Spectrometria de adsorbtie electonica( spectrometria in ultraviolet si vizibil) aplicata in stabilirea structurii compusilor

organici

Generalitati:

Spectrele in ultraviolet (UV) si vizibil (VIS) sunt spectre electronice

ale moleculelor. Ambele tipuri de spectre intre care nu exista nici o diferenta

principala, sunt asociate cu tranzitiile electronice care au loc la trecerea

moleculelor din starea fundamentala intr-o stare excitata electronic. Spectrul

electronic este reprezentarea grafica a variatiei unui parametru legat de

absortia energiei radiante in functie de lungimea de unda sau de frecventa.

Pe abscisa unui spectru electronic se noteaza fie lungimea de unda

λ(exprimata in nm) fie frecventa exprimata ca numar de unda

υ[cm-1]=107λ [nm].

Energiile corespunzatoare tranzitiilor din domeniile UV-VIZ au valori

mult mai mari decat energiile tranzitiilor vibrarorii-rotatorii.Astfel,la 200 nm

energia tranzitiei este de 600 kjouli/moli, la 400 nm este 300kjouli/mol,iar la

800 nm este 150 kjouli/mol.

Pe ordonata unui spectru electronic se reda una din urmatoarele

marimi: transmisia T%(mai rar absortia A%),extinctia E(numita si

absorbanta sau densitate optica),coeficientul molar de extinctie ε(numit si

absorbtivitate molara) sau logaritmul acestuia,definite prin relatiile:

T%=I/I0 · 100

A%=(I0 - I)/ I0 ·100

1

E=lg I0/I

Ε[1000 cm2 · mol-1]=E/l·c

In relatiile de mai sus I0 este intensitatea fluxului luminos

remanent,dupa parcurgerea cuvei cu proba, el este grosimea cuvei in

centometri, iar c este concentratia solutiei analizate,exprimata in moli pe

litru.

Spectrul electronic

Culorile si lungimile de unda corespunzatoare din domeniul vizibil pot

fi reprezentate intr-o diagrama simpla,intuitive. Culorile fundamentale

(cercurile mari) dau prin compunerer doua cate doua,culorile secundare

(cercurile mici) cuprinse in diagrama intre acestea. Culorile opuse sunt

complementare;absorbtia in regiunea unei culori din spectru lasa

necompensata culoarea complementara. O substanta apare astfel colorata

rosu fie cand emite lumina de circa 750nm,fie cand absoarbe lumnia de circa

550nm.Culoarea galbena poatew fi cauzata de absortie fie la limita cu

domeniul ultraviolet(400-450nm),fie la limta cu domeniul infrarosu(750-

800nm).

In reprezentarile grafice ale spectrelor electronice apar diferente mari

de aspect in functie de marimile reprezentate pe abscisa si pe ordonata.

2

Astfel,la spectrele avand reprezentata pe abscisa lungimea de unda λ ,benzile

se distanteaza mult intre ele la valori λ mari,reprezentandu-se pe abscisa

valorile υ ,benzile devin mai echidistante iar ordinea lor se inverseaza.

Reprezentarea pe ordonata a transmisiei T conduce la aparitia benzilor de

absortie in forma unor minime;aceasta orientare este inversata la

reprezentarea pe abscisa a absortiei A. In figurile:e,f,g este prezentat spectrul

aceleeasi substante coordonate:A(T)/υ;E/υ si log E/υ. Se observa ca la

reprezentarea pe ordonata a marimilor A sau T ,benzile intense cres mai

putin prin marirea concentratiei, decat atunci cand pe ordonata se reprezinta

extinctia E sau ε. Reprezentand pe ordonata valorile log E sau log ε spectrele

corespunzand la concentratii diferite au exact acelasi aspect,fiind deplasate

doar pe verticala.

Cel mai util mod de prezentare grafica a spectrelor electronicec este

acela in coordonate ε / λ,se prefera insa prezentarea fotografica a unor

spectre inregistrate direct de aparat in coordonate E/υ.

Principiul aparaturii

Aparatele moderne pentru spectometrie UV-viz sunt spectrometre

automate cu dublu fascicul. Schema bloc este aceeasi cu cea a spectrome-

trelor de IR, fiecare parte componenta fiind adecvata lucrului in domeniul

respectiv. In fugura se prezinta schita de principiu a unui spectrometru UV-

VIZ.

Sursa de radiatii este un bec obisnuit cu filamenet de wolfram pentru

domeniul vizibil si o lampa cu hidrogen sau de uteriu (cu balon din quartz)

3

pentru domeniul UV.Lampa de hidrogen cuprinde doi electrozi metalici,intre

care apare dupa o scurta incalzire prealabila pe cale electrica o descarcare in

atmosfera de hidrogen sau de uteriu la presiune. Aceasta descarcare

furnizeaza o radiatie in domeniul UV(electronii si energii necuantificate isi

reduc energia ajungand la primul nivel excitat al hidrogenului-seria Balmer

din spectrul hidrogenului).

Monocromatorul este costruit fie pe pricipiul dispersiei in

prisme(sticla pentru domeniul VIZ,quartz pentru domeniul UV si VIZ), fie

pe principiul difractiei in retele de difractie. La monocromatoarele cu

dispersie razele trec de regula de doua ori succesiv prin prisma in scopul

imbunatatirii dispersiei.

Acest lucru se realizeaza cu ajutorul unei oglinzi(litrow);prin rotirea ei

cu ajutorul unei came se obtin la fanta de iesire radiatii

monocromatice,avand lungimea de unda variabila monoton,in

timp,permitandu-se deci parcurgerea abscisei spectrului. Prin alegerea

profilului camei care misca oglinda litrow, se poate realiza o variatie liniara

fie a lungimilor de unda fie a frecventelor.

Cuvele sunt confectinate din quartz. Pentru lucrul exclusiv in

domeniul vizibil se pot utiliza cuve din sticla,mai ieftine. Ele au grosimea

stratului de solvent(respectiv solutie)de un centimetru si volumul de cativa

mililitrii. Exista si microcuve cu grisimea de 1mm precum si cuve de gaz

cu volume mai mari. La inregistrarea spectrelor,intr-una din cuve se

introduce solutia probei iar in cealalalta cuva identica cu prima se introduce

solventul curat pentru compensatie.

Realizarea dublului fascicul se face cu ajutorul unei oglinzi

rotative(cu spatii alternante pline si goale) si a mai multor oglinzi plane.

4

Receptorul radiatiilor care au strabatutu cuvele este in principiu o

fotocelula cu strat emisiv. Catodul de cesiu al unei asemenea celule

elibereaza electroni atunci cand este iluminat (cuante de nergie E=Hυ) si

permite inchiderea circuitului electric al fotocelulei. Instrumentul de masura

microampermetru indica un curent fotoelectric proportional cu iluminarea.

Spectrometrele moderne UV-VIZ cuprind de obicei drept receptor un

fotomultiplicator care prezinta un efect de amplificare considerabil al

semnalului. Fotomultiplicatorul este bazat pe principiul celulelor

fotoelectrice, amplificarea realizandu-se prin emisia secundara de elctroni

intr-o succesiune de mai multi electrozi legati la potentiale pozitive

crecatoare,prin intermediul unui divizor de tensiune.

