7

IDENTIFICAREA PESTICIDELOR ORGANO-FOSFORICE PRIN CROMATOGRAFIE N STRAT SUBIRE

CAPITOLUL 1

1.OBIECT

Prezenta procedur stabilete modul n care se efectueaz analiza pentru identificarea pesticidelor organo-fosforice din coninut stomacal i probe de albine, prin cromatografie n strat subire.

CAPITOLUL 2

2.DOMENIU DE APLICARE

Prezenta procedur se aplic n laboratorul de toxicologie din cadrul L.S.V.S.A. Iai, pentru determinarea pesticidelor organo-fosforice din coninut stomacal i probe de albine, n cazul unor suspiciuni de intoxicaie cu aceti compui.CAPITOLUL 33.PRINCIPIUL METODEI

Pesticidele organo-fosforice sunt extrase din proba de analizat cu eter de petrol, dup care extractele obinute se purific pe coloan cu florisil, se concentreaz i se spoteaz pe placa cromatografic unde compuii organo-fosforici sunt pui n eviden cu ajutorul unor reactivi de culoare specifici.

CAPITOLUL 44.DEFINIII

Insecticidele organo-fosforice sunt pesticide frecvent utilizate n agricultur i medicin veterinar, care acioneaz prin blocarea acetilcolinesterazei, determinnd creterea exagerat a tonusului vegetativ parasimpatic, asociat cu manifestri de excitaie i inhibiie cortical, hiper i hipokinezii. Pesticidele organofosforice sunt esteriaiacidului fosforic sautiofosforic.Primul compus din aceasta clasa produs la scara industriala a fost tetraetilpirofosfatul (TEPP),utilizat in timpul celui de al doilea razboi mondial ca substanta toxica de lupta. Estecel mai toxic OP. Ulterior s-a sintetizat parationul.

La ora actual se cunosc peste 200 de compui, printer cei mai utilizai fiind: parationul, malationul, neguvonul, clorofosul, diclorvosul, cumafosul etc.7.3.2. Echipamente

Echipament pentru cromatografie n strat subire Linia TLC CAMAG

Baie de ap (Baie de termostatare BTA 15)

Etuv OMT MK II B070125 Balan analitic (Balan semianalitic AEP-650A, AE 168109550 T6097)

Rotavapor Heidolph.7.3.3. Materiale i reactivi

Reactivi:

- cloroform

- acetonitril pentru cromatografie, saturat cu eter de petrol- eter etilic

- aceton

- benzen- acid acetic glacial

- eter de petrol

- florisil (60 80 mesh), activat 2 ore la 650o C- alcool etilic

- vat de sticl- sulfat de sodiu anhidru

- silicagel 60 G- amidon- brom- hexan- acid sulfosalicilic sol. 1% n etanol 80 %

- tetrabromfenolftalein ethyl ester sol. 0,2 % n aceton- clorur feric soluie 1 % n etanol 80 %

- soluie de azotat de argint: 0,5g azotat de argint se dizolv n 25 ml ap i se dilueaz la 100 ml aceton

- soluie de acid citric: 5g aci citric se dizolv n 50 ml ap i se dilueaz la 100 ml cu aceton

- soluie de 2,6 dibromchinon 4 clorimid: 1g de 2,6 dibromchinon 4 clorimid se dizolv n 100 ml de alcool etilic, acidulat cu 1 ml acid acetic glacial

- etaloane de pesticide organo-fosforice. Sticlrie:

- coloane cromatografice (lungimea 300 mm i = 20-25 mm)- plnii de separare x 100 ml, 500 ml, 2000 ml- plnii de filtrare- baloane cotate x 100 ml- pahare Berzelius x 100 ml

- pahare Erlenmayer x 200 ml- pipete Pasteur

- cilindri gradai x 25, 50, 100, 250 ml

- exicator7.4. Mod de lucru

a) Extracia probelor:1.Coninut gastric: 20 25 g prob de analizat se extrag cu cca. 100 ml eter de petrol timp de 4-5 ore, agitnd energic din cnd n cnd. Extractul se filtreaz i se concentreaz la cca. 20 ml, dup care se supune partiiei cu acetonitril.

