Capitolul 7

ORGANIZAREA MOLECULAR A MATERIALULUI GENETIC Prin material genetic se nelege materialul la nivelul cruia se gsete stocat informaia genetic, adic acizii nucleici, acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) i acidul ribonucleic (ARN-ul). ADN-ul reprezint suportul material al informaiei genetice la eucariote, procariote i adenovirusuri, respectiv ARN-ul la ribovirusuri. 7.1. Structura molecular a acidului dezoxirobonucleic (ADN) 7.1.1. Structura primar a ADN-ului i semnificaia ei genetic Structura primar a ADN-ului este monocatenar, macromolecular. Macromolecula de ADN este alctuit din mai multe subuniti numite nucleotide. Un nucleotid este alctuit dintr-un radical fosforic (P), dezoxiriboz (dR) i o baz azotat purinic sau pirimidinic (N), avnd urmtoarea formul general: P-dR-N. Bazele azotate purinice sunt adenina i guanina iar cele pirimidinice sunt timina i citozina. Semnificaia genetic a structurii primare a ADN. Specificitatea moleculei de ADN este determinat de secvena nucleotidelor (a bazelor azotate) n cadrul monocatenei. Numrul deosebit de mare de combinaii care poate s rezulte din combinarea celor patru tipuri de nucleotide (4n, unde reprezint numrul de nucleotide din cadrul unei molecule de ADN ce poate s ajung la cteva mii sau milioane), reprezint suportul material al variabilitii lumii vii. 7.1.2. Structura secundar a ADN-ului i semnificaia ei genetic Structura secundar reprezint starea natural obinuit n care se gsete ADN-ul. Structura secundar este bicaternar, cele dou catene fiind nfurate helicoidal, formnd un dublu helix cu diametrul de 20 pasul sau distana n cadrul unei nfurri complete este de 34. iar distana ntre dou nucleotide este de 3,4, deci n interiorul unei nfurri complete a dublului helix se gsesc 10 nucleotide. Spre exterior se afl scheletul glocido-fosforic al moleculei de ADN, iar spre interior se gsesc bazele azotate, legate prin puni de hidrogen, de natur electrostatic. mperecherea bazelor azotate i legarea lor prin puni de hidrogen are la baz principiul complementaritii, se realizeaz strict ntre o baz azotat purinic i una pirimidinic. De regul adenina se mperecheaz prin intermediul a dou puni de hidrogen cu timina, iar guanina se mperecheaz prin intermediul a trei puni de hidrogen cu citozina. Cele dou catene ale moleculei de ADN sunt antiparalele n sensul c, dac ntr-o caten legturile fosfodiesterice sunt pe direcia 5'-3', n cealalt caten legturile sunt pe direcia 3'-5'.

Semnificaia genetic a structurii secundare a ADN Structura secundar bicaternar asigur stabilitatea fizic i metabolic a moleculei de ADN. Complementaritatea bazelor asigur posibilitatea realizrii celor dou funcii importante ale materialului genetic: funcia autocatalitic, n cadrul procesului de biosintez replicativ a ADN-ului, prin care se realizeaz copierea i transmiterea mesajului genetic, deci continuitatea genetic; funcia heterocatalitic, n cadrul procesului de biosintez proteic, prin care se asigur exprimarea mesajului genetic la nivelul fiecrui individ. 7.1.3. Organizarea, expresia i evoluia ADN-ului Att la procariote ct i la eucariote, ADN-ul aparine la dou sisteme: sistemul nuclear i sistemul citoplasmatic. a. ADN-ul nuclear La procariote, ADN-ul nuclear este localizat la nivelul unui singur cromozom, fiind reprezentat de o singur macromolecul de ADN circular, pliat pe un miez proteic. Cromozomul bacterian conine numai gene cu funcii vitale. La eucariote, ADN-ul este prezent la nivelul mai multor cromozomi, dispui n perechi omoloage. Fiecare cromozom are o alctuire complex, nucleoproteic. b. ADN-ul citoplasmatic n cazul procariotelor ADN-ul se gsete la nivelul plasmidelor, care sunt alctuite din molecule de ADN circulare i poart gene pentru funcii de adaptare.

2

ADN-ul citoplasmatic la eucariote este reprezentat de molecule circulare, care conin att secvene exonice ct i intronice, fiind localizat la nivelul mitocondriilor i al plastidelor. Caracterele controlate de gene citoplasmatice se transmit pe linie matern. 7.2. Acidul ribonucleic (ARN) Structura primar a acidului ribonucleic este asemntoare cu structura primar a acidului dezoxiribonucleic, n sensul c macromolecula este alctuit tot din nucleotide, legate ntre ele prin legturi monofosfodiesterice. n cadrul nucleotidelor, ns, pentoza este reprezentat de riboz. n ceea ce privete bazele azotate, deosebirea const n faptul c timina este nlocuit cu uracilul . 7.2.1. Acidul ribonucleic mesager (ARN-m) ARN-ul mesager are rolul de a copia mesajul genetic de la nivelul ADN-ului n cadrul procesului de transcripie i de a-l transfera n citoplasm, la nivelul ribozomilor unde se realizeaz biosinteza proteic n cadrul procesului de translaie. ARN-ul mesager prezint numai o structur molecular primar, monocatenar, complementar secvenelor codificatoare (exonice) i necodificatoare (intronice) ale ADN-ului. 7.2.2. Acidul ribonucleic ribozomal (ARN-r) Structura primar a ARN-r este monocatenar, complementar ADN-ului repetitiv din zona organizatorului nucleolar (NOR). Structura secundar rezult prin plierea monocatenei i rsucirii acesteia, formnd poriuni dublu elicoidale ce cuprind circa 80% din totalitatea ARN-r. Biosinteza ARN-r se realizeaz prin transcrierea genelor pentru ARN-r din zona organizatorului nucleolar. 7.2.3. Acidul ribonucleic de transfer ARN-t ARN-t accept i transfer aminoacizii activai la locul sintezei proteice i recunosc cuvintele de cod la nivelul ARN-m, putnd s asigure decodificarea mesajului genetic, cu precizarea secvenei aminoacizilor n lanurile polipeptidice. ARN-t are o structur primar monocatenar, de dimensiuni moleculare relativ reduse, cuprinznd cca. 75 nucleotide, fiind complementar ADN-ului repetitiv ce corespunde genelor pentru ARN-t. Structura secundar rezult prin replierea monocatenei sub forma unei frunze de trifoi, cu patru zone dublu catenare numite tulpini i zone monocatenare, numite bucle. Structura teriar a moleculei de ARN-t rezultat n urma plierii moleculei bidimensionale, aproximativ sub forma unei litere L tridimesionale. 7.3. Exprimarea materialului genetic Exprimarea materialului genetic se realizeaz n procesul de biosintez proteic (funcia heterocatalitic a materialului genetic), care presupune parcurgerea a dou etape: transcripia i translaia. Transcripia este procesul heterocatalitic de biosintez a ARN- ului mesager (ARN-m), prin utilizarea matriei de ADN. Caracteristicile transcripiei este monocatenar, adic este transcris numai catena sens, 3-5;

3

respect principiul comlementaritii bazelor azotate, timina fiind nlocuit cu uracilul; este unidirecional, adic are loc doar pe direcia 5-3; este secvenial, n cadrul unei molecule de ADN exist mai multe uniti de transcripie, delimitate de un promotor i un terminator; este continu, adica sunt transcrise att secvenele intronice ct i cele exonice. Translaia are loc la nivelul ribozomilor i reprezint procesul de traducere a mesajului genetic adus de ctre ARN-m n proteine specifice, determinnd secvena aminoacizilor n lanurile polipeptidice. Caracteristicile translaiei: este unidirecional, n sensul c citirea mesajului genetic se realizeaz prin deplasarea ribozomilor de-a lungul moleculei de ARN-m n direcia 5'---3' este ordonat, adic lanul polipeptidic se sintetizeaz prin adugarea ordonat a aminoacizilor conform mesajului genetic coninut de ctre ARN-m; este relativ rapid, avnd loc ncatenarea a cca. 150 aminoacizi/minut; este multipl, n sensul c mai muli ribozomi pot citi simultan acelai ARN-m, pe acelai ARN-m putndu-se sintetiza simultan mai multe lanuri polipeptidice asemntoare. Etapele translaiei: a) Activarea aminoacizilor i legarea fiecrui aminoacid activat de ARN-ul su de transfer specific; b) Iniierea translaiei, ce presupune interaciunea dintre ARN-m, secvena leader i codonul de iniiere, subunitatea mic i apoi subunitatea mare ribozomal; c) Elongarea sau sinteza lanului polipeptidic; d) Terminarea translaiei, adic oprirea ciclurilor de ncorporare a aminoacizilor ntrun lan polipeptidic. Semnalul de terminare este reprezentat de unul dintre codonii terminatori (UAA, AGA, UAG), plasat la nivelul moleculei de ARN-m. ntre secvena nucleotidelor din cadrul moleculei de ADN i secvena aminoacizilor din cadrul lanurilor polipeptidice exist coresponden, numit colinearitate. Pentru ca mesajul genetic s poat fi tradus din limbajul acizilor nucleici, cu patru simboluri, n limbajul proteinelor, cu 20 de simboluri, mesajul este scris codificat. 7.3.1. Codul genetic Codul genetic este un limbaj biochimic ce asigur corespondena dintre secvena nucleotidelor din cadrul moleculei de ADN i secvena aminoacizilor din cadrul lanurilor polipeptidice. Caracteristicile codului genetic cuvntul de cod se numete codon, reprezentat de o succesiune de trei nucleotide (triplet). Din cele patru nucleotide pot s rezulte 64 combinaii (43), dintre care 61 sunt codoni sens, ce pot codifica un anumit aminoacid i trei codoni sunt non sens sau stop ce marcheaz de regul sfritul translaiei (UAG amber, UAA ochre, UGA opal). Codonul iniiator (AUG), care specific metionina, marcheaz nceputul sintezei lanului polipeptidic, aminoacid ce conine sulf. codul genetic este nesuprapus, n sensul c doi codoni vecini nu au niciodat un nucleotid comun; codul genetic este fr virgule, n sensul c ntre doi codoni nu exist spaii libere;

