cresc în concentrație. Modificarea drastică a culorii între probele

iradiate 15 min și 30 min poate fi corelată cu rezultatele obținute în urma analizei TLC, unde

singurii foto-produși ce apar după 15 min de iradiere sunt cei mai puțini polari ce se regăsesc la

valoarea Rf de 0,822.

300 350 400 450 500 550 600

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180min

iradiat 240 min

(nm)

Ab

so

rban

ta

600 700 800 900 1000 1100 1200

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

300 350 400 450 500 550 600

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

400 450 500 550 600

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

600 700 800 900 1000 1100 1200

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

503 nm

540 nm

809 nm956 nm

831 nm 956 nm

956 nm

AI AIIIAII

BIIIBIIBI

0’ 60’30’15’5’1’ 120’ 240’180’

24

Spectrele de absorbție ale soluției de 2 mg/mL TZ neiradiate și iradiate între 1-240 min,

înregistrate imediat, la 24 h și la 48 h după terminarea procesului de iradiere sunt prezentate în

Figura 5.4. Banda responsabilă de maximul de la 315 nm suferă atât o deplasare hipsocromică cât și

una hipercromică (Figura 5.4 AI). Aceste modificări sunt însoțite de apariția altor două benzi, cu

maxime la 454 nm și 486 nm, încă după primul minut de iradiere și a caror intensitate crește odată

cu expunerea la radiație UV timp de 30 min (Figura 5.4 AII). Pentru timpi de iradiere mai mari de

30 min, cele două benzi nu se mai regasesc în spectrele de absorbție. Astfel, foto-produșii formați în

primele 15 min de iradiere sunt responsabili de benzile de absorbție de la 454 nm și 486 nm și de

culoarea turcoaz deschis a soluțiilor.

Se poate observa, din spectrele de absorbție înregistrate imediat după expunerea la fasciculul

laser, apariția a două benzi, una îngustă cu maxim la 637 nm și una largă cu maxim la 882 nm, ce

sunt prezente încă după primul minut de iradiere, având ambele un maxim al intensității absorbției

pentru soluția iradiată 5 min, urmată de o scădere în intensitate la timpi de iradiere mai mari și în

final la dispariția totală după 180 min de expunere la radiație laser (Figura 5.4 AII).

Aceste benzi au fost observate și în Ref. [9] atât pentru soluțiile de TZ expuse la lumină

ambientală cât și la radiație laser UV. Proba de TZ, la o concentrație de 10-3

M, păstrată la

temperatura camerei și expusă la lumina ambientală suferă modificări spectrale după o expunere de

45 h [9].

Figura 5.4: Spectrele de absorbție ale TZ neiradiate și iradiate între 1-240 min la o concentrație de

2 mg/mL înregistrate A) imediat dupa terminarea procesului de iradiere, în domeniul spectral: I)

280-500 nm; II) 400-1200 nm; B) după 24 h de la terminarea procesului de iradiere, în domeniul

spectral: I) 280-500 nm; II) 400-1200 nm; C) după 48 h de la terminarea procesului de iradiere, în

domeniul spectral: I) 280-500 nm; II) 400-1200 nm

În același timp, iradierea cu un fascicul laser emis la 355 nm produce același efect ca și utilizarea

celei de-a 4-a armonice a laserului cu Nd:YAG, maximele absorbanței regăsindu-se tot la 5 min de

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200

0.00

0.03

0.06

0.09

0.12

0.15 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60min

iradiat 120 min

iradiat 180 min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

637 nm

882 nm

280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180 min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

0

2

4 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180 min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180 min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

486 nm

454 nm

637 nm

AI

BI

AII

BII

280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

0

1

2

3

4 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180 min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14 neiradiat

iradiat 1 min

iradiat 5 min

iradiat 15 min

iradiat 30 min

iradiat 60 min

iradiat 120 min

iradiat 180 min

iradiat 240 min

Ab

so

rban

ta

(nm)

CI CII

25

iradiere [34]. Astfel, poate fi afirmat ca în urma utilizării unui fascicul laser emis la 266 nm sau la

355 nm, sunt generați aceeași radical liberi, responsabili de benzile de absorbție de la 637 nm și

882 nm.

În urma analizei spectrelor de absorbție înregistrare după 24 h de la terminarea procesului de

iradiere, în domeniul spectral 270-600 nm sunt vizibile modificări, existând deplasări către lungimi

de undă mai mari. În domeniul 600-1200 nm, banda cu maximul la 882 nm dispare (Figura 5.4 BIII),

iar cea cu maximul la 637 nm încă poate fi observată în spectrele de absorbție, însă doar pentru

soluțiile de TZ iradiate 1 min și 5 min. După 48 h de la terminarea procesului de iradiere, în

domeniul 270-600 nm nu mai există modificări spectrale comparativ cu cele observate după 24 h de

la terminarea procesului de iradiere, iar în domeniul 600-1200 nm, nicio banda de absorbție nu mai

este prezentă (Figura 5.4 CIII). Aceste fenomene se pot datora radicalilor liberi, ce se regăsesc în

soluția de TZ expusă la radiație UV.

Pentru a determina stabilitatea în timp a probelor de TZ neiradiate și iradiate pe parcursul a

4 săptămâni, pentru fiecare soluție s-au analizat spectrele de absorbție la 0 h, 24 h, 48 h, 1

săptămână, 2, 3 și la 4 săptămâni.

În urma analizei stabilității în timp s-a observat că soluțiile de TZ neiradiată și iradiată între 1 –

240 min pot fi utilizate 4 săptămâni, respectiv 2 săptămâni pentru probele expuse la radiație UV

între 1-120 min și 1 săptămână pentru cele iradiate 180 min și 240 min, fără ca soluțiile să-și

modifice proprietățile.

5.3. Concluzii

Stabilitatea soluțiilor, neiradiate și iradiate cu un fascicul laser emis la 266 nm, de CPZ și TZ a

fost analizată prin spectroscopie de absorbție UV-Vis-NIR la diferite intervale de timp: imediat

(0 h), la 24 h, 48 h, 1 săptămână, 2 săptămâni, 3 săptămâni și la 4 săptămâni după terminarea

procesului de iradiere.

Soluția de CPZ neiradiată poate fi păstrată la întuneric și la o temperatură de 4oC timp de

4 săptămâni fără să-și modifice proprietățile. Probele iradiate între 1- 240 min se stabilizează după

24 h și rămân stabile doar 2 săptămâni de la terminarea procesului de iradiere. De asemenea, pe

parcursul iradierii se poate observa încă după primele 5 min o schimbare a culorii, de la o soluție

transparentă în cazul CPZ neiradiat la o soluție de culoare galben deschis. Odată cu creșterea

timpului de expunere la radiație UV, se observă o schimbare graduală a culorii, ajungând după

240 min de iradiere la maro închis.

Studiul stabilității în timp efectuat pentru soluția de TZ neiradiată sugerează că proba este stabilă

timp de 3 săptămâni. Soluțiile de TZ iradiate 1 min și 5 min se stabilizează după 48 h și rămân

stabile 2 săptămâni, iar cele iradiate între 15-240 min se stabilizează după 24 h și sunt stabile timp

de 2 săptămâni, cu excepția celor expuse la radiație laser 180 min și 240 min, unde soluțiile sunt

stabile doar o săptămână.

Prin urmare, soluțiile iradiate pot fi utilizate în testarea susceptibilității micro-organismelor la

CPZ, după 24 h și nu mai târziu de 2 săptămâni de la terminarea procesului de iradiere și la TZ după

48 h și nu mai târziu de 2 săptămâni in cazul celor expuse la radiație laser 1 min și 5 min si după

24 h și nu mai târziu de 2 săptămâni pentru cele iradiate între 15-240 min, cu excepția probelor

iradiate 180 min și 240 min care pot fi utilizate doar o săptămâna.

26

6. Studiul susceptibilității micro-organismelor la soluțiile de

fenotiazine expuse la radiație laser UV Din momentul în care au fost descoperite, antibioticele au fost și sunt medicamente esențiale

pentru tratarea bolilor infecțioase cauzate de bacterii. Multe dintre antibioticele disponibile nu mai

sunt eficiente, deoarece bacteriile au dezvoltat rezistență la acestea datorită tratamentelor

inadecvate, automedicației, vânzării de antibiotice contrafăcute în combinație cu antibiotice reale,

etc. Bacteriile rezistente sunt larg răspândite și numărul lor continuă să crească în întreaga lume. În

ultimii ani, industria farmaceutică fie a încetinit, fie a oprit complet cercetarea de noi antibiotice. În

prezent se lucrează la examinarea cauzelor rezistenței și se elaborează noi strategii care să garanteze

nu numai dezvoltarea de noi molecule, dar și păstrarea celor existente [52].

Studii recente cu privire la activitatea antimicrobiană a clorpromazinei iradiate, la o concentrație

de 20 mg/mL, au aratat ca soluțiile expuse la radiație laser UV pot fi utilizate în tratarea infecțiilor

bacteriene gram-pozitive și gram-negative. În ceea ce privește efectele citotoxice, soluțiile iradiate

prezintă o toxicitate mai mică decât compusul parental pentru liniile celulare umane acute de

leucemie monocitară, fibroblaste murine Swiss albino și carcinoame epiteliale umane [53-54] [33].

Comparativ cu rezultatele anterioare obținute pe bacterii, sunt necesare studii ample și

amănunțite privind activitatea antimicrobiană și anticancer a derivaților fenotiazinici pe un număr

cat mai mare și diversificat de bacterii, fungi și culturi de celule canceroase. De asemenea, este

necesară o evaluare a siguranței foto-produșilor obținuți în vederea utilizării în tratarea infecțiilor.

6.1. Descrierea metodelor experimentale

Testele in vitro, precum concentrația minimă inhibitorie (CMI) și concentrația minimă de

eradicare a biofilmului (CMEB) sunt cele mai utilizate pentru a testa susceptibilitatea bacteriilor la

medicamente. Soluțiile de non-antibiotice, CPZ și TZ, expuse la radiație laser UV pentru diferiți

timpi de iradiere au fost testate pe diferite tipuri de bacterii și fungi cu scopul de a determina

susceptibilitatea micro-organismelor la amestecul de foto-produși [55].

Micro-organismele utilizate în aceste teste au fost atât bacterii gram-pozitive: S. aureus 6538,

S. aureus MSSA, S. aureus MRSA, E. faecium 17-VAR, E. faecalis 2921, B. subtilis 6633 și gram-

negative: A. baumanii complex 230, P. aeruginosa 27833, K. pneumoniae 40, Ent. cloacae 56,

E. coli 8735 cât și fungi: C. neoformans 204092 și C. albicans 26790.

Pentru fiecare valoare CMI și CMEB obținută în cazul bacteriilor și fungilor s-a determinat

deviația standard care este reprezentată, dacă este diferită de zero, în fiecare grafic. În statistică și în

teoria probabilităților, deviația standard reprezintă un indice al variabilității dintr-un set de date

[56].

Pentru evaluarea toxicității soluțiilor de fenotiazine expuse la radiație laser a fost efectuat un test

metabolic, care măsoară capacitatea reducătoare a celulelor prin determinarea activității unor

dehidrogenaze NADH și NADPH dependente și se bazează pe reducerea unei sări de tetrazoliu

(MTT) galbenă, în celulele viabile, la un precipitat violet (săruri de formazan) ce poate fi ulterior

determinată spectrofotometric. Testul a fost efectuat în condiții de blocare a proliferării cu

actinomicina D (pentru a evita interferența efectului citotoxic cu cel antiproliferativ), pe liniile

celulare L929 – fibroblaste murine și SW403 – celule de adenocarcinom colorectal. Probele

codificate cu i (inițial) sunt cele iradiate 2 h, testate în ziua iradierii, restul sunt testate la 24 h după

iradiere.

27

6.2. Susceptibilitatea micro-organismelor la clorpromazina neiradiată și iradiată între 1 min și 240 min

6.2.1. Analiza concentrației minime inhibitorii

Activitatea in vitro a CPZ în cazul bacteriilor gram-pozitive S. aureus 6538, S. aureus MSSA,

S. aureus MRSA, E. faecium 17-VAR, E. faecalis 2921, B. subtilis 6633 este evidențiată în

Figura 6.1. În graficele ce urmează, pentru fiecare valoare CMI obținută în cazul bacteriilor și

fungilor este prezentă deviația standard care este reprezentată, dacă este diferită de zero, în fiecare

grafic.

Figura 6.1: Activitatea antibacteriană in vitro a CPZ, determinată prin valorile CMI, pentru

S. aureus 6538, S. aureus MSSA, S. aureus MRSA, B. subtilis 6633 și E. faecium 17-VAR

Analiza arată în cazul S. aureus 6538 o valoare a CMI pentru CPZ neiradiat de 82,5 µg/mL,

valoare ce este redusă la jumătate, 41,3 µg/mL, după doar 1 min de iradiere, iar timpul optim de

iradiere este de 30 min, unde se obține cea mai mică valoare CMI, respectiv 2,58 µg/mL. Astfel

pentru S. aureus MSSA (meticileno-sensibil) se observă aceeași dependență a valorii CMI față de

timpul de iradiere, fiind suficientă o iradiere de doar 30 min pentru a obține o activitate

antimicrobiană îmbunătățită de până la 16 ori comparativ cu cea a CPZ neiradiat.

În cazul testării susceptibilității S. aureus MRSA la CPZ neiradiat și iradiat, timpul optim de

iradiere în acest caz este de 15 min, unde rezultă o valoare CMI de 5,16 µg/mL. Pentru E. faecium

17-VAR (tuplină rezistentă la vancomicină) s-a obținut pentru iradiate între 15 și 60 min, valoarea

CMI obținută scade semnificativ, ajungând la 2,58 µg/mL. La timpi de iradiere mai mari, crește

până la 10,3 µg/mL. Și în acest caz, timpul optim necesar de iradiere a CPZ este de 15 min.

Bacteria B. subtilis 6633 s-a dovedit a fi susceptibilă atât la CPZ neiradiat cât și cel iradiat, unde

pentru Pentru probele iradiate între 15 min și 120 min, valorile CMI au fost de 5,16 µg/mL. Prin

urmare, se poate observa o îmbunătățire a activității antimicrobiene de până la 16 ori, iar timpul

optim de iradiere și în acest caz este de 15 min.

Testele in vitro pe tulpina E. faecalis 2921 sugerează un timpul optim de expunere a CPZ la un

fascicul laser emis la 266 nm, cu scopul de a obține efectul antimicrobian cel mai bun este de

15 min.

Aceeași activitate in vitro a CPZ a fost determinată și în cazul bacteriilor gram-negative

A. baumanii complex 230, P. aeruginosa 27833, K. pneumoniae 40, Ent. cloacae 56 și E. coli 8735

și este prezentată în Figura 6.2. Diferența fundamentală între tipurile de bacterii gram-pozitive și

gram-negative este dată de faptul că ultima prezintă în plus față de cealaltă o membrană exterioară,

ceea ce îi conferă capacitatea de a fi mai puțin susceptibilă la antibiotice decât bacteriile gram-

pozitive [57].

0 1 15 30 60 120 180 240

S. aureus 6538 82.50 41.30 5.16 2.58 2.58 2.58 5.16 5.16

S. aureus MSSA 82.50 41.30 5.16 2.58 2.58 5.16 5.16 10.30

S. aureus MRSA 82.50 41.30 5.16 5.16 5.16 5.16 10.30 10.30

E. faecalis 29212 82.50 41.30 10.30 10.30 20.60 20.60 41.30 41.30

B. subtilis 6633 82.50 41.30 5.16 5.16 5.16 5.16 10.30 10.30

E. faecium 17-VAR 82.50 20.60 2.58 2.58 2.58 5.16 10.30 10.30

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CM

I (µ

g/m

L)

timp (min)

28

Testele de susceptibilitate a bacteriilor gram-negative la CPZ neiradiat și iradiat sugerează o

acțiune antimicrobiană mai mică comparativ cu cazul bacteriilor gram-pozitive. Astfel, pentru

A. baumanii complex 230 valoarea CMI cea mai mică este obținută pentru timpii de iradiere de 15,

30 și 60 min, fiind 5,16 µg/mL. În urma analizei, se poate spune că după 120 min de iradiere

eficiența compusului scade, timpul optim de iradiere fiind de 15 min.

În cazul tulpinii P. aeruginosa 27833, nu se poate observă nicio îmbunătățire a activității CPZ

iradiat comparativ cu cel neiradiat, valoarea CMI fiind de 330 µg/mL pentru toate soluțiile testate.

