UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE Grigore T. POPA IAI FACULTATEA DE MEDICIN GENERAL DISCIPLINA DE ANATOMIE

Doctorand

VELICEASA BOGDAN

Coordonator tiinific

Prof. Dr. DOINA LUCIA FRNCU

-2009-

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE Grigore T. POPA IAI FACULTATEA DE MEDICIN GENERAL DISCIPLINA DE ANATOMIE

VELICEASA BOGDAN

MICROANATOMIA OASELOR LUNGII

REMODELAREA OSOASN

OSTEO- I CONDROSARCOAMECoordonator tiinific Prof. Dr. DOINA LUCIA FRNCU

-2009-

CUPRINSUL TEZEI Capitolul 1 Capitolul 2 Scopul i motivaia studiului personal Ontogeneza postnatal a osului3 5 5 11 13 16 16 19 29 35 39 41 41 45 45 46 47 48 53 53 54 56 57 60 61 63 63 66 66 67 67 68

2.1. Morfogeneza oaselor 2.2. Creterea oaselor 2.3. Modelarea i remodelarea osoas

Capitolul 3

Microanatomia osului

3.1. Date generale 3.2. Aspecte mezoscopice 3.3. Aspecte microanatomice 3.4. Vascularizaie 3.5. Inervaie

Capitolul 4

Date generale asupra unor tumori osoase

4.1. Clasificarea tumorilor osoase 4.2. Tumori osteogenice 4.2.1. Osteomul 4.2.2. Osteomul osteoid 4.2.3. Osteoblastomul 4.2.4. Osteosarcomul 4.2. Tumori de origine cartilaginoas 4.2.1. Osteocondromul 4.2.2. Condromul 4.3.3. Condroblastomul 4.3.4. Condrosarcomul

Capitolul 5 Diagnosticul tumorilor osoase (osteo- i condrosarcom)5.1. Diagnosticul clinic 5.2. Diagnosticul imagistic 5.2.1. Examenul radiografic radiografia plan 5.2.2. Computer tomografia axial (C.T.) 5.2.3. Rezonana magnetic nuclear (R.M.N.) 5.2.4. Scintigrafia osoas i P.E.T. 5.2.5. Angiografia 5.3. Diagnosticul anatomopatologic

CONTRIBUII PERSONALE Capitolul 6 Metodologia i materialul utilizat6.1. Studiul anatomic al esutului osos normal 6.1.1. Studiul mezoscopic 6.1.2. Studiul microanatomic 6.2. Studiul anatomoclinic al tumorilor osoase 73 73 73 75 78

-1-

6.2.1. Prelucrarea statistic 6.2.2. Examenul anatomopatologic 6.3. Studiul microscopic cantitativ

CapitoluL 7 Rezultatele i discuiile studiului anatomic7.1. Aspecte mezoscopice 7.2. Aspecte microanatomice

78 79 83 87 87 128 134 134 135 135 145 150 155

Capitolul 8 osoase

Rezultatele i discuiile studiului clinic al tumorilor

8.1. Metode statistice aplicate 8.2. Caracteristici epidemiologice 8.2.1. Lot tumori benigne (Lot B) 8.2.2. Lot condrosarcom (Lot C) 8.2.3. Lot osteosarcom (Lot O) 8.3. Corelaii ntre tipurile de tumori maligne

Capitolul 9 Rezultatele i discuiile studiului paraclinic (imagistic) al tumorilor osoase

157 9.1. Aspecte imagistice ale tumorilor osoase 157 9.2. Remodelarea osoas n vecintatea tumorii aspecte mezoscopice 187

Capitolul 10 Rezultatele i discuiile studiului histopatologic al tumorilor osoase 19210.1. Studiul histopatologic calitativ 10.2. Studiul imunohistochimic 10.3. Studiul histopatologic cantitativ 10.3.1. Stereologia 10.3.1.1. Osteosarcom 10.3.1.1. Condrosarcom 10.3.2. Activitatea proliferativ 10.3.2.1. Osteosarcom 10.3.2.2. Condrosarcom 10.3.3. Neovascularizaia 10.3.3.1. Osteosarcom 10.3.3.2. Condrosarcom 10.4. Remodelarea osoas n vecintatea tumorii aspecte microanatomice 192 196 210 210 210 214 218 218 224 225 225 228 238

238 11.1. Criterii de apreciere a riscului evolutiv 239 11.2. Algoritmul de diagnostic i prognostic al pacienilor cu osteo- i condrosarcom 241 Capitolul 12 Concluziile finale 245 Bibliografie 248

Capitolul 11 Managementul pacienilor cu osteo- i condrosarcom

-2-

CAPITOLUL 1 SCOPUL I MOTIVAIA STUDIULUI PERSONALImensa varietate de tumori umane rezerv neoplasmelor osoase primare un loc aparte datorit incidenei sczute, dar i faptului c cele mai multe din aceste tumori afecteaz copiii i vrsta tnr, sunt deosebit de agresive i cu un prognostic de cele mai multe ori rezervat. Datorit agresivitii i extinderii rapide, att la esuturile nvecinate, ct i la distan, aceste tumori necesit un tratament complex (chirurgical, radio- i chimioterapic) n care sunt implicate mai multe discipline medicale. n cele mai multe cazuri ansele curative sunt minime i se practic rezecii osoase extinse care se soldeaz adesea cu un handicap major al pacientului. Totui, abilitatea medicului curant de a recunoate i diagnostica corect un sarcom de esut osos influeneaz considerabil prognosticul pe termen lung al pacienilor. Evaluarea clinic i histopatologic este o prim etap esenial pentru obinerea unui rezultat chirurgical bun, lipsa unei evaluri corecte naintea aplicrii planului terapeutic explic de ce puini dintre cei diagnosticai cu sarcom beneficiaz de o excizie chirurgical larg, adecvat de la nceput. O serie de variabile histopatologice cum ar fi mrimea tumorii, localizarea, necroza tumoral, pattern-ul de cretere precum i gradul celularitii, pleomorfismul nuclear, activitatea mitotic sau invazia vascular constituie factori ai determinrii gradului de malignitate cu consecine asupra modalitilor de tratament. Pentru pacienii cu sarcoame de grad sczut, unde prognosticul este destul de bun, tratamentul chirurgical este singurul indicat, n timp ce sarcoamele cu grad nalt de malignitate, unde prognosticul este nefavorabil, pot beneficia sau nu de terapie adjuvant, funcie de determinarea unor altor variabile cum ar fi proliferarea, diferenierea, angiogeneza sau procesele apoptotice. Aceste ultime variabile necesit obligatoriu utilizarea testelor imunohistochimice, teste ce trebuie s devin alturi de histopatologia convenional, obligatorii i de rutin n diagnosticul sarcoamelor. -3-

Imunohistochimia, achiziia cea mai important a ultimelor decenii, a evoluat de la o simpl mod la un instrument indispensabil n diagnosticul histopatologic contribuind la exactitatea diagnosticului dar i la evaluarea prognosticului n vederea stabilirii unui tratament adecvat cu repercursiuni asupra rezultatelor pe termen lung. n plus, este cunoscut faptul c neovascularizaia este parte fundamental a procesului de metastazare. Cele mai numeroase studii urmresc legturile dintre angiogenez (numrul microvaselor n tumor) i prezena metastazelor i rata supravieuirii. Consider c, n primul rnd, numai o bun cunoatere i nelegere a modificrilor care apar la nivel celular i, mai ales, ce anume determin aceste modificri, pot duce la un diagnostic precoce i, implicit, la un tratament adecvat i eficient al acestor tumori. Scopul tezei de doctorat este de a reevalua, interpreta i obiectiviza rolul examinrii clinice i al examinrilor paraclinice: imagistice, histopatologice i imunohistochimice n diagnosticul precoce i prognosticul tumorilor osoase (condrosarcom, osteosarcom), cu scopul identificrii unor parametri prognostici semnificativi i stabilirea scorului prognostic final. Am urmrit corelarea datelor obinute prin fiecare din metodele de studiu pentru stabilirea protocolului de explorare i evaluare a pacientului cu osteo- sau condrosarcom, urmat de fundamentarea unui program de depistare precoce a cancerelor cu aceast localizare i evaluarea modificrilor paratumorale pentru predicii terapeutice.