Inregistratorul este dispozitivul de inregistrare mecanica pe hartie a

semnalului obtinut la fotomultiplicator,dupa o noua amplificare intr-un

amplifiactor.

Tehnica de lucru. Solventi spectrali UV-VIZ

De cele mai multe ori spectrele UV-VIZ se inregistreaza pentru probe

aflate in solutie.Intrucat In domeniul UV-VIZ benzile cele mai

importante(din punct de vedere al analizei structurale) au valori ε >104 ,

fiind deci,de circa 100 ori mai intense decat in domeniul IR, probele

spectrale trebuie sa fie extrem de diluate (10-3 -10-4 muli/l ).Cantitatile de

proba de circa 1 mg, cantarite cu precizie la balanta analitica,se dizolva in

100 ml solvent iar din solutia rezultata sunt necesarri doar 2-3 ml pentru o

5

determinare. Concentratiile necesare fiind atat de mici ele pot fi obtinute

usor de la orice substanta organica chiar de la cele foarte putin solubile.

Pentru eliminarea erorilor de cantarire (la cantitati mai mici de 1 mg)

se recomanda cantarirea unor probe mai mari urmata de diluari succesive in

flacoane cotate. Alegerea concentratiei probei trebuie facuta astfel incat

maximele de absortie sa ramana in scala aparatului.Se mentioneaza ca

domeniul de precizie maxima al extinctiilor E este situat intre 0,25-0,75.

Tinand seama de acestea se va lucra in cuve de 1 cm de exemplu cu

concentratii de circa 5·10-5 moli/l. Pentru compusii cu ε =10000 si cu

concentratii de 1 · 10-2 moli/l pentru compusii cu ε=100.

Probele trebuie sa fie extrem de bine purificate intrucat orice

contaminant cu absorbtii proprii intense in domeniul UV-VIZ poate denatura

puternic spectrul.

Solventii spectrali trebuie sa fie transparenti in domeniul de lucru.

Daca in domeniul vizibil se poate lucra practic cu orice solvent incolor, in

UV cei mai uzuali solventi sunt compusi continand numai legaturi σ, de

exemplu hidrocarburi saturate,alcooli .Solventii trebuie sa aiba o puritate

inalta in sensul ca ei nu trebuie sa contina impuritati absorbante in UV-VIZ.

De exemplu alcooli nu trebuie sa contina aldehidele corespunzatoare.

Etanolul nu trebuie sa contina urme de benzen,motiv pentru care se prefera

etanolul de 95% obtinut de regula prin distilari azeotropice cu benzen.

Solventi spectrali pentru domeniul UV- VIZ

6

In scopul verificarii preciziei inregistrarii aparatele spectrale se

calibreaza periodic. Pentru verificarea scalei fotometrice (ordonata

spectrului exprimata in T% sau E) se inregistreaza spectrul unei solutii

etalon de KcrO4 in solutie 0,05 M de KOH apos la 25°C in cuva de 1 cm si

se compara valorile T%, E indicate de aparat cu cele etalon.

7

Solventul Domeniul de utilizare- valori λ[nm]mai mari decat:

Apa 191Metanol 205Etanol 205Etanol 95% 205Pentan, hexan 210Heptan 195Ciclopentan 210Ciclohexan 195Decalina 200Eter etilic 215Tetrahidrofuran 220Dixan 220Acetonitil 195Diclorometan 235Cloroform 245Tetraclorura de C 260N,N- dimetilforamida 270Dimetilsulfoxid 265Benzen 280Toluen 285Piridina 305Acetona 330KBr 200KCl 200

Spectrul UV-VIZ al solutiei etalon de cromat de potasiu

λnm T% E λnm T% E

220 35.8 0.446 360 14.8 0.830250 31.9 0.496 370 10.3 0.978260 23.3 0.633 375 10.2 0.991275 17.5 0.757 390 20.2 0.695290 37.3 0.428 400 40.2 0.396340 48.3 0.316 440 88.2 0.054

Calibrarea abscisei spectrelor UV-VIZ se realizeaza prin inregistrarea

spectrelor etalon ale unor filtre de sticla din oxid de holmiu sau al unor

solutii acide de ioni NO3.Oxidul de holmiu are benzi cu maxime de absortie

caracteristice la:279,3;333,8;360,8;418,5;453,4;536,4;637,5 nm.

Acestea se compara cu valorile inregistrate ale abscisei,facandu-se corectiile

respective.Aceeasi proba de oxid de holmiu se utilizeaza si penrru testarea

rezolutiei:440-460 nm apar 3 benzi intense si distincte.

Solventi spectrali pentru domeniul UV- VIZ

Definitii :

Cromofor este sisitemul ce contine electronii (de obicei n sau π)

datorita carora are loc absortia de enrgie radianta in domeniul vizibil si

ultraviolet (exemplu:cromofor carbonilic, etilenic).

8

Auxocrom este grupa saturata posedand atomi cu electroni

neparticipanti care nu absoarbe in UV,dar care atasata unui cromofor

produce un efect batocrom si hipercrom asupra maximului de absortie al

acestuia:grupa OH,OR si NH2.

Deplasarea batocroma sau deplasarea spre rosu este deplasarea unui

maxim spectral spre valori λ mai mari, adica inchiderea culorii.

Deplasare hipsocroma sau deplasare spre albastru este deplasarea unui

maxim spectral spre valori λ mai mici, adica deschiderea culorii.

Efect hipercrom:efect de crestere a intensitiatii de absortie,adica

intensificarea culorii.

Efect hipocrom: efectul de descrestere a intensitatii de absortie adica

slabirea culorii.

Punct isobestic este punctul comun de extinctie egala al tuturor

spectrelor electronice ale unui compus,generate prin modificari de exemplu:

de timp sau de pH; indica o transformare chimica progresiva A-B(de

exemplu trecerea formei acide a unui indicator colorat in forma bazica).

Tranzitiile electronice si corespondenta acestora cu benzile

spectrale UV-VIS

Tipurile de tranzitii electronice ce se produc in iradierea unei

molecule cu iradiatii UV-VIS difera dupa natura orbitalilor implicati.

Tranzitiile -* sunt caracterizate prin cele mai mari energii,deci prin

cele mai mici lungimi de unda.Benzile corespunzatoare acestor tranzitii apar

la valori <200 nm,in ultravioletul,de vid.Acest domeniu,in care

9

componentii aerului dau si ei absorbtii,necesita o tehnica speciala de lucru in

vid.El este insa un domeniu putin interesant pentru chimistul organic.S-a

vazut ca solventii spectrali cei mai utilizati pentru domeniu UV sunt tocmai

compusii care prezinta numai tranzitii -* fiind transparenti peste circa

200nm.

Tranzitiile de tip -* sunt caracteristice moleculelor cu duble

legaturi(C=C;C=O;C=N).Benzile corespunzatoare transportate pentru

analiza spectrala organica,sunt situate la valori aproximative =170-250

nm.Pozitia lor este puternic afectata de conjugarea cu alti cromafori sau cu

auxocromi.