4

codul genetic este universal, n sensul c aceiai codoni specific aceiai aminoacizi, indiferent de poziia pe care o ocup pe scara evolutiv o anumit specie. 7.4. Gena, subunitate de organizare i funcionare a materialului genetic Gena este unitatea de organizare i funcionare a materialului genetic, fiind alctuit dintr-un fragment al moleculei de ADN (sau ARN n cazul ribovirusurilor), ce poate controla un caracter, prin ndeplinirea uneia din urmtoarele funcii: - precizarea secvenei aminoacizilor n cadrul unui anumit lan polipeptidic (n cazul genelor structurale); -sinteza unui anumit tip de acid ribonucleic (ARN-r i ARN-t) n cazul genelor ARN-r i ARN-t;, - controlul activitii altor gene, n cazul genelor reglatoare. Gena structural la eucariote este discontinu, fiind alctuit din secvene informaionale numite exoni i secvene noninformaionale, numite introni. Fiecare gen este delimitat de dou elemente de control. La captul 5 se afl promotorul iar la captul 3 terminatorul. La procariote gena strucural este continu, avnd numai secvene informaionale. Mai multe gene structurale procariote implicate n controlul unei singure ci metabolice care formeaz un operon sunt delimitate de un singur promotor i un singur terminator. 7.4.1. Controlul exprimrii genelor Controlul cantitativ al exprimrii materialului genetic, respectiv a genelor, se poate realiza la dou niveluri: la nivelul sintezei proteice, printr-un control adaptativ, n cadrul procesului de transcripie i translaie (se refer la reacia de rspuns a genelor sub influena factorilor de mediu) i printr-un control programat n cadrul procesului de activare i inactivare genic (se refer la procesul de difereniere tisular, specific eucariotelor); Controlul adaptativ se poate realiza n procesul de transcripie i n procesul de translaie. Pentru controlul adaptativ n procesul de transcripie este cunoscut modelul operonului inductibil (prin mecanismul induciei pozitive i negative), specific cilor metabolice de degradare a unui substrat i modelul operonului represibil i controlul exprimrii genelor la nivelul secvenei leader, specific cilor metabolice de sintez. la nivelul activitii proteinelor sintetizate, activitate reglat, n cadrul lanului metabolic n care acestea acioneaz printr-un mecanism negenetic, de feed back. Acesta presupune faptul c produsul de sintez, acumulat ntr-o anumit cantitate, poate aciona ca inhibitor al cii metabolice respective, blocnd prin tranzaie alosteric enzima reglatoare. La diferite nivele de organizare a materiei vii, de la virusuri pn la eucariotele superioare, proteinele specifice, ca expresie a marii diversitii genetice, nu sunt sintetizate dintr-o dat. Att sinteza lor ct i activitatea lor poate fi supus unui control adaptativ, rspunsul organismului fiind adecvat solicitrilor mediului. 7.4.2. Structura fin a genei Gena este considerat o tripl subunitate, de mutaie, de recombinare i de funcie. Prin mutaie gena poate suferi modificri ce pot s conduc la manifestarea ereditar a unor expresii diferite a caracterului controlat Cea mai mic subunitate de mutaie a genei este mutonul i corespunde unei singure nucleotide. Prin modificarea unor nucleotide din interiorul unei gene pot s apar serii mutante ale genei, numite serii alelice multiple. Alelele din cadrul 5

unei serii alelice multiple se numesc pseudoalele. Cea mai mic subunitate de recombinare din interiorul unei gene care poate suferi un crossing-over se numete recon i corespunde tot unei singure nucleotide n urma cercetrilor de genetic la nivel biochimic s-a constatat c majoritatea variaiilor ereditare se datoreaz modificrii unor funcii metabolice, gena fiind astfel considerat ca subunitate de funcie. Cea mai mic subunitate de funcie a genei este cistronul. 7.4.3. Tipuri particulare de gene Familiile de gene sunt reprezentate de gene dispuse n tandem, avnd o structur similar sau identic. Familiile multigenice pot fi alctuite din copii multiple ale unei anumite gene, copii rezultate n urma fenomenului de amplificare genic. Familiile de gene codific ARN-r, ARN-t, histone, precum i proteine de rezerv (gliadina - 100 gene n tandem, zeina - 50 gene, faseolina - 14 gene). De exemplu, familia multigenic a histonelor este reprezentat de genele celor cinci histone: H1, H2A, H2B, H3 i H4 care alctuiesc un bloc. Izogenele sau izolocii sunt dispuse n cromozomi diferii i codific izoenzimele (izoenzimele sunt enzime cu aceeai specificitate de substrat dar cu structur diferit). Pseoudogenele sunt gene nefuncionale, dar nrudite ca structur cu cele funcionale. Ele au la origine o gen ancestral din care s-au format prin mutaii succesive. Genele suprapuse determin citirea repetat a unei anumite secvene de nucleotide. Au fost identificate prima dat n genomul fagului x 174 la care existena unei secvene de nucleotide citit repetat determin sinteza a dou catene diferite de polipeptide. Genele suprapuse mresc substanial capacitatea de codificare. Genele antisens sunt gene de excepie ce permit transcrierea informaiei de pe catena antisens. Se cunoate c, de regul, numai catena sens este transcris i translat, n timp ce catena pereche, antisens asigur integritatea secvenelor codificatoare. Un exemplu de gen antisens este gena pentru hormonul ce elibereaz gonadotropina. Genele ADN-c (ADN-complementar) sunt sintetizate pe matrie de ARN-m matur i conin numai secvene exonice. Ele se formeaz n urma transcrierii ARN-m precursor i a excizrii secvenelor intronice, apoi unirea exonilor i formarea de ARN-m matur care este copiat sub form de ADN-c n prezena reverstranscriptazei. Astfel de gene sunt cele ce determin sinteza lanul polipeptidic al imunoglobulinelor. Oncogenele au fost puse n eviden de cercettorii americani M.S.COLETT i R.L.ERIKSON (1978) n genomul vertebratelor. Aceste gene au capacitatea de a induce transformarea malign a celulelor i diviziunea lor dezordonat. n mod normal oncogenele se gsesc n stare represat (protooncogene). Sub influena unor factori de mediu sau n urma integrrii unor virusuri sub form de provirus protooncogenele devin active. Elementele genetice mobile sau elemente transpozabile sunt secvene de ADN capabile s-i schimbe poziia n cadrul genomului, fenomen denumit transpoziie.

6

Capitolul 8 SURSELE VARIABILITII GENETICE

Materialul genetic poate fi modificat prin trei procese distincte i anume: recombinarea genetic, transpoziie i mutaie. Recombinarea genetic, despre care s-a discutat deja, presupune un schimb reciproc de material genetic (ADN) care se realizeaz ntre cromatidele nesurori ale cromozomilor omologi n procesul de crossing over i care, la eucariotele ce se reproduc sexuat, are loc de regul n profaza meiozei I, respectiv segregarea independent a perechilor de cromozomi din anafaza meiozei I. Un schimb asemntor dar unilateral se poate realiza i n cadrul procesului parasexual la bacterii sau chiar la virusuri. Despre transpoziia elementelor genetice mobile i efectul acesteia asupra fenotipului, de asemenea, s-a discutat. n ambele cazuri fenomenele sunt reversibile i constau, de fapt n fenomene mai puin brutale, de recombinare a subunitilor materialului genetic, deja existent. 7.1. Mutaia i clasificarea mutaiilor Mutaia reprezint o modificare efectiv a materialului genetic, relativ brutal i stabil, ce determin apariia brusc a unor efecte fenotipice noi, ereditare, neidentificate n ascenden. Pentru prima oar noiunea de mutaie a fost folosit de HUGO DE VRIES n 1901 (dup PANFIL, 1974). Individul care sufer o mutaie se numete mutant iar procesul mutaiilor se numete mutagenez. CLASIFICAREA MUTAIILOR. n raport cu criteriile de clasificare exist foarte multe tipuri de mutaii. Dup nivelul la care se produc, mutaiile pot fi extracromozomale, ce se produc la nivelul materialului genetic extracromozomal i nucleare ce se produc la nivelul materialului genetic nuclear. Mutaiile nucleare, la rndul lor, pot fi genice (la nivelul genei), cromozomale (la nivelul cromozomului) i genomale (la nivelul genomului, afectnd numrul de cromozomi). Dup relaia de alelism ce la caracterizeaz mutaiile pot fi dominante i recesive. Mutaiile dominante se pot manifesta la organismele diploide, de regul, n anul producerii lor. Mutaiile recesive se pot manifesta numai n descenden, n urma homozigotrii lor. Evident c este posibil i apariia unor mutaii lipsite de dominan sau chiar care s manifeste codominan sau supradominan fa de alela ei. Dup modul de apariie mutaiile pot fi spontane i artificiale. Mutaiile spontane (naturale) survin n mod natural fr cauza aparent i fr intervenia direct a omului. Cauza acestor mutaii se presupune a fi: radiaiile ultraviolete, radiaiile cosmice i radioactive naturale, aciunea unor substane, acumularea unor produi de metabolism etc. Mutaiile artificiale (induse) sunt provocate de regul n mod contient, artificial, de om sub aciunea unor ageni mutageni a cror efect este cunoscut. Dup sensul modificrii n raport cu alela de referin considerat slbatic, mutaiile pot fi directe i inverse. Mutaiile directe (nainte, progresive) se produc dinspre forma slbatic spre forma mutant, care poate fi dominant sau recesiv. Mutaiile inverse (regresive sau retromutaii) se produc dinspre forma mutant spre forma slbatic. 7

a+ D+ a D

a mutaii directe D a+ D+ mutaii inverse

Dup modul de manifestare fenotipic mutaiile pot fi: morfologice, letale, condiionate, biochimice, de rezisten. Mutaiile morfologice afecteaz proprieti vizibile ale organismului, de regul exterioare, cum ar fi mrimea, culoarea .a. Mutaiile letale determin moartea organismului. n cazul mutaiilor condiionate o alel mutant i manifest fenotipul specific numai n anumite condiii numite restrictive n timp ce n alte condiii numite permisive exprim un fenotip normal. De exemplu la Drosophila este cunoscut mutaia dominant letal termosensibil (H) care face ca un individ heterozigot s se comporte normal la temperatura de 20C (condiii permisive) i s moar la 30C (condiii restrictive). Mutaiile biochimice se pot identifica prin lipsa sau modificarea unei funcii biochimice ce, de regul, se traduce prin incapacitatea indivizilor de a crete i de a se nmuli n anumite condiii. Acestei categorii le aparin mutanii auxotrofi, mutanii dependeni de substrat (sau mutanii de deficien) i mutanii de rezisten, comuni la bacterii i ciuperci. Dup felul celulelor afectate mutaiile pot fi gametice i somatice. Mutaia gametic (germinal) afecteaz gameii sau celulele mam din care se formeaz gameii. Acestea se pot transmite pe calea reproducerii sexuate. Chiar dac sunt recesive, aceste mutaii se pot manifesta n urma segregrii i recombinrii, dac sunt incluse n zigot. Mutaia somatic afecteaz celulele somatice i se manifest, de regul, sub form de himere (mozaic de esuturi). Himerele pot fi periclinale (cnd esutul mutant este dispus la suprafa, n strat continuu), mericlinale (cnd esutul mutant este dispus la suprafa n strat discontinuu) i sectoriale (cnd esutul mutant este dispus sectorial n profunzime). Astfel de himere pot s apar n cazul unor gene mutante dominante sau chiar n cazul unor gene mutante recesive, dac gena slbatic dominant este ntmpltor pierdut (pseudodominan) sau dac gena mutant recesiv se homozigoteaz n urma crossing over-ului somatic. Aceste mutaii, de regul, nu se transmit pe calea reproducerii sexuate, n afar de cazul n care din celulele mutante se formeaz organe de reproducere. n mod obinuit se transmit pe calea multiplicrii vegetative. Momentul ontogenetic n care se produce mutaia somatic determin i proporia celulelor afectate. 7.1.1. Mutaia genic Mutaia genic se produce la nivelul genei. Modificarea materialului genetic n cazul mutaiei genice afecteaz structura i funcia genei. Dac modificarea afecteaz o singur pereche de nucleotide din cadrul segmentului de ADN ce aparine unei gene se mai vorbete de mutaia punctiform. Aceste modificri, aparent minore, au repercusiuni la nivelul citirii mesajului genetic. CARACTERISTICILE MUTAIEI GENICE. Mutaiile genice nu pot fi identificate citologic. De regul, sunt recesive, se transmit mendelian i apar ntmpltor, producerea lor fiind, n acelai timp, un fenomen rar. Mutaiile genice, n special cele punctiforme, sunt reversibile, fiind deci susceptibile la retromutaie. MECANISMUL BIOCHIMIC AL PRODUCERII MUTAIILOR GENICE Stabilitatea caracterelor de-a lungul generaiilor este asigurat de legea complementaritii bazelor, att n procesul de biosintez replicativ a ADN-ului prin care se asigur continuitatea materialului genetic, ct i n procesul de transcripie i translaie prin care se asigur exprimarea materialului genetic. Aceast stabilitate este ns relativ. Att n procesul 8