Tulpina K. pneumoniae 40 s-a dovedit a fi rezistentă la probele iradiate, deoarece cea mai mică

valoarea a CMI rezultată pentru toți timpii de iradiere este de 82,5 µg/mL, fiind de 2 ori mai mică

decât cea obținută pentru CPZ neiradiat, respectiv 165 µg/mL.

Figura 6.2: Activitatea antibacteriană in vitro a CPZ determinată de valorile CMI pentru

A. baumanii complex 230, P. aeruginosa 27833, K. pneumoniae 40, Ent. cloacae 56 și E. coli 8735

În cazul bacteriei Ent. cloacae 56, s-a observat o susceptibilitate mai mare a CPZ iradiat 1 min

comparativ cu cel neiradiat, pentru care CMI a fost de 82,5 µg/mL. Pentru restul probelor valorile

CMI cresc odată cu creșterea timpului de expunere, ajungând la 330 µg/mL. Analiza activității anti-

microbiene a CPZ neiradiat asupra tulpinii de E. coli 8735 prezintă un timpul optim de iradiere a

probei de CPZ este de 15 min.

În afara determinării susceptibilității bacteriilor gram-pozitive și gram negative la CPZ neiradiat

și iradiat pentru diferite perioade de timp, aceleași analize s-au făcut și în cazul fungilor

C. neoformans 204092 și C. albicans 26790, iar valorile CMI sunt evidențiate în Figura 6.3.

Activitatea antibacteriană a CPZ asupra C. neoformans 204092, reprezentată de valoarea CMI,

sugerează o îmbunătățire a activității antimicrobiene, obținându-se cea mai mică valoare CMI

pentru o iradiere de 30 min.

Figura 6.3: Activitatea antibacteriană in vitro a CPZ determinată de valorile CMI obținute în cazul

fungilor C. neoformans 204092 și C. albicans 26790

0 1 15 30 60 120 180 240

A. baumanii complex 230 41.30 41.30 5.16 5.16 5.16 10.30 20.60 20.60

P.aeruginosa 27833 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00

K. pneumoniae 40 165.00 82.50 165.00 165.00 330.00 330.00 330.00 330.00

Ent. cloacae 56 82.50 82.50 330.00 330.00 165.00 165.00 330.00 330.00

E. coli 8735 82.50 41.30 10.30 10.30 20.60 20.60 41.30 41.30

0

50

100

150

200

250

300

350

CM

I (µ

g/m

L)

timp (min)

0 1 15 30 60 120 180 240

C.neoformans 204092 10.30 10.30 5.16 2.58 5.16 5.16 10.30 10.30

C. albicans 26790 41.30 41.30 10.30 20.60 41.30 41.30 82.50 330.00

0

50

100

150

200

250

300

350

CM

I (µ

g/m

L)

timp (min)

29

Valorile CMI obținute pentru probele de CPZ neiradiat și iradiate intervale de timp între 1 min și

240 min arată că timpul optim de iradiere a probelor cu un fascicul laser emis la 266 nm de către un

laser Nd:YAG, având o energie medie per puls de 6,5 mJ, este de 15 min, cu excepția bacteriilor

Ent cloacae 56 și C. neoformans 204092 pentru care sunt necesare doar 30 min de expunere la

radiație UV.

C. albicans 26790 s-a dovedit a fi rezistentă la probele de CPZ iradiate deoarece comparativ cu

rezultatele obținute pentru C. neoformans 20409. Cea mai mica valoare CMI este obținută pentru

proba iradiată 15 min, urmată de creșterea odată cu prelungirea expunerii la fasciculul laser,

ajungând până la 330 µg/mL în cazul iradierii timp de 240 min.

6.2.2. Analiza concentrației minime de eradicare a biofilmului

Biofilmele bacteriene sunt consorții multicelulare în care celulele sunt încorporate într-o matrice

extracelulară, acestea fiind distribuite una lângă alta. Aceste consorții sunt în general studiate pentru

a evalua proprietățile particulare ale biofilmelor atașate la suprafețe solide, care însă pot să se

formeze, de asemenea, și ca agregate multicelulare, flocoane dar și granule suspendate în fază

apoasă, ce pot fi caracterizate de specii unice sau mixte [58].

Testarea susceptibilității micro-organismelor la 2 mg/mL CPZ, neiradiat și iradiatat între

1-240 min cu un fascicul laser emis la 266 nm, a fost determinată și prin analizarea concentrației

minime de eradicare a biofilmului (CMEB). Pentru acest tip de analiza, au fost studiate bacteriile

care au format biofilme la interacția cu suprafața godeurilor din plăcile de micro-titrare. Astfel, din

clasa bacteriilor gram-pozitive S. aureus 6538, S. aureus MSSA, S.aureus MRSA, B. subtilis 6633 și

din clasa celor gram-negative A. Baumanii complex 230 și P. Aeruginosa 27833 au fost cele care

au dezvoltat biofilm în godeul ce reprezintă martorul pozitiv (mediul de cultură și bacteria).

În Figura 6.4 sunt prezentate rezultatele obținute în urma determinării CMEB pentru bacteriile

gram-pozitive S. aureus 6538, S.aureus MSSA, S.aureus MRSA, B. subtilis 6633 unde, pentru

soluția de CPZ neiradiat și iradiat 1 min, au rezultat aceleași valori CMEB pentru toate tipurile de

bacterii, respectiv 165 µg/mL și 41,30 µg/mL.

Pentru un timp de expunere de 15 min, 30 min și 60 min, în cazul S.aureus MSSA, S. aureus

MRSA și B. subtilis 6633 a rezultat valoarea CMEB de 5,16 µg/mL, iar în cazul S. aureus 6538 s-a

obținut 2,58 µg/mL. Odată cu creșterea timpului de iradiere se poate observa și o scădere a

eficienței soluțiilor testate deoarece valorile CMEB cresc.

Figura 6.4: Analiza determinării valorilor CMEB a 2 mg/mL CPZ neiradiat și iradiat între 1 min și

240 min pentru S. aureus 6538, S. aureus MSSA, S. aureus MRSA și B. subtilis 6633

Comparând rezultatele analizelor CMI și CMEB asupra bacteriilor gram-pozitive se poate afirma

că soluțiile de CPZ iradiate timp de 15 min și 30 min distrug eficient atât bacteriile planctonice cât

și cele sub formă de biofilm la aproximativ aceleași concentrații și pentru același timp de iradiere.

În cazul micro-organismelor S. aureus 6538 se obțin cele mai bune valori CMI și CMEB la

0 1 15 30 60 120 180 240

S. aureus MSSA 165.00 41.30 5.16 5.16 5.16 10.30 20.60 41.30

S. aureus MRSA 165.00 41.30 5.16 5.16 5.16 10.30 10.30 20.60

S. aureus 6538 165.00 41.30 2.58 2.58 2.58 5.16 5.16 5.16

B. subtililis 6633 165.00 41.30 5.16 5.16 5.16 10.30 10.30 41.30

0

50

100

150

200

250

CM

EB (µ

g/m

L)

timp (min)

30

2,58 µg/mL pentru soluția de CPZ iradiată 30 min și în cazul S. aureus MRSA și B. Subtilis 6633 la

5,16 µg/mL pentru un timp de expunere la radiație laser a CPZ timp de 15 min.

Valorile CMEB determinate în cazul bacteriilor gram-negative sunt prezentate în Figura 6.5,

unde analiza concentrației minime de eradicare a biofilmului în cazul tulpinii P. aeruginosa 27833

sugerează faptul ca nu există nicio diferență din punct de vedere al activității antibiofilm a CPZ

neiradiat cât și a celui iradiat între 1 min și 240 min.

Figura 6.5: Analiza determinării valorilor CMEB a 2 mg/mL CPZ neiradiat și iradiat între 1 min și

240 min pentru A. baumanii complex 230 și P. aeruginosa 27833

În cazul tulpinii A. baumanii complex 230, se poate observa o îmbunătățire a activității

antibiofilm a CPZ iradiat între 30 min și 60 min, pentru care s-a obținut valoarea CMEB de

5,16 µg/mL, fiind de 32 ori mai mică decât cea obținută pentru soluția neiradiată. Astfel se poate

spune că timpul optim de iradiere a 2 mg/mL CPZ este de 30 min. Ca și în cazul bacteriilor gram-

pozitive, pentru tulpina A. Baumanii complex 230 se poate afirma că soluția de CPZ iradiată

distruge eficient atât bacteriile planctonice cât și cele sub formă de biofilm la aceleași concentrații și

pentru același timp de iradiere. Rezultatele obținute sugerează faptul că CPZ poate fi utilizat cu

succes în tratarea infecțiilor bacteriene și fungice pentru timpi optimi de expunere la radiație laser

între 15 min și 30 min.

6.3. Susceptibilitatea micro-organismelor la tioridazina neiradiată și iradiată

între 1 min și 240 min

6.3.1. Analiza concentrației minime inhibitorii

Activitatea in vitro a TZ în cazul bacteriilor gram-pozitive S. aureus 6538, S. aureus MSSA,

S. aureus MRSA, E. faecium 17-VAR, E. faecalis 2921, B. subtilis 6633 este evidențiată în Figura

6.6. Analiza în cazul S. aureus 6538 prezintă o îmbunătățire de aproximativ 10 ori mai mare a

activității antibacteriene a TZ iradiat comparativ cu cel neiradiat, de la 2,58 µg/mL la 20,63 µg/mL,

fiind necesară o iradiere cu un fascicul laser emis la 266 nm timp de 120 min. Pentru S. aureus

MSSA (meticileno-sensibil) se observă exact aceeași dependență a valorii CMI față de timpul de

iradiere, fiind suficientă o iradiere de 120 min pentru a obține o activitate antimicrobiană

îmbunătățită de până la de 10 ori comparativ cu cea a TZ neiradiat.

În cazul testării susceptibilității S. aureus MRSA, pentru probele iradiate între 15 min și 240 min

se obține aceeași valoare CMI de 2,58 µg/mL, cu excepția probei iradiate 30 min pentru care s-a

obținut 5,16 µg/mL. Prin urmare timpul optim de iradiere în acest caz este de 15 min.

Pentru E. faecium 17-VAR (tulpină rezistentă la vancomicină) s-a obținut în cazul TZ iradiat

120 și 240 min s-a obținut o valoare CMI minimă de 2,58 µg/mL. În acest caz timpul optim necesar

de iradiere a TZ este de 60 min.

0 1 15 30 60 120 180 240


P.aeruginosa 27833 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00 330.00

0

50

100

150

200

250

300

350

CM

EB (

µg

/mL)

timp (min)

31

În cazul tulpinii E. faecalis 2921, valoarea CMI pentru proba de TZ neiradiat este de

20,63 µg/mL. Pentru probele iradiate între 15 min și 180 min se obține aceeași valoare CMI de

10,31 µg/mL, cu excepția probei iradiate 30 min pentru care s-a obținut 20,6 µg/mL. Și în acest caz

timpul optim de iradiere a TZ este de15 min.

Figura 6.6: Activitatea antibacteriană in vitro a TZ, determinată prin valorile CMI pentru

A) S. aureus 6538, S. aureus MSSA și S. aureus MRSA, E. faecium 17-VAR și E. faecalis 2921;

B) B. subtilis 6633

Bacteria B. subtilis 6633 s-a dovedit a avea o susceptibilitate mică atât la TZ neiradiat cât și

iradiat comparativ cu celelalte bacterii gram-pozitive testate. Dacă în cazul probei neiradiate s-a

obținut un CMI de 330 µg/mL, pentru probele iradiate între 15 min și 120 min, s-au obținut valori

ale CMI de 165,5 µg/mL. Crescând timpul la 180 min și 240 min, valoarea CMI este aceeași ca și în

cazul probei neiradiate, respectiv 330 µg/mL.

Aceeași activitate in vitro a TZ a fost determinată și în cazul bacteriilor gram-negative

A. baumanii complex 230, P. aeruginosa 27833, K. pneumoniae 40 și Ent. cloacae 56 și este

prezentată în Figura 6.7. Testele de susceptibilitate a bacteriilor gram-negative la TZ neiradiat și

iradiat sugerează o acțiune antimicrobiană mai mică comparativ cu studiile efectuate pe bacteriile

gram-pozitive. Astfel, pentru A. baumanii complex 230 valoarea CMI pentru TZ neiradiat este de

41,25 µg/mL și rămâne aceeași pentru toți timpii de iradiere. Prin urmare, în cazul acestei tulpini,

nu se observă nicio îmbunătățire a activității antibacteriane a probelor iradiate.

Figura 6.7: Activitatea antimicrobiană in vitro a TZ, determinată prin valorile CMI pentru

A. baumanii complex 230, P. aeruginosa 27833, K. pneumoniae 40 și Ent. cloacae 56

În cazul tulpinii P. aeruginosa 27833, activitatea TZ neiradiat este mai mică decât pentru

A. baumanii complex 230, valoarea CMI fiind de 165 µg/mL. Activitatea cea mai bună este dată de

proba iradiată 30 min sau 60 min pentru un CMI de 82,5 µg/mL.

0 1 15 30 60 120 180 240


P.aeruginosa 27833 165.00 165.00 165.00 82.50 82.50 165.00 330.00 330.00

K. pneumoniae 40 165.00 165.00 165.00 82.50 82.50 165.00 330.00 330.00

Ent. cloacae 56 330.00 330.00 82.50 82.50 82.50 165.00 165.00 165.00

0

50

100

150

200

250

300

350

CM

I (µ

g/m

L)

timp (min)

0 1 15 30 60 120 180 240

S. aureus 6538 20.63 10.31 10.31 5.16 5.16 2.58 2.58 2.58

S. aureus MSSA 20.63 20.63 10.31 5.16 5.16 2.58 2.58 2.58

S. aureus MRSA 20.63 20.63 2.58 5.16 2.58 2.58 2.58 5.16

Enterococcus faecium 17-VAR 20.63 20.63 10.31 2.58 1.29 2.58 2.58 2.58

Enterococcus faecalis 2921 20.63 20.63 10.31 20.60 10.31 10.31 10.31 20.63

0

5

10

15

20

25

30

35

CM

I (µ

g/m

L)

timp (min)

32

Pentru tulpina K. pneumoniae 40 s-a obținut aceeași dependență a valorii CMI față de timpii de

iradiere ca și în cazul P. aeruginosa 27833. Astfel, pentru proba neiradiată s-a obținut o valoare de

165 µg/mL, iar pentru cele iradiate valoarea CMI cea mai mică s-a obținut pentru timpii de iradiere

30 min și 60 min, respectiv 82,5 µg/mL.; astfel, se poate spune ca timpul optim de iradiere este și în

acest caz de 30 min.

În cazul bacteriei Ent. cloacae 56, s-a observat aceeași susceptibilitate la TZ neiradiat și iradiat

1 min, respectiv 330 µg/mL. Pentru timpii de iradiere 15 min, 30 min și 60 min s-a obținut

82,5 µg/mL, valoare de 4 ori mai mică decât pentru TZ neiradiat. Prin urmare, pentru acest tip de

bacterie, timpul optim de iradiere al TZ este de 15 min.

În afara determinării susceptibilității bacteriilor gram-pozitive și gram negative la TZ neiradiat

și iradiat pentru diferite perioade de timp, aceeași analiză s-a făcut și în cazul ciupercilor

C. neoformans 204092 și C. albicans 26790, unde valorile CMI sunt evidențiate în Figura 6.8.

Activitatea antibacteriană a TZ asupra C. neoformans 204092, reprezentată prin valoarea CMI

sugerează o îmbunătățire a acesteia obținându-se o valoare de 5,16 µg/mL pentru CPZ neiradiat,

iradiat 1 min și 5 min, iar la 30 min de iradiere se obține 1,29 µg/mL. Pentru ceilalți timpi de

iradiere se obține aceeași valorare a CMI de 1,29 µg/mL sugerând ca proba iradiată cel puțin 30 min

este de 4 ori mai eficientă decât TZ neiradiat.

C. albicans 26790 s-a dovedit a fi mai rezistent la probele de TZ neiradiat și iradiat decât

C. neoformans 204092. Comparativ cu TZ neiradiat pentru care s-a obținut o valoare a CMI de

10,31 µg/mL, pentru restul probelor iradiate s-a obținut o valoare mai mică doar de două ori, cu

excepția celor iradiate 1 min, 15 min și 30 min care au prezentat aceeași valoare precum CPZ

neiradiat. În acest caz, timpul optim de iradiere este de 60 min.