b ) Partiia cu acetonitril:

Extractul concentrate de la punctul a) se trece ntr-o plnie de separare de 100 ml, transferul efectundu-se cu eter de petrol astfel ca volumul final s fie de cca. 25 ml. Se adaug 25 ml acetonitril saturat cu eter de petrol, se agit energic i apoi se las n repaus pentru separarea straturilor. Partiia acetonitril-eter de petrol permite separarea reziduurilor de pesticide (care trec n acetonitril) de grsimi (care rmn n eter de petrol). Extracia cu acetonitril se repet, iar extractele reunite se trec ntr-o plnie de separare de 500 ml care conine 300 ml soluie apoas de sulfar de sodium 2%. Plnia de 500 ml (conine faza apoas i organic) se agit puternic 1 minut i se las n repaus cel puin 30 minute. Dup separare, stratul organic care conine pesticidele se purific pe o coloan cu florisil.

c) Purificarea pe coloan cu florisil:Coloana de sticl, lung de 300 mm i cu un diametru de 20-25 mm, prevzut cu frit sau cu dop de vat, se umple cu un strat de 10 cm de florisil activat care se acoper cu un alt strat de 1 cm de sulfat de sodiu anhidru.

Coloana se umecteaz cu 50 ml eter de petrol, regndu-se viteza de curgere a lichidului prin coloan la 5 ml/minut, dup care se introduce extractul eteric al reziduurilor de pesticide.

Eluarea reziduurilor de insecticide organo-fosforice de pe coloana cu florisil se face succesiv cu urmtoarele amestecuri de solveni: 200 ml 6% eter etilic n eter de petrol; 200 ml 15% eter etilic n eter de petrol i 200 ml 50% eter etilic n eter de petrol. Dup eluie cele trei poriuni de eluat se concentreaz la un volum de 1-5 ml i se trece la determinarea propriu-zis a insecticidelor.

2. Probe de albine: se introduc 20-25g de prob mrunit ntr-un mixer peste care se adaug 350 ml amestec de 35% ap n acetonitril. Se omogenizeaz timp de 5 minute, se iau 250 ml de filtrate i se introduce ntr-o plnie de separare. Peste extractul apos se adaug 100 ml eter de petrol. Se agit amestecul 2 minute. Se adaug 10 ml soluie saturat de NaCl i 600 ml ap, agitndu-se energic, dup care se las straturile s se separare. Se arunc faza apoas, iar stratul de solvent se spal de 2 ori cu cte 100 ml ap. Faza eteric se trece ntr-un Erlenmayer de 100 ml cu dop. Se adaug 15g Na2SO4 anhidru i se agit. Nu se las mai mult de o or cu Na2SO4 deoarece poate avea loc o adsorbie a reziduurilor de insecticide pe acesta. Extractul se filtreaz i se concentraz la un volum de civa ml.

Observaie: dac extractul este colorant, se poate purifica pe o coloan cu florisil.

d) Separarea cromatografic:Extractele obinute sunt supuse separrilor cromatografice pe cromatoplci cu diametrul de 20x20 cm, acoperite cu silicagel G sau alumin. Grosimea stratului adsorbant este cuprins ntre 0,25 0,5 mm. Plcile se activeaz timp de o or la 110o C. Spoturile se aplic la 1,5 cm de marginea inferioar a plcii. Distana de migrare este de aproximativ 17 cm, astfel nct s se obin o separare convenabil.

Pentru aprecierea calitativ, aplicarea spoturilor se face cu pipete Pasteur bine efilate, dup care depozitul spotat se usuc sub current de aer, pentru a mpiedica mprtierea solventului pe o suprafa mai mare de 0,5 cm diametru, chiar dac aplicaia se repet.

Alturi de spoturile probei de analizat se pun spoturi dintr-o soluie etalon de insecticide individuale sau n mixtur.