de replicare ct i n celelalte dou procese pot s apar greeli. Greelile aprute n procesul de transcripie i translaie pot determina modificri fenotipice, ca urmare a sintezei unor proteine nespecifice, dar modificrile nu sunt ereditare. Numai greelile sau modificrile aprute la nivelul materialului genetic, eventual n procesul de replicare, pot determina apariia de modificri ereditare sau apariia de mutaii. Exist cteva tipuri de modificri la nivelul ADN-ului generatoare de mutaii punctiforme. Deleia reprezint excluderea cel puin a unei perechi de nucleotide din mesajul corespunztor unei gene. Ca urmare din dreptul acestei modificri se modific sensul mesajului genetic schimbndu-se faza de citire, ntruct mesajul se face continuu. Cuvintele de cod fiind triplete, sensul mesajului genetic se modific n mod asemntor cum se modific sensul urmtoarei propoziii ele iau ap din ru, compus din cuvinte de cte trei litere, n cazul n care se pierde o liter, cum ar fi de exemplu litera e, eli aua pd inr u. Adiia sau inseria reprezint adugarea unei perechi de nucleotide la mesajul genetic corespunztor unei gene. Efectul adiiei este similar, modificndu-se sensul mesajului genetic din dreptul codonului afectat. Inversia reprezint ruperea i rotirea cu 180C a unui segment din cadrul moleculei de ADN corespunztoare unei gene. Avnd n vedere c citirea mesajului genetic se face unidirecional, n segmentul inversat mesajului genetic este modificat, ca i cum un cuvnt ar fi citit pe dos. Substituia reprezint nlocuirea reciproc a unei perechi de baze azotate cu alta. n cazul n care o baz de un anumit tip este nlocuit cu o baz de acelai tip se vorbete de tranziie (A-T cu G-C), iar n cazul n care o baz de un anumit tip este nlocuit cu o baz de alt tip (A-T cu C-G) se vorbete de transversie. 7.1.2. Mutageneza artificial Mutageneza artificial este procesul inducerii (producerii) mutaiilor artificiale, adic n mod contient de ctre om, sub aciunea unor ageni mutageni. Agenii mutageni pot fi fizici, chimici i biologici. n continuare vom prezenta principalii ageni mutageni i modul de utilizare a lor. 1. Agenii mutageni fizici sunt radiaiile i ocurile de temperatur. Radiaiile pot fi electromagnetice i corpusculare. n cazul radiaiilor electromagnetice (UV, x i ) cantitatea de energie util este exprimat n fotoni, a crui energie elementar este dependent de frecvena undei purttoare: v = c/, fiind invers proporional cu lungimea de und. n termeni relativi energia radiaiilor electromagnetice poate fi clasificat astfel: foton UV < foton x < foton (SEILLEUR, 1982). Radiaiile UV (ultraviolete) sunt radiaii neionizante, au o putere de penetrare slab, fiind utilizate pentru tratamentul organismelor cu volum mic, cum ar fi microorganismele, eventual grunciorii de polen sau pentru inducerea mutaiilor in vitro. Acestea acioneaz prin activarea atomilor electronilor moleculelor iradiate, putnd s determine producerea de dimeri pirimidinici cu consecine cunoscute. Radiaiile x i sunt radiaii ionizante cu o mare putere de penetraie, fiind utilizate pentru tratamentul seminelor, mugurilor sau plantelor ntregi. Sursa cea mai frecvent utilizat pentru producerea radiaiilor este cobaltul 60 (60Co), a crui perioad de njumtire este de 5,3 ani sau Cesiul 137 (137Cs) a crui perioad de njumtire este de 33 ani. 2. Agenii mutageni chimici sunt foarte diveri iar mecanismul lor de aciune a fost, n mare parte, explicat. Principalii ageni chimici sunt:

9

Inhibitori de concuren ai precursorilor acizilor nucleici cu structur analoag bazelor azotate (azaserina) i care pot bloca, printr-un mecanism de feed back sinteza bazelor azotate, inducnd foamea celulei pentru baze cu posibilitatea producerii de rupturi i gap-uri (PANFIL, 1974). Analogii bazelor azotate (5-bromuracil i 2-aminopurina) pot induce tranziii n urma ncorporrii lor n molecula de ADN prin replicare, n locul bazelor azotate. Agenii de intercalare reprezint o important grup de mutageni ce include proflavina, acridinoranjul i compuii ICR. Aceti ageni au molecule plane i se pot intercala ntre bazele azotate din inima dublului helix de ADN, determinnd n procesul de replicare apariia unor adiii sau deleii. Acidul azotos (HNO2) acioneaz prin dezaminarea oxidativ a bazelor azotate, cu inducerea de tranziii. Efectul mutagen al acidului nitros a fost pus n eviden doar la virusuri i bacterii, nu i la plantele superioare. Agenii alkilani provoac, n principal, alkilarea bazelor azotate i inducerea unor tranziii. Prin alkilarea grupelor fosfat pot s apar i rupturi ale lanului polinucleotidic, inducnd apariia unor restructurri cromozomale similar radiaiilor ionizante, motiv pentru care se mai numesc i radiomimetice. Agenii alkilani pot aciona asupra celulelor aflate n afara ciclului celular, deci tratamentele se pot aplica seminelor dorminde Antibioticele s-au dovedit a fi ageni mutageni redutabili n cazul organismelor procariote, utilizarea lor la plantele superioare nu a fost, ns, ncununat de succes sub aspect practic, aplicativ. Se menioneaz faptul c streptomicina poate induce sterilitatea mascul la porumb, dar deocamdat fr utilizare practic (VAN HARTEN, 1991). Unele antibiotice, cum ar fi mitomicina i actinomicina, pot provoca rupturi i restructurri cromozomale. 3. Agenii mutageni biologici cum ar fi unele virusuri, unele microplasme, parazite intracelulare, pot provoca gap-uri ca urmare a competiiei acestora cu celula parazitat n procesul de replicare ADN. n afara aciunii unor ageni biologici specifici, procesul de altoire poate produce mutaii n special la nivelul genelor citoplasmatice, ce se transmit pe linie matern. IMPORTANA MUTAIILOR mutaiile principala surs de variabilitate (evoluie, ameliorare, mutagenez dirijat); existena alelelor, aprute prin mutaie (expresii diferite ale aceleai gene) a permis efectuarea experienelor de analiz genetic i descoperirea legilor transmiterii ereditare. Prin mutagenez se pot explica producerea unor fenomene (mbtrnirea, oncogeneza). Realizri: Penicillium noi tulpini (50-3000 U.I.) Soi de orz Palas, mutar Primex, ovz Floral. Activitatea mutagen i omul: riscul ce l prezint pesticidele, creterea radiaiei terestre, poluarea (Genetica cultural studiaz influena civilizaiei asupra frecvenei genelor). 7.1.3. Mutaii cromozomale Mutaiile cromozomale se produc la nivelul cromozomului i presupun modificarea numrului de gene (deleia, duplicaia) sau modificarea poziiei genelor n cromozom (translocaia, inversia), determinnd o modificare a morfologiei acestuia. Principala cauz o constituie fragmentarea cromozomilor sub aciunea unor ageni mutageni, urmat de pierderea sau unirea nerestituional a fragmentelor rupte. Spre deosebire de mutaiile genice, mutaiile cromozomale pot fi identificate citologic.

10

Mutaiile cromozomale determin anomalii n funcionarea celulelor sau a organismelor n ntregime. Aceste mutaii au un rol important n evoluia genomului pe parcursul evoluiei lumii vii, fiind totodat surs de variabilitate n programele de ameliorare a plantelor. Mutaiile cromozomale pot surveni n celulele tuturor esuturilor. Dac se produc n esuturile somatice pot avea consecine asupra fenotipului unor celule sau a unor sectoare celulare somatice iar cele produse n esutul germinal pot genera gamei i apoi indivizi purttori de mutaii cromozomale. 7.1.3.1. Deleia Pierderea unui fragment cromozomal se numete deleie sau deficien. Apariia unei deleii necesit producerea unor fragmentri cromozomale, rezultnd fragmente acentrice i un fragment cu centromer. De regul, fragmentele acentrice se pierd. Deleia, poate afecta segmente de mrime variabil, situate n orice parte a cromozomului, cantitatea de material genetic pierdut putnd varia de la un nucleotid la segmente cromozomale mari. Deleia poate fi terminal sau intercalar, homozigot sau heterozigot (fig. 7.1.). Deleia terminal const n pierderea unui fragment cu telomer. Asemenea deleii apar n urma unei singure fragmentri n zona terminal a unui bra cromozomal. n lipsa restituiei, fragmentul fr centromer se pierde. Deleia intercalar presupune dou fragmentri ntr-un bra cromozomal i pierderea segmentului acentric situat central. Fragmentul acentric CD este pierdut, n timp ce poriunea terminal AB se ataeaz la restul cromozomului. Deleia poate fi heterozigot, atunci cnd numai un cromozom omolog este afectat, sau homozigot, cnd sunt afectai ambii cromozomi omologi.

Fig. 7.1. Formarea unei deleii intercalare Efectele genetice ale deleiei Consecinele deleiei sunt n funcie de mrimea segmentului pierdut, de importana genelor plasate pe fragmentul pierdut, precum i de starea homozigot sau heterozigot a deleiei. Dac se pierd fragmente cromozomale mari, sau care conin gene importante, ori n cazul deleiilor homozigote, efectul este letal. Plantele cu deleii homozigote nu supravieuiesc dect foarte rar. Gameii masculi cu deficien sunt neviabili, de aceea deleiile se transmit de regul pe linie matern. Plantele poliploide tolereaz mai bine deleiile dect cele diploide. La indivizii heterogametici, efectul deleiei este mai drastic.

11

n cazul deleiei poate apare fenomenul de pseudodominan care const n manifestarea genelor recesive la un organism heterozigot, n urma pierderii alelelor dominante odat cu fragmentul de cromozom lips. 7.1.3.2. Duplicaia Duplicaia este un fenomen opus deleiei i const n ataarea unui segment de cromozom la unul din cromozomii omologi. Regiunile duplicate pot fi adiacente sau localizate, una la un situs original i alta la un alt situs, n acelai cromozom. La un organism diploid vor exista trei copii pentru regiunea considerat cu duplicaie i nu n doz dubl, ceea ce face ca genele respective s nu mai segrege normal. Prin unirea a doi gamei cu segmente duplicate rezult indivizi homozigoi, cu regiunea respectiv multiplicat de patru ori n perechea de cromozomi omologi. La aceti indivizi apare o alt particularitate i anume formarea unor asimetrici. n meioz, un crossing-over inegal, ntre regiunile duplicate poate determina prezena unui segment n doz tripl iar cromozmul omolog s revin la starea normal. Segmentul n plus se poate ataa n tandem (ABCBCD) sau n contra-tandem (ABCCBD). Dup cum s-a artat, duplicaia poate apare n urma unui crossing-over inegal sau n urma unui crossing-over ntre cromatidele surori, cnd cromatida donoare va da natere unui cromozom cu deleie, iar cromatida receptoare, unui cromozom duplicat. n general, duplicaiile sunt rare i dificil de detectat. Modul de mperechere a cromozomilor duplicai se aseamn foarte mult cu cel caracteristic deleiei, ns bucla ce apare n profaza meiozei o formeaz cromozomul duplicat. Efectele fenotipice ale duplicaiei nu sunt att de severe ca i cele ale deleiei, n primul rnd nefiind afectat vitalitatea. Datorit efectului de doz, duplicrile determin intensificarea capacitii de expresie a unor gene. Se consider c genele multiple sau complementare au la origine duplicaii. Locii duplicai, care pot s muteze independent au avut un rol important n evoluie. 7.1.3.3. Inversia Inversia este rezultatul ruperii unui segment netelormeric dintr-un cromozom i realipirea lui la acelai cromozom, dup o rotire de 180. Spre deosebire de duplicaie sau deleie, inversia nu modific cantitatea de material genetic, determinnd schimbarea ordinii genelor n cromozomi. n consecin, indivizii afectai de inversie sunt viabili. Inversiile se clasific dup mai multe criterii. Dac este afectat un singur cromozom omolog, inversia este heterozigot iar dac sunt afectai ambii cromozomi omologi, inversia este homozigot. Dup poziia fa de centromer, inversiile pot fi: paracentrice (acentrice), cnd segmentul inversat nu include centromerul i pericentrice (eucentrice), cnd centromerul se gsete n segmentul inversat. Dup complexitate apar urmtoarele tipuri de inversii: - simple, cnd are loc numai o inversie n cadrul cromozomului: ABCDEFGHI AB EDC FGHI