-4-

CAPITOLUL 6 METODOLOGIA I MATERIALUL UTILIZATStudiul a cuprins dou etape principale: studiul anatomic - macroscopic, mezoscopic i microscopic al oaselor lungi, studiul tumorilor osoase ale oaselor lungi i a esutului osos adiacent, care a inclus investigaii clinico-imagistice, histopatologice i imunohistochimice. 6.1. STUDIUL ANATOMIC AL ESUTULUI OSOS NORMAL Pentru aprecierea aspectelor anatomofuncionale ale oaselor lungi s-au folosit 50 de oase lungi ale membrelor de la adult aflate n colecia Disciplinei de Anatomie, UMF Gr. T. Popa Iai sau din colecii particulare. 6.1.1. STUDIUL MEZOSCOPIC Am urmrit aspectul esutului osos compact i spongios al oaselor lungi pe seciuni att la nivelul diafizelor ct i al epifizelor, insistnd asupra orientrii i distribuiei traveelor osoase principale de la nivelul epifizelor. Am msurat unghiurile dintre travee i axa mecanic a osului folosind programul Philips DICOM Viewer, iar valorile obinute le-am transformat ntr-o serie Fourier pentru reprezentare grafic i analiz ulterioar. Seria Fourier a fost constituit prin transformarea Fourier discret a fiecrui punct I(x,y) din imagine n coordonate polare P(d,). Analiza densitii vrfurilor, a funciei polinomiale f() = P(d,), n domeniul Fourier, poate demonstra orientarea traveelor fa de axa mecanic. 6.1.2. STUDIUL MICROANATOMIC Studiul microanatomic s-a realizat pe seciuni efectuate din fragmente de esut osos normal obinute din piese osoase de amputaie, att de la nivelul epifizelor, ct i al diafizelor. Materialul utilizat a fost prelucrat prin tehnica la parafin i coloraii histologice, lamele fiind examinate apoi calitatitiv pentru aspectul de ansamblu. Tehnicile histologice folosite au fost: -5-

Coloraia Hematoxilin-Eozin este o tehnic curent care presupune colorarea succesiv a seciunilor histologice cu un colorant bazic hematoxilina i un colorant acid eozina. Principalii timpi sunt: deparafinare, hidratare, colorare cu Hematoxilin Bohmer, difereniere cu acid clorhidric, colorare cu Eozin, deshidratare n 2 bi de alcool de 95 de grade, clarificare cu benzen i montare n balsam de Canada. Hematoxilina evideniaz structurile bazofile (cromatina nuclear, ribozomii citoplasmatici sau ergastoplasma, unele mucine i granule de secreie) n nuane albastru intens, iar eozina reacioneaz cu substraturile acidofile (citoplasma celulelor mature, unele granule citoplasmatice, fibre colagene, fibre musculare) obinndu-se o coloraie difuz de la roz pal la roz viu rou. Coloraia Szekely prezint urmtorii timpi principali: deparafinare, hidratare, mordansare cu soluie Lugol, albire cu Tiosulfat de sodiu, colorarea nucleilor cu hematoxilin Mayer, colorare cu soluia A (amestec special de fuxin acid, orange,acid acetic), cltire cu ap acetifiat, colorare cu soluia B (amestec de verde de limun, acid fosfomilibdenic, acid acetic), deshidratare, clarifiere n benzen i montare n balsam de Canada. Nucleii apar colorai n rou nchis sau maron, nucleolii n negru, citoplasmele n roz-violaceu, eritrocitele n rou portocaliu, fibrele n verde, fibrele musculare n rou-brun. Coloraia Van Gieson folosete hematoxilin Weigert i picrofuxin. Nucleii se coloreaz n negru (hematoxilin Weigert), citoplasma galben (acid picric), fibrele colagene rou intens (fuxin acid), membrana bazal i substana fundamental roz, mucusul glbui sau rou deschis, muchiul i hematiile n galben. 6.2. STUDIUL OSOASE ANATOMO-CLINIC AL TUMORILOR

Cercetrile personale au avut ca baz cazurile de osteo- i condrosarcoame diagnosticate n seciile de Ortopedie-Traumatologie ale Spitalului Clinic de Urgene Sf. Ioan (conf. dr. Ovidiu Alexa), Iai i Spitalului Clinic de Recuperare (prof. dr. Paul Botez), Iai, n perioada 1995-2008. n aceast perioad au fost diagnosticate i tratate 237 de tumori osoase osteogene i de origine cartilaginoas, -6-

din care 77 au fost tumori maligne: 46 de osteosarcoame i 31 de condrosarcoame, toate cazurile beneficiind de diagnostic anatomopatologic n serviciul de specialitate al spitalelor de mai sus (prof. dr. Doina Rdulescu i dr. Alice Chirana). Realizarea studiul retrospectiv al tumorilor osoase a avut ca baz de date registrele de histopatologie cu reinerea principalelor date clinice (vrst, sex, data diagnosticului, sediul anatomic al tumorii, diagnosticul la internare, recidivele locale i la distan) i a aspectelor anatomopatologice macroscopia, microscopia i diagnosticul definitiv al diferitelor tipuri de sarcoame. 6.2.1. PRELUCRAREA STATISTIC Pentru stabilirea unei corelaii statistico-clinice a cazurilor luate n studiu am folosit mai multe metode de prelucrare statistic ca: eantionare, testul 2, testul t-Student, tendina. Datele obinute au fost apoi ncrcate i prelucrate cu ajutorul funciilor statistice din programele EPIINFO i SPSS. 6.2.2. EXAMENUL ANATOMOPATOLOGIC S-a efectuat n serviciul de anatomie-patologic a celor dou spitale menionate, descrierea macroscopic i microscopic fiind consemnate n registrul de histopatologie, date ce au constituit baza de pornire a cercetrilor personale. Datele de macroscopie au evideniat pentru piesele de rezecie sau amputaie: localizarea tumorii i raporturile cu esuturile nconjurtoare, dimensiunile tumorii, culoarea, consistena i aspectul macroscopic al tumorii; prezena sau nu a zonelor necrotice i/sau hemoragice. Datele de microscopie -am urmrit tipul histopatologic, gradul de difereniere, nivelul invaziei precum i prezena sau absena metastazelor ganglionare. Pentru diagnosticul histopatologic clasic au fost utilizate coloraia standard (hematoxilin-eozin), dar i coloraii speciale pentru diferitele componente celulare i tisulare (van Gieson, Szekely), tehnici care au fost descrise mai sus. Pe lng aceste tehnici, pentru diagnosticul definitiv al sarcoamelor osoase, dar n special pentru evaluarea prognosticului s-au folosit i teste imunohistochimice care vor fi detaliate n cele ce urmeaz. -7-

Imunohistochimia este o metod calitativ valoroas care permite o analiz structural i fenotipic. Ea utilizeaz criteriul molecular n diagnosticul histopatologic oferind date privind diferenierea, histogeneza i progresia tumoral. Cercetrile imunohistochimice au fost efectuate n vederea evidenierii att a unor markeri structurali (vimentin, S100) ct i a unor markeri de prognostic (Ki67, proteina p53). n plus s-a evaluat angiogeneza cu ajutorul anticorpului CD-34 i reacia de aprare cu CD-45RO ce recunoate limfocitul T (tabel I). Studiul imunohistochimic a fost efectuat pe un lot de 20 de sarcoame, ce a inclus tipul clasic conform gradingului histopatologic internaional, pentru fiecare din cele dou tumori osoase studiate. Blocurile de parafin a celor 20 de sarcoame au fost prelucrate la Laboratorul de Imunologie i Genetic (Prof. Dr. Eugen Carasievici i dr. Laurette Cozma) i la Laboratorul de Anatomie Patologic i Prosectur al Spitalului Militar Clinic de Urgen Dr. Iacob Czihac, Iai (dr. Luminia Ivan).Tabel. I. Caracteristicile markerilor utilizai. ANTIGENUL Vimentina S100 Ki67 Proteina p53 CD-34 CD-45 RO SPECIFICITATE Celule mezenchimale Unele celule epiteliale Celule dendritice Structuri condroide Factor de proliferare Reglator al ciclului celular i al apoptozei Endoteliu vascular Elemente limfocitare ANTICORPUL Mouse anti-Cow Clona Vim 3 B4 Isotype: IgG2a Mouse anti-Human Clona 15E2E2 Isotype: IgG2a Mouse anti-Human Clona MIB-1 Mouse ani-Human Clona DO-7 Isotype: IgG2b Mouse anti-Human Clona QBEND/10 Isotype: Ms IgG1 Mouse anti-Human Clona UCHL1 Isotype: IgG2a PATTERN Citoplasmatic Citoplasmatic Nuclear Nuclear Nuclear Elemente vasculare Limfocite T