Tranzitiile de tip n-* si n-*sunt caracteristice sistemelor cu

heteroatomi posedand electroni neparticipanti.Benzile corespunzatoare

tranzitiilor n-* apar in spectru de lungimi de unda =180-260 nm.Pozitia

lor este puternic influentata de electronegativitatea atomului cromofor.

Tranzitiile n-* se manifesta in spectru sub forma unor benzi lungi de

unda =270-370nm.Desi sunt caracterizate de regula prin extinctii mici,ele

ofera multe informatii structurale.Pozitia acestor benzi, dependenta in

oricare masura de natura atomilor care sunt legati prin legaturi duble este

influentata in mod puternic si caracteristic de conjugarea cu auxocromi.

Reguli de selectie.Intensitatea benzilor spectrale.Probabilitatea

absortiei cuantelor de frecventa corespunzatoare este corelata cu

coeficientul de extinctie prin relatia:

max=0,87* 1020*P*a

in care P-probabilitatea de absorbtie,iar a-asa numita “sectiune de captura” a

moleculei .

10

Pentru valorile P~1 absortiile dau nastere unor benzi cu max=104-

105;aceste benzi corespund unor tranzitii numite “permise”.Din contra

pentru valori de P<0,01 corespund benzii putin intense,cu max=10-

103.Tranzitiile care genereaza aceste benzi se numesc “interzise” si ele se

produc cu o probabilitate foarte mica.

Natura “permisa” sau “interzisa” a benzilor decurge dintr-o serie de

reguli de selectie,fundamentale mecanic-cuantic.

Astfel sunt interzise tranzitiile in care se schimba multiplicitatea

sistemului(singlet-triplet).Sunt interzise de asemenea tranzitiile intre stari

avand aceeasi simetrie a distributiei electronice.Aceste interdictii nu sunt

insa absolute de exemplui banda de cca 250 nm a benzenului sau banda de

cca 300 nm a cetonelor;desi formal “interzise” de asta data ultima regula de

selectie apar totusi in spectrele corespunzatoare datorita devieriilor de

simetrie aduse de vibratia moleculei sau de substituientii diferiti ai grupei

carbonil(in molecula cetonelor).

O lege importanta a fotochimiei este principiul lui Frank si

Condon.Intre geometria moleculei in stare fundamentala si in cea in stare

excitata pot exista uneori diferente apreciabile.Principiul Franck-Condon

arata ca in timpul in care are loc absorbtia fotonului si excitarea electronului

este atat de scurt(~10-15S),cand molecula excitata apare in primul moment

intr-o geometrie identica cu cea a starii fundamentale.De obicei molecula

excitata apare intr-o stare “dilatata”adica distanta interatomica 0*(distanta

de echilibru a starii excitate) este mai mare decat distanta de echilibru 0

pentru starea fundamentala.Tranzitia “verticala” legata de absorbtia sau

remisia instantanee a unui foton,conduce la ocuparea unor nivele excitate

atat electronic cat si vibrational.Aceasta se traduce printr-o anumita”

11

structura vibrationala” a spectrului de absortie in care intensitatea maxima

are o banda corespunzatoare unei tranzitii pe nivele vibrationale superioare.

Structura fina de vibratie

Energiile starii fundamentale si acelei excitate ale unei molecule nu

reprezinta in realitate nivele unice,intrucat diferitele molecule din proba au

energii vibrationale diferite.In momentul excitatiei eletronice se modifica si

energia de vibratie.Ca urmare,energia tranzitiei va fi usor diferita de la o

molecula la alta.Corespondenta in spectru electronic a acestor numeroase

tranzitii ale diferitelor molecule din proba este o “structura fina de

vibratie”a benzilor electronice.

Aceasta structura fina este vizibila la lucru in faza gazoasa.In solventi

nepolari ,unele molecule nepolare rigide(de exemplu benzenul),prezinta de

asemenea structura fina.

In solventi uzuali(de regula polari),datorita interactiilor solvent-

solvat,tranzitiile individuale pe nivele vibrationale sunt greu de sesizat si in

spectru se observa doar o banda larga(anvelopa) care inglobeaza intreaga

structura fina.

Orbitalii si * ai cromatoforilor etilenici individuali se combina in 4

noi orbitali, al caror continut energetic variaza.Diferenta de energie intre

12

orbitalul superior ocupat si cel vacant inferior este mai mica la sistemul

conjugat decat la sistemul neconjugat.

Rezulta ca lungimea de unda a maximului de absortie va fi mai mare

pentru sistemul conjugat.

Acesta este motivul pentru care de regula toate spectrele UV-VIS sunt

caracterizate prin benzi largi(mult mai largi decat in domeniul IR).

Vibratiile energiei de rotatie sunt de regula foarte mici in raport cu

cele ale energiei electronice.De aceea in spectrele electronice nu se observa

structura “hiperfina” datorita rotatiei.

Conjugarea cromoforilor

Prin conjugarea a doi sau mai multi cromofori banda spectrala de

absorbtie caracteristica sufera o deplasare batocroma si hipercroma

Deplasarea batocroma se explica tinand seama de modificarea energiei

orbitalilor implicati in tranzitie.Se considera pentru exemplificare

conjugarea a doi cromofori etilenici ca in butadiena.

Influienta solventului asupra spectrelor electronice

Benzile corespunzatoare tranzitiilor -* sufera deplasari batocrome la

cresterea polaritatii solventului(solvatocromie pozitiva).Acest efect se

explica prin faptul ca cele mai multe tranzitii -* conduc la stari excitate

mai mult polare decat starile fundamentale.Aceste stari excitate polare sunt

mult stabilizate prin interactiuni dipolare cu sovlenti polari;ca

urmare,energia tranzitiei se micsoreaza iar maximul spectral se deplaseaza

13

batocrom.Marimea deplasarii batocrome este de circa 1-20nm la trecerea de

la solvent hexan la etanol.

Compusii care pot forma legaturi de hidrogen cu solventul prezinta de

asemenea deplasari batocrome pe masura ce solventul devine un mai bun

acceptor al protonului in legaturi de hidrogen.

Explicatia acestei deplasari rezulta de asemenea prin luarea in

consideratie a starilor excitate polare care retin mai putin protonii proprii

facandu-i apti de a da legaturi de hidrogen cu solventi corespunzatori(de ex

p-nitrofenolul in dioxan);stabilizarea starilor excitate prin legaturile cu

solventul conduce la diminuarea energiei necesare tranzitiei.

Benzile corespunzatoare tranzitiilor n-*(de exemlu in compusii

carbonilici) sufera deplasari hipsocrome la cresterea polaritatii

solventului(solvatocromie negativa).Explicatia rezida in ponderea diminuata

a legaturilor de hidrogen in starea excitata,conducand destabilizarea

acesteia,insotita de cresterea energiei de tranzitie si deci de scaderea valorii

max .Marimea deplasarii hipsocrome la cetone este de~15 nm la trecerea de

hexan la apa.