12

- independente, cnd au loc dou inversii n cadrul unui cromozom, dar independente una de cealalt: ABCDEFGHI AB F EDCI

GH

- incluse, cnd au loc dou inversiuni n cadrul unui cromozom, din care una se produce n interiorul celeilalte: ABCDEFGHI AB

E CD FGHI

Identificarea inversiilor se face n pachinem, pe baza configuraiei de mperechere specifice. Inversiile au o importan deosebit n studiile de genetic. Ele permit studiul comportamentului cromozomilor n meioz, studiul crossing-overului i a efectelor genetice determinate de acesta. Ca urmare a schimbrii poziiei unor gene din zone heterocro-matice n zone eucromatice i invers apar efecte fenotipice noi, datorit modificrii capacitii de expresie a unor gene. Prin determinarea citologic a punctelor de fragmentare a cromozomului se poate stabili localizarea fizic a unor gene. nversia are capacitatea de a represa crossing-overul, asigurnd astfel stabilitatea grupelor de nlnuire. n cazul unor inversii pericentrice pot apare schimbri n morfologia unor comozomi. De exemplu, un cromozom acrocentric cu inversie poate cpta aspectul unui cromozom metacentric. Fiind surs de variabilitate, inversia are rol important n evoluia speciilor i n dinamica populaiilor. 7.1.3.4. Translocaia Restructurrile produse de schimburile de segmente ntre cromozomii neomologi se numesc translocaii. Transferul unui segment de cromozom dizlocat, ntr-o alt poziie, n acelai cromozom se numete transpoziie. Translocaia prezint mai multe tipuri, n funcie de numrul cromozomilor implicai precum i de poziia segmentelor translocate. Translocaia simpl apare atunci cnd un fragment cromozomal se transfer la un alt cromozom neomolog. Translocaia robertsonian sau fuziunea centric const n producerea a dou fragmentri cromozomale pericentrice la cromozomi acrocentrici, urmat de eliminarea unui centromer i fuziunea celor doi cromozomi, avnd ca i consecin reducerea numrului de cromozomi cu unu. Cel mai frecvent tip de translocaie este translocaia reciproc, care const dintr-un schimb reciproc de segmente ntre cromozomii neomologi. n urma acestui tip de restructurare nu se modific cantitatea de material genetic, dar se schimb poziia genelor n cadrul grupelor de nlnuire, determinnd efecte de poziie. De asemenea, se poate modifica dimensiunea cromozomilor, precum i poziia centromerului. Translocaiile reciproce au un rol important n evoluie, fiind o surs de variabilitate. Prin translocaie se pot rupe anumite grupe de nlnuire nefavorabile i pot fi eliminate astfel unele corelaii nedorite ntre caractere. Ca urmare a schimbrii poziiei genelor n cromozomi din zone eucromatice n zone heterocromatice se schimb capacitatea lor de expresie (efectul de poziie). 13

Prin translocaie reciproc se pot transfera gene valoroase de la specii slbatice la plante cultivate.

Translocaia reciproc

Translocaia complex sau multipl reprezint schimbul de segmente cromozomale care implic mai mult de dou perechi de cromozomi neomologi (uneori schimbul afecteaz toi cromozomii unui genom). Translocaia multipl permite stabilizarea efectului heterozis i obinerea unei semine hibrid simplu, deoarece segregarea independent nu se mai produce. 7.1.4. Mutaii genomale; tipuri de mutaii genomale Numrul, forma i mrimea sunt trsturi caracteristice i relativ stabile pentru diferite specii. Mutaiile genomale se produc la nivelul genomului i determin modificarea numrului de cromozomi. n celule sexuale este prezent un singur set cromozomal (starea haploid, notat simbolic n). Numrul cromozomal de baz sau setul haploid al unei specii diploide se noteaz cu x. Schimbarea numrului cromozomilor poate avea loc spontan sau sub aciunea unor factori artificiali i constituie unul din instrumentele evoluiei speciilor. Astfel de exemple se gsesc foarte frecvent la numeroase plante de cultur. Mutaiile genomale sunt clasificate n funcie de adugarea sau eliminarea unor cromozomi particulari sau a unor seturi ntregi de cromozomi. Euploidia apare atunci cnd modificarea numeric afecteaz ntregul set cromozomal n sensul reducerii sau multiplicrii lui. Indivizii afectai de euploidie se numesc euploizi. Euploidia poate fi de dou feluri: 14

- haploidia, cnd numrul de cromozomi din celulele somatice este egal cu numrul gametic de cromozomi; - poliploidia, cnd numrul de cromozomi din celulele somatice reprezint mai mult dect dublu dumrului cromozomal de baz (ex.: triploizi 3x, tetraploizi 4x, pentaploixi 5x, hexaploizi 6x etc.). Aneuploidia apare cnd modificarea numeric afecteaz numai anumii cromozomi particulari, prin adugarea a unu, doi cromozomi (polisomie) sau pierderea unor comozomi (oligosomie). Reprezentarea schematic a diferitelor tipuri de modificri numeric cromozmale: A Euploidia - haploidia - monoploidia - polihaploidia - poliploidia - autopoliploidia - artioploidia - perisoploidia - alopoliploidia - genomal (amfipoliploidia) - segmental B. Aneuploidia- oligosomia - monosomia - nulisomia - polisomia - trisomia - tetrasomia 7.1.4.1. Haploidia Este fenomenul de reducere la jumtate a numrului de cromozomi din celulele somatice, astfel c plantele haploide au numrul de cromozomi din esutul somatic egal cu numrul gametic de cromozomi. Haploidia este de dou feluri: monoploidie i polihaploidie. Monoploidia reprezint starea celulelor somatice sau a organismelor la care numrul de cromozomi corespunde cu numrul de baz, deci posed un singur set cromozomal (x). Monoploizii sunt de fapt haploizii speciilor diploide, avnd numrul gametic al speciei diploide. Polihaploidia reprezint reducerea la jumtate a numrului de cromozomi din esutul somatic al plantelor poliploide. Poliploizii sunt haploizii speciilor poliploide. Caracteristicile haploizilor La nivel microscopic haploidia este corelat cu reducerea volumului nuclear i a ntregii celule. Diametrul celulelor stomatice este mai mic i nglobeaz un numr reduse de cloroplaste, acestea fiind repartizate neuniform la unitatea de suprafa. La nivel fenotipic, haploizii manifest urmtoarele caracteristici: o vigoare sczut, talie redus, frunze mai puine, mai nguste, de culoare mai deschis. Reducerea taliei i a vitalitii este mai pregnant la plantele alogame, deoarece existena unei singure garnituri cromozomale n cazul monoploizilor permite manifestarea tuturor genelor recesive att a celor utile ct i a celor negative. La plantele autogame consecinele morfologice i fiziologice nu sunt att de puternice, deoarece acetia, n stare diploid, manifest un grad ridicat de homozigoie. Fertilitatea haploizilor este redus, monoploizii fiind aproape complet sterili, datorit desfurrii anormale a meiozei. Prezena n celulele mam ale gameilor a unui singur set cromozomal la monoploizi mpiedic conjugarea i segregarea. Ca urmare, n anfaza meiozei I, cromozomii se repartizeaz neregulat spre cei doi poli, producnd nuclei anormali i sterilitate. Importana haploidiei se regsete att n unele aspecte teoretice ct i practice. n studiile de citogenetic, haploizii permit studiul fiecrui cromozom n parte, evideniindu-se astfel unele duplicaii, precum i comportamentul cromozomilor n cursul

15

diviziunii meiotice, relaiile sinaptice dintre ei. Pe baza mperecherilor sub form de bivaleni sau multivaleni s-a stabilit originea poliploid a unor specii. Importana genetic a monoploizilor const n faptul c aceste organisme i manifest integral toate genele, inclusiv cele recesive. Din acest considerent ei constituie un material ideal pentru studiile de mutagenez, deoarece ofer posibilitatea manifestrii fenotipice a tuturor mutaiilor aprute chiar n anul producerii lor i nu n generaiile segregante, cum se ntmpl la poliploizi. Prin dublarea numrului de cromozomi la haploizi, se obin linii complet homozigote, numite linii izogene, care pot nlocui liniile consangvinizate, n vederea obinerii de hibrizi F1 pentru producie. Aceste linii pot constitui genotipuri superioare, care pot fi cultivate ca atare la plantele autogame. 7.1.4.2. Poliploidia Poliploidia este definit ca fenomenul de multiplicare a numrului cromozomal de baz. Indivizii rezultai prin multiplicarea setului cromozomal de baz propriu sau cei rezultai n urma hibridrii unor indivizi poliploizi ce aparin aceleiai specii se numesc autopoliploizi. n acest caz seturile cromozomale sunt omoloage. Autopoliploizii sunt de dou feluri: artioploizi (autopoliploizi, cu numrul de baz multiplicat de un numr par: 2x, 4x, 6x, 8x etc.) i perisoploizi (autopoliploizi cu numrul de baz multiplicat de un numr impar: 3x, 5x, 7x etc.). Multiplicarea numrului de cromozomi atrage dup sine unele modificri ereditare, ce vor fi promovate n procesul de selecie dac sunt utile speciei. Caracteristicile autoploizilor La nivel microscopic se nregistreaz urmtoarele aspecte: celulele mai mari, cu un numr sporit de cromozomi; diametrul mai mare a celulelor stomatice, cu un numr mai mare de cloroplaste; numrul mai mare al cromocentrilor nucleolari; diametrul mai mare al grunciorilor de polen i numrul mai mare de pori germinativi la grunciorul de polen. Macroscopic se disting urmtoarele caracteristici: plante cu talia mai mare i mai viguroase; numr mai mic de tulpini, lstari sau ramificaii, dar de dimensiuni mai mari. flori mai puine, mai mari i mai intens colorate; numr mai mic de frunze, de dimensiuni mai mari, de un verde intens. Poliploidia la plante este corelat i cu importante modificri fiziologice i biochimice. Astfel, plantele prezint o cantitate mai mare de clorofil i o capacitate sporit de fotosintez, rezisten sporit la stressuri climatice i ageni patogeni, manifestnd, n general, o bun adaptabilitate la condiii de mediu nefavorabile, asociat ns cu tardivitate. Ca urmare a efectului de doz (datorat multiplicrii dozei n care pot fi prezente genele) plantele poliploide au capacitate mai mare de sintetizare a substanelor proteice, a glucidelor, vitaminaelor, pigmenilor etc. Fertilitatea autopoliploizilor este, n general, mai sczut, mai ales la perisoploizi, deoarece pot apare unele anomalii n desfurarea meiozei. Aceste anomalii apar n special n profaza I, deoarece nu se formeaz numai bivaleni, ci uni-, bi-, tri- i tetravaleni. Multivalenii segreg dezordonat n anafaza I i determin gamei neechilibrai. Din acest considerent se recomand utilizarea plantelor poliploide numai atunci cnd din punct de vedere economic