Figura 6.8: Activitatea antimicrobiană in vitro a TZ, determinată de valorile CMI obținute în cazul

fungilor C. neoformans 204092 și C. albicans 26790

Valorile CMI obținute pentru probele de TZ neiradiat și iradiat intervale de timp între 1 min și

240 min arată ca timpul optim de iradiere a probelor cu un fascicul laser emis la 266 nm de către un

laser Nd:YAG, având o energie medie per puls de 6,5 mJ, variază pentru fiecare bacterie în parte.

Astfel, pentru bacteriile gram-pozitive S. aureus MRSA și B. subtilis 6633 și gram-negative

Ent. cloacae 56, timpul optim de iradiere este de 15 min, pentru bacteria gram-negativa

K. pneumoniae 40 și ciuperca C. neoformans 204092 de 30 min, pentru bacteriile gram-pozitive

E. faecium 17-VAR, E. faecalis 2921 și ciuperca C. albicans 26790 de 60 min și pentru cele gram-

pozitive S. aureus 6538 și S. aureus MSSA de 120 min. Pentru bacteria gram-negativa A. baumanii

complex 230, TZ iradiat nu prezintă nicio activitate antibacteriană îmbunătățită față de proba

neiradiată

Ca și în cazul CPZ, pentru toate micro-organismele studiate, activitatea antibacteriană a probelor

iradiate este mai pronunțată decât în cazul probei neiradiate, foto-produșii generați fie acționând

individual, fie într-un mod sinergic, cu excepția bacteriei A. baumanii complex 230, unde nu s-a

observat nicio modificare a valorii CMI. Pentru TZ iradiat, diferențele între valorile CMI ale

0 1 15 30 60 120 180 240

C.neoformans 204092 5.16 5.16 5.16 1.29 1.29 1.29 1.29 1.29

C. albicans 26790 10.31 10.31 10.31 10.31 5.16 5.16 5.16 5.16

0

2

4

6

8

10

12

CM

I (µ

g/m

L)

timp (min)

33

substanței neiradiate și iradiate la intervale de timp între 1 min și 240 min nu au fost la fel de

pronunțate ca în cazul CPZ.

Prin urmare, iradierea cu un fascicul laser emis la 266 nm a unei probe de TZ având o

concentrație de 2 mg/mL pentru diferite perioade de timp produce modificări foto-chimice la

nivelul structurii moleculare ce are ca rezultat final o activitate antibacteriană îmbunătățită

comparativ cu cea a TZ neiradiat.

6.3.2. Analiza concentrației minime de eradicare a biofilmului

Proprietatea a 2 mg/mL TZ neiradiat și iradiat, perioade de timp între 1 min și 240 min, de a

eradica biofilmul, atât în cazul micro-organismelor menționate în studiul anterior, este

exemplificată în studiile prezentate în acest sub-subcapitol prin determinarea valorilor CMEB.

Pentru acest tip de analiză, au fost studiate bacteriile care au format biofilme la interfața cu

suprafața godeurilor din plăcile de micro-titrare. Astfel, din clasa bacteriilor gram-pozitive

S. aureus 6538, S.aureus MSSA, B. subtilis 6633 și E. faecalis 2921 și din clasa celor gram-negative

Ent. cloacae 56 și K. pneumoniae 40 au fost cele care au dezvoltat biofilm în godeul ce reprezintă

martorul pozitiv (mediul de cultură și bacteria).

Valorile CMEB determinate în cazul bacteriilor gram-pozitive sunt prezentate în Figura 6.9,

unde analiza concentrației minime de eradicare a biofilmului în cazul S. aureus 6538 prezintă o

valoare CMEB a probei de TZ neiradiat de 10,31 µg/mL, valoare ce scade pe parcursul expunerii

soluției la radiație laser, la 2,58 µg/mL între 1 min și 60 min. Valori îmbunătățite ale CMEB se

obțin pentru probele iradiate 120 min, 180 min și 240 min, respectiv 1,29 µg/mL. Ca și în cazul

valorilor CMI, timpul de iradiere optim pentru a distruge biofilmul creat de bacterii la interacția cu

suprafața de polipropilenă este de 120 min.

Figura 6.9: Analiza determinării valorilor CMEB a 2 mg/mL TZ neiradiat și iradiat între 1 min și

240 min pentru S. aureus 6538, S.aureus MSSA și E. faecalis 2921

În cazul tulpinii S.aureus MSSA, pentru TZ neiradiat se obține o valoare CMEB de 10,31 µg/mL

și după doar 1 min aceasta este de 2 ori mai mică. Acțiunea TZ asupra formării biofilmului de către

aceste micro-organisme se intensifică odată cu creșterea perioadei de expunere a probei la radiație

laser UV, fiind de aproximativ 8 ori mai puternică pentru un timp de iradiere de 120 min.

În cazul tulpinii E. faecalis 2921, valoarea CMEB pentru proba de TZ neiradiat este de

20,63 µg/mL, la fel ca și CMI, și rămâne constantă până la 30 min de expunere a soluției la radiație

laser. Pentru proba iradiată 60 min, se poate observa o îmbunătățire, valoarea CMEB fiind mai mică

de 2 ori, respectiv 10,31 µg/mL.

Ca și în cazul analizei CMI, biofilmul format de bacteria B. subtilis 6633 s-a dovedit a fi

rezistent atât la TZ neiradiat cât și cel iradiat comparativ cu celelalte bacterii gram-pozitive testate.

Dacă în cazul probei neiradiate s-a obținut un CMI de 330 µg/mL, iar pentru probele iradiate între

15 min și 30 min, s-au obținut valori ale CMI de 165,5 µg/mL. Iradiind pentru o perioadă mai lungă

de timp, mai mare de 30 min, se obține aceeași valoare a CMEB ca și în cazul TZ neiradiat,

respectiv 330 µg/mL.

Valorile CMEB determinate în cazul bacteriilor gram-negative sunt prezentate în Figura 6.10,

unde analiza concentrației minime de eradicare a biofilmului la K. pneumoniae 40 sugerează faptul

0 1 15 30 60 120 180 240

S. aureus 6538 10.31 2.58 2.58 5.16 2.58 1.29 1.29 1.29

S. aureus MSSA 10.31 5.16 5.16 2.58 2.58 1.29 2.58 5.16

Enterococcus faecalis 2921 20.63 20.63 20.63 20.63 10.31 10.31 82.50 10.31

0

20

40

60

80

100

120

140

CM

EB (µ

g/m

L)

timp (min)

34

ca nu există nicio diferență din punct de vedere al activității antibiofilm a TZ neiradiat cât și a celui

iradiat între 1 min și 240 min.

În cazul tulpinii Ent. cloacae 56, se poate observa o îmbunătățire a activității antibiofilm a TZ

iradiat între 15 min și 240 min, pentru care s-a obținut valoarea CMEB de 10,31 µg/mL, fiind de

2 ori mai mică decât cea obținută pentru soluția neiradiată și cea iradiată 1 min.

Figura 6.10: Analiza determinării valorilor CMEB a 2 mg/mL TZ neiradiat și iradiat între 1 min și

240 min pentru K. pneumoniae 40 si Ent. cloacae 56

Astfel se poate spune ca timpul optim de iradiere a 2 mg/mL TZ este de 15 min. Comparativ cu

valorile CMI, cele CMEB sunt de aproximativ 16 ori mai mici pentru proba neiradiată și de

aproximativ 8 ori mai mici pentru proba iradiată 15 min, sugerând ca această soluție este mai

eficientă în inhibarea formării de biofilm decât în distrugerea bacteriei.

6.4. Evaluarea toxicității soluțiilor de fenotiazine

Liniile de celule au fost testate atât pentru CPZ neiradiat și iradiat 15 min, 60 min și 120 min la

24 h după terminarea procesului de iradiere și pentru CPZ iradiat 120 min la câteva ore de iradiere

cât și pentru TZ iradiat 5, 60 și 120 min la 24 h după terminarea procesului de iradiere și la câteva

ore după expunerea la radiație UV pentru proba iradiată 5 min. Timpii de iradiere au fost aleși

pentru testarea soluțiilor la câteva ore după terminarea procesului de foto-degradare cu scopul de a

studia acțiunea radicalilor liberi formați ca urmare a acestui proces și care se regăsesc la

concentrații maxime la timpii de expunere de 120 min și 5 min pentru CPZ și respectiv, TZ.

Radicalii liberi au fost evidențiați prin spectroscopie UV-Vis-NIR și nu se mai regăsesc după 24 h

în probele de CPZ și TZ iradiate 120 min și respectiv 5 min.

Pentru toate probele testate, a putut fi calculată valoarea ED50 în intervalul de concentrații

utilizat. Pentru fenotiazinele neiradiate TZ (Tabel 6.2) a prezentat o activitate citotoxică mai

puternică decât CPZ pe ambele linii de celule testate, manifestată prin deplasarea valorii ED50 către

concentrații mai mici de substanță.

Tabel 6.1: Valorile ED50 (mg/mL) obținute pentru liniile de celule L929 și SW403 tratate cu

actinomicina D în cazul utilizării CPZ neiradiat și iradiat

CPZ.0 CPZ.15 CPZ.60 CPZ.120 CPZi.120

L929 11,01 13,05 18,53 31,44 18,94

SW403 15,89 24,43 34,79 48,353 27,1

Tabel 6.2: Valorile ED50 (mg/mL) obținute pentru liniile de celule L929 și SW403 tratate cu

actinomicina D în cazul utilizării TZ neiradiat și iradiat

TZ.0 TZ.5 TZ.60 TZ.120 TZi.5

L929 7,53 9,64 15,13 16,92 15,15

SW403 14,23 15,79 22,7 23,99 26,1

0 1 15 30 60 120 180 240

K. pneumoniae 40 10.31 10.31 10.31 10.31 10.31 20.63 20.63 10.31

Ent. cloacae 56 20.63 20.63 10.31 10.31 10.31 10.31 10.31 10.31

0

5

10

15

20

25

30

35

CM

EB (

µg

/mL)

timp (min)

35

În cazul ambelor fenotiazine testate pe linia celulară L929, ca urmare a iradierii se observă

creșterea ED50 (toxicitate mai mică), în proporționalitate directă cu timpul de iradiere, efectul fiind

mai puternic pentru CPZ (Tabel 6.1). Pentru CPZ neiradiat valoarea ED50 este de 11,01 mg/mL, în

comparație cu 31,44 mg/mL pentru iradierea de 2 h, iar pentru TZ neiradiat s-a înregistrat o valoare

de 7,53 mg/mL în comparație cu 16,9 mg/mL pentru iradiere 2h. Pe celulele de adenocarcinom

colorectal SW403, tendințele observate se mențin, dar concentrațiile la care este calculat ED50 sunt

mai mici, în comparație cu L929.

Notabil, pentru proba de CPZ iradiată 2 h aplicată pe celule, la scurt timp după preparare,

efectul citotoxic determinat a fost mai mare decât pentru aceeași probă testată 24 h mai târziu.

Astfel, pentru liniile de celule L929, proba de CPZ iradiată 120 min și testată în ziua iradierii,

prezintă o valoare ED50 de 18,94 mg/mL comparativ cu 31,44 mg/mL pentru CPZ iradiat 2 h și

testată după 24 h. Acest efect este în mod paradoxal inversat pentru TZ iradiat la timpul de

acumulare maximă a radicalilor instabili (5 min), proba testată inițial fiind mai puțin toxică (ED50

15,15 mg/mL) comparativ cu cea testată după stocare 24 h (ED50 9,64 mg/mL ). În cazul linilor de

celule SW403, se observă aceleași tendințe, însă pentru concentrații mai mari.

Evoluția toxicității probelor testate în ziua iradierii și după 24 h de la terminarea procesului,

indică o posibilă activitate citotoxică a radicalilor cu timp de viața scurt formați în urma iradierii în

cazul CPZ și o acțiune benefică în cazul TZ, unde după recombinarea radicalilor apar foto-produși

ce determină activitatea citotoxică.

6.5. Posibile căi de acțiune a clorpromazinei și tioridazinei asupra micro-organismelor studiate

Un efect antimicrobian poate fi definit ca o interacțiune între o substanță activă și o țintă

specifică a celulei microbiene. Astfel, până ajung la țintele specifice, microbicidele pot întâlni o

varietate de structuri care sunt responsabile pentru rezistența bacteriilor. Studiile au arătat că

bacteriile gram-negative (cele protejate suplimentar printr-o membrană exterioară), în special

Pseudomonas, sunt mai rezistente decât bacteriile gram-pozitive. Cu toate acestea, moleculele au

posibilitatea de a trece prin membrana exterioară a celulelor prin intermediul porilor umpluți cu apă,

cu condiția ca molecula să nu depășească o anumită mărime, să aibă o anumită sarcină și proprietăți

lipofile. Dacă o substanță este solubilă în apă și masa sa moleculară este mai mică decât 600 Da,

probabilitatea de a fi capabilă să treacă prin canalele porilor este mare. De asemenea, este posibil ca

substanța activă să penetreze membrana exterioară după ce inițial a destabilizat-o și dezorganizat-o

[59]. Atât CPZ cât și TZ sunt molecule mici, având o masă moleculară de 318,86 Da și, respectiv

370,56 Da, sunt solubile în apă și sunt lipofile. Datorită acestor caracteristici, un mecanism de

acțiune ar fi pătrunderea soluțiilor prin porii membranei extracelulare și legarea la situsurile primare

de acțiune pe membrana citoplasmatică sau în citoplasmă, unde încep să-și exercite efectele.

Acestea pot iniția efecte secundare sau ulterioare, care pot provoca apoi efectul real microbiostatic

sau microbicid, fiind evident că modul de acțiune al unui anumit bactericid poate fi prea complex

pentru a permite, în prezent, o descriere clară [59]. Efectul microbicid reprezintă efectul ireversibil,

de distrugere a micro-organismului (bactericid sau fungicid) și cel microbiostatic reprezintă efectul

reversibil, de inhibare temporară a multiplicării (bacteriostatic, fungistatic) [60].

Procesele descrise precum transportarea microbicidului la suprafața celulei microbiene,

adsorbția, difuzia, penetrarea și interacțiunea la locul țintă, nu sunt instantanee, timpul de acțiune

fiind diferit de la micro-organism la micro-organism. Diferențele depind și de modul de acțiune,

precum și de constituția chimică și proprietățile fizico-chimice ale agentului [59].

Dinamica tensiunii superficiale înregistrate pentru CPZ și TZ pentru diferite intervale de iradiere

a arătat o scădere a acesteia sugerând generarea de foto-produși hidrofobi, ce pot interacționa cu

membrana biologică a micro-organismelor si în final, obținându-se o activitate antimicrobiană

crescută a soluțiilor iradiate comparativ cu cele neiradiate.

36

Din analiza CMI și CMEB, atât CPZ cât și TZ pot fi considerați agenți antimicrobieni, însă

mecanismul lor de acțiune asupra bacteriilor este încă necunoscut. Posibilele efecte ce pot fi

mediate de aceste soluții iradiate sunt: inhibarea directă a replicării bacteriilor [61], reducerea

rezistenței antimicrobiene prin creșterea efluxului de medicament [62], inhibarea motilității

bacteriene [63], eliminarea plasmidelor [64] sau inhibarea pompelor de eflux [65].

6.6. Concluzii

Au fost efectuate teste in vitro, precum concentrația minimă inhibitorie și concentrația minimă

de eradicare a biofilmului, utilizate pentru a testa susceptibilitatea bacteriilor și a fungilor la

soluțiile de CPZ și de TZ neiradiate și iradiate cu un fascicul laser emis la 266 nm de către un laser

pulsat Nd:YAG pentru perioade de timp cuprinse între 1 min și 240 min.

Rezultatele obținute au arătat o acțiune antibacteriană puternică asupra fungilor atât CPZ cât și

TZ iradiate, valori CMI mai mici obținându-se în cazul TZ iradiat 30 min pentru C. neoformans

204092 și în cazul CPZ iradiat 30 min pentru C. albicans 26790.

Testele efectuate pe bacteriile gram-pozitive au arătat o acțiune antimicrobiană puternică a CPZ

și TZ iradiate, însă în acest caz pentru CPZ s-au obținut rezultate mai bune din punct de vedere al

timpului optim de iradiere dar și datorită valorilor CMI rezultate.

