179

Si OH Si O (CH2)7CH3+ HO-(CH2)7CH3 + HOH

CAPITOLUL 11

Separarea prin cromatografie de lichide (LC) 11.1. Istoric nceputul cromatografiei de lichide este atribuit lui wet (1903), care a reuit pentru prima dat separarea unor compui naturali colorai pe o coloan umplut cu carbonat de calciu, utiliznd o faz mobil alctuit din solveni organici. Dezvoltarea cromatografiei de lichide ca tehnic analitic are loc ceva mai trziu i este legat de necesitatea crescnd de separare a compuilor organici din matrici complexe. In iunie 1941, Societatea Britanic de Biochimie, i inea cea de-a 214-a edin de comunicri, la Institutul Naional de Cercetri Medicale. La aceast ntlnire Martin i Synge, doi tineri chimiti (Martin avea 31 de ani; Synge 26), au prezentat o lucrare despre separarea i determinarea amino-acizilor N-acilai din probe de ln, printr-o nou metod analitic. Acetia au separat acetil-prolina de acetil-leucina, utiliznd o coloan umplut cu silicagel impregnat cu ap (un material foarte polar) i cloroform ca faz mobil. Lua natere astfel cromatografia de partiie, recunoscut apoi ca separare prin cromatografie de lichide n faz normal.[106,107] Exact 10 ani mai trziu, Martin i un alt tnr cercettor (A.James 29 ani) trimiteau spre publicare o lucrare descriind un proces cromatografic n care faza mobil este un gaz.[108,109] Se puneau bazele cromatografiei de partiie gaz-lichid. In anul 1948 Martin i grupul su de cercetare ncep cercetri la Institutul Naional din Londra cu privire la problema separrii cromatografice a acizilor grai, cu caten hidrocarbonat mare. Aplicarea separrii cromatografice n faz normal nu a dat rezultatele dorite, deoarece coeficienii de partiie ai acestor compui erau aproape total n favoarea fazei mobile. Deci retenia i astfel separarea lor pe o coloan polar nu avea loc. Ideea de a schimba rolurile celor dou faze a venit imediat. Astfel au realizat prima faz staionar nepolar prin tratarea kiselgurului cu Si(CH3)2Cl2, care devine total neaderent de ctre solveni polari i hidrofili. In anul urmtor au realizat pentru prima dat separarea acidului lauric (C12) de acidul stearic (C18). Mai trziu, tehnica bazat pe acest principiu avea s fie cunoscut ca separare prin cromatografie de lichide n faz invers, dei pn n 1970 chiar i IUPAC considera aceast tehnic analitic doar de interes istoric. Prin realizarea fazelor staionare chimic legate aceast tehnic ia o mare dezvoltare, n prezent fiind cea mai important tehnic analitic de separare.[110] Contribuiile eseniale ale lui Martin i Synge la dezvoltarea cromatografiei au fost rspltite n anul 1952 prin acordarea Premiului Nobel n Chimie. Prima faz staionar sintetizat este atribuit autorilor Halasz i Sebastian (1969), care au refluxat silicagelul cu 1-octanol, obinnd eterul avnd la baz o structur destul de instabil n prezena apei, caraterizat de legturile Si-O-C: In 1970 Kirkland i DeStefano au ataat lanuri hidrocarbonate la structura silicagelului prin utilizarea reactivilor de derivatizare de tip silanic, obinnd structuri mult mai stabile

180

Si OH Si (CH2)7CH3ClCH3

CH3

Si (CH2)7CH3

CH3

CH3

Si O + HCl+

pe baz de legturi Si-O-Si, ca n exemplul urmtor:

Horvath, Knox, Soczewinski, Snyder, Scott, Kirkland, Guiochon sunt doar cteva nume mari de oameni de tiin care au adus contribuii fundamentale, teoretice sau experimentale, la dezvoltarea cromatografiei de lichide ca tehnic analitic de mare performan. 11.2. Clasificarea separrilor prin cromatografia de lichide Retenia n cromatografia de lichide este un proces complex, care implic interacii ale speciilor din proba injectat att cu faza mobil, ct i cu faza staionar. Cunoaterea mecanismului dup care se desfoar procesul de retenie are ca prim avantaj pentru analist posibilitatea prediciei acestuia i mai ales alegerea acelor condiii experimentale pentru atingerea unor selectiviti maxime ntre analii. Cea mai important clasificare a separrilor LC este bazat pe mecanismul care st la baza separrii, care la rndul su depinde de natura celor faze (staionar i mobil) participante n procesul de separare cromatografic. Cele mai importante clase de separri LC sunt urmtoarele: A) Cromatografia de lichide n faz normal (NP-LC normal-phase liquid chromatography) n care faza staionar este polar, iar faza mobil este alctuit dintr-un solvent nepolar cu un coninut mic de modificator polar. B) Cromatografia de lichide n faz invers (RP-LC reversed-phase liquid chromatography) n care faza staionar este nepolar i hidrofob, iar faza mobil este alctuit dintr-un solvent polar. C) Cromatografia de lichide prin mecanism de schimb ionic (IC ion chromatography), n care faza staionar este un schimbtor de ioni, iar faza mobil este apoas cu un pH controlat. D) Cromatografie de lichide prin mecanism de excludere (sau cromatografie pe gel), n care faza staionar este un gel cu porozitate controlat, iar componenii probei sunt separai n funcie de forma i dimensiunea molecular. E) Cromatografie de lichide bazat pe interacia diferit a compuilor asimetrici cu anumite structuri din faza staionar (numite selectori de chiralitate).

Cele mai importante separri cromatografice se efectueaz n prezent pe o coloan cromatografic, confecionat dintr-un metal. In interiorul coloanei se gsete faza staionar, fixat la capete ntre dou frite. Diametrul i lungimea sunt parametri constructivi, funcie de care coloanele se mpart n mai multe clase, descrise n tabelul urmtor. Cromatografia de lichide planar este o tehnic cu aplicaii din ce n ce mai puin utilizate n practic analitic. Cromatografia pe hrtie sau cromatografia n strat subire n diverse variante (ascendent sau descendent) pot decurge prin unul din mecanismele de mai sus, iar vizualizarea compuilor separai sub forma de spoturi se poate face utiliznd proprietatea de absorbie sau de fluorescen a analiilor separai, cu sau fr reactiv de derivatizare (aa-numita developare). Exist i posibilitatea ca spoturile rezultate s fie izolate i apoi printr-o procedur de extracie cu un solvent adecvat, analitul coninut s fie determinat printr-o tehnic spectrometric.

181

Tabel 11.1. Clasificarea coloanelor n LC n funcie de dimensiuni.[111] Descriere i.d. (mm) d.p. (m) Debit optim faz mobil

Coloane deschise < 0,025 - < 25 nL/min

Coloane nanobore 0,025 0,1 - 25-4000 nL/min

Coloane capilare 0,1 - 1 - 0,4 200 L/min Coloane microbore 1 - 2 3 - 5 0,05 1 mL/min

Coloane narrow-bore 2 - 4 3 - 5 0,3 3 mL/min

Coloane normal-bore 4 - 5 3 - 7 1 10 mL/min

Coloane semi-preparative 5 - 10 5 - 12 5 40 mL/min

Coloane preparative > 10 5 - 20 > 20 mL/min

11.3. Faze mobile n cromatografia de lichide Faza mobil (nepolar) n cromatografia de lichide n faz normal (NP-LC) este alctuit din dou componente principale: a) solventul nepolar, care poate fi unul dintre solvenii: pentan, hexan, ciclohexan; b) modificator polar (ntr-un procent foarte mic): tetrahidrofuran, 2-propanol, acetonitril, eteri, esteri, cloroform, etc.