16

intereseaz masa vegetativ i nu producia de semine (ex.: plante furajere, plante ornamentale, sfecl de zahr etc.). Inducerea artificial a poliploidiei Producerea experimental a poliploidiei se realizeaz prin influenarea mecanismelor diviziunii celulare. Se preteaz la poliploidizare acele specii care prezint un numr mic de cromozomi, la care intereseaz masa vegetativ i nu producia de semine, iar dac prezint un grad ridicat de sterilitate, s se poat multiplica vegetativ. n vederea inducerii artificiale a autopoliploidiei au fost elaborate mai multe metode: tratamente cu ocuri de temperatur, ridicate sau sczute, aplicate la diferite organe, esuturi sau celule aflate n diviziune pot deregla aparatul mitotic; metoda centrifugrii i a iradierii urmrete distrugerea fusului de diviziune sau mpiedicarea formrii lui i apariia unor nuclei de restituie; metoda regenerrii se bazeaz pe dublarea numrului de cromozomi prin endomitoz, fercvent ntlnit n culturile de celule i calusuri de cicatrizare (ex.: punctul de altoire) sub influena heteroauxinei; metoda poliembrioniei const n facilitatea procesului de formare a seminei cu doi sau mai muli embrioni, dintre care unii pot fi poliploizi; metoda tratamentului cu colchicin sau proto-oxid de azot, este cea mai eficient i mai des utilizat. Importana autoploidiei Poliploidia prezint o importan deosebit, att pentru evoluie ct i pentru ameliorarea plantelor. n evoluie, autopoliploidia reprezint o important surs de variabilitate, numeroase specii avnd o origine poliploid (cartoful 2n = 48; alunele de pmnt 2n = 40; cafeaua 2n = 22, 44, 66, 88 etc.). MNTZING consider c exist o corelaie pozitiv ntre numrul de cromozomi i durata vieii unei plante. Numeroase specii perene au provenit din plante anuale cu un numr mai mic de cromozomi./ De exemplu, Sorghum sudanensis (anual) are n = 10 cromozomi iar Sorghum halepense (peren) are n = 20 cromozomi; Helianthus annuus (anual) are n = 17 cromozomi iar Helianthus tuberosus (peren) are n = 51 cromozomi. Un avantaj evolutiv al autopoliploizilor l constituie i rezistena mai mare la condiiile nefavorabile de mediu. Poliploidia la plante este corelat cu importante modificri morfologice, fiziologice i biochimice.n consecin, n programele de ameliorare a plantelor pot fi exploatate unele caracteristici importante ale autopoliploizilor cum ar fi: vigoarea vegetativ, coninut ridicat n proteine, vitamine, pigmeni, precum i rezistena sporit la ger, secet, boli i duntori. Din punct de vedere practic prezint importan economic unii triploizi, care datorit sterilitii nu au semine, ca de exemplu: strugurii pentru stafide (3x = 57), pepenele verde (3x = 33), bananierul (3x = 33) sau ananasul (3x =75). La sfecla de zahr, triploizii au cel mai ridicat coninut de zahr i cea mai mare producie de rdcini. Formele autopoliploide prezint importan n cultura plantelor ornamentale, datorit unei dimensiuni mai mari a florilor i a unei pigmentaii mai intense (lalele, crizanteme, garoafe, narcise). 7.1.4.3. Allopoliploidia

17

Allopoliploidia rezult n urma hibridrii unor specii ndeprtate genetic i n consecin gradul de omologie ntre seturile cromozomale este mai redus dect n cazul autopoliploizilor. Multiplicarea numrului de cromozomi poate fi rezultatul hibridrii, n cazul n care cel puin una dintre formele parentale este poliploid sau poate fi rezultatul dublrii numrului de cromozomi al unui hibrid interspecific. Allopoliploizii rezultai n acest din urm caz se mai numesc amfiploizi sau amfidiploizi dac speciile parentale au fost diploide. Dup gradul de omologie dintre seturile cromozomale parentale amfiploizii pot fi segmentali i genomali. Amfiploizii genomali sunt rezultatul hibridrilor ntre specii cu genomuri complet diferite. Amfiploizii segmentali sunt rezultatul hibridrii ntre specii cu genomuri parial sau complet omoloage, urmate de dublarea numrului de cromozomi (AxA' AAA'A'). Amfiploizii segmentali manifest un grad ridicat de sterilitate, datorit mperecherilor dezordonate din profaza meiozei I (trivaleni i univaleni) precum i segregrii haotice din anafaza I, oarecum asemntor autopoliploizilor. Importana alloploidiei. n natur allopoliploidia reprezint o importan deosebit n evoluia speciilor, un rol preponderent avnd amfiploidia genomal. Un allpopoliploid natural, de mare interes este grul comun (Triticum aestivum 2n = 6x = 42). Prin studiul speciilor slbatice diploide sau tetraploide, cu numrul de baz x = 7 a fost posibil reconstituirea evoluiei probabile a acestei cereale panificabile. n meioza grului sunt prezente 21 perechi de cromozomi. Fiecare cromozom are un singur omolog i nu cinci parteneri poteniali. nperecherea bivalent n meioz este asigurat de gena Ph situat pe braul lung al cromozomului 5 B. Aceast gen Ph asigur un comportament diploid acestei specii hexaploide. Amfiploizii manifest att caracteristicile celor dou forme parentale, ct caracteristicile poliploizilor, avnd i o capacitate mai bun de adaptare. Prin amfiploidie se pot obine specii noi, artificiale. O prim ncercare n acest sens a avut-o KARPECENKO (1928), care dorea s realizeze un hibrid fertil ntre varz (Brassica oleracea, 2n = 18) i ridiche (Raphanus sativus, 2n = 18). Hibridul obinut a fost ns steril. Singurul amfiploid de interes economic este Triticale, un amfiploid ntre gru (Tricium aestivum, 2n = 6x = 42) i secar (Secale cereale, 2n = 2x = 14). Triticale mbin foarte bine randamentul grului cu rusticitatea secarei. 7.1.4.4. Aneuploidia Aneuploidia este fenomenul prin care modificarea numeric afecteaz anumii cromozomi particulari, adic n celule exist unul sau mai muli cromozomi n plus sau n minus. Dac la numrul diploid de cromozomi (2n) se ataeaz un anumit numr de cromozomi, aneuploidia este de tip hiperploid (polisomie). Dac din garnitura diploid se pierd unul sau mai muli cromozomi, aneuploidia este de tip hipoploid (oligosomia). Cu toate c aspectele genetice i citogenetice ale fenomenului de aneuploidie sunt diferite, n esen toate au cauze comune i anume: nondisjuncia cromozomilor n mitoz sau meioz i, n consecin, repartizarea inegal a materialului genetic la celulele fiice; formarea de trivaleni i univaleni n loc de bivaleni normali; apariia de aberaii n structura unor cromozomi; lipsa de sinapsis sau un sinapsis parial ntre unii cromozomi, fenomen mai frecvent la cromozomii lungi. Tipuri de aneuploidie 18

Hiperploidia sau polisomia se ntlnete n situaia cnd la o pereche de cromozomi omologi se gsete un cromozom n plus, adic 2n + 1, fenomen denumit trisomie sau cnd unei perechi de cromozomi i se altur doi cromozomi, 2n + 2, fenomen denumit tetrasomie. Trisomia a fost pentru prima dat evideniat de BLAKESLEE (1921) ntr-o cultur de Datura stramonium, 2n = 24, prin existena unor plante cu habitus, vigoare precum i frunze deosebite de celelalte. BELLING (1924) fcnd analiza citologic a acestor plante a constatat existena unui cromozom n plus, adic 2n = 24+1, fa de forma euploid normal. Tetrasomia a fost pentru prima oar descris tot la Datura stramonium. Fenomenul rezult n urma fecundrii unui ovul n+1 cu polen n+1. De obicei, formele tetrasomice rezult prin ncruciarea formelor trisomice. Polisomia poate afecta oricare pereche de cromozomi att la organismele diploide ct i la cele poliploide. n general, ea nu are efecte negative asupra organismului vegetal. Hipoploidia sau oligosomia reprezint starea unor celule sau a unor organisme care au pierdut un cromozom din garnitura normal, fenomen denumit monosomie (2n-1) sau o pereche de cromozomi, fenomen denumit nulisomie (2n-2). Aspectele de hipoploidie se ntlnesc foarte rar la speciile diploide. Dac cromozomul lips are o importan vital, organismele monosomice sau nulisomice nu sunt viabile. Au ans de supravieuire speciile poliploide, ca urmare a fenomenului de compensare determinat de efectul de doz, datorit prezenei mai multor cromozomi omologi. Monosomia pentru cromozomul X sau sindromul Turner se ntlnete la specia uman. Femeile cu un singur cromozom X nu posed cromatin sexual, au statur mic, gt plat, dezvoltare sexual rudimentar, ntrziere minal. Caracteristicile aneuploizilor n general, vitalitatea i fertilitatea aneuploizilor este mai redus. Aneuploidia este mai bine tolerat de gametul femel, gameii masculi aneuploizi nefiind, n general, viabili. n consecin, aneuploidia se transmite pe linie matern. Ca urmare a efectului de doz polisomii prezint unele particulariti, specifice cromozomilor n plus. La oligosomi, ca urmare a reducerii dozei de material genetic, apar caracteristici noi fa de formele iniiale 2n, fapt ce permite stabilirea importanei fiecrui cromozom.

CAPITOLUL 8 INGINERIA GENETIC Ingineria genetica este reprezentat de totalitatea metodelor si tehnicilor prin care se actioneza in vitro asupra genelor, cromozomilor sau celulelor cu scopul obtinerii unor structuri genetice noi, posibil prestabilite. Ingineria genetica se delimiteaza de restul biotehnologilor prin scopul propus i anume, obinerea unor structuri genetice noi.

19

Domenii specifice a. Transgeneza b. Hibridarea si cibridarea celulara c. Haploidia prin androgeneza si ginogeneza d. Variabilitatea somaclonala e. Mutageneza dirijata Importanta - Prin inginerie genetica se pot realiza obiective greu sau imposibil de realizat cu metode clasice. - Se pot transfera gene de la eucariote la procariote in vederea clonarii si recoltarea produsului genelor clonate din mediul de cultura (asa s-a obtinut interferonul, insulina,etc.). Se pot transfera gene de la procariote la eucariote. Pentru exprimare, gena trebuie sa fie echipata cu promotorul specific celulei gazada. Pe aceasta cale s-au obtinut plante rezistente la erbicide neselective, la virusuri, bacterii, ciuperci, insecte, etc. Mutageneza dirijat pe situsuri prin extensia enzimatic a oligonucleotidelor mutagenice permite plasarea oricrei modificri n orice poziie dorit a ADN-ului donor. Oligonucleotidele de sintez pot fi utilizate pentru evidenierea formei mutante i formei slbatice, prin experiene de hibridare. Ingineria genetic permite sinteza artificial a unor gene, care pot nlocui anumite gene bolnave, deschizndu-se astfel calea terpaiei genice. 8.1. Hibridarea i cibridarea celular Hibridarea celular, hibridarea somatic sau hibridarea parasexuat presupune fuziunea a dou celule somatice, spontan sau indus, diferite una de alta, n urma creia rezult un hibrid somatic care nglobeaz materialul genetic nuclear i citoplasmatic al formelor parentale. Rezult astfel o celul binucleat, denumit homocarion, dac celulele parentale sunt de acelai fel sau un heterocarion, dac fuzioneaz celule diferite. Hibrizii celulari sunt produi numai de ctre heterocarioni. Dup parcurgerea unui ciclu celular, cei doi nuclei fuzioneaz, formnd un sincarion, o celul mononucleat, care nglobeaz materialul genetic al ambelor linii parentale. Hibridarea celular la plante este condiionat de obinerea prealabil a protoplatilor. Protoplastul este o celul vegetal sau bacterian nud, nconjurat de membrana plasmatic, adic o celul a crei perete celular a fost ndeprtat prin digestie enzimatic cu pectinaz i celulaz. Importana hibridrii celulare se regsete n special n programele de ameliorare a plantelor. Prin fuziunea protoplatilor se pot obine hibrizi ntre specii incompatibile sexuat sau hibrizi asimetrici, ca urmare a eliminrii selective a unor cromozomi la hibrizii obinui din specii ndeprtate. Prin hibridare somatic se pot obine hibrizi la speciile care, n mod normal, nu se pot nmuli sexuat, hibrizi la care se poate exploata fenomenul heterozis. Fuziunea protoplatilor de la aceeai specie conduce la obinerea unor varieti poliploide, operaiune ce necesit foarte mult timp dac este realizat pe alte ci. Prin hibridare somatic pot fuziona genomuri nucleare, care unesc caractere agronomice favorabile.