Efecte mult mai puternice ale solventului se observa cand starea

fundamentala si cea excitata au polaritati mult diferite.Exemplu cazul

indigoului care prezinta o solvatocromie,caci in starea fundamentala

contributia structurii de rezonanta nepolara este mai mare decat a celei

polare,in timp ce in starea excitata situatia este inversa.Solventii polari vor

solvata mai puternic starea excitata decat cea fundamentala.Solvatocromia

negativa a unei betaine de N-hidroxifenilpiridiniu,la care starea

fundamentala este mai polara decat cea excitata.O crestere a polaritatii

solventului conduce la o deplasarea batocroma in cazul indigoului si la o

deplasare hipsocroma in cazul betaienei.

14

A.Efectul solventilor asupra spectrului electronic al indigoului

Solvent Vapori CCL4 C6H4Me2 EtOH Me2SO Solid(in KBr)

maxnm 540 588 591 610 620 660

Culoarea Rosu Violet Albastru Indigo

B.Efectul solventilor asupra spectrului electronic al betainei2

Solventul MeOH EtOH Me2CH(CH2)2OH

Me2CO C6H5OEt

maxnm 515 550 608 677 785

Culoarea solutiei

rosie violeta albastra Verde galbena

Et(kcal/mol)

55,5 51,9 47,0 42,2 37,2

Const.dielectrica (250)

32,6 24,3 14,7 20,7 4,2

Pe baza lungimii de unda maxnm a benzii de absorbtie a betainei s-a

propus un parametru Et (kcal/mol) al polaritatii solventilor

Et=28 560/maxnm(betaina 2)

Parametrii de polaritate a solventilor

Solventul Et30 AN DN *

n-hexan 30,9 0.00 - 0 0 -0,08CCl4 32,5 8,6 - 0 0 0,29Benzen 34.5 8.2 0.1 0 0 0.59Eter etilic 34,6 3,9 19,2 0 0.49 0.27Acetat de etil 38.1 - 17.1 0 0.47 0.55cloroform 39.1 23.1 - 0 - 0.76piridina 40.2 14.2 33.1 0 0.66 0.87nitrobenzen 42 14.8 4.4 - - -

15

Aparatura folosita pentru identificari si dozari in domeniul metodelor

fotometrice si spectrofotometrice in ultraviolet si vizibil este reprezentata de

diferite tipuri de spectrofotometre si fotometre.Obtinerea radiatiilor din

anumite domenii spectrale cat si a radiatiilor monocromatice se realizeaza

prin intermediul filtrelor colorate,a lampilor spectrale combinate cu diferite

filtre sau cu ajutorul sistemelor dispersive(retele de difractie,prisme).

Filtre colorate

Filtrele colorate sunt utilizate fie pentru izolarea unei anumite linii

spectrale in asociatie cu o sursa de lumina adecvata fie pentru separarea unui

domeniu spectral.In anumite situatii,filtrele se asociaza cu lumina unei lampi

cu vapori de mercur avand drept scop obtinerea unei lumini monocromatice.

Filtrele colorate sunt reprezentate de foi de gelatina colorata ce sunt

montate intre doua discuri de sticla incolora.Filtrul colorat se caracterizeaza

printr-o curba de transmisie care exprima dependenta transmisiei de

lungimea de unda.Eficacitatea filtrului mai este data si de dispersia energiei

spectrale a sursei cat si de sensibilitatea spectrala a receptorului.

Caracteristica unui filtru o reprezinta selectivitatea sa care se poate

determina pentru un izvor de lumina cu o temperatura de aproximativ

3000ºC.

Filtrele spectrale “S” au gravate pe ele un numar care reprezinta

domeniul in care filtrul are cea mai mare transparenta.Trebuie subliniat

faptul ca filtrele “S” sunt valabile numai in asociatii cu becul cu

incandescenta al fotometrului Pulfrich.Setul de filtre colorate este format din

16

9 bucati,insa poate sa fie completat si cu alte filtre,acestea prezentand alte

caracteristici spectrale.

Lampi spectrale

Fotometrul Pulfrich prezinta o lampa cu vapori de mercur.Aceasta

lampa in asociere cu anumite filtre permite selectarea unor lungimi de unda

ale liniilor mercurului:435,8nm(filtrul S 43);546,1nm(filtrul S 53);577,0nm

si 579,1 nm (filtrul S 57).

Prisme si retele optice

Spectrofotometrele utilizeaza ca sisteme dispersive retele si prisme

care au capacitatea de a sigura o monocromaticitate superioara.

Dispersia luminii reprezinta fenomenul optic pe care se bazeaza

obtinerea unui spectru cu ajutorul unei prisme sau retele.Prin iluminarea

fantei de intrare a sistemului dispersiv cu o sursa de radiatii se obtine un

spectru care este format dintr-o succesiune de imagini monocromatice ale

fantei.Fanta de intrare este o deschidere ingusta,paralela cu muchia prismei

sau cu trasaturile retelei.Calitatea unei prisme depinde de dispersia

unghiulara si de rezolutia cromatica.

Numeroase spectrofotometre folosesc retele ca sistem dispersiv in

locul prismelor.Aceste retele sunt de fapt niste placi de sticla sau cuart pe

care s-au zgariat striatiuni paralele la distante egale in numar de

300-1000/nm.Dispersia radiatiei se produce la caderea acesteia pe retea.

In cazul prismelor se folosesc materiale diferite pentru perfectionarea

acestora,in functie de modul de lucru in ultravilet,vizibil sau

infrarosu.Insa,spre deosebire de prisme,retelele se pot folosi in ultravioletul

indepartat pana in infrarosul indepartat.

17

Luminozitatea unui spectrofotometru cu prisma este mult mai mare

decat a unui aparat cu retea iar intretinerea unui spectrofotometru este,de

obicei,mai delicata decat in cazul unui aparat cu pris

Domeniul de transparenta al materialelor de confectionare a prismelor

Materialul Domeniul de transparenta

Sticla crownSticla flint greuCuart uviolCuart cristalinFluorura de litiu(LiF)Fluorina(CaF2)Sare gema(NaCl)Silvina(KCl)Bromura de potasiu(KBr)Bromoiodura de taliu

0,36-10,40-10,28-1

0,185-3,50,12-60,125-90,20-170,20-210,21-280,50-40

Aparate cu citire vizuala

Ochiul omenesc este sensibil numai in domeniul vizibil(400-760nm)

si nu are facultatea aprecierii directe a raportului dintre diferite intensitati.

Fotometrele si spectrofotometrele cu citire vizuala,functioneaza numai ca

aparate de nul.

La citirile vizuale dispersia este de obicei in jur de ±1%,insa

ochiul uman are un maxim de sensibilitate spectrala la 555nm,care

scade catre domeniile albastru sau rosu ale spectrului.

18

Obs!!!

Indiferent de perfectionarile care au fost aduse aparatelor cu citire

vizuala,in ultimii ani au cunoscut o dezvoltare mai mare aparatele care

folosesc celule fotoelectrice si care pot fi utilizate,in egala masura,si in

domeniul ultraviolet.

