1

Sinteză privind activitatea de cercetare şi obiectivele îndeplinite în cadrul proiectului „Instrumente nanobiotehnologice cu aplicații în medicina moleculară: sinteză, caracterizare şi studii in vitro” la etapa unică an 2014, respectiv etapa nr. 3 (01/06/2014 - 15/12/2014)

PAGINA WEB A PROIECTULUI http://www.usamvcluj.ro/nanopart-cell/

Proiectul de fața și-a propus pentru etapa 3, respectiv lunile 19-25 de derulare, următoarele obiective: O4. Obţinerea-Funcţionalizarea de microstructuri lipidice pentru potenţiale aplicaţii în medicina moleculară (transportul ţintit de medicamente şi metode de diagnostic la nivel molecular); O5. Caracterizarea morfologică şi structurală a microstructurilor sintetizate sau comerciale prin metode de microscopie si spectroscopie (SEM, FTIR, Raman-SERS); S-a reuşit îndeplinirea obiectivelor cu succes. Mai mult decât atât, s-au realizat şi activităţi propuse pentru etapa următoare a proiectului (lunile 29-36), respectiv, parte din studiile in vitro propuse în cadrul O6 - Studii in vitro pe culturi celulare fibroblaste pentru testarea biocompatibilității microsctructurilor obţinute şi a interacţiunii lor cu celulele. Practic, s-au obţinut şi caracterizat două tipuri de microstructuri, respectiv microbule comerciale SonoVue formate dintr-o membrana fosfilipidică şi un interior inert de hexafluorură de sulf şi microcapsule obţinute de noi în laborator, prin încapsularea de nanoparticule de aur în matrice polimerică de alginat de sodiu. Spectre FTIR şi Raman caracteristice microbulelor fosfolipidice sunt prezentate în Figura 1. Spectrele vibrationale FTIR si Raman prezinta trasaturi caracteristice fosfolipidelor. Benzi caracteristice gruparii fosfat apar la 1230-1260 cm-1. Picul cel mai intens de la 1097 cm-1 este datorat interactiunilor, in special tip legaturi de hidrogen care se formeaza intre gruparile fosfat si molecule de apa. Picul de la 841cm-1 este caracteristic tot vibratiilor gruparilor fosfat. Spectrele Raman evidentiaza de asemenea picuri caracteristice gruparilor fosfat la 860 si 1062 cm-1. Picurile din domeniul 1000-1200 cm-1 sunt datorate vibraților de întindere C-C. Vibrațile caracteristice legaturilor C-H din grupările CH2 sunt prezente la 1396 cm-1, iar picul de la 1485 cm-1 este caracteristic vibraților C-H din grupările CH3. Picul situat la 2886 cm-1 este datorat vibraților de întindere C-H. Rezultatele confirma natura fosfolipidica a microsferelor, formate dintr-o parte hidrofila cu resturi fosfat si o parte hidrofoba, respectiv lant hidrocarbonat.

(a) (b)

Figura 1. Spectre FTIR (a) şi Raman (b) caracteristice microsferelor fosfolipidice în formă liofilizată. Spectrele FTIR au fost inregistrate pe domeniul 600-4000 cm-1. S-a folosit spectrometru model Schimadzu IR-Prestige. Spectrele au fost inregistrate cu o rezolutie de 4 cm-1, folosindu-se detectia de tip Attenuated Total Reflectance (ATR). Spectrele Raman au fost inregistrate cu laserul de 633 nm, folosind un instrument model Bruker Raman Senterra. Spectrele au fost înregistrate cu un

2

obiectiv Olympus LUCPlanFLN 40x. Rezoluția spectrala utilizata a fost 8 cm-1, spectrele fiind obtinute din doua coaditii cu timp de integrare de 10 secunde.

În ceea ce priveşte obţinerea microcapsulelor polimerice de alginat de sodiu în care s-au încapsulat nanoparticule de aur, s-a utilizat o metodă de sinteză în doi paşi, după cum urmează:

(1) Sinteza nanoparticulelor de aur Într-o primă etapă, nanoparticulele aur fost sintetizate prin adaugarea de soluţie de citrat 1%, in sarea de aur HAuCl4, la fierbere. După adăugarea citratului, so observă schimbarea culorii soluţiei de la incolor la roşu. Spectroacopia UV-Vis confirmă formarea nanopartculelor prin apariţia unui pic de absorbţie în domeniul vizibil, la 518 nm (Figura 2(a)).