20

In domeniul animal, o realizare deosebit o reprezint obienrea hibridoamelor, prin fuziunea dintre limfocitele B i celulele mielonice, hibidoame ce permit obinerea anticorpilor monoclonali n cantiti mari i la preuri reduse. Cibridarea celular este o variant a hibridrii celulare ce const n fuziunea a dou celule somatice n urma creia rezult un cibrid celular care nsumeaz materialul genetic citoplasmatic de la ambele celule, dar poart materialul genetic nuclear doar de la o singur celul. Citoplasmele enucleate se numesc citoplati, iar nucleii purificai se numesc carioplati. Cibrizii pot fi obinui prin urmtoarele metode: a) se utilizeaz o celul parental normal i o celul a crei nucleu este inactivat pe cale chimic (cu iodoacetat) sau prin iradiere; b) fuziunea unei celule normale cu o celul enucleat; c) hibridarea unor celule parentale normale, dar ndeprtate filogenetic (n acest caz cibrizii rezult prin eliminarea selectiv a cromozomilor ce aparin unei forme parentale). Cibridarea celular a permis transferul la cibrizi a unor caractere fenotipice determinate de gene citoplasmatice. Astfel s-a realizat n timp scurt convertirea unor linii androfertile n linii citoplasmatic mascul sterile, utilizate n procesul producerii de smn hibrid fr castrare, rezolvndu-se prin urmare problema controlului polenizrii ncruciate. De asemenea, cibridarea celular permite manifestarea unei noi combinaii mitocondrii-cloroplaste. Prin cibridare celular este posibil manipularea genelor citoplasmatice, n vederea obinerii unor linii celulare rezistente la boli i duntori, stressuri climatice, exces de sruri, pesticide etc. 8.2. Variabilitatea somaclonal Variabilitatea somaclonal poate fi definit ca variabilitatea genetic ntlnit la plantele regenerate in vitro din culturi de celule sau esuturi somatice. Deoarece toate celulele unui organism au o origine comun, iar la baza multiplicrii celulelor somatice st mecanismul mitozei, ce are un caracter conservativ i care n mod teoretic asigur identitatea celulelor fiice, toi descendenii ar trebui s fie identici. Totui, n timpul procesului de cultur in vitro a celulelor i esuturilor pot avea loc modificri frecvente, ce se manifest ereditar printre plantele regenerate. Cauzele variabilitii somaclonale pot fi: poliploidia i aneuploidia, modificrile structural cromozomale, crossing over-ul somatic, mutaia somatic punctiform, transpoziia, amplificarea genic i mutaiile produse la nivelul genelor citoplasmatice. Variabilitatea somaclonal prezint o importan desebit n ameliorarea plantelor cu baz genetic i variabilitatea limitat, n special la plantele cu reproducere vegetativ sau la cele apomictice. Avantajele aduse de variabilitatea somaclonal se concretizeaz n urmtoarele aspecte: variaia poate fi generat din zone ale genomului care nu sunt accesibile metodelor convenionale de ameliorare, este o tehnic ieftin, comparativ cu hibridarea somatic sau transformarea, are aplicabilitate la un numr mare de specii i apare cu o frecven destul de ridicat. Dezavantajele utilizrii variabilitii somaclonale sunt legate, n principal, de instabilitatea variaiilor aprute n cursul autofecundrilor sau ncrucirilor din cadrul unui program de ameliorare, precum i de faptul c unele nsuiri utile evideniate in vitro nu se regsesc ntotdeauna la plantele din cmp sau au un caracter ntmpltor. 8.3. Haploidia prin androgenez i ginogenez

21

O plant haploid este aceea care posed n esutul somatic numrul gametic de cromozomi, deci ea deriv dintr-o celul a gametofitului femel sau mascul. Haploidia prin androgenez reprezint regenerarea plantelor pe un mediu de cultur artificial din elementele haploide ale gametofitului mascul. Se poate realiza prin cultur de antere sau cultura de microspori. Regenerarea plantelor haplopide poate avea loc direct din embrioni (androgenez direct) sau din calusuri (androgenez indirect). Haploidia prin ginogenez const n regenerarea plantelor haploide din elementele sexuale haploide ale gametofitului femel (cultur de ovule nefecundate sau cultur de ovare). Pentru obinerea in vitro a haploizilor trebuie parcurse urmtoarele etape: prelevarea butonilor florali ntr-un stadiu optim de dezvoltare a gametofiilor (microspori uninucleai i saci embrionari maturi); aplicarea unor ocuri de temperatur sczut urmat de sterilizarea materialului biologic; incubarea n camere de cretere n condiii controlate, pe medii artificiale; regenerarea plantelor prin adrogenez sau ginogenez direct (din embrioni) sau indirect (din calusuri). Haploidia in vitro implic un numr mare de factori ce depind de natura donorului i condiiile de cultur in vitro i de aceea metodologia de obinere a plantelor haploide difer de la o specie la alta. 8.4.Transgeneza Presupune introducerea in cadrul unei celule gazda , prin intermediul unui vector (V) a unei gene straine numite pasager (P), celula gazda suferind astfel un proces de transformare genetica (gena se poate replica si exprima in celula gazda) 8.4.1.Transformarea genetica la procariote Obiectivul principal il reprezinta clonarea genelor, adica multiplicarea lor o data cu V si cu bacteriile. Prin clonare se urmareste recoltarea produsului de expresie al genei transferate, modificarea genei transferate prin mutageneza dirijata, caracterizarea genei (secvenierea). Etapele clonarii 1. izolarea V 2. obtinerea pasagerului 3. integrarea pasagerului in vector (V+P = ADN recombinant) 4. introducerea ADN-ului recombinant in celula gazda 5. selectia celulelor gazda ce poarta ADN recombinant 6. selectia celulelor gazda ce poarta un anumit pasager 1. Izolarea vectorului. Caracteristicile vectorilor sunt: - vectorul trebuie sa fie un replicon (molecula de ADN capabila de autoreplicare) - vectorul nu trebuie sa fie foarte mare (2-5 kb) - vectorul sa poarte markeri genetici necesari selectiei celulelor transformate - vectorul sa poata integra specific pasagerul

22

Vectorii actuali poarta secvente polilinker (MSC) reprezentate de secvente unice de restrictie, dispuse in tandem. Ex. de vectori: plasmidele, fagul lambda, vectorul YAC. Acestia pot sa integreze pasageri de la aproximativ 15 kb pana la 1 Mb. 2. Obtinerea pasagerului Pasagerul poate fi obtinut prin: a. digestie enzimatica cu enzime de restrictie a ADN-ului genomal; b. reverstranscriere a ARN-ului mesager, rezultand ADN complementar (cADN); c. amplificare PCR; d.sinteza artificiala. Enzimele de restrictie sunt enzime codificate de gene plasmidiale, capabile sa recunoasca o anumita secventa nucleotidica (situs de restrictie) din patru pana la opt perechi de baze, la care poate sa produca o ruptura. Unele enzime, in urma acestei taieri pot sa determine formarea unor capete monocatenare adezive. 3. Integrarea pasagerului in vector Se face diferentiat, in functie de modul de obtinere a pasagerului. Daca pasagerul a fost obtinut prin digestie cu o enzima de restrictie, vectorul trebuie sa fie digerat cu aceeasi enzima de restrictie. Astfel, rezulta capete adezive monocatenare, comple-mentare, iar pasagerul se integreaza in vector pe baza de complementaritate. Legarea covalenta a nucleotidelor vecine din dreptul rupturii se face in prezenta ADN-ligazei. 4. Introducerea ADN-ului recombinant in celula gazda Se poate face prin transformare genetica bacteriana, daca pasagerul nu este foarte mare. Daca pasagerul este mare se poate interveni prin electroporare sau cu polietilenglicol (PEG). In cazul fagilor, introducerea se face prin infectie. 5. Selectia celulelor gazda ce poarta ADN recombinant Se realizeaza prin inactivarea de insertie a unor markeri. De ex. la bacteriile slbatice exist o enzim, -galactozidaza, care poate s transforme un substrat cromogen, x-gal, ntr-un produs albastru. 6.Selectia celulelor gazda ce poarta un anumit pasager Totalitatea ADN-ului recombinant reprezinta o banca de gene. Selectia se face pe doua cai: prin hibridare moleculara si cu ajutorul metodelor imunologice. In cazul hibridarii moleculare, ADN-ul recombinant denaturat se hibrideaza cu o sonda, eventual radioactiva, monocatenara, pe baza de complementaritate (sonda va realiza un hibrid molecular doar cu pasagerul cu care este complementar). Identificarea hibridului molecular se face prin autoradiografie. Metodele imunologice permit identificarea genei de interes in mod indirect pe baza produsului de expresie proteica a acesteia, proteina identificata cu ajutorul unor anticorpi specifici, eventual radioactivi. 8.4.2. Transformarea genetica la eucariote Obiectivul principal il reprezinta regenerarea plantelor transgenice din celulele transformate, plante la care gena transferata este capabila sa se exprime. Pentru o exprimare stabila este necesar ca gena sa se integreze in materialul genetic al gazdei. Transformarea

23

genetica este un proces integrativ. Plantele transgenice se mai numesc si OMG (organisme modificate genetic). Dupa modul de introducere a ADN-ului recombinant in celula gazda exista doua grupe de metode: transformarea prin metode directe si prin metode indirecte. Prin metode indirecte, ADN-ul recombinant este introdus in celula gazda prin intermediul unui agent natural de transfer (Agrobacterium tumefaciens produce cancerul bacterian al plantelor si A. rhizogene produce fenomenul Hary roots, radacini filiforme). La bacteria A. tumefaciens tumoarea reprezinta tesut vegetal transformat genetic in mod natural, de catre bacterie. Responsabila de producerea tumorii (opinelor) este plasmida. Opinele sunt analogi ai aminoacizilor utilizate de bacterie ca sursa de azot si carbon. In procesul de infectie si inducere a tumorii, bacteria se apropie de tesutul ranit pe baza de chemotropism. In celula este transferata secventa T- ADN care se integreaza natural in cromozomul gazda. Pentru transferarea secventei T - ADN sunt responsabile genele VIR. Ingineria genetica cauta sa utilizeze acest proces natural de transformare genetica, inlocuind genele responsabile de formarea tumorilor cu gene utile si markeri genetici (pentru selectia celulelor transformate) Prin metode directe ADN-ul recombinant este introdus in mod direct in celula gazda fara interventia unui agent natural de transfer. Tansformarea directa se poate realiza pe urmatoarele cai: a. Transformarea directa a protoplastelor b. Electroporarea si porarea laser c. Microinjectia d. Macroinjectia e. Metodele biolistice a.Transformarea genetica a protoplastelor Protoplastele sunt celule nude, lipsite de perete celular, dar cu membrana celulara. Peretele celular este eliminat prin digestie cu enzime litice (celulaza, pectinaza). ADN-ul recombinant patrunde in interiorul protoplastelor prin endocitoza. Celulele din protoplastele transformate vor forma calus transformat, din care se vor regenera plante transformate. Regenerarea se face prin embriogeneza (formarea unui proembrion) sau prin organogeneza (formarea lastarilor si apoi inradacinarea). b.Electroporarea si porarea laser Pe aceasta cale se creaza pori reversibili la nivelul celulei vegetale cu ajutorul unui curent electric continuu, pulsatoriu sau cu ajutorul radiatiei laser. Metoda se poate aplica atat la protoplaste cat si la tesuturi. c.Microinjectia Se aplica in special la animale si consta in introducerea in interiorul nucleului a ADN-ului recombinant cu ajutorul unei seringi sau a unui micromanipulator. d.Macroinjectia Consta in pulverizarea unei suspensii de ADN recombinant in inflorescenta, dupa polenizare. e.Metodele biolistice Introducerea ADN-ului recombinant in tesutul gazda are loc sub actiunea unei forte de explozie, rezultata in urma aprinderii unei incarcaturi explozive (metoda tunului de particule ADN-ul este fixat la suprafaa unor microproiectile de tungsten sau aur) sau in urma ruperii unei membrane de grosimi diferite sub actiunea heliului de presiune ridicata. In cazul metodei arcului electric are loc pulverizarea unei picaturi de apa, sub actiunea unui curent electric, la o tensiune de 800 de volti.