Bacteriile gram-negative sunt mai puțin susceptibile la agenții antimicrobieni decât cele gram-

pozitive, acest lucru fiind observat din valorile CMI obținute. Și în acest caz TZ neiradiat și iradiat

prezintă o acțiune moderată, mai slabă comparativ cu cea a CPZ. În cazul bacteriei A. baumii

complex 230 nu există nicio diferență a valorii CMI între soluția de TZ neiradiata și iradiată între

1 min și 240 min. Aceeași situație se regăsește și pentru P. aeruginosa însă în cazul testării CPZ

neiradiat sau iradiat.

În cazul eradicărilor biofilmelor formate de bacteriile S. Aureus 6538, S.aureus MSSA, B. Subtilis

6633, E. Faecalis 2921, Ent. Cloacae 56 și K. Pneumoniae 40, TZ este mai eficient în împiedicarea

aderării bacteriilor la suprafața godeurilor decât să le distrugă, fapt confirmat de valorile mai mici

obținute pentru CMEB decât cele CMI.

În cazul studiului toxicității soluțiilor de CPZ și TZ neiradiate și iradiate, concentrațiile la care

este observată o citotoxicitate de 50%, cresc odată cu expunerea prelungită la radiație UV, ceea ce

înseamnă că toxicitatea scade odată cu creșterea timpului de iradiere pentru ambele substanțe testate

după 24 h de la terminarea procesului de iradiere. De asemenea, în cazul CPZ, generarea unor

radicali cu timp de viață scurt nu este benefică si este recomandată o utilizare a soluțiilor iradiate

după 24 h de la terminarea expunerii la radiație UV, iar în cazul TZ efectul fiind exact invers.

Prin urmare, utilizarea unui fascicul laser emis la 266 nm pentru a iradia soluții de non-

antibiotice cu scopul de a genera foto-produși cu proprietăți antimicrobiene poate fi considerată o

metodă nouă ce poate fi folosită împotriva rezistenței bacteriilor la tratamentul cu antibiotice.

37

7. Studiul efectelor radiației laser UV asupra soluțiilor de

clorpromazină în picătură suspendată sau în volum. Aplicații

asupra pseudotumorilor induse în ochi de iepure

Studiile în volum (2 mL), prezentate în Capitolul 4, ce conțin soluții de CPZ și TZ dizolvate în

apă ultrapură la concentrația de 2 mg/mL, au evidențiat generarea prin expunerea acestora la

radiație laser în domeniul UV (266 nm) a unor foto-produși. De asemenea, în Capitolul 5 a fost

determinată stabilitate în timp a compușilor rezultați, iar în Capitolul 6, efectul antibacterian al

amestecului format comparativ cu cel al compusului parental a fost evidențiat.

În acest capitol sunt investigate modificările spectrale produse în urma expunerii a 10 mg/mL de

CPZ la două fascicule laser, emise la 266 nm și la 355 nm. Acest studiu reprezintă o analiză în

detaliu a modificărilor produse în spectrele de fluorescență ale soluțiilor și a foto-produșilor

identificați prin cromatografie în strat subțire. De asemenea, este prezentată ca aplicație biologică,

aplicarea directă a soluției apoase de CPZ neiradiată și iradiată, la o concentrație de 10 mg/mL și

20 mg/mL, pe țesuturile pseudotumorale induse în ochi de iepure.

7.1. Analiza clorpromazinei expuse la 266 nm și 355 nm sub formă de picătură suspendată și în volum

În acest subcapitol este prezentată comparația dintre modificările moleculare ale unei soluții

apoase de CPZ produse prin expunerea la un fascicul laser emis la 355 nm și la 266 nm de către un

laser pulsat Nd: YAG, în picături de 10 µL suspendate în aer și a unor volume mai mari, de 1 mL.

7.1.1. Descrierea sistemului experimental

CPZ (Sigma-Aldrich, DE, 98%) a fost dizolvată în apă ultrapură la o concentrație de

10 mg/mL. Tehnicile experimentale folosite pentru a analiza amestecul de foto-produși atât în

volum cât și în picătură sunt fluorescența indusă laser (LIF) și cromatografia în strat subțire (TLC).

Fasciculul laser la lungimea de undă 266 nm și 355 nm au fost emise de laserul Nd: YAG

(Continuum, Surelite II). Laserul emite în regim pulsat având frecventa de repetiție a pulsurilor 10

Hz și durata la semi-înălțime a pulsului de 6 ns.

În cazul picăturii suspendate, energia fasciculului laser a fost setată la 3 mJ pentru a obține un

efect rezonant rapid și în același timp pentru a evita efectele mecanice specifice interacției

nerezonante [66]. Picătura a fost poziționată la 220 mm de lentilă pentru ca fasciculul să o acopere

în totalitate. Talia fasciculului are un diametru de 2,5 mm în planul de interacție cu picătura,

asemănător cu cel al picăturii de 10 μL, respectiv 2,67 mm.

În cazul experimentului în volum, pentru soluția de CPZ la o concentrație de 10 mg/mL, s-a

utilizat o celulă standard de spectrofotometru (45x12,5x12,5 mm) poziționata la o distanță de

425 mm de lentilă. În acest caz, talia fasciculului a fost de 11 mm. În timpul măsurătorilor a fost

folosită o cantitate de 1 mL de soluție de CPZ, ce a fost amestecată continuu cu o bară magnetică la

700 rpm pentru a omogeniza în permanență proba, iar energia medie a fasciculului laser a fost setată

la 7 mJ, în concordanță cu studiile anterioare [53-54] [38] [35].

Intervalele temporale de iradiere au fost alese astfel încât doza de iradiere să fie aceeași atât

pentru experimentele cu picături suspendate cât și pentru cele în volum. Doza de iradiere a fost

calculată considerând puterea medie a fasciculului incident pe suprafața iradiată (densitatea de

putere) în timpul iradierii [67]. Suprafața iradiată, în cazul picăturii suspendate, este de 0,056 cm2

(aria circulară descrisă de raza picăturii) și aproximativ 1 cm2 în cazul iradierii în volum de 1 mL.

Astfel, densitatea de putere medie calculată pentru picătură a fost de 524 mW/cm2 și cea pentru

volum de 70 mW/cm2. Prin urmare doza de iradiere este de 7,5 ori mai mică pentru măsurătorile în

volum decât pentru cele în picătură pentru același timp de iradiere. În consecință, probele cu

volume de 1 mL au fost iradiate de 7,5 ori mai mult pentru a obține aceeași doză ca și în picătură.

38

Analiza LIF permite monitorizarea foto-disocierii soluției de CPZ în timp real prin vizualizarea

modificărilor spectrului de fluorescență, reprezentate atât de deplasări batocromice sau hipocromice

cât și hipercromice [38] . Spectrele au fost înregistrate cu un spectrometru Ocean Optics HR4000

(rezoluție de 0,64 nm) și un spectrograf Acton SpectraPro 2750 (Princeton Instruments, rezoluție de

0,02 nm) și reprezintă o mediere a spectrelor înregistrate timp de 10 sec.

Analiza TLC permite compararea directă a foto-produșilor generați prin iradierea cu fascicule

laser emise la 266 nm și 355 nm la diferiți timpi de expunere [35] [37] . În acest experiment a fost

utilizat ca fază mobilă un amestec de acetonă: metanol: 25% amoniac (150:50:5, V:V:V) și plăci

TLC (DC-Alufolien Kieselgel 60F254; Merck, Darmstadt, DE) de dimensiuni 14x10 cm. Din fiecare

probă iradiată s-a aplicat un μL pe placa TLC, ce a fost apoi introdusă în incinta de developare ce

conținea faza mobilă și după uscare, într-o incintă de inspecție cromatografică UV (Chromo-Vue®

Cabinet C-65 (UVP)) unde s-au înregistrat poze pentru fiecare placă expusă la lungimile de undă de

254 nm și 366 nm. Utilizând programul de analiză CP ATLAS 2.0 freeware TLC analysis, fiecare

poză a plăcii a fost transformată într-un grafic, reprezentând intensitatea fiecărei „pete” („pată”

reprezintă un foto-produs sau o clasă de foto-produși de aceeași polaritate) ca funcție de poziția de-a

lungul unei direcții alese (în acest caz, de jos în sus).

Interacția fasciculului laser cu ținta poate fi nerezonantă, atunci când nu este absorbită de

picătură [66] și/sau rezonantă, atunci când este absorbită și produce modificări la nivelul structurii

moleculare [68]. În cazul experimentelor cu picături suspendate, analiza TLC a fost efectuată,

utilizând picături diferite pentru fiecare timp de iradiere, iar în cazul măsurătorilor LIF o singură

picătură a fost folosită pentru întreaga perioadă de expunere la radiație laser.

7.1.2. Analiza cromatografică în strat subțire

Efectele rezonante ale interacției radiației laser cu picături suspendate și cu volume de soluții de

CPZ la concentrația de 10 mg/mL au fost investigate pentru diferiți timpi de iradiere. Fiecare placă

TLC este vizualizată la două lungimi de undă, 254 nm și 366 nm. Plăcile TLC, corespunzătoare

soluțiilor iradiate în picătură suspendată, vizualizate la 254 nm și 366 nm sunt prezentate în Figura

7.1. În acest caz energia medie per puls a fost 3 mJ, iar timpii de iradiere au fost 0,5, 1, 2, 3, 4 și

5 min. Fiecare coloană din plăcile TLC corespunde unui timp de iradiere specific: prima coloană

reprezintă proba neiradiată, apoi de la stânga la dreapta sunt prezentate probe de CPZ iradiate

pentru diferiți timpi și diferite doze de iradiere. Săgețile indică CPZ ce se regăsește în probă la

finalul intervalului de iradiere. Se poate observa că intensitate acestei pete scade pe măsură ce

timpul de iradiere crește și de asemenea, iradiind la 355 nm se poate observa o foto-degradare mai

rapidă a compusului parental comparativ cu iradierea utilizând un fascicul laser emis la 266 nm. În

același timp, utilizând două lungimi de undă, 254 nm și 366 nm pentru a vizualiza plăcile se pot

observa foto-produși diferiți, unii care absorb la 254 nm și alții la 366 nm.

Figura 7.1: Plăcile TLC vizualizate la diferite lungimi de undă pentru 10 mg/mL soluție de CPZ,

iradiată în picătură timp de 0,5, 1, 2, 3, 4 și 5 min: A) 254 nm și B) 366 nm

În Figura 7.2 este prezentată placa TLC, corespunzătoare iradierii în volum, a unei soluții de

CPZ având o concentrație de 10 mg/mL, cu un fascicul laser emis la 266 nm și 355 nm având o

energie medie de 7 mJ pentru următorii timpi de iradiere: 0,5, 1, 2, 3, 4 și 5 min.

266 nm 355 nm

nei

rad

at

A

0.5 1 2 3 4 5 0.5 1 2 3 4 5

266 nm 355 nm

un

irra

d

B

0.5 1 2 3 4 5 0.5 1 2 3 4 5

39


iradiată în volum timp de 0,5, 1, 2, 3, 4 și 5 min: A) 254 nm și B) 366 nm

Deoarece volumul este mai mare decât în cazul picăturii, foto-degradarea compusului parental nu

este la fel de rapidă, putând fi observați mai puțini compuși în urma analizei TLC. Și în acest caz

pot fi diferențiați compușii ce absorb la 254 nm și la 366 nm, fiind mai mulți cei ce absorb la

366 nm.

În Figura 7.3 este prezentată analiza TLC în cazul iradierii cu un fascicul emis la 266 nm și

355 nm, în volum, la aceeași doză de iradiere ca și în picătură, adică mărind timpul de expunere de

7,5 ori. Energia medie per puls este de 7 mJ pentru următorii timpi de iradiere: 7,5x0,5, 7,5x 1,

7,5x 2, 7,5x 3, 7,5x 4 și 7,5x 5 min. Și în acest caz, ca și în cel al picăturii iradiate, se pot observa

mai mulți foto-produși decât iradierea în volum la aceeași energie. Prin urmare procesul de iradiere

depinde atât de timpul de expunere, de lungimea de undă a fascicului laser, de doza de iradiere cât

și de volum. Alegerea corectă a acestor parametri poate avea ca rezultat final generarea foto-

produșilor necesari în tratarea infecțiilor bacteriene și a pseudotumorilor.


iradiată în volum de la 7,5x0,5 min la 7,5x5 min: A) 254 nm și B) 366 nm

În Figura 7.4 și Figura 7.5 sunt prezentate rezultatele analizei plăcilor TLC menționate anterior,

obținute în urma utilizării programului ATLAS 2.0 CP freeware TLC analysis. Analiza a fost

efectuată în cazul vizualizării la 254 nm a plăcilor TLC ce conțin soluții de CPZ iradiate 5 min în

picătură, în volum și în volum la aceeași doza de iradiere ca în picătură (Figura 7.4) și în cazul

vizualizării la 366 nm a plăcilor TLC în aceleași condiții, însă pentru o iradiere de 30 sec a soluției

de CPZ (Figura 7.5). În general, s-a observat că în timpul iradierii la cele două lungimi de undă ale

fasciculului emis atât în volum cât și în picătură sunt obținuți aceiași foto-produși. Acest lucru

sugerează că modificările moleculare sunt aceleași atât pentru iradierea în picătură cât și în volum.

Compusul parental, CPZ, centrat la 375 pixeli, prezintă o concentrație mai mică în cazul

expunerii la un fascicul laser emis la 355 nm decât în cazul utilizării la 266 nm atât în iradierea în

picătură cât și în volum pentru aceleași doze de iradiere. În acest caz, scăderea concentrației de CPZ

rămas în probă indică o foto-degradare mai rapidă a moleculelor pentru 355 nm decât pentru

266 nm. În picătură, CPZ este complet foto-degradat după cele 5 min de expunere la 355 nm.

0.5 1 2 3 4 5 0.5 1 2 3 4 5

A

0.5 1 2 3 4 5 0.5 1 2 3 4 5

B266 nm 355 nm

nei

rad

at

266 nm 355 nm

7.5 x 7.5 x

0.5 1 2 3 4 5 0.5 1 2 3 4 5

A

0.5 1 2 3 4 5 0.5 1 2 3 4 5

7.5 x 7.5 x

B266 nm 355 nm

nei

rad

at

266 nm 355 nm

40

Figura 7.4: Distribuția de intensitate a “petelor” soluțiilor de CPZ aplicate pe plăcile TLC

vizualizate la 254 nm și analizate utilizând CP ATLAS 2.0 freeware software, în cazul iradierii timp

de 5 min A) în picătură, B) în volum și C) în volum având aceeași doză de iradiere

Analiza plăcilor TLC vizualizate la 366 nm prezintă mai multe diferențe în cazul utilizării

fasciculului laser emis la cele două lungimi de undă (266 nm si 355 nm). Prin urmare, pentru soluția

de CPZ iradiată în picătură și în volum având aceeași doză de iradiere principalii foto-produși

prezintă aproximativ aceeași intensitate pentru ambele lungimi de undă folosite la iradiere. Însă în

picătură, după 30 sec de expunere, principalii foto-produși prezintă o intensitate mai mare atunci

când proba este iradiată cu 355 nm (Figura 7.5 A).

Figura 7.5: Distribuția de intensitate a “petelor” soluțiilor de CPZ aplicate pe plăcile TLC

vizualizate la 366 nm și analizate utilizând CP ATLAS 2.0 freeware software, în cazul iradierii timp

de 5 min A) în picătură, B) în volum și C) în volum având aceeași doză de iradiere

Acest lucru înseamnă că mai multe molecule de CPZ din soluție sunt foto-degradate la iradierea

probei cu fasciculul emis la 355 nm. Datorită evoluțiilor intensităților “petelor” din placa TLC, ce

reprezintă foto-produșii sau o clasă de foto-produși cu aceeași polaritate, la cele două lungimi de

undă folosite la iradiere, dinamica procesului de transformare/foto-degradare a produsului parental

este diferită în picătură față de volum pentru aceeași doză de iradiere.

În urma vizualizării la 366 nm a plăcilor TLC, ce conțin soluțiile de CPZ iradiate 30 sec la

355 nm, se observă un nou foto-produs sau o clasă de foto-produși, cu o polaritate mai mică decât

CPZ, ce a fost evidențiat/ă atât în picătură cât și în volum, regăsindu-se la aproximativ 405 pixeli

(Figura 7.5 A și C). Acest foto-produs sau această clasă de foto-produși reprezentat prin săgeți, se

formează doar în atunci când se iradiază cu fasciculul laser emis la 355 nm, în picătură și în volum

la aceeași doză ca în picătură.