Acetia pot fi clasificai n solveni slabi (cu putere elutropic mic) i solveni tari (putere elutropic mare, dup cum se poate observa din tabelul 11.2). Faza mobil (polar) n RP-LC este n general alctuit din dou componente principale: componenta apoas i componenta organic. Parametrii fazei mobile care influeneaz retenia n RP-LC sunt urmtorii: Natura modificatorului organic (acetonitril, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, tetrahidrofuran, dioxan, etc); puterea elutropic a modificatorului organic este o msur a capacitii sale de a micora factorul de capacitate (timpul de retenie) al analiilor: cu ct puterea elutropic este mai mare, cu att timpul de retenie va fi mai mic. Coninutul modificatorului organic (% n volume): de regul, cu ct concentraia modificatorului organic este mai mare, cu att timpul de retenie al analiilor este mai mic (prin creterea solubilitii analiilor n faza mobil); pH-ul i componentei apoase din faza mobil influeneaz retenia analiilor cu proprieti acido-bazice; Natura acidului (acizi formic, acetic, trifluoracetic, tricloracetic) sau a tamponului utilizat n componenta apoas (se pot utiliza soluii tampon pe baz de fosfat, borat, acetat, etc, cu amoniac, trietilamina, dar cu pH-ul cuprins ntre 2 i 8); Tria ionic a componentei apoase (care depinde de concentraia unor sruri adugate, sau de concentraia soluiei tampon); Natura i concentraia agenilor de formare de perechi ionice (R4N+; R-SO3-; R-O-SO3-, etc). Solvenii folosii n LC trebuie s fie filtrai (pentru a nu conine particule n suspensie), degazai i de puritate cromatografic. Folosirea unor solveni cu particule solide n suspensie conduce la colmatarea coloanei cromatografice i a sistemului cromatografic. Prezena unor gaze (N2 sau O2) dizolvate n faza mobil poate influena

182

detecia, deoarece dup ieirea din coloana cromatografic fluxul mobil are o presiune mai mic dect n coloan i astfel se pot forma bule gazoase care pot perturba n procesul de detecie.

11.4. Faze staionare n cromatografia de lichide Faz normal

Cea mai important faz staionar n cromatografia de lichide n faz normal este silicagelul (SiO2). Acesta este considerat un adsorbant foarte polar, datorit gruprilor silanol reziduale din matricea sa. De asemenea, Al2O3, ZrO2, sau TiO2 sunt menionate des ca faze staionare polare n NP-LC. Fazele staionare polare legate sunt derivate din silicagel; acestea conin grupri funcionale polare X, precum hidroxil, nitro, cian, sau amino, legate printr-un lan hidrocarbonat scurt R:

Dintre acestea, aminopropil-silicagelul sau dihidroxipropil-silicagelul sunt cele mai utilizate faze staionare legate n separrile LC prin acest mecanism.

Utiliznd tehnica derivatizrii amino-silicagelului cu acidul dodecamolibdofosforic s-au realizat noi faze staionare polare, utilizate n separarea compuilor aromatici. Retenia puternic a compuilor aromatici pe astfel de faze staionare polare se explic prin interacia puternic a orbitalilor din nucleele aromatice cu orbitalii d ai Mo.[112] Faz invers

In cromatografia de lichide n faz invers (RP-LC) fazele staionare sunt hidrofobe. Acestea se pot obine prin modificarea chimic a silicagelului (sau chiar

Si O Si

CH3

CH3

Aminopropil-silicagel

CH2 CH2 CH2

Dihidroxipropil-silicagel

CH2Si O

CH3

CH3Si CH

OH

CH2OH

NH2

Si O SiCH3

CH3

R X

Si OH

O

O

O

Si

Si

Si

O

O

O (CH2)3-NH3

(CH2)3-NH3

(CH2)3-NH3

PMo12O403-+

+

+

183

Si OH + X Si (CH2)17CH3

CH3

CH3

Si Si (CH2)17CH3

CH3

CH3

O

Si OH

Si OH

Si OH

O

O

+ X Si (CH2)17CH3

X

X O

O

Si

Si

Si

O

Si

SiO

O (CH2)17CH3

(CH2)17CH3

(CH2)17CH3

(CH2)17CH3O

Si

O Si

Densitate: 8 1 mol/m2

Densitate: 4,5 mol/m2

pKa = 5-7

Silicagel

aluminei) sau pot fi de natur polimeric. De aceea, aceste faze staionare se mai numesc i faze chimic legate (bonded phases). Principiul de sintez a fazelor chimic legate se bazeaz pe reacia gruprilor silanol reziduale din matricea silicagelului tratat termic cu un agent de silanizare. In figura urmtoare, prin reacia de derivatizare, n una din cele dou modaliti menionate, s-a introdus radicalul hidrocarbonat octadecil legat de matricea silicagelului.[113,114] In funcie de natura radicalului R grefat prin intermediul reactivului de derivatizare de tip silanic se disting urmtoarele faze staionare (redate n ordinea descresctoare a hidrofobicitii lor): -C18H37 (octadecil-silicagel, sau C18); -C8H17 (octil-, sau C8); C6, C4, C2 -C6H5 (fenil-); -C6H4-NO2 (nitrofenil); -(CH2)3-CN(cianopropil).