-8-

Ca i principii generale, reaciile imunohistochimice (IHC) se bazeaz pe legtura antigen tisular anticorp, acesta din urm fiind evideniat prin conjugare direct cu molecule trasoare (reacie direct) sau prin intermediul unui lan de alte legturi cu anticorpi liberi sau marcai (reacie indirect cu dou sau mai multe faze). Ca tehnic s-a utilizat metoda IHC tristadial indirect ABC (avidin - biotin complex), o metod n trei faze cu avidin i biotin peroxidat. 6.3. STUDIUL MICROANATOMIC CANTITATIV Msurtorile cantitative s-au fcut n Laboratorul de Microanatomie Cantitativ a Institutului de Anatomie Ion Iancu din cadrul U.M.F. Gr. T. Popa Iai, pe seciunile microscopice reprezentative, cu obiectiv 20x, 40x sau 90x. Imaginile au fost preluate de la microscop cu ajutorul unui sistem de achiziie a imaginilor (camer video conectat unui PC), dup care s-a aplicat programul profesional PRODIT 5.2. Acest program digital interactiv a permis efectuarea a numeroase msurtori prin alegerea din meniu a metodei cantitative dorite, rezultatele calculndu-se automat. S-au utilizat diferite opiuni: 1. STEREOLOGIA Aceast metod combin puncte-test cu linii-test n interiorul unei suprafee standard i permite estimarea volumelor procentuale ale structurilor componente ale tumorii (celule tumorale, stroma, vase sanguine). Se utilizeaz suprapunerea digital a grilei standard peste imaginea video achiziionat de pe lama histologic. Grila a fost adaptat de ctre observator parametrilor esutului de studiat pentru a se ndeplini condiiile optime de cuantificare. Etapele principale ale msurtorii sunt: determinarea structurilor de referin din tumor: celulele tumorale, stroma sau matricea tumorii, format din celule mononucleate rotunde sau ovalate i fibre conjunctive, vasele sanghine, alte structuri (de ex. necroze, os/cartilaj, hemoragii n osteosarcom), -9-

definirea grilei geometrice Weibel suprapus pe imaginea microscopic, definirea caracteristicilor specifice tumorii, stabilirea numrului total de puncte care trebuie numrate i contorizarea lor prin apsarea tastelor corespunztoare interseciilor cu structurile de referin, calcularea automat a raportului stereologic, evaluarea statistic a parametrilor calculai, reprezentarea grafic a modificrilor constatate, formularea concluziilor. 2. ACTIVITATEA PROLIFERATIV Aprecierea activitii proliferative s-a fcut pe 30 cmpuri consecutive utiliznd un ocular 10x, un obiectiv 40x cu apertura numeric 0.75 i un cmp rectangular cu diametrul de 450 m i suprafaa de 0.202500 mm2. S-au cuantificat: indexul activitii mitotice (MAI) care reprezint numrul total de figuri mitotice numrate pe 10 cmpuri (hpf highpower field), densitatea mitotic care reprezint numrul de mitoze/mm2, rata mitozei care apreciaz valoarea procentual a mitozelor cuantificate la 150 nuclei tumorali, pe un cmp circular cu suprafaa de 0,159043 mm2. 3. DENSITATEA MICROVASCULAR Densitatea microvascular a fost cuantificat cu magnificaia 20x, n aria cu cea mai activ angiogenez, evalund sensibilitatea i specificitatea la markerul endotelial (CD34). Vasele sunt prezente n esutul conjunctiv stromal al tumorii. Nu s-a observat nici o reacie cu celulele tumorale. Raportul cuantificrii a calculat automat: densitatea microvaselor/mm2 de strom tumoral, densitatea microvaselor/mm2 de tumor.

- 10 -

CAPITOLUL 7 REZULTATELE I DISCUIILE STUDIULUI ANATOMIC AL OSULUI NORMAL7.1. ASPECTE MEZOSCOPICE n studiu s-a urmrit aspectul exterior i interior al oaselor lungi pe seciuni longitudinale i transversale. Urmrind aspectul macroscopic al substanei osoase de la nivelul epifizelor se observ dou tipuri de travee: longitudinale sau principale i transversale sau secundare. n 1955 Dempster afirma c traveele osoase de la acest nivel sunt orientate n principal dup liniile de for i n special cele de la nivelul membrelor inferioare care preiau greutatea corpului. El a reprezentat sistemul osteoarticular sub forma unui sistem de prghii, de uniti funcionale ce se pot mobiliza una n raport cu alta. Astfel, din punct de vedere mecanic, la nivelul fiecrui os se pot descrie dou axe: mecanic i longitudinal (fig. 1).

B

D

Fig. 1. Reprezentarea schematic a corpului sub forma unui sistem de prghii (A). Dispunerea axei mecanice (rou) i a axei longitudinale (albastru) la nivelul humerusului (B), femurului (C), oaselor antebraului (D) i gambei (E).

A

E C

Pornind de la aceast reprezentare schematic am urmrit dispunerea traveelor la nivelul epifizelor oaselor lungi luate n studiu pe seciuni frontale sau sagitale i pe imagini radiologice ale acelorai seciuni osoase. - 11 -

n unele cazuri am msurat i deviaia, n grade, a traveelor osoase raportat la axa mecanic a osului respectiv.Pentru analiz, aceste valori au fost incluse ntr-o serie Fourier. Cele dou axe, mecanic i longitudinal, sunt complet diferite ca direcie la nivelul epifizei proximale a femurului i tind s se apropie la nivelul epifizei distale (fig. 1 C). La nivelul epifizei proximale a femurului traveele prezint o dispoziie particular, fiind orientate vertico-radiar n partea superioar a gtului i orizonto-radiar n partea inferioar. Poriunea axial a epifizei are aspect mai uniform, fiind alctuit din lame osoase i areole distribuite aleator, fr orientare regulat, poriunea nonaxial creeaz benzi de travee osoase care asigur preluarea i distribuia stresului pentru evitarea leziunilor, descriindu-se dou tipuri principale de trabecule de stress: trabeculele de tensiune i trabeculele de compresie (fig. 2A). La nivelul epifizei distale a femurului traveele osoase sunt orientate n principal n lungul axului diafizar (fig. 2B). Am trasat axa mecanic a osului i am msurat deviaia traveelor osoase principale n raport cu aceasta (fig. 3). La nivelul epifizei distale femurale, de partea lateral, unghiul traveelor fa de axa mecanic a variat n intervalul 1,2 - 5,5, cu o medie de 3,19 i 1,35 abaterea standard. Intervalul de ncredere (IC 95%) a fost 1,84 - 4,54, ceea ce evideniaz n acest caz domeniul Fourier n intervalul 1 - 5. De remarcat c lim e f() tinde la 5 ceea ce demonstreaz paralelismul traveelor n acest domeniu, cu o nclinaie de cel mult 5 fa de axa mecanic.

A B Fig. 2. Seciune frontal la nivelul epifizei proximale femurale (A) i la nivelul epifizei distale femurale (B) n care se poate observa aspectul i direcia traveelor osoase.