7.1.3. Analiza fluorescenței induse laser

Analiza fluorescenței induse laser pentru micro-picături suspendate (Figura 7.6 și Figura 7.7)

arată o intensitate maximă a fluorescenței la aproximativ 20 sec în cazul expunerii la o radiație laser

emisă la 266 nm (Figura 7.6) și în mai puțin de 10 sec pentru radiația emisă la 355 nm (Figura 7.7).

Dacă în cazul iradierii cu un fascicul emis la 355 nm se folosește un timp de integrare mai mic de

10 sec, se observă apariția unei valori maxime a intensității fluorescenței încă din prima secundă de

expunere a soluției.

41

Figura 7.6: Spectrele LIF pentru 10 mg/mL CPZ iradiat în picătură timp de 5 min cu fascicul laser

emis la A) 266 nm și B) 355 nm

O evoluție asemănătoare a intensității fluorescenței se regăsește și în cazul iradierii în volum

pentru aceleași intervale de iradiere folosite în picătură (Figura 7.7). În acest caz o valoare maximă

a intensității de fluorescență apare după 4 min și 30 sec la 266 nm (Figura 7.6 B) și 1 min și 10 sec

la 355 nm (Figura 7.6 B).

Figura 7.7: Spectrele LIF pentru 10 mg/mL CPZ iradiat în volum timp de 5 min cu fascicul laser

emis la A) 266 nm și B) 355 nm

Utilizând aceeași doză de iradieri pentru experimentul în volum (Figura 7.8), intensitatea

spectrelor LIF prezintă scăderi uniforme pentru ambele lungimi de undă utilizate, asemănătoare cu

evoluția concentrației CPZ din analiza TLC.

Figura 7.8: Spectrele LIF pentru 10 mg/mL CPZ iradiat în volum timp de 5 min la aceeași doză ca

și în picătură cu fascicul laser emis la A) 266 nm și B) 355 nm

O corelare directă între evoluția maximului de intensitate LIF la cele două lungimi de undă

folosite în experimentele de iradiere și evoluția procesului de foto-degradare a CPZ nu este încă

prezentată în literatură. Acest comportament al intensității LIF poate fi influențat și de fluorescența

foto-produșilor generați. Deoarece o parte dintre aceștia au fost identificați [35] [38] [69], s-a

42

încercat validarea a doi foto-produși, mai exact PZ și CPZ–SO, din amestecul de compuși formați în

timpul iradierii, cu substanțe de referință PZ (Sigma-Aldrich, 98%) și CPZ–SO (British

Pharmacopoeia Commission Laboratory).

Activitatea LIF a compușilor de referință a fost evaluată la o concentrație de 0,2 mg/mL în apă

ultrapură. Câte 1 mL din fiecare soluție a fost expusă la radiație laser în aceleași condiții ca și

soluția de CPZ iradiată în volum. Toate spectrele LIF înregistrate în timpul iradierii soluțiilor de PZ

și CPZ–SO cu un fascicul emis la 266 nm și 355 nm prezintă două benzi spectrale.

În experimentele cu picătura suspendată, comportamentul intensității fluorescenței CPZ din

spectrul LIF este asemănător cu cel al CPZ–SO în cazul utilizării aceleiași lungimi de undă la

iradiere, mai exact se observă o scădere în intensitate. Acest lucru se datorează faptului că CPZ–SO

este printre primii foto-produși formați atunci când soluția de CPZ este iradiată și prezintă împreună

cu PZ cele mai mari rate de formare în primele minute de iradiere (Capitolul 5).

În urma iradierii unei soluții de CPZ având concentrația de 2 mg/mL, cu un fascicul laser emis la

266 nm, CPZ–SO prezintă în primele 5 min de iradiere o concentrație procentuală relativă maximă

de 6%. Foto-produsul PZ prezintă aproximativ aceeași concentrație relativă după 5 min de iradiere,

iar la 60 min de iradiere se obține concentrația procentuală relativă maximă de 40%. Datorită

iradierii în picătură, unde cantitatea de soluție folosită este de 103

ori mai mică decât în cazul

iradierii în volum, la o doză de iradiere mare într-un interval de timp scurt, activitatea foto-

produsului CPZ este dominantă, comparativ cu cea a PZ.

Pentru iradierea în volum la aceeași doză de iradiere ca și în picătură, intensitatea LIF a soluției

de CPZ pare a fi influențată de intensitatea LIF a soluției de PZ. Comportamentul spectrului LIF al

PZ este asemănător cu cel descris în [37]. Prin urmare, diferențele observate între spectrele LIF ale

CPZ și PZ și cele ale CPZ și CPZ–SO se datorează influențelor foto-produșilor generați în soluția

iradiată de CPZ.

Figura 7.9: Evoluția maximelor LIF ale CPZ, CPZ–SO și PZ iradiate până la 5 min cu un fascicul

laser emis la 266 nm și 355 nm

Prin urmare, analizele TLC și LIF au evidențiat procesele de foto-degradare ale CPZ, ce depind

atât de lungimea de undă folosită pentru iradiere cât și de cantitatea de substanță: volum și picătură.

Utilizarea programului de analiză ATLAS 2.0 CP freeware TLC analysis pentru plăcile TLC au

arătat că procesele de transformare ale compusului parental sunt mai rapide în primele minute de

iradiere, în cazul utilizării unui fascicul emis la 355 nm decât cel la 266 nm, atunci când energia

medie a fasciculului este de 3 mJ pentru picătura suspendată și de 7 mJ în volum.

7.2. Aplicații biologice: pseudotumori induse în ochi de iepuri

Cea mai veche descriere a pseudotumorilor orbitale se regăsește în 1905, când Birch-Hirschfeld

a descris un sindrom orbital misterios, asemănător cu neoplasmul orbital clinic benign sau malign,

în care, în momentul explorării chirurgicale a fost găsit doar țesutul inflamator. Din păcate,

0 1 2 3 4 50 1 2 3 4 5

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 1 2 3 4 5

Inte

ns

ita

te

timp (min)

PZ @266 nm

PZ @355 nm

CPZ-SO @266 nm

CPZ-SO @355 nm

Picatura

CPZ @266 nm

CPZ @355 nm

Volum

CPZ @266 nm

CPZ @355 nm

43

termenul de pseudotumoare orbitală a fost folosit atât pentru a diagnostica boli care nu puteau fi

detectate ușor, cât și diverse alte boli inflamatorii și chiar tumori limfoide. Odată cu evoluția

medicinii și cu o recunoașterea îmbunătățită a acestor alte boli, definiția dată de Birch-Hirschfeld a

evoluat pentru a desemna o inflamație orbitală benignă nespecifică, fără a evidenția cauzele locale

sau sistemice specifice. Cu toate acestea, această definiție nouă, încă valabilă, nu are o bază

histologică bine delimitată [70].

7.2.1. Descrierea metodei experimentale

Aplicarea directă a soluției apoase de CPZ la o concentrație de 10 mg/mL și 20 mg/mL a fost

făcută pe țesuturile pseudotumorale induse în ochi de iepure. Pseudotumorile au fost induse

utilizând metoda Schmidt-Erfurth care constă în introducerea unui fir de sutură din propilenă (0,5)

în limbul sclerodermal [71].

Zonele inflamatorii ale țesutului conjunctiv și ale corneei au fost menținute 7 zile, fără nici un

tratament, pentru a ajunge la un nivel semnificativ de inflamație. Soluțiile de CPZ în apă ultrapură

au fost aplicate prin injectare în țesutul subconjuctival al ochiului. Aceste soluții, la concentrații de

20 mg/mL și 10 mg/mL, au fost expuse la radiație laser emisă la 266 nm având o energie medie per

puls de 6.5 mJ, timp de 20 min și 4 h. De asemenea, s-a evitat expunerea iepurilor aflați sub

tratament la radiație luminoasă luând în considerare Ref. [71-73].

După trei zile de la injectare, timp în care medicamentul a interacționat cu țesutul limbic

pseudotumoral, ochii au fost extrași și s-au făcut analize macroscopice și microscopice ale

țesuturilor tumorale. Studiile au fost efectuate pe un grup de 5 iepuri, dintre care iepurele nr. 1 a

avut ochii netratați fiind considerat martor I, iepurele nr. 2 a avut ochii tratați cu CPZ neiradiat fiind

considerat martor II, iar iepurii nr. 3, 4 și 5 au ochii tratați cu soluții de CPZ iradiate. Pentru fiecare

ochi au fost înregistrate imagini histologice ale țesuturilor pseudotumorale după extracție, iar

studiul anatomopatologic a fost făcut prin compararea controlului cu țesuturilor tratate.

7.2.2. Analiza microscopică a țesuturilor pseudotumorale

Măsurătorile au fost efectuate pe cinci iepuri, dintre care nr. 1 a fost păstrat ca martor I, unde

pseudotumorile nu au fost tratate, și nr. 2 a fost păstrat ca martor II, unde pseudotumorile au fost

tratate cu CPZ neiradiat la două concentrații diferite (într-un ochi s-a injectat 0,1 mL de soluție la

20 mg/mL și în celălalt 0,1 mL de soluție la 10 mg/mL).

Iepurii nr. 3, 4 și 5 au fost tratați cu soluții de CPZ la două concentrații, 10 mg/mL și 20 mg/mL,

iradiate fiecare 20 min și 4 h cu un fascicul laser emis la 266 nm. Astfel, pentru iepurii nr. 3 și 4, un

ochi a fost injectat cu 0,1 mL soluție CPZ 20 mg/mL și al doilea a fost injectat cu 0,1 mL soluție de

CPZ 10 mg/mL, ambele concentrații fiind iradiate 20 min. În cazul iepurelui nr. 5, un ochi a fost

injectat cu 0,1 mL soluție de CPZ la 20 mg/mL iar celălalt cu 0,1 mL soluție de 10 mg/mL, ambele

fiind iradiate 4 h.

La finalul timpului de tratare fiecare ochi a fost extras și s-au făcut în cadrul examinării lor

anatomopatologice studiile histologice ale țesuturilor pseudotumorale. Rezultatele obținute au fost

organizate pe perechi de ochi extrași și sunt prezentate ca imagini ale părților țesuturilor selectate în

conformitate cu dimensiunile și tipul efectelor produse de către substanțele studiate. În Figura 7.10

este prezentată imaginea histopatologică a țesutului pseudotumoral extras dintr-un ochi al iepurelui

martor I (iepurele nr. 1).

44

Figura 7.10: Imaginea țesutului pseudotumoral netratat al ochiul iepurelui nr. 1 (iepurele martor I)

la un factor de mărire 20x. Zonele A și B prezintă celule de tip inflamator, iar C reprezintă

elementul vascular normal

La sfârșitul celor trei zile de observație, în această imagine, se poate observa o parte a țesutului

conjunctiv, unde zonele A și B includ celule de tip inflamator, iar în zona C se pot observa

elementele vasculare, normale, însă rare. Iepurele martor II a fost folosit pentru a obține imaginile

țesuturilor pseudotumorale în cazul injectării a 0,1 mL soluție de CPZ neiradiat la 20 mg/mL și

10 mg/mL. În Figura 7.11 A, poate fi observat un țesut inflamator granular (zona A), precum și

infiltrarea cronică moderată de eozinofile în cazul tratamentului cu 20 mg/mL soluție de CPZ şi în

Figura 7.11 B, în cazul tratamentului cu 0,1 mL soluție de 10 mg/mL CPZ neiradiată, sunt

prezentate mase necrotice ale țesuturilor striate (zona A) bogate în eozinofile cronice infiltrate

(zona B).

Figura 7.11: Țesutul pseudotumoral extras din ochiul de iepure, martor II, tratat cu A) 0,1 mL

soluție de 20 mg/mL CPZ neiradiată la un factor de mărire de 20x, unde în zona A este evidențiat

țesutul inflamator granular; B) 0,1 mL soluție de 10 mg/mL CPZ neiradiată la un factor de mărire

de 20x, unde în zona A și B sunt evidențiate mase necrotice ale țesuturilor striate și respectiv,

eozinofile cronice infiltrate

În cazul celor doi iepuri, martor I și II, nu există diferențe semnificative între marimea efectelor

și astfel se poate spune că cele două concentrații de CPZ utilizate nu contribuie la diminuarea rapidă

a pseudotumorilor.

În cazul iepurilor nr. 3 și 5, soluții de CPZ la cele două concentrații, 10 mg/mL și 20 mg/mL, au

fost iradiate 20 min cu un fascicul laser emis la 266 nm. Acest interval de timp se încadrează între

cele 5 min și 37,5 min pentru care au fost analizate modificările soluției de CPZ, prezentate în

subcapitolul anterior.

Imaginea din Figura 7.12 prezintă rezultatele obținute după tratamentul cu soluții de CPZ a

iepurelui nr. 3. Figura 7.12A reprezintă imaginea țesutului pseudotumoral după tratamentul cu

20 mg/mL CPZ iradiat 20 min și se poate observa abundența inflamațiilor cronice (zona A),

eozinofilele (zona B) și masele de țesut nodular necrotic (zona C) plasate în țesutul muscular striat,

precum și vasele de sânge (zona D).

În Figura 7.12 B este prezentată imaginea ochiului tratat cu 10 mg/mL CPZ iradiat, unde au loc

același tip de efecte ca și în cazul utilizării concentrației de 20 mg/mL. În cazul utilizării a

A B

45

10 mg/mL CPZ, densitățile "defectelor" sunt mai scăzute decât în cazul tratamentului cu 20 mg/mL,

fiind recomandă utilizarea pentru tratament a soluțiilor de CPZ la 10 mg/mL expuse la radiație laser

UV.

Figura 7.12: Imaginea țesutului pseudotumoral al iepurelui nr.3 tratat cu 0,1 mL soluției de CPZ

expusă 20 min la radiație UV (266 nm), la concentrațiile A) 20 mg/mL (factor de mărire 10x);

B) 10 mg/mL (factor de mărire 20x). Zona A arăta o inflamația cronică, zona B prezintă

eozinofilele, zona C evidențiază țesut necrotic nodular, iar zona D prezintă vasele de sânge

În Figura 7.13A și 7.13B sunt prezentate imaginile histopatologice ale mostrelor de țesuturi

pseudotumorale obținute pentru iepurele nr. 5. În Figura 7.13A ochiul a fost injectat cu 0,1 mL

soluție de 20 mg/mL CPZ expus 4 h la fascicul laser emis la 266 nm și în Figura 7.13B țesutul a fost

injectat cu 0,1 mL soluție de 10 mg/mL CPZ iradiat în aceleași condiții.

Figura 7.13: Imaginile histopatologice, la un factor de mărire 10x, ale țesuturilor pseudotumorale

induse pentru: A) ochiul de iepure nr. 5 injectat cu 0,1 mL soluție de 20 mg/mL CPZ expusă 4 h la

fascicul laser emis la 266 nm; zona A prezintă eozinofilele, iar zona B țesutul necrotic nodular; B)

ochiul de iepure nr. 5 injectat cu 0,1 mL soluție 10 mg/mL CPZ expusă 4 h la fascicul laser emis la

266 nm; zona A prezintă eozinofilele, zona B țesutul necrotic nodular, iar zona C vasele de sânge

ce prezintă tromboză

În ambele imagini se poate observa o abundență de infiltrate cronice în țesutul inflamator care

conțin eozinofile (zone A) și mase tisulare necrotice nodulare (zone B) ce se regăsesc în țesutul

muscular striat. De asemenea, se regăsesc și vasele de sânge care prezintă tromboză (Figura 7.13 B,

zona C).

Principala concluzie care rezultă din analiza Figurilor 7.11-7.13 este că tratamentul cu soluția de

CPZ iradiată este cel mai eficient în recuperarea calităților țesutului corneei atunci când este

utilizată concentrație de 10 mg/mL. Deși timpul de expunere pentru soluția folosită pentru a trata

iepurele nr. 5 este de 4 h (adică 12 de ori mai mare decât în cazul soluțiilor folosite în tratamentul

iepurelui nr. 3) efectele nu sunt mai bune comparativ cu cazul soluțiilor expuse 20 min.