(2) Sinteza microcapsulelor (încapsularea nanoparticulelor de aur în matricea polimerică de alginat) În a doua etapă, pentru realizarea microcapsulelor propriu+zise, s-a utilizat un aparat de incapsulare model Encapsulator Biotech. In acest scop, s-au amestecat solutii de alginat de sodiu 1% si de nanoparticule de aur, sterilizate in prealabil. Amestecul astfel obtinut s-a trecut printr-o duza cu diametrul de 120 µm. Aceasta duza controleaza practic diametrul microcapsulelor obtinute. Microcapsulele sunt colectate intr-o baie de CaCl2 2% unde se pastreaza pentru minim o ora, pentru intarirea membranei. Parametri de lucru folositi pentru incapsulare au fost: frecventa 1020 Hz. Presiunea de 640 bari si potentialul de electrod 1610 V. Sinteza microcapsulelor şi respectiv înglobarea nanoparticulelor de aur în interiorul acestora este confirmată de dispariţia picului de absorbţie în domeniul vizibil caracteristic nanoparticulelor de aur (Figura 2(a)). Acest lucru indică faptul că s-a reuşit încapsularea nanoparticulelor în interiorul matricii polimerice de alginat de sodiu Ca si strutura chimica, alginatul este o polizaharidă, care conţine doi acizi uronici (α-L-guluronic (G) şi β-d-mannuronic (M)) în proporţii diferite şi în secvenţe alternative, după cum se poate observa în Figura 2(c).Cantitatea şi tipul secvenţelor de acizi α-L-guluronic şi β-d-mannuronic influenţează masa molecuară şi proprietăţile fizice ale polimerului. Lanţurile polimerice de alginat sunt biodegradabile si prezintă utilitate în multe domenii, în special în procese cum ar fi încapsularea si formarea de diferite coatinguri.

(a)

(b)

(c) Figura 2. (a) Comparaţie între spectrul UV-Vis caracteristic nanoparticulelor de aur cu un maxim de absorbţie la 518 nm şi spectrul caracteristic nanoparticulelor după încapsulare în care se observă dispariţia picului de absorbţie în domeniul vizibil, fapt care confirmă formarea microcapsulelor; (b) Compartie intre aspectul solutiei coloidale de nanoparticule de aur (stânga) si cel al solutiei care contine nanoparticulele de aur incapsulate in matricea de alginat (dreapta); (c) structura lantului polimeric de alginat. Microcapsulele de aur-alginat au fost caracterizate prin intermediul spectroscopiei FTIR si Raman (Figura 3 (a) şi (b)). Figura 3(a) ilustrează comparativ spectrele FTIR caracteristice unui film de alginat de sodiu şi spectrul caracteristic microcapsulelor de alginat. După cum este de aşteptat, cele două spectre prezintă aceleaşi benzi de vibraţie. Spectrul caracteristic alginatului de sodiu a fost obţinut prin depunerea unei picături de soluţie de alginat pe cristalul de diamant al detectorului ATR urmată de uscare si evaporarea apei. Pentru obţinerea spectrului caracteristic microcapsulelor, s-au centrifugat 2 ml de solutie continand microcapsule, s-a colectat fracţiunea sedimentată şi s-a uscat

3

pentru eliminarea din spectru a picurilor proeminente cauzate de vibraţiile legaturilor O-H din moleculele de apă. Pe lângă benzile de vibraţie de la 3280 şi 2929 cm−1 reprezentând vibraţii de alungire caracteristice grupărilor –OH şi respectiv vibraţii de alungire C–H şi C–O spectrul FTIR al alginatului mai prezintă o regiune de picuri până la 1700 cm-1 (Figura 3(a)). Picurile intense care apar la 1595 şi 1404 cm−1 corespund vibraţiilor simetrice şi asimetrice de alungire caracteristice grupărilor carboxyl COO−. Picurile de la 1296, 1125 şi 1082 cm−1 sunt caracteristice oligozaharidelor, iar picurile de la 1024 şi 945 cm−1 sunt specific vibraţiilor legăturilor C–O ale lanţurilor de zaharide şi indică prezenţa acizilor glucuronic şi mannuronic.

(a)

(b) Figura 3. (a) Spectre FTIR caracteristice alginatului de sodiu si repectiv microcapsulelor oţinute din nanoparticulele de aur şi alginat; (b) spectru Raman caracteristic nanoparticulelor de aur încapsulate în matricea polimerică de alginat de sodiu. Spectrele Raman au fost înregistrate folosind laserul de 532 nm. Studii in vitro pe culturi celulare HFL-1 Scopul final al studiului de faţă este realizarea de studii în vitro pe culturi de fibroblaste din plămân de fetus uman (HFL-1), cu scopul testării biocompatibilătăţii celule-microcapsule şi a interacţiunii dintre cele două. În acest scop, celulele HFL-1 au fost cultivate în mediu F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 1% penicilină/streptomicină, în condiții standard: 37◦C temperatură, 5% concentrație CO2 și 95% umiditatea relativă. După atingerea confluenţei, celulele au fost tripsinizate şi insămânţate în plăci cu 12 de godeuri pentru 24 h în număr de 104 celule/godeu.