- 12 -

A Fig. 3. Seciune frontal la nivelul epifizei distale femurale i orientarea traveelor osoase (n grade) funcie de axa mecanic.

n zona medial, unghiurile au variat n intervalul 1,8 3,9 cu o medie de 2,65 0,65, domeniul Fourier stabilindu-se n intervalul 2 - 4. Prin simetrie fa de axa mecanic, pe aceast parte a domeniului se aplic funcia lim ln f() care tinde la 2, ceea ce demonstreaz c i pe partea medial a femurului distal traveele sunt paralele, cu o nclinaie fa de axa mecanic de cel puin 2. La nivelul epifizei distale femurale, punctele de pe suprafaa articular n care s-au ales traveele perpendiculare fiind aleatorii, domeniul Fourier se poate uor lrgi, concluzionnd c pentru femurul distal traveele sunt paralele fa de axa mecanic, cu o nclinaie de 2 - 5 (fig. 4). Coroborate rezultatele obinute n urma analizei Fourier evideniaz: paralelismul traveelor, cu un unghi de nclinaie fa de axa mecanic ce variaz ntre 2 i 7; pe partea lateral a esutului analizat unghiurile dintre travee i axa mecanic sunt uor mai mari comparativ cu partea medial; reprezentarea grafic a celor dou funcii lim e f() i lim ln f() urmrete conturul suprafeei articulare, a celor doi condili, demonstrnd perpendicularitatea traveelor pe aceasta. La nivelul oaselor gambei cele dou axe, mecanic i longitudinal coincid sau sunt paralele (fig. 1E). La nivelul epifizei proximale a tibiei am observat c direcia traveelor osoase tinde s se deprteze de axa mecanic pe msur ce se deprteaz de centrul epifizei tinznd s urmeze forma suprafeei articulare. Astfel putem descrie trei zone: central situat imediat sub poriunea intercondilian (A); lateral (B) i medial (C). Am trasat axa mecanic a osului i am msurat deviaia traveelor osoase principale n raport cu aceasta (fig. 5). - 13 -

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 20 15 10 Medial 5 0

A X A M E C A N I C

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 Lateral 15 20

Fig. 4. Histograma filtrat a distribuiei unghiurilor traveelor osoase la nivelul epifizei distale femurale fa de axa mecanic. Seria Fourier pentru epifiza distal femural.

C

A

B

Fig. 5. Seciune frontal la nivelul epifizei proximale tibiale i mprirea acesteia n cele trei zone funcie de orientarea traveelor: zon intercondilian (A), condilian lateral (B) i zon condilian medial (C).

n funcie de forma osului, unghiul traveelor fa de axa mecanic a fost calculat n cele trei zone: lateral, median, medial. Coroborate rezultatele obinute n urma analizei Fourier evideniaz urmtoarele aspecte (fig. 6): paralelismul traveelor mediane, cu un unghi de nclinaie fa de axa mecanic ce variaz ntre 8 i 10; divergena traveelor perpendiculare pe suprafeele articulare cu o nclinaie fa de axa mecanic variind n domeniul 10-25; urmnd suprafaa articular, pe partea lateral a esutului analizat unghiurile dintre travee i axa mecanic sunt mai mari comparativ cu partea medial. Reprezentarea grafic a celor dou funcii lim e f() i lim ln f() urmrete conturul suprafeei articulare, a celor doi condili, demonstrnd perpendicularitatea traveelor pe aceasta. - 14 -

30 25 20 15 10 5 0 30 20 Medial 10 0

A X A M E C A N I C

30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 Lateral 15 20 25

Fig. 6. Histograma filtrat a distribuiei unghiurilor traveelor osoase la nivelul epifizei proximale tibiale fa de axa mecanic. Seria Fourier pentru epifiza proximal tibial.

Mezoscopic, la nivelul epifizei distale tibiale am observat o dispunere a traveelor osoase principale mai mult n lungul axei mecanice. Am trasat axa mecanic a osului i am msurat deviaia traveelor osoase principale n raport cu aceasta (fig. 7).

A Fig. 7. Seciune frontal la nivelul epifizei distale tibiale i orientarea traveelor osoase (n grade) funcie de axa mecanic (A).

Coroborate rezultatele obinute n urma analizei Fourier evideniaz urmtoarele aspecte: paralelismul traveelor, cu un unghi de nclinaie fa de axa mecanic ce variaz ntre 2,3 i 3; urmnd suprafaa articular, pe partea lateral a esutului analizat unghiurile dintre travee i axa mecanic sunt puin mai mici comparativ cu partea medial, reprezentarea grafic a funciei liniare urmrete conturul suprafeei articulare demonstrnd perpendicularitatea traveelor pe aceasta(fig. 8). Urmnd aceeai pai, att mezoscopic, ct i din analiza Fourier a valorilor unghiurilor msurate se observ paralelismul - 15 -

traveelor osoase ale celor dou epifize fibulare, proximal i distal, fa de axa mecanic.10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 20 15 10 Medial 5 0

A X A M E C A N I C

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 Lateral 15 20

Fig. 8. Histograma filtrat a distribuiei unghiurilor traveelor osoase la nivelul epifizei distale tibiale fa de axa mecanic. Seria Fourier pentru epifiza tibial distal.

La nivelul humerusului, cele dou axe, mecanic i longitudinal, nu coincid i tind s se apropie la nivelul epifizei distale (fig. 1B). La nivelul epifizei proximale humerale cele dou axe sunt deviate, mezoscopic se observ o dispunere particular a traveelor osoase la cest nivel. Acestea pot fi mprite n (fig. 9A): un grup subcondral cu travee condensate ce sunt perpendiculare pe suprafaa articular (1); un grup corespunztor trohiterului cu travee ce sunt orientate sub aciunea muchilor capei rotatorilor n lungul axului diafizar (2) i un grup metafizo-epifizar, inferior, a crui travee se ntretaie n partea central avnd o dispoziie radiar, n evantai, care pleac de la nivelul corticalei mediale i laterale i se ndreapt spre capul humeral (3). La nivelul epifizei distale humerale, datorit prezenei fosetei olecraniene am mprit-o n raport cu aceasta n trei zone (fig. 9B): superioar, metafito-epifizar (1) cu travee groase care prezint un traiect convergent inferior spre linia median; mijlocie (2) n care se gsete foseta olecranian; inferioar (3) n care traveele longitudinale prezint un traiect n lungul axului diafizar. Am trasat axa mecanic a osului i am msurat deviaia traveelor osoase principale n raport cu aceasta. Coroborate rezultatele obinute n urma analizei Fourier evideniaz urmtoarele aspecte: - 16 -

paralelismul traveelor, cu un unghi de nclinaie fa de axa mecanic ce variaz ntre 2 i 3,2; pe partea lateral a esutului analizat unghiurile dintre travee i axa mecanic sunt uor mai mici comparativ cu partea medial (fig. 10).1 2 3 1 2 3 A B

Fig. 9. Seciune frontal la nivelul epifizei proximale humerale (A) n care se observ dispunerea traveelor osoase n zona subcondral (1), n zona corespunztoare trohiterului (2) i n zona metafizo-epifizar (3) i seciune frontal la nivelul epifizei distale humerale (B) n care se poate observa aspectul i direcia traveelor osoase n cele trei zone.10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 25 20 15 Medial 10 5 0

A X A M E C A N I C

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 Lateral 15 20 25

Fig. 10. Histograma filtrat a distribuiei unghiurilor traveelor osoase la nivelul epifizei distale humerale fa de axa mecanic. Seria Fourier pentru humerus distal.