7.3. Concluzii

Interacția rezonantă a unui fascicul laser pulsat cu micropicături sau volume de 1 mL ce conțin

soluții de CPZ la o concentrație de 10 mg/mL, în apă ultrapură, produce foto-degradarea structurii

moleculare a compusului parental. Concentrațiile relative de CPZ rămase în probă după iradiere,

identificate prin metoda TLC, scad odată cu creșterea timpului de expunere a soluției de CPZ atât la

A B

A B

46

355 nm cât și la 266 nm. În cazul foto-produșilor, majoritatea fiind mai polari decât CPZ,

concentrațiile lor relative cresc odată cu durata iradierii. S-a observat că în cazul iradierii soluției de

CPZ cu un fascicul laser la 355 nm, se obține un foto-produs sau o clasă de foto-produși care

este/sunt mai puțin polar decât compusul parental.

În cazul iradierii soluției de CPZ în volum la aceeași doză de iradiere ca și în picătură, procesele

de foto-degradare încep în același timp, însă cu rate de producere mai mari în cazul utilizării

fasciculului laser emis la 355 nm. Spectrele LIF obținute pentru soluția de 10 mg/mL CPZ, iradiată

atât în volum cât și în picătură, au fost comparate cu cele ale celor doi compuși disponibili

comerciali ce au fost identificați în amestecul de foto-produși din proba iradiată, mai exact PZ și

CPZ–SO (Capitolul 5). Asemănări au fost observate între comportamentul curbelor LIF în cazul

iradierii în picătură între CPZ și CPZ–SO și în cazul iradierii în volum între CPZ și PZ.

Utilizarea unei soluții apoase de CPZ expuse la un fascicul laser emis la 266 nm pentru a trata

țesuturi pseudotumorale induse în ochi de iepure, arată că rezultatele tratamentului, în ceea ce

privește recuperarea calitățile țesuturilor corneei sănătoase, depind de concentrația de CPZ înainte

de iradiere și de durata de expunere a soluțiilor la fascicul laser. Aplicarea soluțiilor iradiate de CPZ

pe ochii de iepure cu pseudotumori induse pare să producă o recuperare mai rapidă a țesuturilor în

raport cu martorul, ochii netratați, iar concentrația de 10 mg/mL și timpul de iradiere de 20 de min

par a fi parametrii optimi de lucru în acest studiu.

8. Concluzii generale. Contribuții personale și perspective În prezent există o creștere semnificativă la nivel mondial a infecțiilor bacteriene/fungice, acest

fapt fiind un motiv serios de îngrijorare. Eficacitatea antibioticelor convenționale prezintă o scădere

semnificativă deoarece din ce în ce mai mulți patogeni devin rezistenți la tratamente multiple cu

antibiotice (MDR), datorită tratamentelor inadecvate, automedicației, industriei alimentare, vânzării

de antibiotice contrafăcute în combinație cu antibiotice reale, etc. Astfel există o nevoie urgentă de

a elabora noi strategii de combatere a rezistenței și de a dezvolta noi clase de agenți antimicrobieni,

ce pot înfrânge cu succes MDR dobândit de patogeni.

Obiectivul tezei de doctorat face parte dintr-un studiu mai amplu ce are ca scop dezvoltarea de

noi platforme antimicrobiene și antipseudotumorale ce pot fi utilizate în tratarea infecțiilor

bacteriene sau fungice ce au dezvoltat rezistență la tratamente multiple cu antibiotice (MDR) și de

asemenea, în tratarea pseudotumorilor. Pentru a realiza acest obiectiv, au fost studiate proprietățile

fizico-chimice și antibacteriene ale soluțiilor de clorpromazină și tioridazină ca urmare a iradierii

cu un fascicul laser emis la 266 nm.

Principalul element de noutate al studiului este descoperirea de noi compuși cu efecte

antimicrobiene directe sau sinergice, obținuți prin iradierea cu laser a unui medicament, ce pot fi

buni candidați în tratamentul MDR dobândit de bacterii sau ciuperci, fapt ce reprezintă un pas

important în cercetare antimicrobiană.

Tehnicile experimentale utilizate au dovedit că sistemele dezvoltate în cadrul tezei pot fi

mijloace analitice utile pentru studiul amestecurilor de compuși formați în timpul iradierii.

Combinarea acestora oferă o imagine de ansamblu asupra transformărilor care apar în structura

moleculară și privind identificarea foto-produșilor.

Contribuțiile originale din cadrul tezei de doctorat reprezintă combinarea atât a metodelor

spectroscopice, fizico-chimice analitice, cât și a metodelor de testare a susceptibilității micro-

organismelor la agenți antimicrobieni cu scopul de a analiza, identifica și testa foto-produșii cu

proprietăți antimicrobiene obținuți:

1. În urma expunerii la radiație laser UV, respectiv 266 nm, emisă de către un laser pulsat

Nd:YAG, atât CPZ cât și TZ suferă modificări structurale, fiind formați diverși foto-produși.

Soluțiile obținute prin iradierea între 1 min și 240 min au fost analizate prin metode spectroscopice:

spectroscopie UV-Vis-NIR, spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier și fluorescență

47

indusă laser dar și prin metode fizico-chimice analitice precum studiul tensiunii superficiale,

cromatografie în strat subțire, cromatografie de lichide cuplată cu spectrometrie de masă și

măsurători de pH.

o Din spectrele de absorbție și cele LIF se poate deduce foto-disocierea moleculelor de

CPZ și de TZ și formarea foto-produșilor prin adăugarea unor grupări funcționale la structura

moleculară, spectrele FT-IR oferind informații despre formarea de noi legături chimice.

o Utilizând tehnica LC-TOF/MS s-au obținut informații cu privire la masele moleculare

ale foto-produșilor și au fost propuse structurile chimice ale acestora.

o Analiza TLC sugerează numărul de foto-produși existenți în soluțiile iradiate, iar

utilizare programului de analiză JustTLC poate oferi informații cantitative.

2. Studiul stabilității în timp a avut ca scop furnizarea de informații cu privire la felul în care

calitatea unei substanțe de tip medicament variază în timp sub influența factorilor de mediu, cum ar

fi temperatura, umiditatea și lumina, și de a stabili perioada optimă de testare și condițiile de

păstrare a medicamentelor. Analiza stabilității în timp a fost determinată prin înregistrarea

spectrelor UV-Vis-NIR a probelor testate.

o Soluția de CPZ neiradiată poate fi păstrată la întuneric și la o temperatură de 4oC timp

de 4 săptămâni fără să-și modifice proprietățile de interes, iar probele iradiate între 1 – 240 min se

stabilizează după 24 h și rămân stabile doar 2 săptămâni de la terminarea procesului de iradiere.

o Soluția de TZ neiradiată este stabilă 3 săptămâni și soluțiile de TZ iradiate 1 min și

5 min se stabilizează după 48 h și rămân stabile 2 săptămâni. Probele iradiate între 15 – 240 min se

stabilizează după 24 h și sunt stabile timp de 2 săptămâni, cu excepția celor expuse la radiație laser

180 min și 240 min, unde soluțiile sunt stabile doar 1 săptămână.

3. Testele in vitro de susceptibilitate a micro-organismelor la agenții antimicrobieni, precum

concentrația minimă inhibitorie și concentrația minimă de eradicare a biofilmului au fost utilizate

pentru a testa soluțiile de CPZ și TZ neiradiate și iradiate cu un fascicul laser emis la 266 nm de

către un laser pulsat Nd:YAG pentru perioade de timp cuprinse între 1 min și 240 min.

o Testele efectuate pe bacteriile gram-pozitive și pe fungi au arătat o acțiune

antimicrobiană puternică a CPZ și TZ iradiate, însă în acest caz pentru CPZ valorile CMI au fost

obținute pentru intervale mai mici de iradiere.

o Soluția de CPZ este un agent antimicrobian mai bun datorită obținerii unor valori

CMI mai mici decât cele obținute pentru TZ. Bacteriile gram-negative sunt mai puțin susceptibile la

agenții antimicrobieni decât cele gram-pozitive, acest lucru fiind observat din valorile CMI

obținute. Și în acest caz TZ neiradiat și iradiat prezintă o acțiune moderată, mai slabă comparativ cu

cea a CPZ. Bacteriile ca Ps. Aeruginosa 27833, K. pneumoniae 40 și Ent. Cloacae 56 sunt

rezistente atât la probele de CPZ și TZ atât neiradiate cât și iradiate.

o TZ este mai eficient în împiedicarea aderării bacteriilor la suprafața godeurilor decât

să le distrugă în cazul eradicărilor biofilmelor formate de bacteriile S. aureus 6538, S.aureus MSSA,

B. subtilis 6633, E. faecalis 2921, Ent. Cloacae 56 și K. pneumoniae 40, fapt confirmat de valorile

mai mici obținute pentru CMEB decât cele CMI.

o Activitatea antibiofilm a CPZ iradiat asupra tulpinilor de bacterii este îmbunătățită

comparativ cu soluția neiradiată, cu excepția tulpinii P. aeruginosa 27833, unde biofilmul prezintă

rezistență la soluțiile neiradiate și iradiate. Astfel, soluțiile de CPZ expuse la radiație UV, pot

distruge eficient atât bacteriile planctonice cât și cele sub formă de biofilm.

o In cazul studiului toxicității soluțiilor de CPZ și TZ neiradiate și iradiate,

concentrațiile la care este observată o citotoxicitate de 50%, cresc odată cu expunerea prelungită la

radiație UV, ceea ce înseamnă că toxicitatea scade odată cu creșterea timpului de iradiere pentru

ambele substanțe testate după 24 h de la terminarea procesului de iradiere.

o În cazul CPZ, generarea unor radicali cu timp de viață scurt nu este benefică în astfel

de studii și este recomandată o utilizare a soluțiilor iradiate după 24 h de la terminarea expunerii la

radiație UV, iar în cazul TZ efectul fiind exact invers.

4. Un alt studiu, face referire la interacția rezonantă a unui fascicul laser pulsat cu

micropicături (10 µL) sau volume de 1 mL ce conțin soluții de CPZ la o concentrație de 10 mg/mL,

48

în apă ultrapură, unde are loc același proces de foto-degradare a structurii moleculare a compusului

parental. Soluțiile atât în picătură cât și în volum, au fost expuse la radiație laser emisă la două

lungimi de undă, respectiv 266 nm și 355 nm pentru aceleași perioade de timp, dar și pentru aceeași

doză de iradiere și analizate prin metodă TLC.

o În cazul foto-produșilor, din analiza TLC s-a observat că majoritatea sunt mai polari

decât CPZ, concentrațiile lor relative crescând odată cu expunerea prelungită la radiație UV. S-a

observat că în cazul iradierii soluției de CPZ cu un fascicul laser la 355 nm, se obține un foto-

produs sau o clasă de foto-produși (de aceeași polaritate) care are/au o polaritate mai mică decât

compusul parental.

o S-au observat asemănări între comportamentul LIF în cazul iradierii în picătură între

CPZ și CPZ–SO și în cazul iradierii în volum între CPZ și PZ.

o Rezultatele privind aplicarea soluțiilor de 10 mg/mL și 20 mg/mL CPZ iradiate 20 min

și 4 h pe pseudotumori induse în ochi de iepure arată că recuperarea calitățile țesuturilor corneei

sănătoase depinde de concentrația de CPZ utilizată și de durata de expunere a soluțiilor la fascicul

laser. O recuperare mai rapidă a țesuturilor în raport cu martorul, ochii netratați, poate fi observată

pentru concentrația de 10 mg/mL și timpul de iradiere de 20 min.

Prin urmare, utilizarea unui fascicul laser emis la 266 nm pentru a iradia soluții de non-

antibiotice cu scopul de a genera foto-produși cu proprietăți antimicrobiene poate fi considerată o

metodă nouă ce poate fi folosită împotriva rezistenței bacteriilor la tratamentul cu antibiotice.

Studiul din cadrul tezei și rezultatele obținute deschid perspective atât în domeniul foto-chimiei

medicamentelor, înfrângerii rezistenței la tratamente multiple cu antibiotice, cât și în domeniul

dezvoltării unei direcții de cercetare și aplicare în igiena muncii.

În cadrul dezvoltării unei fotochimii a medicamentelor, pot fi dezvoltate noi platforme de

prepararea a compușilor ultrapuri prin expunerea medicamentelor la radiație laser. Compușii

rezultați pot fi obținuți doar prin metode de iradiere cu laser, într-un timp scurt și fără a utiliza

metode chimice standarde de sinteză. Astfel, se obține o modificare rapidă a structurii moleculare

prin interacția radiației laser cu medicamentele având ca scop final generarea rapidă de foto-

produși. Studiul dinamicii proceselor soluțiilor de medicamente și corelarea proprietăților de

stabilitate în timp a acestora cu nevoile din tratamentele clinice determină un pas important în

implementarea acestei metodei în cercetările clinice pe animale. Utilizând tehnici moderne foto-

produșii pot fi separați, astfel obținându-se compuși ultrapuri a căror acțiune antibacteriană și

antifungică trebuie investigată. Prin urmare se poate dezvolta o platformă de generare, testare și

separare a unor soluții de medicamente ce poate fi asociată unei foto-chimii specifice, ca alternativă

la cea clasică.

Un pas important în înțelegerea modului de acțiune al soluțiilor este dat de clarificarea

mecanismelor de interacțiune dintre micro-organismele rezistente la tratament și agentul

antimicrobian obținut prin iradierea unui medicament cu un fascicul laser. Un alt aspect important

ce poate rezulta din studiile prezentate în teza de doctorat, ar putea fi aplicarea metodelor laser în

tratarea tumorilor maligne utilizând alte tehnici decât terapia foto-dinamică. Prin urmare, se pot

dezvolta noi clase de citostatice prin modificarea medicamentelor utilizate în prezent.

În concluzie, metoda laser utilizată în studiul din cadrul tezei ar putea fi o abordare rapidă și

ieftină de a dezvolta noi agenți antimicrobieni/antitumorali, având ca produs final un nou model de

a obține într-un timp scurt, fără utilizare de agenți chimici și metode de sinteză consumătoare de

timp. Prin combinarea tehnicilor de analiză și identificare se poate afirma că procesul de formare a

foto-produșilor prin iradierea soluției de CPZ și TZ cu un fascicul laser emis la 266 nm, nu este

unul liniar, existând o competitivitate între procesele foto-chimice evidențiată de ratele de formare a

compușilor.

49

Referințe bibliografice

[1] R. Schinke, Photodissociation dynamics: spectroscopy and fragmentation of small polyatomic

molecules, Cambrige: Cambrige University Press, 1993.

[2] J. J. Aaron, M. D. GayeSey, S. Trajkovska și N. Motohashi, „Bioactive Phenothiazines and

Benzo[a]phenothiazines: Spectroscopic Studies, and Biological and Biomedical Properties and

Applications,” în Bioactive Heterocycles VII. Flavonoids and Anthocyanins in Plants,and Latest

Bioactive Heterocycles II, Berlin, Springer, 2009.

[3] R. Landau, B. Achilladelis și A. Scriabine, Pharmaceutical Innovation: Revolutionizing Human Health,

Philadelphia: Chemical Heritage Foundation, 1999.

[4] D. Healy, The Creation of Psychopharmacology, Library of Congress Cataloging -in-Publication Data,

2002.

[5] J. W. Robinson și E. Skelly, Undergraduate Instrumental Analysis, Seventh Edition, Boca Raton,

Florida: Taylor & Francis Group, 2014.

[6] P. S. Kalsi, Spectroscopy of Organic Compounds, 6th edition, New Delhi: New age international , 2004.

[7] P. G. Guilfoile, Antibiotic-Resistant Bacteria, New York: Infobase Publishing, 2007.

[8] D. Greenwood, „Antimicrobial Drugs: Chronicle of a Twentieth Century Medical Triumph,” 2008.

[9] Y. S. Mc Carter, „Antimicrobial Modes of action,” în Manual of antimicrobial susceptibility testing,

American Society for Microbiology, 2005.

[10] K. Rogers, Bacteria and Viruses, New York: Encyclopædia Britannica, 2011.

[11] N. Komatsu, N. Motohasi, M. Fujimaki și J. Molnar, „Induction of a protective immunity in mice

against Escherichia coli by phenothiazines, 10-[n-(phthalimido)alkyl]-2-substituted-10H-phenothiazines

and 1-(2-chloroethyl)-3-(2-substituted-10H-phenothiazines-10-yl)alkyl-1 -ureas,” In vivo, vol. 11, nr. 1,

pp. 13-16, 1997.

[12] M. Martins, S. G. Dastidar, S. Fanning, J. E. Kristiansen, J. Molnar, J. M. Pagès, Z. Schelz, G. Spengler,

M. Viveiros și L. Amaral, „Potential role of non-antibiotics (helper compounds) in the treatment of

multidrug-resistant Gram-negative infections: mechanisms for their direct and indirect activities,” Int J

Antimicrob Agents, vol. 31, nr. 3, pp. 198-208, 2008.