Eroarea analitica relativa a metodelor vizuale,care este conditionata de

sensibilitatea ochiului,avand in vedere Legea Lambert-Beer, este data de

urmatoarea expresia dc/c.

Dc/c=-dI/I*0,434/E

Eextinctia citita

DI/Ieroarea de citire

0,434modulul de transformare al logaritmilor naturali in logaritmi

zecimali

Fotometrul Pulfrich

Acest fotometru prezinta urmatoarele piese principale:

lampa cu becul de incandescenta(sursa de lumina);

dispozitivul pentru cuve;

fotometrul cu filtrele colorate.

Fotometrul Pulfrich este dotat cu becuri cu incandescenta de 6V si cu

lampi cu mercur „HQE 40”.

19

Functionarea aparatului este urmatoarea:

a.Cele doua fascicule de lumina,emise de becul cu incandescenta strabat con

densatoarele,discurile de sticla clara sau mata,cele 2 cuve in care se gaseste

solutia de analizat si ajung in fotometru.

b.Fasciculele de lumina trec succesiv prin:diagramele reglabile cu

tambururile,lentilele de focalizare,prismele cu reflectie totala,o biprisma si

un filtru colorat si ajung in ocular.

c.Cu ajutorul lupei se priveste inainte de masurare campul diafragmei care

trebuie sa fie uniform ca si campul vizual privit dupa indepartarea lupei.

Obs!!!

1.Campul vizual trebuie sa apara ca find doua jumatati separate printr-

o linie verticala de demarcatie foarte neta.

2.Cu ajutorul tamburilor se poate realiza scaderea intensitatii

fasciculelor de lumina.

Aparate cu citire fotoelectrica

Aparatele cu citire fotoelectrica prezinta celule fotoelectrice care au

capacitatea de a transforma energia de radiatie in energie electrica.

Exista doua tipuri principale de spectrofotometre de absorbtie si

anume:cu un singur fascicul si cu doua fascicule,acestea folosind una sau

doua celule fotoelectrice (fotoelemente).Insa,aparatele cu doua fascicule

permit inregistrarea directa a transmisiei si a extinctiei probelor in conditii

de precizie mai mare decat in cazul aparatelor cu un singur fascicul.

20

Printre spectrofotometrele si fotometrele cu citire fotoelectrica

utilizate in laboratoarele in care se realizeaza analiza medicamentelor se

numara:

1.Pentru domeniul vizibil:

celula fotoelectrica Elpho adaptabila la fotometrul Pulfrich pentru citiri de

extinctii sau transmisii prin metoda compensatiei sau substitutiei

spectrofotometrul „Spekol”care este un spectrofotometru neinregistrator

cu monocromator cu retea

2.Pentru domeniul ultraviolet si vizibil:

a.aparate neinregistratoare:

spectrofotometrul CΦ4 cu prisma de cuart ce functioneaza cu un singur

fascicul prin metoda compensatiei in domeniul 220-1000nm.

spectrofotometrul VSU-2 cu prisma de cuart sau sticla;acesta functioneaza

cu un singur fascicul prin metoda compensatiei in domeniul 210-1000nm.

spectrofotometrul CΦD-2 cu retele de difractie;functioneaza cu un singur

fascicul prin metoda compensatiei in domeniul 220-1000nm.

b.aparate inregistratoare:

spectrofotometrul „Spekord”cu prisma de cuart;functioneaza cu dublu

fascicul in domeniul 185-800nm.

spectrofotometrul „Unicam SP 1800 B”cu retele de difractie;functioneaza

cu fascicul dublu in domeniul 190-850nmsi este prevazut cu inregistrator,

dispozitiv automat pentru schimbarea cuvelor si alegerea domeniului

spectral.

Spectrofotometrul „Spekol” poate sa functioneze fie ca „aparat

principal”,utilizat pentru determinari de extinctii si transmisii in domeniul

21

365-700nm,fie ca „aparat universal”,care lucreaza cu amplificator

tranzistorizat si cu celule fotoelectrice cu gaze si care poate fi folosit atat

pentru determinari de transmisii si extinctii cat si pentru determinari de

fluorescenta,turbiditate sau de reflexie difuza,in domeniul 365-750nm.

Aparatul foloseste drept detector un fotoelement cu seleniu iar ca surse de

radiatii fie un bec cu incandescenta de 6V,30W,cu stabilizator de tensiune

fie o lampa cu vapori de mercur.Pentru citiri se vor folosi cuve de sticla de

0,1cm-5cm grosime fie eprubete de sticla.

Spectrofotometrul cu prisma de cuart CΦ4 se foloseste la

determinari de extinctii si transmisii in domeniul 220-1100nm.Acesta este

prevazut cu surse de radiatii cu tub de descarcare electrica in hidrogen(220-

350nm) si cu detectori cu celula fotoelectrica cu stibiu si cesiu(220-650nm)

si cu celula fotoelectrica cu oxid de cesiu(600-1100nm).

Spectrofotometrul VSU2-P cu prisma este utilizat pentru determianri

de extinctii si transmisii in domeniul 200-1000nm.Acest spectrofotometru poate

sa utilizeze prisma de sticla in domeniul 200-1000nm.El este prevazut cu surse de

radiatii cu:tub de descarcare electrica in deuteriu(200-380nm) si bec de

incandescenta9320-1000nm) si ca detectori cu:celula fotoelectrica tip

MQVS(200-680nm) si celula fotoelectrica tip MV(630-1000nm).Pentru

etalonare se utilizeaza lampa cu vapori de mercur HQE 40 F.

Spectrofotometrul inregistrator,cu dublu fascicul,SPEKORD UV

VIS,cu prisma de cuart este utilizat pentru determinari de extinctii si

transmisii in domeniul 185-800nm.Acest spectrofotometru este prevazut ca

surse de radiatii cu tub de descarcare electrica in deuteriu tip D2E si bec cu

incandescenta (325-800nnm) si ca detectori cu fotomultiplicator.

22

Spectrofotometrul inregistrator,cu dublu fascicul UNICAM SP

1800,cu retea de difractie,este utilizat la determinari de extinctii si transmisii

in domeniul 190-850nm.Spectrofotometrul prezinta ca surse de radiatii un

tub de descarcare electrica in deuteriu si bec cu incandescenta cu filament de

tungsten.Aparatul prezinta un schimbator automat de cuve,selector de

lungimi de unda,programator.