Cromatografia se execut n sistem ascendent n tancuri etane care se satureaz n prealabil pentru echilibrare, prin cptuire cu hrtie de filtru mbibat cu solveni.

Ca amestec de eluie se folosete sistemul benzen aceton n raportul 4:1.

Dup uscare, se expune placa la vapori de brom i dup 10 - 15 minute se spreiaz cu o soluie de clorur feric 0,1%. Dup nc 15minute se spreiaz cu o soluie de acid sulfosalicilic 1% cnd apar spoturi caracteristice alb-glbui pe fondul mov lila al plcii.

O alt posibilitate de a pune n eviden pesticidele organo-fosforice este urmtoarea: se elueaz placa cu un amestec de hexan: aceton n raport de 4:1.

Dup uscare, se pulverizeaz uniform cu o soluie de 0,2% ester etilic de tetrabromfenolftalein. Placa devinit albastr se pulverizeaz apoi cuo soluie de azotat de argint 0,5%. Dup alte 2 minute plcile se spreiaz cu o soluie de acid citric 5%. Apar spoturi albastre sau purpurii pe fond galben.

Un alt reactiv de culoare characteristic pentru compuii organo-fosforici este 2,6-dibromchinon-4-clorimid. Dup eluarea plcii cu hexan:aceton i uscare, aceasta se pulverizeaz cu o soluie de 2,6-dibromchinon-4-clorimid 1% n alcool. Apar spoturi galbene, roii sau brune, caracteristice diverselor grupe de compui organo-fosforici. Pentru intensificarea culorii spoturilor placa se nclzete la 110oC timp de 5 minute.

Limita de detecie este de 1 g.7.5. Exprimarea rezultatelor

Rezultatul se exprim sub forma: pesticide organo-fosforice - prezente sau pesticide organo-fosforice - nedetectabile.

IDENTIFICAREA PESTICIDELOR ORGANO - CLORURATE DIN CONINUT STOMACAL I PROBE DE ALBINE

7.2.1 Protecia personalului se realizeaz n conformitate cu

PO L - 08;a. Este obligatoriu purtarea halatului alb, de protecie;

b.Splarea sticlriei cu amestec sulfocromic se va face purtnd mnui de cauciuc. n cazul n care amestecul sulfocromic a venit n contact cu pielea, se spal cu mult ap rece;

c. n laboratorul n care se lucreaz cu solveni uor inflamabili, este interzis lucrul cu foc deschis;

d. Deoarece solvenii i reactivii utilizai sunt toxici, se va evita ingerarea acestora n timpul manipulrii.

7.2.2. Protecia echipamentelor

a. Toat sticlria care se folosete n aceast determinare se pstreaz curat, n dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prfuirea, contaminarea sau spargerea accidental. Sticlria de msur utilizat nu va fi uscat la cald (etuv) pentru a preveni decalibrarea;

b. Balanele cu care se efectueaz cntririle se instaleaz pe suprafee plane, fr trepidaii (de preferin pe mese consol sau grele), n mediu lipsit de praf i schimbri brute de temperatur.

7.2.3. Verificarea strii de funcionare a echipamentelor i confirmarea metrologic

Balanele, n perioada de valabilitate a verificrii metrologice, se verific periodic conform instruciunilor prevzute n PG L - 10.

Nu se vor utiliza mijloace de msurare a cror perioad de valabilitate metrologic este depit, care nu funcioneaz la parametrii corespunztori sau care nu se ncadreaz n clasa de precizie impus de standardul de lucru.