Fig. 11.1. Modaliti de obinere a fazelor staionare chimic modificate din silicagel, utiliznd reactivi de derivatizare mono-funcionali sau tri-funcionali, i unele caracteristici

ale suprafeei silicagelului nainte i dup derivatizare.

Cu toate acestea, n materialul rezultat dup reacia de silanizare o parte nsemnat a gruprilor silanol rmn intacte. Prezena acestora n compoziia fazei staionare poate influena mecanismul de separare, datorit interaciunilor dipol-dipol sau

184

prin legturi de hidrogen cu grupri similare din moleculele de analit. Derivatizarea complet a acestora conduce la faze staionare complet inertizate (cunoscute n literatura de specialitate ca faze staionare de tip end-capped) i se poate efectua prin utilizare unui reactiv de derivatizare trifuncional, plus aplicarea n final a unei silanizri cu trimetilclorsilan, care datorit volumului su mai mic poate accesa restul de grupri silanol, ecranate steric de gruprile chimic legate deja introduse anterior.

Fazele staionare chimic modificate de tip monolitic, coninnd radicali hidrocarbonai R, se obin prin procese sol-gel. Aceste materiale au un aspect ceramic, caracterizate de o porozitate nalt, iar radicalii R sunt orientai n afara matricei solide. Prepararea unor astfel de materiale de tip ceramic pornete de la reactivul de baz tetrametoxisilan, care prin hidroliz acid (n prezen de HCl) formeaz compui intermediari cu legturi Si-OH, datorat reaciei:[115]

Si(OCH3)4 + n HOH Si(OCH3)4-n(OH)n + n CH3OH In continuare au loc reacii de condensare ce conduc la formarea de legturi siloxanice, iar structura devine tridimensional: Dac alturi de tetrametoxisilan se adaug ntr-un raport molar ales trimetoxialchilsilan; structura tridimensional rezultat va conine radicali hidrocarbonai R legai de atomul de siliciu. Ecuaia reaciei poate fi scris n mod simplificat astfel: La nclzire, molecule de ap i metanol sunt eliminate din porii materialului format. Acesta poate lua forma unei bare care apoi se introduce n coloana cromatografic. Fazele staionare modificate din silicagel au o mare aplicabilitate n cromatografia de lichide, dar prezint i unele inconveniente. Dou dintre inconvenientele cele mai serioase ale acestor faze staionare sunt: - domeniul de pH al componentei apoase utilizate este relativ restrns (2-8); la pH-uri sub 2 are loc hidroliza gruprilor O-Si(CH3)2-R, iar la pH-uri mai mari de 8 are loc dizolvarea silicagelului; - acestea nu pot fi utilizate n separri cromatografice pentru concentraii ale componentei apoase n faza mobil apropiate de 100%. In acest caz lanurile hidrocarbonate legate de structura silicagelului colapseaz, ele neputnd a reveni la conformaia iniial dup utilizarea de faze mobile total sau aproape total apoase (mai mari de 98%). Colapsarea lanurilor hidrocarbonate este similar formrii micelelor, lanurile hidrocarbonate avnd tendina de a micora suprafaa de contact cu mediul apos. In Fig. 11.2 sunt redate tendinele unei suprafee de silicagel chimic modificat cu lanuri

SiOSiSi OH SiOH+ + HOH

Si OCH3 SiOH+ SiOSi + CH3OH

Si OCH3

OCH3

OCH3

CH3O Si OCH3

R

OCH3

CH3O+ Si OR

OOSi

O

O+ (4x + 3y) CH3OHx ( )y

HOH( )

x y

185

hidrocarbonate, n prezena unei faze mobile coninnd un procent semnificativ de modificator organic, comparativ cu o faz mobil cu un coninut apropiat de 100% ap. Fig. 11.2. Conformaii ale lanurilor C18 n prezena unui mediu ap + modificator (solvent) organic