Caracteristici ale aparaturii utilizate in U.V. si vizibil

Sursa

Sistemul de izolare a benzii spectrale

Locul de plasare al probei

DetectorCalcul automatic si prezentare

Domeniu spectral utilizabil(nm)

Ultraviolet

1.Lampa cu argon Filtre

Cuve cu ferestre de LiF

Fotomultiplicator

Microampermetru

107-165

2.Lampa cu xenon

Filtre de interferenta

Cuve cu ferestre de LiF

Celula fotoelectrica

Galvanometru

150-700

3.Lampa de hidrogen

Monocromator(prisme sau retele)

Cuve de cuart

Celula fotovoltaica

Punte potentiometrica

180-380

Vizibil

4.Lampa cu filament dewolfram

Filtre de absorbtie

Cuve de sticla

Element fotoelectric cu seleniu.Ochiul uman

Ochiul uman 350-800

5.Lumina Filtre de Cuve de Element fotoelectric Ochiul

23

alba absorbtie sticla cu seleniu Ochiul uman

uman 350-800

Spectrometria de absorbtie in ultraviolet este o metoda de

investigatie des folosita in controlul medicamentelor cu aplicatii la:

cunoasterea constitutiei moleculare a unor substante,bazata pe

recunoasterea unor grupari cromofore sau a unor grupari care modifica

benziile de absorbtie atribuite altor cromofori;

identificarea si controlul puritatii unor substante;

dozarea unor substante din amestecuri sau ca atare;

studiul echilibrelor in solutie,formarea combinatiilor complexe,ordinul

unei reactii,gradul de polimerizare,interactiuni posibile.

1.Spectrul U.V.-criteriu de identitate si puritate

Absorbtia luminii in U.V. reprezinta o caracteristica a produsului pur.

Pentru identificarea substantelor medicamentoase pure fie se indica cu

precizie lungimile de unda la care se inregistreaza maximele si minimele de

absorbtie cu precizarea valorilor extinctiilor,a coeficientilor de extinctie

molara fie se recomanda compararea spectrului U.V. al substantei de

determinat cu cel obtinut in aceleasi conditii experimentale pentru aceeasi

substanta in stare pura.

De exemplu,spectrul de absorbtie in U.V. al clorhidratului de

oxitetraciclina in HCl 0,01N prezinta 2 maxime la 268nm si 353nm;

24

extinctia unei solutii 0,001%,masurata in cuve de 1cm,este la 268nm de

0,37-0,40 si la 353nm de 0,27-0,29.Proba de identificare a produsului

reprezinta,de cele mai multe ori,un test de puritate.

2.Determinari cantitative in U.V.

Spectrofotometria in U.V. poate fi folosita la determinarea

cantitativa fie a componentelor unui amestec,cu sau fara separarea lor

prealabila,fie ca atare.

Dozarea barbituricelor(barbital sodic,butalbital sodic si fenobarbital

sodic)care sunt prezente alaturi de excipienti in drajeuri,cu maxime situate in

U.V. la aproape aceeasi 240nm,se poate realiza numai dupa separarea lor

pe placa cromatografica.

Dozarea codeinei din siropuri se realizeaza dupa diluarea siropului

cu alcool 60° si trecerea unei cantitati determinate peste o coloana

cromatografica cu schimbatori de ioni.De pe coloana,codeina retinuta prin

schimb ionic se elueaza cu metanol amoniacal(10% NH3).Extinctia se

citeste la 287nm in cuve de 1cm fata de solvent.

Dozarea spectrofotometrica in U.V. a paracetamolului

Principiul metodei:

paracetamolul(4-hidroxiacetanilida)dizolvat in H2SO4 0,05M prezinta

o absorbanta in U.V. la 243nm si o absorbanta specifica egala cu 645.

25

Mod de lucru:

0,1000g paracetamol se aduc cu H2SO4 0,05M intr-un balon cotat de

100

mL;

1mL din solutia obtinuta se dilueaza cu H2SO4 0,05M la 100mL;

solutiei formate i se determina absorbanta la 243nm fata de H2SO4

0,05M

ca martor,in cuva de 1cm.

Obs!!!

Cunoscand valoarea absorbantei specifice se calculeaza concentratia

in paracetamol utilizand urmatoarea formula:

C=A/A cm

A=absorbanta probei analizate

Determinarea spectrofotometrica a cafeinei si a acidului

acetilsalicilic

Cafeina si acidul acetilsalicilic se pot doza din amestec,chiar daca

spectrele lor se suprapun partial.Se masoara absorbanta probei la doua

lungimi de unda corespunzatoare maximelor de absorbtie ale celor doua

componente.

Spectrul unui amestec de doi componenti(x+y) este echivalent cu rezultatul

insumarii spectrelor caracteristice x si y.

26

Reactivi si aparatura:

Solutie etalon 0,002%(m/v) de cafeina in alcool etilic;

Solutie etalon 0,002%(m/v) acid acetilsalicilic in alcool etilic;

Alcool etilic;

Spectrofotometru UV-VIS.

Mod de lucru:

Proba de analizat care contine acid acetil salicilic si cafeina se aduce

cu alcool etilic la flacon cotat de 100mL.In functie de continutul probei in

cafeina si acid acetilsalicilic se realizeaza dilutiile corespunzatoare astfel

incat absorbanta sa fie cuprinsa intre 0,1-0,8 pentru ca aceasta sa poata fi

usor citita.Se masoara absorbanta solutiei de lucru la 273 si 229nm,in cuva

de 1cm,folosind ca martor alcool etilic.

Obs!!!

Absorbantele specifice pentru cafeina si acidul acetilsalicilic la cele

doua lungimi de unda sunt determinate experimental prin masurarea

absorbantei solutiilor etalon cu concentratia 0,002%(m/v) la 273nm si

229nm.

27

Metode spectrofotometrice de absorbtie in U.V. si invizibil aplicate

antibioticelor

Antibioticele sunt compusi cu structuri chimice foarte diferite,a caror

denumire se datoreaza specificitatii si eficacitatii pe care o prezinta fata de

numeroase microorganisme.Metodele de obtinere si puritatea relativa a

preparatelor au facut,ca initial, sa se aplice pentru dozare in special metode

microbiologice.Pe masura ce acesti compusi se obtineau cu o puritate mai

avansata,s-a ajuns sa se prefere tot mai multe metode fizico-

chimice,respectiv spectrofotometrice.

Pentru dozarea spectrofotometrica a antibioticelor din lichidele de

fermentatie este necesara,de multe ori,o separare prin metode extractive,la

diferite pH-uri sau prin metode cromatografice.Metodele spectrofotometrice

in U.V. care se adreseaza intregii molecule sunt,de obicei, mai specifice

decat cele in vizibil.

I.PENICILINE

Penicilinele sunt acizi monobazici formati dintr-un sistem tiazolidin-

β-lactamic condensat.

Penicilinele naturale sunt :benzilpenicilina(penicilina G)

fenoximetilpenicilina(penicilina V)

2-pentenil-penicilina(penicilina F sau I)

3-pentenil-penicilina

n-amil-penicilina

28

p-hidroxibenzil-penicilina

n-heptil-penicilina(penicilina K)

Benzilpenicilina si fenoximetilpenicilina prezinta spectre de absorbtie

caracteristice in U.V. care pot fi folosite drept criteriu de puritate.Penicilina

G prezinta in solutie apoasa are maxime de absorbtie la 250nm si 260nm iar

penicilina V prezinta in solutie apoasa maxime de absorbtie la 268nm si

274nm si un minim la 272nm.

Untermann recomanda o metoda spectrofotometrica selectiva in U.V.

pentru dozarea penicilinei V din lichidele de fermentatie.Procainpenicilina

se poate determina in U.V. la 290nm sau la 322nm.Penicilina G se poate

determina in U.V. la 262nm in metanol sau la 322nm dupa prealabila

degradare.