La nivelul oaselor antebraului cele dou axe, mecanic i longitudinal coincid sau sunt paralele (fig. 7.1D). La nivelul radiusului am observat c la nivelul epifizei proximale traveele sunt mai groase fa de cele de la nivelul epifizei distale unde traveele prezint un aspect mult mai compact. Mezoscopic, pe seciunea efectuat la nivelul epifizei proximale am observat o orientare - 17 -

convergent spre suprafaa articular i spre axa mecanic a traveelor longitudinale (fig. 11A) i o orientare predominat paralel cu axa mecanic la nivelul epifizei distale.(fig. 11B)

Fig. 11. Seciune frontal la nivelul epifizei proximale radiale (A) i la nivelul epifizei distale radiale (B) n care se poate observa aspectul i direcia traveelor osoase. A B

Am trasat axa mecanic i am msurat valorile unghiurilor sub care traveele sunt orientate fa de aceasta. La nivelul epifizei proximale, n urma analizei Fourier, se evideniaz urmtoarele aspecte: convergena traveelor, cu un unghi de nclinaie fa de axa mecanic ce variaz ntre 12 i 15; pe partea lateral a esutului analizat unghiurile dintre travee i axa mecanic sunt uor mai mari comparativ cu partea medial (fig. 12).20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 8 6 4 Medial 2 0

A X A M E C A N I C

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 Lateral 6 8

Fig. 12. Histograma filtrat a distribuiei unghiurilor traveelor osoase la nivelul epifizei proximale radiale fa de axa mecanic. Seria Fourier pentru radius proximal.

n cazul epifizei distale radiale, n urma analizei Fourier, se evideniaz urmtoarele aspecte: paralelismul traveelor, cu un unghi de nclinaie fa de axa mecanic ce variaz ntre 4 i 6; pe partea lateral a esutului analizat unghiurile dintre travee i axa mecanic sunt mai mari comparativ cu partea medial(fig. 13). n ambele - 18 -

cazuri, prin reprezentarea grafic a funciei polinomiale se observ c aceasta urmrete conturul suprafeei articulare demonstrnd perpendicularitatea traveelor pe aceasta.20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 20 15 10 Medial 5 0

A X A M E C A N I C

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 Lateral 15 20

Fig. 13. Histograma filtrat a distribuiei unghiurilor traveelor osoase la nivelul epifizei distale radiale fa de axa mecanic. Seria Fourier pentru radius distal.

La nivelul epifizelor ulnei am observat o arhitectur particular al traveelor osoase dictat, n special n partea superioar de prezena celor dou apofize - olecranian i coronoid. Epifiza proximal ulnar este format dintr-o reea trabecular alctuit din travee longitudinale i transversale de dimensiuni variate far o orientare predominant. n poriunea superioar, la nivelul apofizei olecraniene, traveele prezint o dispoziie mai condensat pentru a oferi o rezisten mai mare la aciunea muchiului triceps brahial (fig. 14A). La nivelul epifizei ulnare distale traveele longitudinale au orientarea preferenial n lungul axului diafizar (fig. 14B).

Fig. 14. Seciune sagital la nivelul epifizei proximale ulnare (A) i la nivelul epifizei distale ulnare (B) n care se poate observa aspectul i direcia traveelor osoase. A B

- 19 -

7.2. ASPECTE MICROANATOMICE Pe seciunile microscopice am urmrit: aspectul sistemelor haversiene rareori ele avnd forma circular descris clasic (fig. 15), canale Volkman de legtur ntre sistemele haversiene (fig. 15A); ntre lamelele speciale (secundare) se observ lacune ocupate de celule osteoprogenitoare (fig. 16A); aspectul n spie de roi ale canaliculelor ce leag lacunele de sistemul haversian; dispunerea lamelelor fundamentale (primare) (fig. 16B).

A

B

Fig. 15. A - seciune microscopic prin esut osos compact n care se observ aspectul i dispunerea sistemelor Haversiene, coloraie SK, ob. x20; B - seciune microscopic printr-un osteon (detaliu), coloraie SK, ob. x40.

A

B

Fig. 16. A - seciune microscopic transversal prin os compact prezena lacunelor interlamelare n interiorul crora se gsesc osteocite, coloraie H&E, ob. x20; B - seciune microscopic prin os compact cu vizualizarea lamelelor interstiiale (detaliu), coloraie VG, ob. x60.

- 20 -

CAPITOLUL 8 REZULTATELE I DISCUIILE STUDIULUI CLINIC AL TUMORILOR OSOASE8.1. METODE STATISTICE APLICATE Eantionare - stabilete dac dimensiunea eantionului ales este reprezentativ n populaie. Testul 2 - este un test neparametric care compar dou sau mai multe repartiii de frecvene provenite din aceeai populaie; se aplic cnd evenimentele ateptate se exclud. n calculul diferenei semnificative dintre dou medii, testul t-Student ine cont de msurarea variabilitii i ponderea observaiilor. Tendina - calculat i aplicat ca prognostic, este liniar y = a + bx i pune n eviden evoluia fenomenului analizat. 8.2. CARACTERISTICI EPIDEMIOLOGICE Lotul de studiu a fost constituit din 238 de pacieni cu tumori osoase, osteogene i de origine cartilaginoas, extrai din Registrul de anatomie patologic al Spitalului Clinic de Recuperare Iai i al Spitalului Clinic de Urgene Sf. Ioan Iai n perioada 1995-2008, care s-au prezentat la consult n cele dou spitale. 8.2.2. LOT CONDROSARCOM (LOT C) Monitorizarea n timp a cazurilor cu condrosarcom, n perioada 1995 2008 indic o tendin descresctoare a acestei afeciuni (y = 3,88 - 0,20 x), prognosticnd 1-2 cazuri pentru anul 2009 (fig. 17). Lotul C de studiu a fost constituit din 31 pacieni cu condrosarcom, 23 brbai i 8 femei n raportul M/F = 2,88 / 1. Distribuia pe sexe este preponderent masculin (74,2%) (fig. 18). Distribuia pe grupe de vrst. Vrsta medie a pacienilor la intrarea n studiu a fost de 48,84 19,17 ani, variind de la 15 la 79 ani. Pe sexe, vrsta medie a cazurilor de sex feminin a fost de 59,13 ani cu variaii de la 17 la 79 ani, iar la sexul masculin vrsta medie a - 21 -

fost de 45,26 cu variaii ntre 15 i 72 ani. Pe grupe de vrst i sex, frecvena cea mai mare se ntlnete la grupa de vrsta 46-55 ani, la sexul masculin (19,4%), iar la sexul feminin modulul se regsete la grupa de vrsta 66-75 ani (9,7%) (fig. 19).8

6

5 4

5 4 3 3 3

4 2

1

1

1

1 0

Fig. 17. Distribuia cazurilor din lotul C pe ani de studiu.

Nr. cazuri

0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

Anul

Feminin 25.8%

Masculin 74.2%

Fig. 18. Distribuia pe sexe a pacienilor din lotul C.

Localizare condrosarcom - de remarcat localizarea preponderent a acestuia pe femur (41,9%), iar din totalul localizrii pe femur 53,8% dintre acestea sunt cu localizare distal. Localizarea pe tibie sau humerus au fost 100% proximale (tabel II).25 20 % 15 10 5 0 15 16-25 26-35 36-45 46-55 56-65 66-75 >75 Grupa de vrst (ani) Masculin Fe minin

Fig. 19. Distribuia pe grupe de vrst i sex a pacienilor din lotul C.

- 22 -

Tabel II. Localizarea condrosarcomului. Localizare Humerus Femur Tibie Calcaneu Coxal Falang Omoplat Vertebr n 3 13 5 1 5 2 1 1 din care proximal distal n % n % 3 9,7 100 1 7,7 7 41,9 53,8 5 16,1 100 Alte localizri 3,2 16,1 6,5 3,2 3,2 %

Debut condrosarcom - pacienii diagnosticai cu condrosarcom au prezentat preponderent debut insidios (96,8%), la un singur caz debutul a fost cu fractur (3,2%) (fig. 20).Recidive cele 6 cazuri cu recidiv (19,4% din cazurile de condrosarcom) nu prezint diferene semnificative n funcie de sex sau grupa de vrst.Fig. 20. Debutul afeciunii la pacienii din lotul C.0 25 50 % 75 100

debut

insidios

cu fractura

8.2.3. LOT OSTEOSARCOM (LOT O) Monitorizarea n timp a cazurilor cu osteosarcom, n perioada 1995 2008 indic o tendin uor descresctoare a acestei afeciuni (y = 3,58 - 0,04 x), prognosticnd 3 cazuri pentru anul 2009 (fig. 21). Lotul O de studiu a fost constituit din 46 pacieni cu osteosarcom, 32 brbai i 14 femei n raportul M/F = 2,29 / 1. Distribuia pe sexe este preponderent masculin (69,6%) (fig. 22). Distribuia pe grupe de vrst. Vrsta medie a pacienilor la intrarea n studiu a fost de 39,02 19,83 ani, variind de la 16 la 78 - 23 -

ani. Pe sexe, vrsta medie a cazurilor de sex feminin a fost de 49,07 ani cu variaii de la 17 la 75 ani, iar la sexul masculin vrsta medie a fost de 34,63 cu variaii ntre 16 i 78 ani. Pe grupe de vrst i sex, frecvena cea mai mare se ntlnete la grupa de vrsta 16-25 ani la sexul masculin (37%), iar la sexul feminin modulul se regsete la grupa de vrsta 46-55 ani (15,2%) (fig. 23).87

6

5 4

5 4 3 4 3 2 2 3

Nr. cazuri

42

2

1

1

Fig. 21. Distribuia cazurilor din lotul O pe ani de studiu.