(partea stng) i n prezena unui mediu total apos (partea dreapt). Acest ultim inconvenient s-a putut rezolva prin realizarea de faze staionare chimic modificate, coninnd grupri polare intercalate ntre lanul hidrocarbonat i atomul de siliciu. O astfel de structur este mai flexibil la faze mobile total sau aproape total apoase. Sinteza lor presupune dou etape, una de introducere a gruprii polare, urmat de introducerea radicalului hidrofob R. Dou dintre posibilitile aplicate n obinerea fazelor staionare chimic legate cu grupri polare intercalate sunt prezentate n continuare. Calea de sintez a fazelor staionare legate, cu grupare polar intercalat de tip amidic este urmtoarea:[116] Fig. 11.3. Procedeu de derivatizare a silicagelului pentru obinerea fazelor staionare chimic legate

cu grupare polar amidic intercalat.

OH

OH

OH

OH+ CH3 CH2O Si

CH3

CH3NH2

OH

OH

O

O

Si

CH3

CH3NH2

Si

CH3

CH3NH2

+ R CO

ClOH

OH

O

O

Grupa amidica

Si

CH3

CH3NH CO R

Si

CH3

CH3NH CO R

(silicagel)

O Si

CH3

CH3

O Si

CH3

CH3

O Si

CH3

CH3

Mediu polar (solvent organic / ap) Mediu foarte polar (100% ap)

O SiCH3

CH3

O Si

CH3

CH3

O SiCH3

CH3Lanuri hidrocarbonate de tip C18

186

Rs

puns

det

ecto

r Rs

puns

det

ecto

r

min

min

Calea de sintez a fazelor staionare legate, cu grupare polar intercalat de tip carbamic, este redat mai jos:[116]

Fig. 11.4. Procedeu de derivatizare a silicagelului pentru obinerea fazelor staionare chimic legate cu grupare polar carbamic intercalat.

Introducerea gruprii polare influeneaz procesul de retenie cromatografic. Gruparea polar poate interaciona cu grupri polare din moleculele de analit. In cazul gruprilor polare intercalate de tip amidic sau carbamic, pot interveni interacii - ntre analit i gruparea polar din faza staionar. Astfel, n exemplul redat n Fig. 11.5, ordinea de eluie se poate modifica n cazul perechii de analii trans-stilben i dibenzil la eluia printr-o coloan umplut cu faz staionar C18 cu grupare polar intercalat, comparativ cu una C18 clasic. Spre deosebire de dibenzil, molecula de trans-stilben posed n plus o dubl legtur carbon-carbon, care determin o interacie mai puternic cu legturile din gruprile polare ale fazei staionare. In schimb, n cazul separrii pe o coloan clasic C18, ordinea de eluie este dat de ordinea hidrofobicitii; trans-stilbenul este mai puin hidrofob dect dibenzilul, datorit dublei legturi (vezi Tabelul 2.4), astfel c va elua primul din coloana cromatografic.

Fig. 11.5. Compararea separrii unui amestec de trans-stilben i dibenzil, pe o coloan cu faz staionar C18 (sus) i faz staionar C18 cu grupare polar intercalat (jos).

Condiiile de separare identice pentru cele dou coloane: faza mobil compus din 70% CH3OH i 30% H2O; debit 1 mL/min; 40C; detecie UV 254 nm.[117]

OH

OH

OH

OH+

OH

OH

O

O

Si

CH3

CH3

Si

CH3

CH3

O NH

RO

O NH R

O

Cl Si

CH3

O NH

R

CH3

O

Gruparecarbamica

- HCl

187

Analit

Modificator polar

11.5. Mecanismul de separare LC n faz normal

Cromatografia de lichide n faz normal se aplic de obicei la separarea compuilor organici foarte polari, cum sunt aminoacizii.