Metodele spectrofotometrice in vizibil desi sunt rapide si simple,nu

prezinta o selectivitate suficienta,reactia de culoare angajand doar o anumita

grupare a moleculei ceea ce face ca produsii de descompunere sa interfereze.

Dozarea penicilinelor ca acid hidroxamic

Reactivi necesari:

►solutie de hidroxilamina.Se dizolva 6,95g de clorhidrat de hidroxilamina

crist.in 40 mL apa,se aduce pH-ul la 6 cu NaOH N(circa 50 mL) si se

completeaza volumul la 100mL cu apa.

►Acid acetic 50%(v/v).

►Alcool izobutilic.

29

►Solutie alaun feriamoniacal.Se dizolva 6,98g alaun feriamoniacal in

100mL apa la balon cotat.

►Solutie de referinta.Se cantareste exact 0,05000g penicilina G sare de

potasiu si se dizolva in 100mL apa la balon cotat.

Mod de lucru:

Pentru construirea unei curbe etalon de extinctie se pipeteaza in 5

palnii de separare de 50mL:0,5mL; 1mL; 2mL; 4mL si 6mL solutie de

referinta.Volumele se aduc la 10 mL cu apa.Se adauga in fiecare palnie cate

1mL solutie de hidroxilamina,se agita si se lasa 10min in repaus.Se

aciduleaza fiecare proba cu acid acetic pana la pH=3,5-5,se adauga 1mL

solutie alaun feric si imediat alcool izobutilic ca dupa saturarea fazei apoase

sa mai ramana un exces de cca. 4 mL.Se agita 30 s,se aduc fazele apoase in

alta palnie de separare si se mai extrag de 2 ori cu cate 2mL de alcool

izobutilic.Solutiile alcoolice se reunesc intr-un balon cotat de 10mL ce se

completeaza cu alcool izobutilic pana la semn.Extinctiile se citesc la

500nm,fata de alcoolul izobutilic ca martor.

Pentru dozare se aduc intr-o palnie de separare cca.10mL solutie,care

sa contina aprox.2mg penicilina.Se lucreaza mai departe in modul cum s-a

aratat la construirea curbei etalon de extinctie.Din extinctia citita se

calculeaza cantitatea de penicilina din proba analizata.In cazul lichidelor de

fermentatie acestea trebuie in prealabil,neutralizate.

Pentru dozarea penicilinelor de semisinteza se pot folosi metodele

generale care se adreseaza grupului comun tuturor penicilinelor sau metoda

30

spectrofotometrica in U.V.Ultima metoda recomandata de Herriot,Stock si

Holbrook este specifica,sensibila si expeditiva si se bazeaza pe faptul ca

molecula penicilinei,incalzita in anumite conditii de pH,de temperatura si de

timp formeaza un produs de degradare stabil,cu maximum de absorbtie la

322nm.Produsul format este acidul penicilenic si prezenta urmelor de cupru

este necesara pentru a obtine rezultate reproductibile.

Aiteanu a studiat comportarea in U.V. a penicilinelor semisintetice in

diferiti solventi,stabilind conditiile de lucru care au fost adoptate si de

F.R.VIII.

Conditii pentru dozarea spectrofotometrica a penicilinelor semisintetice

Denumirea Solventul Concentratia Λ(nm) Extinctie specifica

Ampicilina Tampon fosfatPH=7

50mg/100mL 268 5,50

Meticilina Apa 10mg/100mL 280 57,50

OxacilinaTampon fosfatPH=5,4(30 min la 70°)

100mg/100mL 340 2,50

ColxacilinaTampon fosfatPH=4,6(30 min la 70º

100mg/100mL 340 4,95

II.CEFALOSPORINE

Cefalosporinele si penicilinele au in comun nucleul -

lactamic.Nucleul tipic cefalosporinelor este acidul 7-amino-cefalosporinic

care este la fel de putin activ ca si acidul 6-aminopenicilanic.

31

Principalul antibiotic extras din culturile de Cephalosporium

acremorium este cefalosporina C.Molecula cefalosporinei C este formata

dintr-un nucleu cu structura -lactamdihidrotiazinica si doua catene laterale.

Cefalotina este sarea de sodiu a acidului 7-(tiofen-2-acetamido)-

cefalosporinic.Farmacopeea Statelor Unite ed.XVIII(1970) prevede

determinarea absorbtiei solutiei 0,0025% intre 220 si 310nm,comparativ cu

o substanta de referinta.

Cefaloridina este betaina acidului 7-[(2-tienil)-acetamido]-3-(-piridil-

metil)-3-cefam-4-carboxilic.Farmacopeea Engleza 1968 prevede

determinatrea absorbtiei solutiei 0,002% la 240nm,cu o absorbtie cuprinsa

intre 0,72 si 0,79.

Cefalexina este acidul 7-(D--amino--fenilacetamido)-3-metil-3-

cefem-4-carboxilic.Firmele producatoare prevad determinarea continutului

in substanta activa din capsule,dupa extractie in acid clorhidric si diluare cu

solutie tampon acetat pH=4,5 la 262nm fata de solutia tampon.Extinctia

specifica la 262nm este 232.

Datorita sistemului ciclic condensat si gruparii cromofore O=CN

C=C,a fost utilizat,pentru unele cefalosporine,in special,la identificare,

spectrul de absorbtie in U.V.

Din studiul spectrului de absorbtie al Cefalotinei,in diferite conditii de

solvent,temperatura si pH,a rezultat ca aceasta are in solutie apoasa,un

spectru bine conturat,cu un maxim la 237nm,un minim la 212nm si o

inflexiune la 260-270nm.Maximul de absorbtie la 237nm se datoreaza

gruparii tienil.

32

III.AMINOGLICOZIDE

a.Streptomicina

Streptomicina a fost izolata pentru prima data in anul 1944.Pentru

obtinerea streptomicinei se utilizeaza tulpini de Streptomyces

griseus,Actinomyces globisporus streptomycini.

Streptomicina poate fi dozata in U.V. la 322nm prin masurarea

absorbtiei maltolului care se formeaza cantitativ la hidroliza alcalina.

Dihidrostreptomicina poate fi dozata in prezenta streptomicinei folosind

diferenta absorbtiilor la 265nm si 280nm dupa prealabila hidroliza acida.

In cazul metodelor spectrofotometrice in vizibil se folosesc reactiile

de culoare pe care le dau componentele moleculei.Pentru streptidina se

folosesc reactiile de culoare caracteristice gruparii guanidice:cu -naftol si

hipobromit sau hipoclorit alcalin ;cu -naftol si diacetil inainte sau dupa

prealabila separare prin cromatografie pe hartie ;cu nitroprusiat de sodiu sau

de amoniu.

Metodele spectrofotometrice in vizibil se adreseaza numai unei

anumite componente a moleculei.Aceste metode sunt destul de sensibile si

nu sunt nici specifice.De obicei,se foloseste metoda de dozare a maltolului

recomandata pentru dozarea urmelor de streptomicina din dihidrostreptomi

cina,combinata cu o metoda de dozare a streptidinei.