0 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

Anul

Feminin 30.4%

Fig. 22. Distribuia pe sexe a pacienilor din lotul O.Masculin 69.6%

40 35 30 25 20 15 10 5 0 15 16-25 26-35 36-45 46-55 56-65 Grupa de vrst (ani)

Masculin Feminin

%

66-75

>75

Fig. 23. Distribuia pe grupe de vrst i sex a pacienilor din lotul O.

Localizare osteosarcom - de remarcat localizarea preponderent a osteosarcomului pe femur (50,0%), iar din totalul - 24 -

localizrii pe femur 65,2% dintre acestea sunt cu localizare distal. Localizarea pe tibie s-a nregistrat n procent de 19,6%, dintre aceste localizri 77,8% au fost proximale. 15,2% dintre cazurile de osteosarcom au avut localizarea pe humerus, iar dintre aceste localizri 85,7% au fost proximale (tabel III).Tabel III. Localizarea osteosarcomului. Localizare Humerus Femur Tibie Fibul Metatarsian Coxal n 7 23 9 1 1 5 din care proximal distal n % n % 6 1 14,3 15,2 85,7 5 21,7 15 65,2 50,0 7 1 11,1 19,6 77,8 1 2,2 100 Alte localizri 2,2 10,9 %

Debut osteosarcom - pacienii diagnosticai cu osteosarcom au prezentat preponderent debut insidios (84,8%), la un singur caz debutul a fost cu fractur (15,2%) (fig. 24). Recidive - cele 4 cazuri cu recidiv (8,7% din cazurile de osteosarcom) nu prezint diferene semnificative n funcie de grupa de vrst (p=0,295), n schimb sunt nregistrate semnificativ mai multe cazuri cu recidiv ale osteosarcomului la sexul feminin (p=0,043).Fig. 24. Debutul afeciunii la pacienii din lotul O.25 50 % 75 100

debut 0 insidios cu fractura

- 25 -

CAPITOLUL 9 REZULTATELE I DISCUIILE STUDIULUI IMAGISTIC AL TUMORILOR OSOASE9.1. ASPECTE IMAGISTICE ALE TUMORILOR OSOASE Examenele imagistice sunt importante n diagnosticul condrosarcomului i de multe ori aproape patognomonice, evideniind leziunea n ntregime. Aspectul radiografic al tumorilor maligne este foarte variat, att funcie de tipul tumorii osteosarcom, condrosarcom, ct i funcie de stadiul tumorii. Pe radiografiile plane am urmrit: aspectul leziunii osteoliz, osteocondensare; localizarea formaiunii zon metafizar cu extindere spre epifiz i n unele cazuri spre diafiz; reacia periostal sub form de triunghi Codman, raze de soare; extinderea sau nu la prile moi nvecinate; diseminarea la distan (fig. 25-28).

A

B

Fig. 25. Radiografie genunchi incidene anteroposterioar (A) i lateral (B): leziune tumoral osteolitic situat la nivelul metafizei i epifizei distale femurale, neomogen, cu zone de osteocondensare pe faa anterioar, cu ntreruperea corticalei de pe faa antero-lateral i posibila extensie spre esuturile din jur, calcificri intratumorale - Osteosarcom metafiz distal femur (pacient B.C., 63 ani).

- 26 -

A

B

Fig. 26. Radiografie genunchi incidene anteroposterioar (A) i lateral (B): fractur pe os patologic; leziune tumoral osteolitic situat la nivelul metafizei i epifizei proximale tibiale, imprecis delimitat, cu margini osteoscleroase, cortical subiat, reacie periostal minim - Osteosarcom epifiz proximal tibie (pacient L.T., 48 ani).

Fig. 27. Radiografie old inciden anteroposterioar: leziune tumoral osteolitic situat la nivelul aripii iliace, inprecis delimitat, neomogen, distrugerea lizereului de siguran cu extensie n prile moi adiacente, reacie periostal important i calcificri att intratumorale, ct i n prile moi adiacente Condrosarcom arip iliac (pacient C.M., 23 ani).

- 27 -

A

B

Fig. 28. Radiografie femur incidene anteroposterioar (A) i lateral (B): leziune tumoral osteolitic situat la nivelul 1/3 proximale a diafizei i metafizei femurale, de aspect lobulat, neomogen, calcificri intralezionale, ntreruperea lizereului de siguran la nivelul feei externe cu extensie spre esuturilor moi nconjurtoare, osteoscleroz la nivelul corticalei interne, important reacie periostal la nivelul feei posterioare i interne Condrosarcom 1/3 proximal femur (pacient G.P., 51 ani).

Radiografiile plane au fost completate cu examene CT sau RMN. CT-ul ofer o imagine mai ampl a leziunii att din punct de vedere al structurilor osoase afectate, ct i din punct de vedere a esuturilor moi nvecinate (fig. 29 i fig. 30).Fig. 29. CT bazin seciune coronar: formaiune tumoral cu caractere osteolitice interesnd cavitatea acetabular i ramul ischiatic drept, cu dezvoltare att pelvin ct i spre stratul profund muscular al regiunii gluteale drepte, avnd structur neomogen, nu prezint adenopatii tumorale pelvine Osteosarcom arip iliac i ram ischiatic (pacient B.I., 59 ani).

- 28 -

Fig. 30. CT bazin seciune coronar: leziune tumoral osteolitic situat la nivelul aripii iliace, neomogen, efect de mas asupra prilor moi ale micului bazin, invadarea muchiului psoas iliac i mare gluteu fa de care nu prezint limite nete de demarcaie, multiple calcificri la nivelul prilor moi - Condrosarcom arip iliac (pacient C.M., 23 ani).

RMN-ul prezint imagini multiaxiale, mult mai detaliate referitoare la leziune, esuturile moi i n special raporturile tumorii cu structurile neurovasculare din vecintate (fig. 31 i fig. 32). Pe lng acestea scintigrafia osoas ofer informaii suplimentare referitoare la leziune i prile moi limitrofe ei, dar cel mai important rol l are n detectarea depozitelor tumorale la distan (fig. 33).

A

B

Fig. 31. RMN genunchi seciune frontal (A) i sagital (B): leziune neomogen, n hiposemnal, situat la nivelul metafizei distale femurale, relativ bine delimitat, ce ntrerupe corticala i prezint efect de mas asupra esuturilor moi din vecintate i pachetului v-n popliteu, fa de care prezint limit de demarcaie Osteosarcom telangiectatic metafiz distal femur (pacient I.S., 47 ani).

- 29 -

A

B

Fig. 32. RMN bra seciune sagital (A, B): leziune voluminoas, neomogen, situat la nivelul 1/3 proximale a diafizei humerale, cu contur neregulat, lobulat, cu extensie extraosoas n prile moi adiacente i efect de mas asupra acestora Osteosarcom telangiectatic 1/3 proximal humerus (pacient P.P., 24 ani).

Fig. 33. Scintigrafie osoas - corp ntreg: examinarea scintigrafic osoas corp ntreg relev situs moderat fixator de radiofarmaceutic la nivelul extremitii distale a femurului drept; hiperfixare intens la nivelul articulaiilor mari i mici ale membrelor inferioare i superioare Osteosarcom hemibazin cu mts osoase la nivelul articulaiilor mari i mici ale membrelor inferioare i superioare (pacient B.I., 59 ani).