[13] J. E. Kristiansen și K. Gaarslev, „The antibacterial effect of selected neuroleptics on Vibrio cholerae,”

Acta Pathol Microbiol Immunol Scand B, vol. 93, nr. 1, pp. 49-51, 1985.

[14] S. M. Weinreb, Science of Synthesis: Hetarenes and related ring system, Stuttgart: Thieme, 2004.

[15] D. C. Dumitras, Tehnici laser si aplicatii, Bucuresti: Editura Universităţii din Bucureşti, 2006.

[16] L. Danaila and M. L. Pascu, Lasers in Neurosurgery, Bucuresti: Editura Academiei Romane, 2001.

[17] P. S. Sindhu, Fundamentals of Molecular Spectroscopy, New Delhi: New Age International, 2006.

[18] J. Solé, L. Bausa și D. Jaque, An Introduction to the Optical Spectroscopy of Inorganic Solids, West

Sussex: Jhon Wiley and Sons Ltd, 2005.

[19] R. P. Lucht, „Applications of laser induced fluorescence spectroscopy for combustion and plasma

diagnostics,” în Laser Spectroscopy and its Applications, New York, Marcel Dekker, 1987, pp. 623-

677.

[20] C. af Klinteberg, M. Anderssson, O. Sandström, S. Andersson-Engels și S. Svanberg, „Laser Induced

Fluorescence Spectroscopy (LIFS),” LOT-Oriel Group Europe, Darmstadt, 2001.

[21] P. R. Griffiths și J. A. de Haseth, Fourier Transform Infrared Spectrometry, New Jersey: Jhon Wiley

and Sons, 2007.

[22] P. Chen, O. I. del Rio și A. W. Neumann, „Axisymmetric drop shape analysis,” în Physical Chemistry

of Biological Interfaces, New York, Marcel Dekker, 2000.

[23] P. C. Hiemenz și R. Rajagopalan, Principles of Colloid and Surface Chemistry, Third Edition, Revised

and Expanded, New York: Marcel Dekker, 1997.

50

[24] S. G. Udeagbara, Effect of Temperature and Impurities on Surface Tension of Crude Oil, Boca Raton:

Stephen Gekwu Udeagbara, 2010.

[25] E. Stahl, Dunnschlicht-Chromatographie, ein Laboratoriumshandbuch, Berlin: Springer, 1962.

[26] R. E. Ardrey, Liquid Chromatography–Mass Spectrometry: an introduction, Chippenham: John Wiley

& Sons Ltd, 2003.

[27] R. A. Durst, Standardization of pH measurements, Natioonal Bureau of Standards, 1975.

[28] C. Y. Wu, F. W. Koch și R. A. Durst, Standardization of pH measurements, National Bureau of

Standards, 1988.

[29] R. Schwalbe, L. Steele-Moore și A. C. Goodwin, Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols, Boca

Raton: CRC Press, 2007.

[30] M. B. Coyle, Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing, American Society for Microbiology,

2005.

[31] N. Zelver, M. Hamilton, D. Goeres și J. Heersink, „Development of a standardized antibiofilm test,” în

Microbial Growth in Biofilms: special environments and physicochemical aspects, London, Academic

press, 2001.

[32] M. L. Pascu, V. Nastasa , A. Smarandache, A. Militaru, A. Martinis, M. Viveiros, M. Boni, R. I. Andrei,

A. Pascu, A. Staicu, J. Molnar, S. Fanning și L. Amaral, „Direct modification of bioactive

phenothiazines by exposure to laser radiation,” Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery,, vol.

6, nr. 2, pp. 1-13, 2011.

[33] M. C. Moran, T. Tozar, A. Simon, A. Dinache, A. Smarandache, I. R. Andrei, M. Boni, M. L. Pascu, F.

Cirisano și M. Ferrari, „Toxicity study in blood and tumor cells of laser produced medicines for

application in fabrics,” Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2015.

[34] M. L. Pascu, A. Smarandache, M. Boni, J. Kristiansen, V. Nastasa și I. R. Andrei, „Spectral properties

of some molecular solutions,” Romanian Reports in Physics, vol. 63, pp. 1267-1284, 2011.

[35] M. L. Pascu, B. Danko, A. Martins, N. Jedlinszki, T. Alexandru, V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. R.

Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, S. Fanning și L. Amaral, „Exposure of chlorpromazine to 266 nm laser

beam generates new species with antibacterial properties: contributions to development of a new

process for drug discovery,” PloS One, vol. 8, nr. 2, p. e55767, 2013.

[36] A. Hunyadi, B. Danko, M. Boni, A. Militaru, T. Alexandru, V. Nastasa, I. Andrei, M. Pascu și L.

Amaral, „Rapid, Laser-Induced Conversion of 20-Hydroxyecdysone and its Diacetonide – Experimental

Set-up of a System for Photochemical Transformation of Bioactive Substances,” Anticancer Research,

vol. 32, nr. 4, pp. 1291-1297, 2012.

[37] A. Simon, T. Alexandru, M. Boni, V. Damian, A. Stoicu, V. Dutschk și M. L. Pascu, „Interaction of

solutions containing phenothiazines exposed to laser radiation with materials surfaces, in view of

biomedical applications,” vol. 475, nr. 1-2, pp. 270-281, 2014.

[38] T. Alexandru, A. Staicu, A. Pascu, E. Radu, A. Stoicu, V. Nastasa, A. Dinache, M. Boni, L. Amaral și

M. L. Pascu, „Characterization of mixtures of compounds produced in chlorpromazine aqueous

solutions by ultraviolet laser irradiation: their applications in antimicrobial assays,” Journal of

Biomedical Optics, vol. 20, nr. 5, p. 051002, 2015.

[39] A. V. Ronin, A. I. Sulatskaya, I. M. Kuznetsova și K. K. Turoverov, „Fluorescence of Dyes in Solutions

with High Absorbance. Inner Filter Effect Correction,” PLoS One, vol. 9, nr. 7, p. e103878., 2014.

[40] J. Karpinska, B. Starczewska și H. Puzanowska-Tarasiewicz, „Analytical properties of 2- and 10-

disubstituted phenothiazine derivatives,” Anal. Sci., vol. 12, pp. 161-170, 1996.

[41] S. Kus, Z. Marczenko și N. Obarski, „Derivative UV-VIS Spectrophotometry in Analytical Chemistry,”

Chern. Anal. , vol. 41, pp. 889-927, 1996.

[42] N. A. Kuznetsova, N. S. Gretsova, E. A. Kalmykova, E. A. Makarova, S. N. Dashkevich, V. M.

Negrimovskii, O. L. Kaliya și E. A. Luk’yanets, „Relationship between the photochemical properties

and structure of pophyrins and related compounds,” Russ. J. Gen. Chem., vol. 70, nr. 1, pp. 133-140,

1997.

51

[43] J. Malkin, Photophysical and Photochemical Properties of Aromatic Compounds, Boca Raton: CRC

Press, 1992.

[44] D. Moore și D. Tamat, „Photosensitization by drugs: photolysis of some chlorine-containing drugs,” J.

Pharm. Pharmacol., vol. 32, nr. 3, pp. 172-177, 1980.

[45] K. Huynh-Ba, Handbook of stabilitz testing in pharmaceutical development, Newark: Springer, 2009.

[46] J. P. Hammond, „The use of spectrophotometry in the pharmaceutical industry,” în Accurate

Measurement of Optical Properties of Materials , Amsterdam, Elsevier, 2014, pp. 409-456.

[47] A. Riedel și C. S. Leopold, „Quantification of omeprazole degradation by enteric coating polymers:an

UV-VIS spectroscopy study,” Pharmazie, vol. 60, nr. 2, pp. 126-130, 2005.

[48] D. Castro, M. A. Moreno, S. Torrado și J. L. Lastres, „Comparison of derivative spectrophotometric and

liquid chromatograpic methods for the determination of omeprazole in aqueous solutions during

stability studies,” J Pharm Biomed Anal, vol. 21, p. 291298, 1999.

[49] N. M. El-Kousy și L. I. Bebawy, „Stability-indicating methods for determining omeprazole and

octylonium bromide in the presence of their degradation products,” J AOAC Int, vol. 82, pp. 599-606,

1999.

[50] A. A. Wahbi, O. Abdel-Razak, A. A. Gazy, H. Mahgoub și M. S. Moneeb, „Spectrophotometric

determination of omeprazole, lansoprazole and pantoprazole in pharmaceutical formulations,” J Pharm

Biomed Anal, vol. 30, pp. 1133-1142, 2002.

[51] C. F. Chignell, A. G. Motten și G. R. Buettner, „Photoinduced free radicals from chlorpromazine and

related phenothiazines: relationship to phenothiazine-induced photosensitization,” Environ Health

Perspect., vol. 64, pp. 103-110, 1985.

[52] S. Anibal, „The threat of antibiotic-resistant bacteria and the development of new antibiotics,” în

Antimicrobial Resistance in Bacteria, Norfolk, Horizon bioscience, 2006.

[53] A. M. Armada, T. Alexandru, D. Machado, B. Danko, A. Hunyadi, A. Dinache, V. Nastasa, M. Boni, J.

Ramos, M. Viveiros, J. Molnar, M. L. Pascu și L. Amaral , „The in vitro activity of products formed

from exposure of chlorpromazine to a 266nm laser beam against species of mycobacteria of human

interest,” In vivo, vol. 27, pp. 605-610, 2013.

[54] T. Alexandru, A. Armada, A. Militaru, M. Boni, V. Nastasa, M. Viveiro, M. L. Pascu, J. Molnar și L.

Amaral, „Biological Evaluation of products formed from the irradiation of chlorpromazine with a 266

nm laser beam,” Biochemistry & Pharmacology, vol. 2, nr. 1, p. 1000109, 2013.

[55] T. Tozar, M. Popa, V. Nastasa, A. Stoicu, C. Saviuc, M. C. Chifiriuc și M. L. Pascu, „Determination of

the susceptibility of bacteria in planktonic and biofilms forms to chlorpromazine exposed to a 266 nm

laser beam,” in curs de publicare.

[56] U. Kohler și F. Kreuter, Data Analysis Using Stata, college station: Stata Press, 2005.

[57] W. Paulus, Microbicides for the Protection of Materials: A Handbook, London: Chapman % Hall, 1993.

[58] S. Kjelleberg și M. Givskov, „The biofilm mode of life,” în The Biofilm Mode of Life: Mechanisms and

Adaptations, Norfolk, Horizon Bioscience, 2007.

[59] G. G. Anderson și G. A. O'Toole, „Innate and Induced Resistance Mechanisms of Bacterial Biofilms,”

în Bacterial Biofilms, Berlin, Springer, 2008.

[60] G. Broasca și D. Farima, „Antimicrobial treatment on textile surfaces,” Leather and Footwear Journal,

vol. 10, nr. 4, pp. 61-66.

[61] L. Amaral, J. Kristiansen și V. Lorian, „Synergic effect of chlorpromazine on the activity of some

antibiotics,” J Antimicrob Chemother, vol. 30, 1992.

[62] M. Viveiros, A. Jesus, M. Brito, C. Leandro, M. Martins, D. Ordway, A. M. Molnar, J. Molnar. și L.

Amaral , „Inducement and Reversal of Tetracycline Resistance in Escherichia coli K-12 and Expression

of Proton Gradient-Dependent Multidrug Efflux Pump Genes,” Antimicrob Agents Chemother., vol. 49,

nr. 8, pp. 3578-3582, 2005.

[63] J. Molnar, J. E. Kristiansen și M. J. Nakamura, „Effects of some tricyclic psychopharmacons and

52

structurally related compounds on motility of Proteus vulgaris,” Antonie Van Leeuwenhoek., vol. 62, nr.

4, pp. 319-320, 1992.

[64] G. Spengler, A. Miczak, E. Hajdu, M. Kawase, L. Amaral și J. Molnar, „Enhancement of plasmid

curing by 9-aminoacridine and two phenothiazines in the presence of proton pump inhibitor 1-(2-

benzoxazolyl)-3,3,3-trifluoro-2-propanone,” Int J Antimicrob Agents., vol. 22, nr. 3, pp. 223-227, 2003.

[65] S. Sabatini, G. W. Kaatz, G. M. Rossolini, D. Brandini și A. Fravolini, „From phenothiazine to 3-

phenyl-1,4-benzothiazine derivatives as inhibitors of the Staphylococcus aureus NorA multidrug efflux

pump,” J Med Chem., vol. 51, nr. 14, pp. 4321-4330, 2008.

[66] M. L. Pascu, G. V. Popescu, C. M. Ticos și I. R. Andrei, „Unresonant interaction of laser bea,s with

microdroplets,” J. Europ. Opt. Soc. Rap. Public., vol. 7, p. 12001, 2012.

[67] I. R. Andrei, T. Tozar, A. Dinache, M. Boni, V. Nastasa și M. L. Pascu, „Chlorpromazine

Transformation by Exposure to Ultraviolet Laser Beams in Droplet and Bulk,” in curs de publicare.

[68] M. L. Pascu, I. R. Andrei, M. Ferrari, A. Staicu, A. Smarandache, A. Mahamoud, V. Nastasa și L.

Liggieri, „Laser beams resonant interaction with micro-droplets which have a controlled content,”

Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 365, nr. 1-3, pp. 83-88, 2010.

[69] G. R. Buetiner, R. D. Hall, C. F. Chignell și A. G. Motten, „The stepwise biphotonic photoionization of

chlorpromazine as seen by laser flash photolysis,” Photochemistry and Photobiology, vol. 49, nr. 3, pp.

249-256, 1989.

[70] I. Mombaerts, Orbital Pseudotumor, Amsterdam: Kugler Publications, 1996.

[71] R. A. Pascu, „Study on the efficiency of some molecules exposed to optical / laser radiation used in

ophthalmology: applications in the ophthalmology pathology,” PhD Thesis, University of Medicine and

Pharmacy “Carol Davila” Bucharest, 2010.

[72] M. L. Pascu, M. Brezeanu , B. Carstocea și R. A. Pascu, „5-Fluorouracil as a Phosensitiser,” In vivo,

vol. 19, pp. 215-220, 2005.

[73] M. L. Pascu, A. Staicu , L. Voicu, M. Brezeanu, B. Carstocea, R. Pascu și D. Gazdaru, „Methotrexate as

a photosensitiser,” Anticancer Res. , vol. 14, nr. 5A, pp. 2925-2930, 2004.

53

9. Lista contribuțiilor proprii

Contribuțiile proprii sunt prezentate sub forma listelor lucrărilor publicate în reviste ISI și non-ISI

cât și sub formă de comunicări la conferințe naționale și internaționale. Lucrările publicate în

reviste ISI sunt prezentate în copie în Anexa 1.