Dozarea streptomicinei prin metoda maltolului

33

Reactivi:

►reactiv Folin-Ciocaltau;

►Hidroxid de sodiu 5N;

►Acid sulfuric 5N;

►Solutie clorura ferica (FeCl3*6H2O)2% in acid clorhidric;

►Solutie carbonat de sodiu 20%l;

►Sulfat de amoniu;

►Solutie de referinta.Se dizolva 0,06250g sulfat de streptomicina in 50 mL

la balon cotat.

Mod de lucru:

Pentru realizarea curbei etalon se pipeteaza in 5 eprubete urmatoarele

cantitati:0,5mL; 1mL; 1,5mL; 2mL; 2,5mL solutie de referinta.Volumele se

aduc la 4mL cu apa.Se pipeteaza in fiecare eprubeta 1mL NaOH 5N si se

incalzesc eprubetele 3min intr-o baie de apa fierbinte.Dupa racire se aduc

solutiile cantitativ,pe rand,cu 2 mL acid sulfuric in aparatul de distilare,se

adauga 1g sulfat de amoniu si se antreneaza maltolul cu vapori de

apa,prinzandu-se 10mL distilat intr-un cilindru gradat.Se adauga 1mL

solutie clorura ferica,se agita si apoi se citeste extinctia la 550nm,fata de un

martor pregatit prin amestecarea a 10mL apa cu 1mL solutie clorura

ferica.Cu extinctiile citite se realizeaza curba etalon de extinctie.

Pentru dozarea unei probe se pregateste o solutie care sa contina

aprox.1mg/mL streptomicina baza.Intr-o eprubeta se pipeteaza 2mL din

aceasta solutie,se completeaza volumul la 4mL cu apa si se lucreaza mai

departe exact ca la realizarea curbei etalon.

34

b.Kanamicina

Kanamicina este produsa de o tulpina a speciei Streptomyces

kanamyceticus.Acest antibiotic este activ in infectiile produse de coci

grampozitivi si gramnegativi.

Kanamicina este constituita din 2 amino-zaharuri ce sunt legate

glicozidic de un derivat al 1,3-diaminociclohexanului,denumit 2-

dezoxistrep tamina.

Este solubila in apa;datorita insusirilor sale bazice formeaza saruri iar

dintre acestea sulfatul fiind cel mai des folosit.

Kanamicina poate fi dozata spectrofotometric in U.V. la 277nm,

masurand absorbtia furfurolului care se formeaza prin hidroliza acida a

produsului.Kanamicina se poate doza si spectrofotometric in vizibil,folosind

reactia de culoare cu antrona,caracteristica hidratilor de carbon sau cu 1,2-

naftochinon-4-sulfonatul de sodiu.

Dozarea kanamicinei cu antrona

Reactivi necesari:

►Reactiv cu antrona.Se dizolva 0,200g antrona intr-un amestec format din

5mL apa si 100mL acid sulfuric.

►Solutie de referinta.Solutie apoasa de kanamicina cu un continut de 160

U.I./mL.

Mod de lucru:

35

Pentru realizarea curbei etalon de extinctie se pipeteaza in 6 eprubete

urmatoarele cantitati:0,1mL; 0,2mL; 0,4mL; 0,6mL; 0,8mL; 1mL solutie de

referinta.Aceste volume se aduc la 2mL cu apa.Separat se pipeteaza intr-o

eprubeta 2mL apa(proba martor).Se adauga in fiecare eprubeta cate 4mL

reactiv cu antrona,se incalzesc 20min intr-o baie de apa in fierbere si se

citesc extinctiile probelor,dupa racire,la 575nm fata de martor.Cu extinctiile

citite se construieste curba etalon de extinctie.

Pentru dozarea unei probe de kanamicina,se prepara o solutie apoasa

care sa contina aprox.100 U.I./mL.Se pipeteaza intr-o eprubeta 1mL solutie

si se lucreaza mai departe exact ca la realizarea curbei etalon de extinctie.

IV.CLORAMFENICOL

Cloramfenicolul a fost izolat in anul 1947 din lichidele de fermentatie

provenite de la Streptomyces venezuelae.Este activ fata de bacilii

gramnegativi,coci grampozitivi si gramnegativi,ricketsii.

Cloramfenicolul si esterii sai prezinta spectre de absorbtie

caracteristice in U.V.Sferuzza indica o metoda spectrofotometrica in U.V. de

dozare a cloramfenicolului in prezenta esterilor sai dupa separare prin

C.H.Lorenz indica metode pentru dozarea spectrofotometrica in U.V. a

cloramfenicolului si pentru dozarea cloramfenicolului in prezenta

sulfamidelor.Literatura recomanda metode in U.V. pentru dozarea

cloramfenicolului in amestec cu hidrocortizon,cu tetraciclina.

Unele farmacopee au adoptat spectrofotometria in U.V. pentru

dozarea cloramfenicolului si a esterilor sai sau pentru controlul puritatii.

36

In ceea ce priveste metodele spectrofotometrice in vizibil,cea mai

mare parte se bazeaza pe reactiile de culoare ale gruparii amino,dupa

prealabila reducere cu clorura stanoasa,zinc pulbere,clorura de titan.Ca agent

de cuplare se foloseste diclorhidratul de N-(1-naftil)-etilendiamina.

Dozarea cloramfenicolului din supozitoare:dupa dizolvarea excipientului

gras cu eter de petrol sau benzen saturat cu cloramfenicol,reziduul insolubil

in acesti solventi,constituit din cloramfenicol,se dizolva in alcool etilic si se

spectrofotometreaza dupa diluare la =278nm in cuve de 1cm fata de solvent

(extinctia specifica=298).

V.TETRACICLINE

Tetraciclinele sunt antibiotice cu spectru bacterian.Aureomicina sau

clortetraciclina a fost primul antibiotic din grupa tetraciclinelor izolat in anul

1945 de catre Duggar dintr-o tulpina de Streptomyces aureofaciens.

Tetraciclinele prezinta spectre caracteristice in U.V. Literatura de

specialitate recomanda numeroase metode spectrofotometrice in U.V. pentru

dozarea tetraciclinelor singure sau asociate intre ele cu alti compusi din

medicamente,lichide de fermentatie,furaje,alimente etc.Clortetraciclina din

lichide de fermentatie a fost dozata prin masurarea extinctiilor la 274nm si

370nm,dupa incalzire cu acid sulfuric sau la 262,5nm si 305nm in acid

clorhidric.

Dijkhuis si Griffiths au recomandat spectrofotometria in U.V. si

vizibil pentru dozarea anhidroderivatului si a epimerului

37

tetraciclinei.Oxitetraciclina se poate doza la 353nm,dupa incalzire cu NaOH

0,4N.

Metodele spectrofotometrice in vizibil se impart in mai multe grupe:

metode bazate pe degradarea in mediu acid;

metode bazate pe degradarea in mediu alcalin;

metode bazate pe formare de chelati;

metode conditionate de prezenta gruparii fenolice;

metode conditionate de grupa cetonica;

metode diverse.

38

39