- 30 -

9.2. REMODELAREA OSOAS N TUMORII ASPECTE MEZOSCOPICE

VECINTATEA

Ca i reacie a osului, n imediata vecintate a tumorii, am observat o serie de modificri, de remodelri osoase, cu scopul att de a menine integritatea structural, ct i ca reacie la factorul tumoral. Datorit caracterului n special osteolitic apar modificri n ceea ce privete trabeculele osoase. n unele cazuri, acolo unde s-a putut, pe imaginile radiografice, am ncercat s calculez unghiurile sub care sunt orientate traveele fa de axa mecanic i fa de suprafaa articular (fig. 34 i fig. 35).A B Fig. 34. Imagini radiografice a unui osteosarcom n inciden anteroposterioar situat la nivelul epifizei distale femurale i orientarea traveelor osoase (n grade) funcie de axa mecanic n zona condilian medial (A) i condilian lateral (B) (pacient B.C., 63 ani).

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 12 10 8 6 Medial 4 2 0

A X A M E C A N I C

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 Lateral 8 10 12

Fig. 35. Reprezentarea grafic a valorilor unghiurilor traveelor osoase ale epifizei femurale distale situat n imediata vecintate a unui proces tumoral - osteosarcom (pacient B.C., 63 ani).

- 31 -

Att mezoscopic, ct i din valorile obinute, se observ c traveele principale i pstreaz orientarea fa de suprafaa articular, acestea rmnnd paralele fa de axa mecanic aa cum sunt orientate i la nivelul osului normal. Modificrile observate au constat n special n ceea ce privete numrul traveelor: n interiorul leziunii acestea sunt lizate aproape n totalitate datorit caracterului osteolitic al leziunii; n zonele limitrofe procesului tumoral se observ deseori un grad avansat de osteoscleroz caracterizat prin condensarea structurilor osoase ca urmare a formrii excesive de esut osos, n jurul tumorii, la distan mai mare, numrul traveelor este redus, observndu-se un grad variabil de osteoporoz cu trabecule rarefiate i areole de dimensiuni mari. Ca urmare remodelrii patologice a osului n imediata vecintate a procesului tumoral, epifizele nu i mai pot ndeplini eficient funcia de tampon fa de extinderea procesului sarcomatos, n special datorit reducerii numrului traveelor i, n al doilea rnd, datorit dezorganizrii lamelelor i orientrii anarhice a traveelor constituiente.

- 32 -

CAPITOLUL 10 REZULTATELE I DISCUIILE STUDIULUI HISTOPATOLOGIC AL TUMORILOR OSOASE10.1. STUDIUL HISTOPATOLOGIC CALITATIV Osteosarcomul prezint un grad ridicat de anaplazie cu pleomorfism celular putndu-se observa celule tumorale imature dispuse anarhic printre zone de osteoid tumoral. Celulele tumorale prezint nuclei voluminoi, chiar gigani, cu unul sau mai muli nucleoli i numeroase mitoze atipice (fig. 36A). Aspectele microscopice observate n condrosarcom au variat funcie de gradul tumoral, dar toate s-au caracterizat prin prezena condrocitelor atipice cu nuclei mrii, hipercromatici, celule bi- sau multinucleate i mitoze atipice (fig. 36B).

A

B

Fig. 36. A - osteosarcom de tip convenional, ob. x20 celule tumorale cu nuclei gigani, numeroase atipii i mitoze (pacient CF, 18 ani), B - condrosarcom gradul 2, ob. x40 celularitate marcant cu condrocite atipice, numeroase atipii nucleare (pacient CV, 51 ani). Coloraie H&E.

10.2. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC n studiul imunohistochimic am urmrit reactivitatea markerilor n 10 osteosarcoame i 10 condrosarcoame. Am folosit o serie de markeri structurali cum ar fi: vimentin, S 100, dar i o serie de markeri prognostici, de agresivitate: Ki67, p53. Pe lng acetia am folosit CD-34 pentru a evidenia expresia neoangiogenezei i CD- 33 -

45 ca expresie a reaciei de aprare a organismului la factorul tumoral. Markerii structurali au fost utilizai ca metod adjuvant n confirmarea diagnosticului histopatologic, ei neprezentnd specificitate pentru osteo- i condrosarcoame. n cazurile de osteosarcom luate n studiu am observat o reacie de pozitivare citoplasmatic intens pentru vimentin (fig. 37A), iar condrosarcoamele au prezentat o reacie moderat pozitiv citoplasmatic pentru acelai marker (fig. 37B). Pentru S100 osteosarcoamele au prezentat reacie zonal pozitiv (fig. 38A), iar condrosarcoamele au prezentat reacie pozitiv att nuclear, ct i citoplasmatic de la moderat la intens (fig. 38B).

A

B

Fig. 37. A - osteosarcom de tip convenional, ob. x60: pozitivitate intens citoplasmatic pentru vimentin n celulele tumorale (pacient TI, 17 ani); B condrosarcom grd. 2, ob. x40: vimentin moderat pozitiv n celulele tumorale (pacient BI, 67 ani). Coloraie IHC Vim.

A

B

Fig. 38. A - osteosarcom de tip convenional, ob. x40 reacie zonal pozitiv pentru S 100 (pacient TI, 17 ani); B - condrosarcom grd. 3, ob. x20: S 100 intens pozitiv (pacient BA, 57 ani). Coloraie IHC S 100.

- 34 -

Markerii prognostici au fost alei pentru evidenierea celor dou mecanisme importante de care depinde creterea tumoral: Ki 67 - proliferare celular i p53 reglator al ciclului celular. Aspectele observate n osteo- i condrosarcoame au relevat pozitivitate nuclear de la slab la intens pentru Ki 67, omogen sau granular, funcie de gradul tumoral (fig. 39). Pozitivitatea pentru Ki 67 a fost cu att mai mare cu ct gradul de ncadrare histologic al tumorii a fost mai mare. Reacia imunologic pozitiv pentru p53 a fost corel cu cantitatea formelor mutante ale proteinei p53, punnd n eviden proliferarea celular i inhibiia apoptozei. Condrosarcomul a prezentat o reacie nuclear moderat pozitiv la acest marker (fig. 40).

A

B

Fig. 39. A - osteosarcom de tip convenional cu grad nalt de malignitate, ob. x20 reacie nuclear intens pozitiv, omogen, pentru Ki 67 (pacient LT, 48 ani); B condrosarcom gradul 3, ob. x40 - reacie intens pozitiv, omogen, pentru Ki 67 (pacient BA, 57 ani). Coloraie IHC - Ki 67, contracolorare cu hemalaun Mayer.

Fig. 40. Condrosarcom gradul 2, ob. x20 p 53 moderat pozitiv nuclear (pacient CM, 23 ani). Coloraie IHC - p 53, contracolorare cu hemalaun Mayer.

- 35 -

Markerii adiionali au fost utilizai n scopul evidenierea angiogenezei (CD-34) i aprarea organismului la stresul tumoral (CD-45 RO). La colorarea imunohistochimic cu CD-34 n osteo- i condrosarcoame am observat numeroase vase de neoformaie de tip capilar dispuse izolat sau grupat (fig. 41). Reacia pozitiv la CD-45 RO s-a concretizat prin observarea infiltratului inflamator att la periferia tumorii, ct i intratumoral. Acesta a fost mai mare n cazul osteosarcoamelor fa de condrosarcoame, unde s-a nregistrat prezena limfocitelor T cu efect de marginaie n interiorul vaselor sangvine i dispoziie inconstant att n periferia tumorii, ct i intratumoral (fig. 42).

A

B

Fig. 41. A - osteosarcom de tip convenional, ob. x40: numeroase vase de neoformaie dispuse grupat sau izolat (pacient CF, 18 ani), B - condrosarcom gradul 2, ob. x20 - vase de neoformaie numeroase grupat n stroma de la periferia insulelor tumorale (pacient FA, 75 ani). Coloraie ICH CD-34.