9.1. Lucrări publicate în reviste

9.1.1. Reviste cotate ISI

1. A. Hunyadi, B. Danko, M. Boni, A. Militaru, T. Alexandru,V. Nastasa, I. R. Andrei, M. L. Pascu and L. Amaral

(2012), Rapid, Laser-Induced Conversion Of 20-Hydroxyecdysone And Its Diacetonide – Experimental Set-Up

Of A System For Photochemical Transformation Of Bioactive Substances, Anticancer Research 32(4), 1291-1297

(scor de influenta 0,44)

2. M. L. Pascu, B. Danko, A. Martins, N. Jedlinszki, T. Alexandru, V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. Relu Andrei,

A. Staicu, A. Hunyadi, S. Fanning, L. Amaral (2013) Exposure of Chlorpromazine to 266 nm Laser Beam

Generates New Species with Antibacterial Properties: Contributions to Development of a New Process for Drug

Discovery, PLoS One 8(2), e55767 (scor de influenta 1,4)

3. A. M. Armada, T. Alexandru, D. Machado, B. Danko, A. Hunyadi, A. Dinache, V. Nastasa, M. Boni, J. Ramos,

M. Viveiros, J. Molnar, M. L. Pascu and L. Amaral (2013) The In Vitro Activity of Products Formed from

Exposure of Chlorpromazine to a 266nm LASER Beam Against Species of Mycobacteria of Human Interest, In

vivo 27,605-610 (scor de influenta 0,3)

4. A. Simon, T. Alexandru, M. Boni, V. Damian, V. Dutschk, M. L. Pascu (2014) Interaction of solutions containing

phenothiazines exposed to laser radiation with materials surfaces, in view of biomedical applications, International

journal of Pharmaceutics 475(1–2), 270–281 (scor de influenta 0,82)

5. A. Dinache, M. Boni, T. Alexandru , E. Radu, A. Stoicu, I. R. Andrei, A. Staicu, L. Liggieri, V. Nastasa, M. L.

Pascu, M. Ferrari (2015) Surface properties of Vancomycin after interaction with laser beams, Colloids and

Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 480, 328-335 (scor de influenta 0,555)

6. T. Alexandru, A. Staicu, A. Pascu, A. Dinache, A. ben Abdeladhim, M. Enescu, A. Khatyr, M. L. Pascu

(acceptată 2014) Light cleavage of some potential linkers for drug carriers, Romanian Reports in Physics (scor de

influenta 0,133 )

7. T. Alexandru, A. Staicu, A. Pascu, E. Radu, A. Stoicu, V. Nastasa, A. Dinache, M. Boni, L. Amaral, M. L. Pascu

(2015) Characterization of mixtures of compounds produced in Chlorpromazine aqueous solutions by UV laser

irradiation: their applications in antimicrobial assays, Journal of Biomedical Optics 20(5), 051002 (scor de

influenta 0,719)

8. M. C. Morán, T. Tozar, A. Simon, A. Dinache, A. Smarandache, I. R. Andrei, M. Boni, M. L. Pascu, F. Cirisano,

M. Ferrari (2015), Toxicity study in blood and tumor cells of laser produced medicines for application in fabrics,

Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, doi:10.1016/j.colsurfb.2015.06.041 (scor de influenta 0,826)

9.1.2. Reviste non-ISI

1. T. Alexandru, A. Armada, A. Militaru, M. Boni, V. Nastasa, M. Viveiros, M. L. Pascu, L. Amaral (2013)

Biological evaluation of products formed from the irradiation of chlorpromazine with a 266 nm laser beam,

Journal of Biochemistry & Pharmacology: Open Access 2(1): 1-4

2. T. Alexandru, M. L. Pascu, B. Danko, V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. R. Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, A.

Armada, M. Viveiros, L. Amaral (2013) Generation and biological evaluation of the products formed from the

exposure of Phenothiazine to a 266nm laser beam, Proc. SPIE 8882, ROMOPTO 2012: Tenth Conference on

Optics: Micro- to Nanophotonics III, 88820T, doi:10.1117/12.2032666

9.2. Lucrări prezentate la conferințe

9.2.1. Conferințe internaționale

1. T. Alexandru (2012) 7th and final management committee meeting of Cost action BM0701 – ATENS “Antibiotic

transport and efflux: new strategies to combat bacterial resistance”, Bucuresti, Romania, 26-27 aprilie 2012

2. T. Alexandru, M.-L. Pascu, B. Danko, A. A. Martins, N. N. Jedlinszki, , V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. R.

Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, S. Fanning, L. Amaral (2012) International Student Conference on Photonics

(ISCP 2012), Sinaia, Romania,8-11 mai 2012

54

3. T. Alexandru, M. L. Pascu, A. Armada, B. Danko, V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. R. Andrei, A. Staicu, A.

Hunyadi, M. Viveiros, L. Amaral (2012) Exploratory workshop 2012 “Emerging analytical tools to investigate

Nitro-Oxidative stress”, Bucuresti, Romania, 24-26 iulie 2012

4. M.L. Pascu, V. Nastasa, M. Boni, T. Alexandru, A. Smarandache, A. Militaru (2012 Exploratory workshop 2012

“Emerging analytical tools to investigate Nitro-Oxidative stress”, Bucuresti, Romania, 24-26 iulie 2012

5. T. Alexandru, M. L. Pascu, B. Danko, V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. R. Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, A.

Armada, M. Viveiros, L. Amaral (2012) Intl. Conference “Micro-to Nano-Photonics III ROMOPTO 2012”,

Bucuresti, Romania, 3-6 Septembrie 2012

6. A. Staicu, A. Pascu, M. Boni, T. Alexandru, M. Enescu, M.L. Pascu (2012) Intl. Conference “Micro-to Nano-

Photonics III ROMOPTO 2012”, Bucuresti, Romania, 3-6 Septembrie 2012

7. T. Alexandru, A. Hunyadi, B. Danko, M. Boni, A. Militaru, V. Nastasa, I. R. Andrei, M. L. Pascu, L. Amaral

(2012), International Conference "Advanced Topics in Optoelectronics, Microelectronics and Nanotechnologies",

Constanta, Romania, 23-26 august 2012

8. M.L. Pascu, A. Militaru, M. Boni, T. Alexandru, V. Nastasa, I. R. Andrei (2012), 26th

Congress Laser Medicine,

Florenta, Italia, 9-10 noiembrie 2012

9. A. Dinache (Militaru), M. Martins, M. P. McCusker, T. Alexandru, V. Nastasa, M. Boni, S. Fanning, M. L. Pascu

(2012) International Conference on Antimicrobial Research – ICAR2012, Lisabona, Portugalia, 21-23 noiembrie

2012

10. I.R. Andrei, T. Alexandru, A. Dinache, M. Boni, V. Nastasa, S. Simion, C. Ticos, M.L. Pascu (2013) 2nd

EOS

Conference on Optofluidics, Munchen, Germania, 13-15 mai 2013

11. T. Alexandru, V. Nastasa, A. Staicu, M. L. Pascu (2013) International Student Conference on Photonics (ISCP

2013), Bran, Romania, 20-24 Mai 2013

12. A. Stoicu, E. Radu, V. Nastasa, A. Dinache, T. Alexandru, M. Boni, G. Popescu, A. Staicu, M.-L. Pascu (2013)

International Student Conference on Photonics (ISCP 2013), Bran, Romania, 20-24 Mai 2013

13. A. Simon, A. Smarandache, T. Alexandru, V. Nastasa, M. L. Pascu (2013) International Student Conference on

Photonics (ISCP 2013), Bran, Romania, 20-24 Mai 2013

14. T. Alexandru, A. Staicu, V. Nastasa, A. Pascu, A. Dinache, A. Smarandache, A. Simon, E. Radu, M. Enescu, M.

L. Pascu (2013) 16th

International Graduate summer school - Biophotonics '13, Inslad of Ven, Suedia, 8-15 iunie

2013

15. T. Alexandru, A. Armada, V. Nastasa, A. Dinache, E. Radu, A. Stoicu, M.Viveiros, L. Amaral, M. L. Pascu

(2013) NABATIVI summer school "Targeting Gram-negative bacteria: from drugs discovery to pre-clinical

exploitation", Milano, Italia, 1-3 iulie 2013

16. M.L. Pascu, T. Alexandru, M. Boni, A. Dinache, V. Nastasa, I. Andrei (2014) Smart and green interface and 5th

International Conference on “Heat transfer and fluid flow in microscale”, Marseille, Franta, 22-24 aprilie 2014

17. T. Alexandru , A. Staicu, A. Pascu, V. Nastasa, E. Radu, A. Stoicu, M. L. Pascu (2014) International Conference

"Modern Laser Applications" 4th

Edition, Bran, Romania, 19-23 mai 2014

18. I.R. Andrei, T. Alexandru, M. Boni, A. Dinache , V. Nastasa, M.L. Pascu (2014) International Conference

"Modern Laser Applications" 4th


19. A. Dinache, M. Boni, I. Andrei, T. Alexandru, V. Nastasa, M. L. Pascu (2014) International Conference "Modern

Laser Applications" 4th


20. A. Simon, T. Alexandru, M. Boni, V. Damian, V. Dutschk, M.L. Pascu, (2014) International Conference "Modern

Laser Applications" 4th Edition, Bran, Romania, 19-23 mai 2014

21. V. Nastasa, M. Boni, T. Alexandru, A. Stoicu, A. Simon, A. Dinache, A. Smarandache, I. R. Andrei, A. Staicu, M.

L. Pascu (2014) 2014 Biophotonics Summer School, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, Statele

Unite ale Americii, 19 – 30 mai 2014

22. A. Dinache, M. Boni, V. Nastasa, T. Alexandru, A. Stoicu, I. Andrei, E. Radu, M. L. Pascu (2014) 20th

International Symposium on Surfactants in Solution, Coimbra, Portugalia, 22-27 iunie 2014

23. T. Alexandru, A. Staicu, A. Pascu, V. Nastasa, E. Radu, A. Stoicu, M. L. Pascu (2014) International Student

Conference on Photonics (ISCP 2014), Orastie, Romania, 23-26 Septembrie 2014

55

24. T. Alexandru, A. Staicu, A. Pascu, A. Dinache, M. Enescu, A. Khatyr, M. L. Pascu (2014) International Student


25. T. Alexandru, A. Armada, V. Nastasa, M. Boni, A. Dinache, L. Amaral, M. L. Pascu (2014) International Student


26. A. Simon, T. Alexandru, A. Smarandache, A. Dinache, I.R. Andrei, M.L. Pascu (2014) International Student


27. V. Nastasa, A. Smarandache, T. Alexandru, A. Staicu, Z. Saponjic, M.L. Pascu (2014) International Student


28. I. R. Andrei, T. Alexandru, M. Boni, A. Dinache, V. Nastasa, M.L. Pascu (2014) International Student Conference

on Photonics (ISCP 2014), Orastie, Romania, 23-26 Septembrie 2014

29. A. Stoicu, T. Alexandru, E. Radu, V. Nastasa, M.L. Pascu (2014) International Student Conference on Photonics

(ISCP 2014), Orastie, Romania, 23-26 Septembrie 2014

30. A. Simon, T. Alexandru, M. Boni, V. Damian, V. Dutschk, M.L. Pascu (2014) International Student Conference

on Photonics (ISCP 2014), Orastie, Romania, 23-26 Septembrie 2014

31. A. Dinache, M. Boni, A. Staicu, T. Alexandru, E. Radu, V. Nastasa, A. Stoicu, I. R. Andrei, V. Damian, M.

Ferrari, M.L. Pascu (2014) International Student Conference on Photonics (ISCP 2014), Orastie, Romania, 23-26

Septembrie 2014

32. A. Staicu, A. Dinache, T. Alexandru, A. Pascu, A. Smarandache, V. Nastasa, M. Boni, A. Simon, F. Sima, M.

Enescu, M. L. Pascu (2014) International Student Conference on Photonics (ISCP 2014), Orastie, Romania, 23-26

Septembrie 2014

33. A. Stoicu, T. Alexandru , E. Radu , V. Nastasa, M.L. Pascu (2014) Introduction to Gaussian: Theory and Practice,

Ulm, Germania, 28 iulie -1 august 2014

34. T. Tozar, A. Stoicu V. Nastasa, M. Popa, I. R. Andrei, C. M. Chifiriuc, M.L. Pascu (2015), 6th Congress of

International PhotoTherapy Association, Nisa, Franta, 9-10 iulie 2015

35. T. Tozar, A. Dinache, V. Nastasa, M. Boni, Á. Simon, M.L. Pascu (2015) ”New frontiers in regenerative medicine

and surgery. Interdisciplinarity, research and clinical applications” Congress, Bucuresti, Romania, 12, 15- 16 mai

2015

36. T. Tozar, M. C. Morán, A. Dinache, A. Smarandache, I. R. Andrei, A.Simon, M. Boni, F Cirisano, M. Ferrari, M.

L. Pascu (2015) 11 th International Conference "Micro- to Nano-Photonics IV- ROMOPTO 2015", Bucuresti,

Romania, 1-4 septembrie 2015

37. T. Tozar, A. Stoicu, V. Nastasa, M. Popa, I. R. Andrei, C. M. Chifiriuc, M. L. Pascu (2015) 11th

International

Conference "Micro- to Nano-Photonics IV- ROMOPTO 2015", Bucuresti, Romania, 1-4 septembrie 2015

38. A. Simon, A. Smarandache, T. Tozar, V. Nastasa, R. Pirvulescu, M. L. Pascu (2015) SPIE Optics + Photonics, San

Diego, SUA, 9-13 august 2015

39. A. Simon, T. Alexandru, M. Boni, V. Damian, A. Stoicu, V. Dutschk, M. L. Pascu (2015) ”New frontiers in

regenerative medicine and surgery. Interdisciplinarity, research and clinical applications” Congress, Bucuresti,

Romania, 12, 15- 16 mai 2015

40. A. Simon, T. Tozar, A. Stoicu, M. Boni, V. Damian, M.L. Pascu (2015) 11th

International Conference "Micro- to

Nano-Photonics IV- ROMOPTO 2015", Bucuresti, Romania, 1-4 septembrie 2015

41. V. Nastasa, M. Boni, A. Smarandache, T. Alexandru, A. Staicu, I.R. Andrei , A. Dinache, Z. Saponjic, M.L.

Pascu (2015) Smart and green interfaces- Conference 2015, Belgrade, Serbia, 31 martie- 1 aprilie 2015

42. A. Staicu, A. Dinache, A. Smarandache, T. Tozar, A. Pascu, V. Nastasa, M. Boni, A. Simon, I.R. Andrei, M.

Enescu, M. L. Pascu (2015) 11th

International Conference "Micro- to Nano-Photonics IV- ROMOPTO 2015",

Bucuresti, Romania, 1-4 septembrie 2015

43. A. Dinache, T. Tozar, M. Boni, A. Staicu, V. Nastasa, A. Stoicu, I.R. Andrei, V. Damian, E. Radu, M. Ferrari,

M. L. Pascu (2015), Smart and green interfaces- Conference 2015, Belgrade, Serbia, 31 martie- 1 aprilie 2015

9.2.2. Conferințe naționale

1. A. Simon, A. Smarandache, T. Alexandru, V. Nastasa, M.L.Pascu (2013) Annual Scientific Conference of

Faculty of Physics, 21 iunie 2013, Magurele, Romania

56

2. T. Alexandru, V. Nastasa, A. Staicu, E. Radu, A. Stoicu, M. L. Pascu (2013) Annual Scientific Conference of

Faculty of Physics, 21 iunie 2013, Magurele, Romania

3. A. Simon, T. Alexandru, M. Boni, V. Damian, V. Dutschk, M.L. Pascu (2014) Annual Scientific Conference of

Faculty of Physics, Magurele, Romania, 20 iunie 2014

4. T. Alexandru, A. Staicu, A. Pascu, A. Dinache, A. Ben Abdeladhim, M. Enescu, A. Khatyr, M. L. Pascu (2014)

Annual Scientific Conference of Faculty of Physics, Magurele, Romania, 20 iunie 2014

5. A. Dinache, M. Boni, A. Staicu, T. Alexandru, V. Nastasa, A. Stoicu, I.R. Andrei, V. Damian, M.L. Pascu (2014)

Annual Scientific Conference of Faculty of Physics, Magurele, Romania, 20 iunie 2014

6. I. R. Andrei, T. Alexandru, M. Boni, A. Dinache, V. Nastasa, M.L. Pascu (2014) Annual Scientific Conference of

Faculty of Physics, Magurele, Romania, 20 iunie 2014

7. T. Tozar, A. Stoicu, V. Nastasa, M. Popa, I. R. Andrei, M. C. Chifiriu, M. L. Pascu (2015) Annual Scientific

Conference of Faculty of Physics, 19 iunie 2015, Magurele, Romania

8. A. Simon, T. Tozar, A. Stoicu, M. Boni, V. Damian, M.L. Pascu (2015) Annual Scientific Conference of Faculty

of Physics, 19 iunie 2015, Magurele, Romania

9. A. Smarandache, A. Simon, A. Dinache, T. Tozar, M. Boni, I. R. Andrei, M. C. Moran, F. Cirisano, M.

Ferrari,M. L. Pascu (2015) Annual Scientific Conference of Faculty of Physics, 19 iunie 2015, Magurele,

Romania

9.3. Capitole de cărți

1. M. L. Pascu, A. Militaru, M. Boni, V. Nastasa, T. Alexandru, A. Staicu, I. R. Andrei (2014) Trends in basic

research on laserbiomedicine, Laser Manual Medical technology, Leonardo Longo, Officina Editoriale Oltrarno,

1:139-182

Tatiana ALEXANDRU (TOZAR) G IE OBȚINUȚI ÎN ȚIAlsg.inflpr.ro/Picture/Rezumat teza T. Alexandru...

Documents

Transcript of Tatiana ALEXANDRU (TOZAR) G IE OBȚINUȚI ÎN ȚIAlsg.inflpr.ro/Picture/Rezumat teza T. Alexandru...