7.3. Reguli de procedur privind modul de lucru

77.3.2. Echipamente

Echipament pentru cromatografie n strat subire Linia TLC CAMAG

Baie de ap (Baie de termostatare BTA 15)

Etuv OMT MK II B070125 Balan analitic (Balan semianalitic AEP-650A, AE 168109550 T6097)

Rotavapor Heidolph.7.3.3. Materiale i reactivi

Reactivi:

- eter de petrol- acetonitril pentru cromatografie, saturat cu eter de petrol- eter etilic

- florisil (60 80 mesh), activat 2 ore la 650o C- alcool etilic

- sulfat de sodiu anhidru

- silicagel 60 G- amidon

- amestec de eluie: 6% eter etilic n eter de petrol;15% eter etilic n eter de petrol;- difenilamin;- etaloane de pesticide organo-clorurate. Sticlrie:

- coloane cromatografice (lungimea 300 mm i = 20-25 mm)- plnii de separare x 100 ml, 500 ml- plnii de filtrare- baloane cotate x 100 ml- pahare Berzelius x 200 ml

- pahare Erlenmayer x 200 ml- pipete Pasteur

- cilindri gradai x 25, 50, 100, 250 ml

- exicator7.4. Mod de lucru

b) Extracia probelor:1.Coninut gastric: 20 25 g prob de analizat se extrag cu cca. 100 ml eter de petrol timp de 4-5 ore, agitnd energic din cnd n cnd. Extractul se filtreaz i se concentreaz la cca. 20 ml, dup care se supune partiiei cu acetonitril.

b ) Partiia cu acetonitril:

Extractul concentrate de la punctul a) se trece ntr-o plnie de separare de 100 ml, transferul efectundu-se cu eter de petrol astfel ca volumul final s fie de cca. 25 ml. Se adaug 25 ml acetonitril saturat cu eter de petrol, se agit energic i apoi se las n repaus pentru separarea straturilor. Partiia acetonitril-eter de petrol permite separarea reziduurilor de pesticide (care trec n acetonitril) de grsimi (care rmn n eter de petrol). Extracia cu acetonitril se repet, iar extractele reunite se trec ntr-o plnie de separare de 500 ml care conine 300 ml soluie apoas de sulfat de sodiu 2%. Plnia de 500 ml (conine faza apoas i organic) se agit puternic 1 minut i se las n repaus cel puin 30 minute. Dup separare, stratul organic care conine pesticidele se purific pe o coloan cu florisil.

e) Purificarea pe coloan cu florisil:Coloana de sticl, lung de 300 mm i cu un diametru de 20-25 mm, prevzut cu frit sau cu dop de vat, se umple cu un strat de 10 cm de florisil activat care se acoper cu un alt strat de 1 cm de sulfat de sodiu anhidru.

Coloana se umecteaz cu 50 ml eter de petrol, regndu-se viteza de curgere a lichidului prin coloan la 5 ml/minut, dup care se introduce extractul eteric al reziduurilor de pesticide.

Eluarea coloanei se face cu 200 ml amestec 6% eter etilic n eter de petrol. Eluatul astfel obinut se concentreaz la 5 10 ml. Acest eluat conine n general toate reziduurile de pesticide organo-clorurate cu excepia dieldrinului i endrinului.

Dup colectarea primului eluat se mai poate face o eluie a coloanei cu 200 ml 15% eter etilic n etre de petrol. Acest din urm eluat conine dieldrin i endrin i se reunete cu primul eluat.

2. Probe de albine: se introduc 20-25g de prob mrunit ntr-un mixer peste care se adaug 350 ml amestec de 35% ap n acetonitril. Se omogenizeaz timp de 5 minute, se iau 250 ml de filtrate i se introduce ntr-o plnie de separare. Peste extractul apos se adaug 100 ml eter de petrol. Se agit amestecul 2 minute. Se adaug 10 ml soluie saturat de NaCl i 600 ml ap, agitndu-se energic, dup care se las straturile s se separare. Se arunc faza apoas, iar stratul de solvent se spal de 2 ori cu cte 100 ml ap. Faza eteric se trece ntr-un Erlenmayer de 100 ml cu dop. Se adaug 15g Na2SO4 anhidru i se agit. Nu se las mai mult de o or cu Na2SO4 deoarece poate avea loc o adsorbie a reziduurilor de insecticide organo-clorurate pe acesta. Extractul se filtreaz i se concentraz la un volum de civa ml.