Cromatografia lichid-solid (LSC) este de obicei denumit ca o tehnic de separare n faz normal, caracterizat de utilizarea unui adsorbant anorganic sau a unei faze staionare chimic legate cu grupri funcionale polare, iar ca faz mobil neapoas unul sau mai muli solveni organici apolari (n special hexanul) n amestec cu un solvent polar, pn la realizarea unei valori optime a triei solventului din punct de vedere al polaritii. In cadrul acestei separri, pe suprafaa fazei staionare se formeaz un strat de molecule adsorbite ale fazei mobile, cu o compoziie ce depinde de alegerea fazei mobile, care de multe ori nu reflect compoziia acesteia sau modificarea ei n timpul unui proces de separare n gradient de solvent. Retenia unui solut este determinat de balana interaciunilor moleculei de solut cu moleculele fazei mobile i a moleculelor adsorbite pe suprafaa fazei staionare. Pentru acest proces s-au propus pn n prezent dou modele de retenie:[30] a) modelul competiional dezvoltat de Snyder i Soczewinski; b) modelul interaciilor de solvent, propus de Scott i Kucera. In forma cea mai simplificat, modelul competiional presupune c suprafaa ntreag a adsorbantului este acoperit de un monostrat de molecule ale fazei mobile. Retenia are loc prin dislocuirea unui numr de molecule de faz mobil, adsorbite la nivelul centrilor activi ai fazei staionare, echivalente ca volum cu molecula de solut. In urmtoarea etap are loc dislocuirea moleculei de solut adsorbit de ctre molecule ale fazei mobile. O reprezentare schematic a acestui model simplu de explicare a reteniei n NP-LC este redat n figura urmtoare.

Fig. 11.6. Reprezentarea schematic a modelului competiional de retenie n cromatografia de lichide n faz normal.

Conform modelului competiional dat n Fig. 11.6, retenia se bazeaz pe urmtoarele dou procese fizice care au loc la suprafaa fazei staionare:

Si-OH + nS Si-OH(S)n

Si-OH(S)n + A Si-OH(S)n-xA + xS , n care Si-OH reprezint centrul de adsorbie de pe suprafaa adsorbantului (considerat ca fiind gruparea silanol rezidual din structura silicagelului), la care se adsorb n molecule de solvent polar S din faza mobil, iar molecula de analit A va dislocui x dintre moleculele de solvent adsorbite.

188

Pentru ca analitul s elueze din coloana cromatografic este necesar ca acest proces s fie reversibil. De aceea tria interaciei sale cu centrul activ nu trebuie s fie foarte puternic. Dup cum se poate observa, modelul competiional neglijeaz orice interacie ntre molecula de analit i moleculele fazei mobile. Predicia reteniei este redat de relaia simplificat:

)(kklog 21

2

1 = (11.1) reprezint parametrul de trie al fazei mobile (putere elutropic), care semnific energia liber de adsorbie a moleculelor de solut per unitate de suprafa de faz staionar, iar parametrul este specific moleculei de solut (n dependen de volumul molar). In tabelul de mai jos sunt redate valorile parametrului pentru cei mai importani solveni utilizai n mecanismul de faz invers n HPLC.

Tabel 11.2. Valorile parametrului pentru solveni utilizai n NP-LC.[118] pentru

Solvent Silicagel Alumina

n-hexan 0,01 0,01

1-clorbutan 0,20 0,26

cloroform 0,26 0,40

izopropileter 0,34 0,28

acetat de etil 0,38 0,58

tetrahidrofuran 0,44 0,57

acetonitril 0,50 0,65

Modelul bazat pe interacia moleculelor de solut, respectiv a modificatorului polar din faza mobil, presupune formarea a dou straturi adsorbite, ca urmare a interaciilor dipol-dipol. Atunci cnd concentraia modificatorului polar este mic, formarea celui de-al doilea strat de molecule de modificator polar adsorbite, n interacie cu primul strat i cu centrul activ, nu are loc, iar interacia moleculei de solut cu centrul activ devine mai puternic, conducnd la timpi de retenie mari. Dimpotriv, atunci cnd concentraia modificatorului polar crete, are loc formarea celui de-al doilea strat de molecule adsorbite, iar molecula de solut va interaciona mult mai slab cu centrul activ, datorit ecranrii celor dou straturi adsorbite. Ca urmare, timpul de retenie al solutului va fi de data aceasta mai scurt, fiind dat de relaia simplificat:

polar ificatormodr

Ct1 += (11.2)

Aceast relaie este ns valabil pentru un domeniu relativ ngust al concentraiei modificatorului polar din faza mobil.