Morfologia celulelor HFL-1dupa tratamentul cu microcapsule aur-alginat După 24 h de la însămânțare, celulele HFL-1 au fost tratate cu doua concentratii diferite de microcapsule, urmărindu-se microscopic aspectul şi evoluţia celulelor pe parcusrul a 24 h. Imagini sugestive pentru celulele HFL-1 la 24 h după tratarea cu microcapsulele de aur-alginat sunt ilustrate în Figura 4. Imaginile de microscopie în contrast de fază relevă faptul că morfologia celulelor HFL-1 nu este modificata la 24 h comparativ cu controlul (celule netratate). In cazul tratamentului cu concentratia mai mica de microcapsule (Figura 4(c)) se observa disparitia microcapsulelor dupa 24 h, in timp ce dupa tratamentul cu microcapsule in concentratii mai mari (Figura 4(d)) capsulele sunt vizibile dupa 24 h de la tratament. Disparitia capsulelor dupa 24 h este un aspect deosebit de important, deoarece implica faptul ca acestea ar putea fi folosite pentru transportul tintit de substante bioactive. Practic, capsulele au dimensiuni mai mari decat celulele si nu pot fi inglobate in interiorul lor. Dar spargerea capsulelor dupa ce sunt administrate celulelor duce la eliberarea moleculelor pe care acestea le contin in interior, in cazul de fata nanoparticule de aur, care pot fi inglobate ulterior in celule.

4

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4. Microscopia în contrast de fază pentru (a) microcapsule de aur-alginat, (b) celulele HFL-1, (c) si (d) celule HFL-1 tratate cu doua concentratii diferite de microcapsule de aur-alginat. Pentru vizualizarea nanoparticulelor din interiorul microcapsulelor de alginat, s-a incercat functionalizarea acestora cu o substanta fluorescenta, respectiv rodamina 6G (R6G), urmata de încapsularea după procedura descrisă mai sus. Imagini microscopice ale microcapsulelor cu interior de nanoparticule de aur fucntionalizate cu R6G sunt prezentate in imaginile alaturate. S-au efectuat si teste de viabilitate celulara utilizand microcapsulele de alginat-aur-R6G. Practic, după 24 h de la însămânțare, celulele HFL-1 au fost tratate cu trei concentratii diferite de microcapsule, iar dupa alte 24 h s-au efectuat teste de proliferare celulara.

Proliferarea celulara, respectiv numărul de celule viabile a fost determinată utilizand reactivul 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu bromid (MTT). Această metodă se bazează pe proprietatea celulelor viabile de a reduce reactivul MTT la formazan colorat, care este detectat prin citirea absorbanţei la 550 nm. Rezultatele au fost exprimate ca rată de supraviețuire în raport cu un martor netratat (control). Morfologia celulelor HFL-1 la 24 de ore dupa tratamentul cu microcapsule de alginar-aur-R6G este ilustrata in Figura 5. In afara de tratamentul cu concentratia maxima unde microsferele sunt prezente si dupa 24 h,

5

in celelalte cazuri se observa disparitia microsferelor, ceea ce indica inca o data ca sub anumite concentratii ele se sparg in contact cu mediul celular si pot favoriza eliberarea de substante bioacticve. Mai mult decat atat, tratamentul cu microsfere nu este citotoxic, inregistrandu-se o scadere maxima a viabilitatii celulare de 29% dupa 24 de la tratament cu concentratia cea mai mare de microcapsule.

(a) (b) (c)

(d)

Figura 5. Microscopie în contrast de fază pentru (a) proba control, respectiv celule HFL-1 netratate; (b), (c), (d) celule HFL-1 tratate cu concentratii crescatoare de microcapsule alginar-aur-R6G.

DISEMINARE REZULTATE

Rezultatele obținute până în etapa 3 a proiectului s-au concretizat în elaborarea a trei manuscrise, dintre care două au fost deja submise la revistele Oxidative Medicine and Cellular Longevity (IF=3.363) şi Studia Chemia (IF=0.136), iar al treilea urmează să fie submis la revista Nanoscale Research Letters (IF=2.48).

1. Titlu articol: Chokeberry anthocyanin extract as pancreatic β-cell protectors in two models of induced oxidative stress Autori: Dumitriţa Rugină, Zoriţa Diaconeasa, Cristina Coman, Andrea Bunea, Carmen Socaciu, Adela Pintea

submis la Oxidative Medicine and Cellular Longevity (IF=3.363).

2. Titlu articol: Biosynthesis of Gold Nanoparticles by Allium sativum Autori: Cristina Coman, Olivia-Dumitrita Rugină, Loredana Florina Leopold, Zoriţa Diaconeasa, Pompei Florin Bolfă, Nicolae Leopold, ,Maria Tofană, Carmen Socaciu Submis la Studia Chemia (IF=0.136).

Activitatea de cercetare s-a concretizat si cu participarea simpozioane stiinţifice internaţionale, două cu prezentări orale şi trei prezentări poster. Copii ale rezumatelor sunt ataşate prezentului raport.

1. Prezentare orală invitată International Conference on Small Science (ICSS 2014), 8-11 decembrie 2014, Hong Kong, China

2. Prezentare orală The 13th International Symposium Prospects for the 3rd Millenium Agriculture, 25-27 septembrie 2014, Cluj-Napoca, Romania

3. Poster Advanced Spectroscopies on Biomedical and Nanostructured Systems (Bionanospec), 7-10 septembrie 2014, Cluj-Napoca, Romania

4. Poster International Conference on Raman Spectroscopy (ICORS 2014), 10-15 august 2014, Jena, Germania

5. Poster Surface-Enhanced Spectroscopies (SES 2014), 7-10 august 2014, Chemnitz, Germania 03.12.2014