Observaie: dac extractul este colorant, se poate purifica pe o coloan cu florisil.

f) Separarea cromatografic:Extractele obinute sunt supuse separrilor cromatografice pe cromatoplci cu diametrul de 20x20 cm, acoperite cu silicagel G sau alumin. Grosimea stratului adsorbant este cuprins ntre 0,25 0,5 mm. Plcile se activeaz timp de o or la 110o C. Spoturile se aplic la 1,5 cm de marginea inferioar a plcii. Distana de migrare este de aproximativ 17 cm, astfel nct s se obin o separare convenabil.

Pentru aprecierea calitativ, aplicarea spoturilor se face cu pipete Pasteur bine efilate i uscarea consecutiv a depozitului spotat, pentru a mpiedica mprtierea solventului pe o suprafa mai mare de 0,5 cm diametru, chiar dac aplicaia se repet.

Alturi de spoturile probei de analizat se pun spoturi dintr-o soluie etalon de insecticide individuale sau n mixtur.

Cromatografia se execut n sistem ascendent n tancuri etane care se satureaz n prealabil pentru echilibrare, prin cptuire cu hrtie de filtru mbibat cu solveni.

Ca amestec de eluie se folosete sistemul eter de petrol : eter etilic n raportul 2:1.

Dup eluie plcile se usuc la temperatura camerei. Relevarea se face prin stropirea plcilor cu o soluie alcoolic 0,5% de difenilamin, urmat de iradiere n ultraviolet timp de cteva minute.

Limita de detecie este de 0,5 g.7.5. Exprimarea rezultatelor

Rezultatul se exprim sub forma: pesticide organo-clorurate - prezente sau pesticide organo-clorurate - nedetectabile.

IDENTIFICAREA PESTICIDELOR PRIN GAZCROMATOGRAFIEMod de lucru, execuia propriu-zis7.3.4.1. Extracia 7.3.4.1.1. Extracia pesticidelor din produse de origine non-animal

a. Extracia pesticidelor din fructe i legume

Din proba de origine non-animal, foarte bine omogenizat, se cntresc,ntr-un tub de centrifug, 7,5 g (la balana analitic, cu precizie de 0,0001g). Se adaug 15 ml aceton, se omogenizeaz timp de 20 secunde apoi se adaug 15 ml clorur de metilen i 15 ml eter de petrol. Se agit din nou pentru 20 secunde. Se centrifugheaz la 4000 rot/ min timp de 10 min. Se decanteaz 15 ml din extractul organic,se evapor pn aproape de sec la rotavapor(temperatura bii de ap este de 400C). Se evapor la sec la temperatura camerei. Reziduul se redizolv n 3 ml amestec isooctan/toluen ((9:1v/v) coninnd standard intern de concentraie 0,05 g/ml mirex pentru determinarea pesticidelor cu detector ECD, 0,1 g/ml etion pentru determinarea pesticidelor cu detector TSD sau 0,2 g/ml TPP pentru determinarea pesticidelor cu detector MS i se sonicheaz timp de 5 min. n continuare se procedeaz ca la punctul 7.3.4.3.

Metoda poate fi lucrat i cu cantiti la jumtate.

b. Extracia pesticidelor din cereale i alune(metoda static)

Din proba de cereale sau alune, foarte bine omogenizat, se cntresc 12,5 grame,ntr-un pahar Berzelius. Se daug 50 ml amestec: aceton/clorur de metilen (50:50,v/v), se omogenizeaz timp de 20 secunde apoi se las peste noapte. Se centrifugheaz la 4000 rot/min timp de 10 min. Se decanteaz 15 ml din extractul organic i se evapor pn aproape de sec la rotavapor (temperatura bii de ap este de 400C). Se evapor la sec la temperatura camerei.