24

Confirmarea transformrii se face prin metode histobiochimice sau prin metode moleculare (PCR sau Southern Blotting).

REALIZARI PRIVIND TRANSFORMAREA GENETICA A PLANTELOR DE CULTURA I. Ameliorarea rezistentei la virusuri Majoritatea virusurilor sunt virusuri cu filament pozitiv, la care informatia genetica poate fi tradusa. In procesul infectiei virale patrunde virusul matur (ARN + capsida + material genetic). Mijloace clasice de control a infectiei virale - combaterea agentilor vectori - cultivarea unui material de plantare liber de viroze, obtinut prin culturi de meristeme, cu aplicarea eventuala a termoterapiei - efectuarea unor infectii incrucisate (infectarea cu o tulpina mai putin virulenta si obtinerea unei imunitati fata de tulpinile mai virulente) - hibridarea si selectia (metoda clasica) Metode specifice ingineriei genetice - transgeneza si fuziunea de protoplaste Transgeneza 1.Transferul unor gene de rezistenta, izolate si clonate (gene provenite de la plante rezistente sau de la animale). 2.Transferul unor gene de tip viral (PDR). Ex.:a) Genele ce codifica proteinele de capsida sunt integrate in genomul gazdei. Plantele transgenice ce poarta aceste gene produc proteine de capsida, fapt ce determina decapsidarea virusului infectant, care nu se mai replica. b) Strategia antisens presupune transferul unor secvente genice virale ce se transcriu sub forma de ARN complementar capatului 5 sau 3 a genomului viral. Daca ARN-ul este complementar cu 5 blocheaza translatia, iar daca este complementar cu 3 blocheaza replicarea. c) Strategia sens urmareste transferul unor secvente genomice virale care se transcriu sub forma de ARN sens de tip viral, identic capatului 3 de initiere a replicarii. Aceste secvente, produse constitutiv in celula gazda intra in competitie pentru replicarea virala cu virusul infectant. II. Ameliorarea rezistentei la bacterii si ciuperci Metoda de baza este transgeneza, dar se poate folosi si fuziunea de protoplaste. a) transgeneza genelor ce codifica proteine implicate in rezistenta umorala a insectelor. Ex. de proteine: cecropine, apidecine(produse de albine) etc. b) transgeneza genelor ce codifica proteine implicate in procesul de patogeneza. Ex.: proteine implicate in sinteza ligninelor, proteine cu proprietati antimicrobiene, antifungice sau antibac-teriene, izoflavonoide. c) Transgeneza genelor ce codifica proteine capabile sa detoxifice toxinele. Ex. gena ttr care codifica o enzima capabila sa detoxifice tabloxina produsa de pseudomonas. Ameliorarea rezistentei la atacul daunatorilor Metoda de baza este transgeneza dar se foloseste si fuziunea de protoplaste.

25

a) transferul genei ce codifica endotoxina de la Bacilus thuringiensis (bacil care produce o preendo-toxina care se transforma in intestinul insectei intr-o toxina foarte puternica pentru o anumita insecta). Ex.: gena cry I omoara lepidoptere (fluturi) gena cry III - coleoptere (gandaci) gena cry IV - diptere (muste) b) transferul genelor ce codifica proteinele PIP (protease inhibiting proteins). Proteazele sunt enzime utilizate de insecte pentru asimilarea proteinelor. Daca proteazele sunt inhibate, insecta moare de inanitie (nu mai asimileaza proteine). Sunt periculoase pentru om si animale. Metoda se poate folosi la speciile la care produsul vegetal se prelucreaza termic. c) transferul genelor ce codifica proteinele care inhiba amilaza (AIP) d) transferul genelor ce codifica lectinele (glicoproteine cu proprietati insecticide). Aceste gene nu sunt periculoase nici pentru om, nici pentru animale. Au fost izolate si clonate de la ghiocel. e) combaterea nematozilor care paraziteaza radacinile. Chimic, combaterea lor se face foarte greu. Prin transferul unor gene ce codifica proteine PIP, echipate cu promotori inductibili la radacini, asigura o combatere eficienta a nematozilor, partea aeriana fiind comestibila, netoxica. Ameliorarea rezistentei la erbicide neselective si ameliorarea calitatii 1.Erbicidele selective combat anumite specii de buruieni si permit supravietuirea plantelor de cultura. Sunt toxice pentru om si animale, remanente in sol (sunt poluante, nefiind biodegradabile). Erbicidele neselective omoara toata vegetatia, atat buruienile, cat si plantele de cultura. Prin inginerie genetica se cauta sa se obtina plante de cultura rezistente la aceste erbicide. - Ameliorarea rezistentei la Roundup (glyphosat) La specia bacteriana Salmonella a fost izolata si clonata o gena mutanta, responsabila de sinteza enzimei EPSPS (enzima tinta). Enzima tinta este implicata in sinteza acizilor aromatici, asupra ei actionand erbicidul. Prin transferul genei respective s-au obtinut plante transgenice de porumb i soia, rezistente la acest erbicid. - Ameliorarea rezistentei la paraquat si diquat, care sunt doua erbicide totale ce inactiveaza enzimele implicate in fotosinteza. Au ca efect acumularea de oxigen activ, toxic, conducand la stresul superoxidant care apare si in cazul erbicidului si in cazul excesului de lumina. Pe aceasta cale s-au obtinut plante de lucerna rezistente la aceste erbicide. 2.Ameliorarea calitatii - Ameliorarea continutului in proteine. Majoritatea proteinelor de origine vegetala sunt sarace in aminoacizi cu sulf, necesari in hrana animalelor. Ameliorarea s-a realizat prin transgeneza, in urma izolarii si clonarii unei gene preluate de la o planta de origine braziliana, ce determina un continut bogat in aminoacizi cu sulf. - La rapita exista o proteina alcatuita din doua subunitati: napina 20%, bogata in aminoacizi cu sulf si cruciferina 80%, saraca in aminoacizi cu sulf. Prin strategia antisens s-a blocat producerea cruciferinei, proteina rezultata in cantitati normale fiind alcatuita din napina. Prin mutageneza dirijata se pot introduce codoni ce specifica aminoacizi esentiali (ex.lizina). - Ameliorarea continutului in amidon. Amidonul este un polizaharid alcatuit din 20% amiloza si 80% amilopectina. Prin strategia antisens s-a blocat amiloza, rezultand amilopectina. - Intarzierea senescentei (imbatranirii) florilor si manipularea coacerii fructelor se poate realiza prin strategia antisens, blocand enzimele implicate in sinteza etilenei. Manipularea

26

coacerii fructelor se poate realiza prin strategia antisens, blocand enzimele implicate in sinteza etilenei. 3. Producerea de noi compusi. - Prin inginerie genetica se pot realiza anumiti compusi nespecifici pentru plantele de cultura. Se produc tranzitoriu in urma infectiei plantelor cu un anumit virus ce poarta gena responsabila de producerea unui anumit compus.(ex. tricosantinul cu proprietati anti HIV). Compusii pot fi produsi in diferitele generatii in urma integrarii in genomul plantelor gazda a genelor responsabile de producerea respectivului produs. (ex. anticorpi impotriva hepatitei B, antigene impotriva hepatitei B vaccin oral, producerea substantelor plastice biodegradabile de la bacteria Alcaligenes eutrophus).

Capitolul 9 EREDITATEA LA REPRODUCEREA ORGANISMELOR

Reproducerea este proprietatea organismelor vii de a produce urmai, prin care se asigur perpetuarea speciilor. Reproducerea nu se confund cu nmulirea, deoarece nmulirea reprezint sporirea numrului de indivizi. Modul de reproducere este condiionat de locul pe care l ocup organismul pe scara evolutiv, fiind o consecin a adaptrii la condiiile de mediu. La organismele vii se ntlnesc dou tipuri de reproducere: reproducerea asexuat i reproducerea sexuat. 27

Reproducerea sexuat presupune fuziunea materialului genetic aparinnd la dou celule cu potenialiti diferite (femele i mascule) n cadrul unui proces de fecundare, avnd ca i consecin recombinarea genetic. 8.1. Reproducerea asexuat Caracteristica reproducerii asexuate o constituie faptul c lipsete fecundarea, iar individul nou format va moteni caracteristicile unei singure forme parentale. Reproducerea asexuat este cunoscut i sub denumirea de reproducere amictic sau agam. La organismele unicelulare reproducerea asexuat se realizeaz prin sciziparitate sau diviziune direct (la bacterii) prin nmugurire sau gemiparitate (la drojdii) i prin segmentarea multipl (la sporozoare). La organismele pluricelulare reproducerea asexuat se realizeaz prin spori, pe cale vegetativ sau prin apomixie (formarea seminelor fr fecundare). Reproducerea prin spori asexuai (sporogamia) se ntlnete la ciuperci i se realizeaz prin celula specializate haploide (conidii). Reproducerea vegetativ poate avea loc din celule somatice ce pot forma organe nespecializate pentru reproducere (butai, fragmente de tulpin, de frunze, de rdcin) sau organe specializate (bulbi, tuberculi, stoloni, rizomi). n cadrul apomixiei are loc formarea de embrioni fr fecundare, din formaiuni implicate n mod obinuit n procesul sexual. Organismul format poate fi haploid, cnd ia natere dintr-o celul haploid (oosfer nefecundat, sinergide sau antipode) sau diploid, cnd ia natere dintr-o celul diploid (celule ale nucelei, chalazei). Apomixia este un mod de reproducere asexuat care prezint urmtoarele forme: partenogeneza, partenocarpia, apogamia, displosporia i aposporia. Partenogeneza este dezvoltarea unui individ din oosfera nefecundat, proces care se numete ginogenez. n cazul n care individul nou se formeaz din gametofitul mascul procesul se numete androgenez. Partenogeneza poate avea loc pe cale natural sau poate fi indus artificial, constituind o modalitate de obinere a haploizilor. Apogamia este procesul dezvoltrii embrionului din sinergide sau antipode (haploide). n acest caz descendena motenete numai caracterele i nsuirile materne. Displosporia se produce cnd embrionul rezult din oosfera neredus (nu are loc meioza I). Aposporia se realizeaz cnd ia natere embrionul din celulele somatice ale nucelei sau integumentelor. 8.1.1. Ereditatea la reproducerea asexuat Ereditatea la reproducerea asexuat este simpl, urmaii motenesc fidel caracteristicile unei singure forme parentale, de la care au rezultat, fr s aib loc recombinarea genetic (excepie fac unele forme de apomixie la care poate avea loc recombinarea genetic n cursul meiozei). Ereditatea la reproducerea asexuat manifest un conservatism relativ, deoarece poate interveni variabilitatea somaclonal, mutaia somatic sau crossin over-ul somatic. Descendena vegetativ a unei singure plante se numete clon sau linie clon. Indivizii care aparin unei linii clon sunt fenotipic uniformi, iar din punct de vedere genetic conserv structura homozigot sau heterozigot a formei parentale. n consecin, atunci cnd se