Reziduul se redizolv n 3 ml amestec isooctan/toluen ((9:1v/v) coninnd standard intern de concentraie 0.05 g/ml mirex pentru determinarea pesticidelor cu detector ECD, 0,1 g/ml etion pentru determinarea pesticidelor cu detector TSD, 0,2 g/ml TPP pentru determinarea pesticidelor cu detector MS i se sonicheaz timp de 5 min .

7.3.4.1.2.Extracia grsimii din esuturile grase Circa 100g esut gras (inut n prealabil la rece)se trec prin robotul de buctrie i se omogenizeaz. Din proba bine omogenizat, se cntresc circa 25g prob i se pun ntr-o plnie de sticl prevzut cu hrtie de filtru, pe care s-a aezat un strat de cca 10g de sulfat de sodiu anhidru. Se aeaz plnia ntr-un vas conic i se ine n etuv la 650C, timp de 4ore, pn cnd grsimea nceteaz s mai curg. Se cntresc 0,5g de grsime, care se dizolv ntr-un mililitru de eter de petrol. 7.3.4.1.3. Extracia grsimii din lapte i produse lactatea. Extracia direct a grsimii din lapte prin metoda AOAC

ntr-o plnie de separare, de 700cm3 se introduc 100cm3 lapte cu 1g oxalat de sodiu. Apoi se adaug 100cm3 alcool metilic, 100cm3 eter etilic, 100cm3 eter de petrol i se agit 1 min. Se las plnia n repaus pn la separarea straturilor. Stratul inferior se ndeprteaz. Pentru deshidratare, extractul eteric(stratul superior) se trece printr-o coloan de sulfat de sodiu anhidru i se colecteaz ntr-un balon de 100cm3. Se concentreaz la evaporatorul rotativ, la cca. 400C, obinndu-se astfel grsimea purificat. Se cntresc 0,5g grsime i se dizolv ntr-un mililitru de eter de petrol.

b. Extracia grsimii din lapte prin centrifugare

Din lapte integral

Se centrifugheaz 50 ml de lapte integral timp de 10min la 2500 rot/min i se transfer smntna ntr-un pahar ce conine 6g de sulfat de sodiu anhidru. Se adaug 30 ml n-hexan i se omogenizeaz timp de 10min. Se filtreaz faza hexanic printr-un dop de vat de sticl acoperit cu sulfat de sodiu anhidru.Se evapor la evaporatorul rotativ faza de n-hexan la 400C la aproximativ 1ml i se ndeprteaz solventul rmas folosind un curent slab de azot. Se cntresc 0,5g grsime i se dizolv ntr-un mililitru de eter de petrol. n continuare se procedeaz ca la punctul 7.3.4.2. Din lapte praf Se iau 10g lapte praf dizolvat n 90ml ap (omogenizat timp de 4 ore).

c. Extracia grsimii din brnzeturi

ntr-un balon de 100ml se introduc 25g brnz foarte bine mrunit i 50ml eter de petrol. Se agit foarte bine i se las peste noapte. Se decanteaz stratul de solvent i se filtreaz prin hrtie de filtru cu porozitate mare, n care s-a introdus, n prealabil, cca.5g sulfat de sodiu anhidru. Extractul eteric se prinde n balonul evaporatorului rotativ i se concentreaz, pn la ndeprtarea solventului. Se cntresc 0,5g grsime i se dizolv ntr-un mililitru de eter de petrol.

d. Extracia grsimii din unt Se nclzete untul la cca 500C i se filtreaz la cald printr-o hrtie de filtru cu porozitate mare pe care s-a pus, n prealabil, un strat de sulfat de sodiu anhidru. Se cntresc 0,5g grsime i se dizolv ntr-un mililitru de eter de petrol. n continuare se procedeaz ca la punctul 7.3.4.2.7.3.4.2. Extracia i purificarea reziduurilor de pesticide din grsimea de origine animal a. Extracia pesticidelor din grsimea de origine animal Se cntresc 2 poriuni de grsime(maxim 0,5g) n eprubete de centrifug, se adaug 2,5ml amestec de extracie (acetonitril/eter de petrol(hexan) 75/25) i se amestec cu vortexul timp de 1min. Se centrifugheaz la 3000rot/min timp de 20min, la -100C. Se separ fazele prin decantarea fazei superioare ntr-o eprubet, se nclzete uor grsimea rmas pe fundul eprubetei de centrifug pn cnd se topete i se repet extracia folosind 2,5ml amestec de extracie.Se colecteaz fazele organice i se concentreaz la sec. b. Purificarea pe coloan de florisil

n coloana cromatografic se adaug 4g florisil, se taseaz umplutura prin batere uoar n pereii tubului i deasupra se adaug 1g sulfat de sodiu anhidru. Extractul organic de la punctul 7.3.4.2. adus la sec se reia cu 5ml eter petrol(hexan) i se trece cantitativ n coloan. Se spal paharul, de 3 ori, cu cte 1 ml eter de petrol.Reziduurile de pesticide reinute pe florisil se elueaz cu cte 30ml solvent eluie A, B i C. Se regleaz robinetul coloanei astfel nct debitul s fie de 2,5-3ml/min. Eluatul obinut se concentreaz la rotavapor, la 400C, la sec .c. Concentrarea solventului de eluie Dup trecerea pe coloana de florisil, solventul de eluie se colecteaz n balonul de 100 ml al evaporatorului rotativ i se concentreaz pn ce volumul eluatului se reduce la circa 1ml, dup care concentratul se evapor la sec sub curent de azot. Reziduul se redizolv n 2,5 ml amestec isooctan/toluen ((9:1v/v) coninnd standard intern. d.Extracia reziduurilor i purificarea lor prin gel permeaie de nalt performan

Grsimea obinut se topete prin nclzire uoar pe baia de ap. Din aceasta se cntrete 0,5 g ntr-un vial , se dizolv cu 5ml amestec ciclohexan-acetat de etil1:1, i se injecteaz n sistemul GPC.

Pentru produsele cu un coninut redus de grsime,extractul eteric obinut n urma etapei de extracie se concentreaz pn aproape de sec,dup care se aduce la un volum de 5ml cu amestec ciclohexan-acetat de etil 1:1 se introduce ntr-un vial al sistemului GPC.si se injecteaz.

Probele purificate astfel se concentreaz sub curent de azot aproape de sec dup care se aduc la un volum de 3ml i apoi se injecteaz n GC.

e. Purificarea reziduurilor de pesticide din produse de origine non animal prin gel permeaie de nalt performan1. Partiie

Din proba de origine non-animal, foarte bine omogenizat, se cntresc,ntr-un tub de centrifug, 7,5 g (la balana analitic, cu precizie de 0,0001g). Se adaug 15 ml aceton, se omogenizeaz timp de 20 secunde apoi se adaug 15 ml clorur de metilen i 15 ml eter de petrol. Se agit din nou pentru 20 secunde. Se centrifugheaz la 4000 rot/ min timp de 10 min. Se decanteaz 15 ml din extractul organic,se evapor pn aproape de sec la rotavapor(temperatura bii de ap este de 400C). Se evapor la sec la temperatura camerei. Reziduul se redizolv n 5 ml amestec ciclohexan/acetat de etil (1:1v/v)

2. Purificarea

Se introduce proba astfel pregtit ntr-un vial al sistemului GPC i se injecteaz.

Proba purificat se concentreaz sub curent de azot aproape de sec dup care se

aduce la un volum de 3ml cu amestec isooctan/toluen(9:1),apoi se injecteaz n GC.