28

urmrete pstrarea unor caracteristici valoroase aprute la anumite soiuri de plante, se aplic nmulirea vegetativ a acestora, inclusiv prin culturi de esuturi i celule in vitro. 8.2. Reproducerea sexuat Reproducerea sexuat sau amfimixia constituie un salt evolutiv, oferind posibilitatea creterii variabilitii genetice prin recombinare. Organismele care se nmulesc pe cale sexuat formeaz celule sexuale gamei masculi i gamei femeli. Acetia se unesc prin fecundare i dau natere zigotului, din care se dezvolt prin nmulirea i diferenierea celulelor, un organism nou. 8.2.1. Tipuri de sexualitate la plante Dup modul de repartizare a organelor sexuale se disting urmtoarele tipuri de plante: plante hermafrodite, cnd organele sexuale mascule i femele sunt prezente n aceeai floare (mazrea, fasolea, ardeiul, grul .a.); plante monoice, la care florile sunt unisexuate dar sunt prezente pe aceeai plant (porumbul, castravetele, ricinul, nucul etc.); plante dioice, cnd plantele sunt unisexuate, existnd plante mascule i plante femele (spanacul, cnepa, hameiul etc.). 8.2.2. Ereditatea la reproducerea sexuat Reproducerea sexuat reprezint un salt evolutiv, oferind posibilitatea recombinrilor genetice, care determin amplificarea variabilitii. Valorificarea acestei posibiliti depinde de modul de realizare a polenizrii. Dup modul de polenizare plantele pot fi: autogame i alogame. Plantele autogame se polenizeaz cu polen propriu. n acest caz zigotul rezult din fecundarea a doi gamei ce provin de la acelai printe. n urma autogamiei rezult organisme homozigote, asemntoare formelor parentale, la care, recombinarea genetic este practic nul. Ereditatea este simpl. Plantele alogame se polenizeaz cu polen strin. Descendenii motenesc caracteristicile a dou forme parentale, deci ereditatea este dubl. Fecundarea ncruciat permite manifestarea puternic a fenomenului de recombinare genetic. Structura heterozigot a populaiilor alogame permite meninerea n patrimoniul ereditar a numeroase alele recesive, dintre care unele pot fi valoroase din punct de vedere practic sau evolutiv.

8.3. Autoincompatibilitatea Alogamia ofer o serie de avantaje, cum ar fi: vitalitate i vigoare sporit, sporirea variabilitii genetice prin recombinare. Datorit acestor avantaje, plantele dispun de o serie de mecanisme morfologice, fiziologice sau genetice care asigur polenizarea strin. Aceste mecanisme sunt: monoicia cu dihogamie (maturizarea ealonat a florilor mascule i femele: protandria maturizarea polenului cu 2-4 zile naintea stigmatului; protogenia maturizarea stigmatului cu 2-4 zile naintea polenului), dioicia i autoincompatibilitatea. Autoincompatibilitatea se manifest la plantele hermafrodite i const n incapacitatea plantelor de a realiza autofecundarea. 29

Sistemele genetice de autoincompatibilitate la plantele hermafrodite alogame au fost mprite n dou grupe mari, n funcie de morfologia florii: grupul homomorfic i grupul heteromorfic. 8.3.1. Autoincompatibilitatea homomorfic Din grupul homomorfic fac parte specii hermafrodite cu o morfologie a florii ce permite realizarea autopolenizrii, ns auto-fecundarea este blocat datorit unor mecanisme genetice. Autoincompatibilitatea homomorfic este determinat de seria alelic multipl S i poate fi gametofitic i sporofitic. Tipul de incompatibilitate este specific unei familii, dei n cadrul unei familii pot exista specii autocompatibile i autoincompatibile. 8.3.3. Importana fenomenului de autoincompatibilitate Autoincompatibilitatea asigur controlul eficient al alogamiei la plantele hermafrodite, un aspect cu semnificaie evolutiv deosebit, deoarece permite sporirea variabilitii i meninerea unui nalt grad de heterozigoie la nivelul speciei. O importan practic deosebit a fenomenului de autoincompa-tibilitate o reprezint posibilitatea obinerii seminei dublu hibride F1, fr castrare. Aceasta se poate realiza n trei etape: a) obinerea liniilor parentale homozigote pentru alelele de autoincompatibilitate, pe baza fenomenului de pseudocompatibilitate; b) obinerea hibrizilor simpli parentali n dou loturi de hibridare; c) obinerea hibrizilor dubli De fenomenul de autoincompatibilitate trebuie inut cont la nfiinarea livezilor cu soiuri pure. n astfel de livezi, pe lng soiul de baz, trebuie plantate i soiuri polenizatoare (aproximativ 10%) care s asigure polenul necesar obinerii produciei, mai ales la speciile diploide autoincompatibile (cire, migdal) i mai puin la speciile poliploide (prun, viin, mr, pr). n astfel de livezi pot fi plantate i clone aparinnd aceluiai soi, dar intercompatibile, izolate prin selecie clonal sau utilizarea unor soiuri care permit dezvoltarea partenocarpic a fructelor.

C a p i t o l u l 10 EREDITATEA EXTRACROMOZOMAL Celula, unitate morfologic i funcional a organismelor vii reprezint de fapt o interaciune ntre nucleu i citoplasm, n sensul c, citoplasma nu este viabil fr nucleu, iar materialul genetic nuclear nu se manifest n lipsa citoplasmei. n consecin i ereditatea este o proprietate a ntregii celule. Primele date care atest ereditatea extracromozomal au fost formulate de ctre CORRENS (1909), care n urma unor ncruciri reciproce la plante de Mirabilis jalapa, tipul albomaculatus a stabilit c transmiterea unor caracteristici se face numai prin intermediul citoplasmei materne.

30

Ereditatea extracromozomal (extranuclear sau citoplasmatic) reprezint transmiterea caracterelor de la prini la urmai prin intermediul genelor localizate n afara cromozomilor, la nivelul citoplasmei. Pentru a face distincie ntre factorii genetici cromozomali i cei citoplasmatici, primii se noteaz cu literele alfabetului latin, iar cei citoplasmatici cu literele alfabetului grec.

10.1. Locul ereditii extracromozomale n cadrul sistemului genetic celular Totalitatea genelor celulare constituie ideotipul (sistemul genetic celular). Ideotipul include sistemul genetic nuclear sau sistemul genetic citoplasmatic sau plasmotipul, care cuprinde totalitatea genelor citoplas-matice (plasmogene). La procariote, sistemul genetic extracromozomal este reprezentat de plasmide (episomi) iar la plantele eucariote sistemul ectracromozomal cuprinde sistemul genetic mitocondrial, plastidic, chinetosomal i simbiont. Sistemul genetic mitocondrial cuprinde gene plasate n mitocondrii, numite condriogene, localizate la nivelul ADN-ului mitocondrial. Acest ADN este asemntor cu ADN-ul organismelor procariote, fiind alctuit din molecule de ADN circulare, fr a fi complexate cu proteine ca n cazul ADN-ului cromozomal. La nivelul unei celule vegetale exist aproximativ 100 de mitocondrii, iar ntr-o mitocondrie exist cca. 10 molecule de ADN Sistemul genetic plastidic este reprezentat de gene situate la nivelul plastidelor, numite plastogene. Este alctuit din circa 10 molecule de ADN/plastid i poart informaia genetic pentru transcrierea ARN-r, ARN-t i ARN-m ce este tradus n proteine specifice, care reprezint suportul enzimelor implicate n procesul de fotosintez. 10.2. Caracteristici i metode de punere n eviden a ereditii extracromozomale Sistemul genetic citoplasmatic sau extracromozomal este relativ autonom fa de sistemul genetic nuclear, n sensul c posed un mecanism propriu de replicare, transcriere i traducere a informaiei genetice. Totui ntre cele dou sisteme se pot stabili relaii de interaciune reciproc. n transmiterea ereditar a caracterelor controlate de genele citoplasmatice nu se respect legile mendeliene. Acest lucru se datoreaz faptului c, constituienii citoplasmatici purttori ai informaii genetice nu se distribuie n cantiti riguros egale la celulele fiice n timpul diviziunilor celulare, evideniindu-se fenomenul de segregare somatic, aspectul descendenei depinznd de tipul constituienilor inclui n celulele sexuale. La eucariote, genele citoplasmatice se transmit preponderent pe linie matern (matroclinie), deoarece gameii femeli sunt cei care n procesul de fecundare aduc citoplasma. 10.3. Importana ereditii extracromozomale Ereditatea extracromozomal prezint o importan deosebit, att din punct de vedere practic ct i teoretic. Unele nsuiri cu importan practic n munca de ameliorare sunt determinate de gene extracromozomale. Astfel, la alegerea genitorilor se va ine cont de caracterele determinate de gene citoplasmatice, utilizndu-se ca genitor matern printele care poart factori de interes (rezistena la boli i duntori, la pesticide etc.).

31

Segregarea materialului genetic citoplasmatic are importan n procesul diferenierii celulare. n cazul hibrizilor heteroplasmatici, la nivelul plasmagenelor, mai ales a celor mitocondriale, a fost pus n eviden posibilitatea manifestrii fenomenului heterozis. Prin inginerie genetic la nivelul plastogenelor este posibil sporirea randamentului fotosintetic. Androsterilitatea, n special cea de natur citoplasmatic, permite obinerea la scar industrial, a seminei hibride, fr castrare. 10.4. Androsterilitatea Androsterilitatea este incapacitatea plantelor de a forma sau de a elibera gamei masculi funcionali. Dup criteriul localizrii determinanilor genetici ai sterilitii mascule se disting trei tipuri de androsterilitate: nuclear, citoplasmatic i nucleocitoplasmatic. Androsterilitatea nuclear este determinat de factorii genetici nucleari, de regul recesivi, care segreg n descenden. n urma polenizrii plantelor mascule sterile cu polen de la plantele fertile heterozigote se obin n generaia F1 50% plante homozigote androsterile i 50% plante heterozigote androfertile. Dac se polenizeaz plante mascule androsterile cu polen de la plante homozigot fertile, n descendena F1 se obin numai descendeni fertili, heterozigoi. Pentru ca acest tip de androsterilitate s fie utilizat la producerea seminei hibride, este necesar eliminarea plantelor fertile segregante de pe rndurile mam, n timp util, naintea nfloritului. Acest lucru este posibil numai dac gena de fertilitate este linkat cu markeri genetici dominani, capabili s determine apariia unor caractere uor evideniabile la plantule. De exemplu, la floarea soarelui, la care s-a utilizat acest tip de androsterilitate, markerul genetic controleaz apariia culorii roii antocianice la plantule astfel c din loturile de hibridare, de pe rndurile mam pe care a fost nsmnat linia cu androsterilitate nuclear, se elimin toate plantele roii, fertile. Meninerea liniei mam androsteril se face prin polenizarea ei cu forma analoag fertil, heterozigot pentru genele de androsterilitate i gena marker. n descenden apare segregarea de 1 fertil : 1 steril. Datorit crossing over-ului pot s apar n descenden i un numr limitat de plante verzi, fertile. Androsterilitatea citoplasmatic este determinat de factori genetici extracromozomali care se transmit dominant pe linie matern, fr segregare. Prin polenizarea unor plante androsterile citoplasmatic cu polen de la plante androfertile (F) n generaia F1 rezult numai plante androsterile (S), nsuire transmis prin citoplasma gametului femel. Meninerea formei androsterile se face prin polenizarea acesteia cu polen de la o form analoag androfertil. Genele nucleare care controleaz fertilitatea nu se manifest n prezena citoplasmei S. Smna hibrid se obine prin semnarea alternativ a formei mam androsterile cu forma tat androfertil. Deoarece descendena hibrid este steril, acest tip de androsterilitate se utilizeaz pentru producerea seminei hibride la speciile la care intereseaz masa vegetativ i nu producia de semine (ceap, sfecl de zahr etc.). Dac intereseaz producia de semine, cum este cazul porumbului, poate fi utilizat acest tip de androsterilitate, numai c pe suprafeele destinate culturilor pentru consum se nsmneaz n ames