7.3.4.3.Separarea gaz-cromatografica. Condiii de lucru ale GC/ECD: Se deschide metoda de lucru i se ateapt pn cnd aparatul ajunge la condiiile de lucru:

temperatura injectorului: 2500C;

temperatura detectorului: 3000C;

programul de temperatur al cuptorului: Tiniial= 600C , Rate 1: Temp=2000C, viteza de cretere a temperaturii este 300C/ min., st 1min.; Rate 2: Temp=2300C, viteza de cretere a temperaturii este 30C/ min., st 5min; Rate 3: Temp=2800C, viteza de cretere a temperaturii este 50C/ min., st 5min. gaz purttor: heliu de puritate 99,99% cu debitul de 2ml/ min;

gaz de adaos( make-up) : azot de puritate 99,99% cu debitul de 25ml/ min.;

volumul de injecie: 1l.b. Condiii de lucru ale GC/TSD:

Se deschide metoda de lucru i se ateapt pn cnd aparatul ajunge la condiiile de lucru:

temperatura injectorului: 2500C;

temperatura detectorului: 2500C;

programul de temperatur al cuptorului: Tiniial= 600C,sta 1min.,Rate 1: Temp=1800C, viteza de cretere a temperaturii este 300C/ min., st 3min; Rate 2: Temp=2300C,viteza de cretere a temperaturii este 40C/ min.,st 1min;Rate 3:Temp=2600C, viteza de cretere a temperaturii este300C/ min, st 0min; gaz purttor: heliu de puritate 99,99% cu debitul de 2ml/ min;

gaz de adaos( make-up) : azot de puritate 99,99% cu debitul de 30ml/ min.; gaze de flacr: H2-4,2ml/min; aer- 175ml/min;

bead current: 3,4A; volumul de injecie: 1l.c. Condiii de lucru ale GC/MS:

Se deschide metoda de lucru i se ateapt pn cnd aparatul ajunge la condiiile de lucru:

temperatura injectorului: 2500C;

temperatura detectorului: 2500C;

programul de temperatur al cuptorului: Tiniial= 500C,sta 1min.,Rate 1: Temp=1800C, viteza de cretere a temperaturii este 180C/ min., st 2min; Rate 2: Temp=2000C,viteza de cretere a temperaturii este 20C/ min.,st 4min;Rate 3:Temp=2900C, viteza de cretere a temperaturii este100C/ min, st 4min; gaz purttor: heliu de puritate 99,99% cu debitul de 1,5ml/ min;

volumul de injecie: 1l Dup ce aparatul a ajuns la condiiile de lucru de mai sus se analizeaz probele i se integreaz dup curba de calibrare. Curba iniial de calibrare se prepar pentru fiecare analit de interes, folosind 5 sau mai multe standarde de calibrare de concentraii apropiate, dar deasupra limitei de detecie a metodei precum i alte concentraii ce corespund domeniului de concentraie n probele reale. Coeficientul de determinare este calculat, pentru fiecare curb, de ctre soft i este folosit la aprecierea curbei potrivite. Un coeficient 0,99 este acceptat. Curba de calibrare iniial trebuie s fie verificat la fiecare 24 ore(continuarea calibrrii) prin injectarea standardului de lucru. Dac rspunsul variaz de la rspunsul prevzut, mai mare dect criteriul acceptat, trebuie s se fac o nou calibrare.

n cadrul determinrilor de reziduuri de pesticide, prin gaz-cromatografie, ordinea zilnic a cromatogramei trebuie s fie urmtoarea:

prob oarb blank pentru controlul puritii reactivilor; etalonul compusde lucru;

un test de recuperare compus dintr-o prob martor i o prob fortificat;

setul de probe lucrate n ziua respectiv cu acelai lot de reactivi i materiale (care au fost controlate prin proba blanc) i de ctre acelai analist;

etalonul compus de lucru care nu trebuie s difere semnificativ de cel de la nceputul lucrului.

Se injecteaz cte 1l de etalon compus, la fel i pentru probe, recuperare sau blank. Se obin astfel cromatogramele etalonului i a probei de analizat. Identificarea componenilor din prob se face n funcie de timpul de retenie, comparativ cu timpul de retenie a etalonului. Prin utilizarea sistemului de integrare se realizeaz att marcarea automat a timpilor de retenie ct i integrarea vrfurilor cromatografice, afindu-se direct aria lor. La probele cu depiri a MRL se repet analiza i se reface curba de calibrare n matrice.