A

B

Fig. 42. A - osteosarcom de tip convenional cu grad nalt de malignitate, ob. x60 infiltrat limfoid micronodular dispus grupat n stroma tumoral (pacient LT, 48 ani), B - condrosarcom gradul 2, ob. x60 - limfocite T de marginaie dispuse n interiorul unui vas sangvin i elemente limfoide rspndite n stroma tumoral (pacient BI, 67 ani). Coloraie IHC CD-45 RO, clona UCHL1.

- 36 -

10.3. STUDIUL HISTOPATOLOGIC CANTITATIV 10.3.1. STEREOLOGIA 10.3.1.1. Osteosarcom Analiza stereologic a debutat cu identificarea structurilor de referin din osteosarcomul clasic, izolnd unele structuri din componena de baz, pentru a putea aprecia separat formaiunile care cresc gradul de risc al tumorii: celulele tumorale, celulele cu atipii i monstruziti, celulele n diviziune (mitoze), prezena matricei osteoide, prezena vaselor sarcomatoase, stroma fibrovascular. Rezultatele au fost prezentate separat pentru fiecare stadiu evolutiv.60 50

40

Celule tumorale Atipii celulare Mitoze Vase sarcomatoase Matrice osteoid Strom fibroas

30

Fig. 43. Grafic centralizator al rezultatelor cuantificrilor stereologice din osteosarcoamele clasice.

20

10

0 GRAD 2 GRAD 2-3 GRAD 3 GRAD 4

Tabel. IV. Tabel centralizator al rezultatelor cuantificrilor stereologice din osteosarcoamele clasice. Celule Atipii Vase Matrice Strom Mitoze GRAD Tumorale Celulare Sarcomatoase Osteoid Fibroas 7,86 3,04 3,21 8,93 21,43 55,54 2 11,61 4,29 3,93 19,82 28,75 31,61 2-3 14,82 6,61 5,00 25,18 32,50 15,89 3 18,39 8,39 7,32 26,43 31,07 8,39 4

Compararea rezultatelor i reprezentarea grafic obiectiveaz cele mai evidente modificri microscopice cantitative care difereniaz stadiile evolutive ale osteosarcoamelor clasice i care ar putea fi utilizate n aprecierea prognosticului acestei forme tumorale (fig. 43, tabel IV). 10.3.1.1. Condrosarcom Analiza stereologic a debutat cu identificarea structurilor de referin din condrosarcomul clasic. Compararea rezultatelor i reprezentarea grafic obiectiveaz cele mai evidente modificri - 37 -

microscopice cantitative care difereniaz stadiile evolutive ale condrosarcoamelor clasice i care ar putea fi utilizate n aprecierea prognosticului acestei forme tumorale (fig. 44, tabel V).90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 GRAD 1 GRAD 2 GRAD 2-3 GRAD 3

Celule tumorale Strom Mitoze Cel. bi i multinucleate Strom mixoid Necroz

Fig. 44. Grafic centralizator al rezultatelor cuantificrilor stereologice din condrosarcoamele clasice.

Tabel. V. Tabel centralizator al rezultatelor cuantificrilor stereologice din condrosarcoamele clasice. Cel. Cel. Bi- i Strom Strom Mitoze Necroz GRAD Tumorale Multinucleate Mixoid 9.82 87.86 1.43 0.89 0 0 1 11.43 86.07 1.43 1.07 0 0 2 14.64 64.82 2.32 3.93 13.39 0.89 2-3 21.96 43.75 5.54 5.71 11.25 11.79 3

10.3.2. ACTIVITATEA PROLIFERATIV 10.3.2.1. Osteosarcom Studiul activitii proliferative din osteosarcoamele clasice sa fcut corelnd evoluia clinic a cazurilor cu aspectele microscopice. Am utilizat mprirea cazurilor n loturi, n funcie de gradingul histologic. Menionm c nu am avut nici o tumor n stadiul 1.GRAD 4 GRAD 3 GRAD 2-3 GRAD 2 7 8 9.9 Rata mitozei 14 12 13 16 18 25.3 21.7

17

16.6

Fig. 45. Grafic centralizator cu rezultatele cuantificrii activitii proliferative n osteosarcoame.

Mitoze/mm2

Indexul activitii mitotice

- 38 -

Tabel. VI. Tabel centralizator cu rezultatele cuantificrii activitii proliferative n osteosarcoame. GRAD Mitoze/mm2 Indexul Activitii Mitotice Rata Mitozei 9,9 7 8% 2 16,6 13 12 % 2-3 21,7 17 14 % 3 25,3 18 16 % 4

Cuantificarea activitii proliferative prin cei trei parametri, a demonstrat acelai sens al modificrilor, valorile crescnd brusc spre gradul 2-3, atingnd maximele n gradul 4 (fig. 45, tabel VI). 10.3.2.2. Condrosarcom n condrosarcoamele clasice activitatea proliferativ este mult mai redus comparativ cu osteosarcoamele motiv pentru care activitatea proliferativ a fost evaluat pe baza volumelor procentuale ale mitozelor calculate prin stereologie. 10.3.3. NEOVASCULARIZAIA 10.3.3.1. Osteosarcom Metodologia cuantificrii angiogenezei a fost aceeai, metoda aplicndu-se pe fiecare din loturile gradingului tumoral. Reprezentarea grafic a rezultatelor cuantificrii neovascularizaiei n osteosarcoamele clasice studiate demonstreaz un raport direct proporional ntre densitatea microvaselor, att n strom, ct i n tumora n ansamblu. Densitatea microvaselor crete progresiv de la un grad la altul, demonstrnd intensificarea procesului angiogenetic odat cu creterea riscului tumoral de metastazare (tabel VII, fig. 46). Trebuie s precizm c densitatea vaselor de neoangiogenez n condrosarcoame este influenat de apariia unor modificri care disociaz vasele, cum ar fi transformarea mixoid a stromei tumorale, zone ntinse de necroz, etc.Tabel. VII. Tabel centralizator cu rezultatele cuantificrii neovascularizaiei n osteosarcoamele studiate. Gradingul Densitatea Microvaselor / mm2 Densitatea Microvaselor / mm2 de Strom Tumoral de Tumor Tumoral 1880,77 9006,50 Gradul 2 2898,07 17062,22 Gradul 2-3 3710,18 30214,68 Gradul 3 4355,51 48954,50 Gradul 4

- 39 -

GRAD 4 GRAD 3 GRAD 2-3 GRAD 2 0 10000 20000 30000 40000 50000

Fig. 46. Grafic centralizator cu rezultatele cuantificrii neovascularizaiei n osteosarcoamele studiate.

Densitatea microvaselor/mm2 de tumor Densitatea microvaselor/mm2 de strom tumoral

10.3.3.2. CondrosarcomGRAD 3

GRAD 2-3

GRAD 2

Fig. 47. Grafic centralizator cu rezultatele cuantificrii neovascularizaiei n condrosarcoamele studiate.0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Densitatea microvaselor/mm2 de tumor Densitatea microvaselor/mm2 de strom tumoral

Tabel. VIII. Tabel centralizator cu rezultatele cuantificrii neovascularizaiei n condrosarcoamele studiate. Gradingul Densitatea Microvaselor / mm2 Densitatea Microvaselor / mm2 de Strom Tumoral de Tumor Tumoral 522,27 2367,62 Gradul 2 877,69 4203,04 Gradul 2-3 1036,51 6618,11 Gradul 3

Reprezentarea grafic a rezultatelor cuantificrii neovascularizaiei n condrosarcoamele clasice studiate demonstreaz, ca i n cazul osteosarcoamelor, dar la un alt nivel, un raport direct proporional ntre densitatea microvaselor n strom i n tumor. Densitatea microvaselor crete progresiv de la un grad la altul, dar mai puin evident, demonstrnd intensificarea procesului angiogenetic odat cu creterea riscului tumoral (fig. 47, tabel VIII). - 40 -

CAPITOLUL 11 MANAGEMENTUL PACIENILOR CU OSTEO- I CONDROSARCOM CRITERII DE APRECIERE A RISCULUI EVOLUTIVPornind de la aspectele expuse n capitolele precedente propun o etapizare a metodelor de diagnostic i prognostic pentru realizarea unui protocol eficient att din punct de vedere economic, dar, n primul rnd, pentru realizarea unui diagnostic corect, lipsit de erori i evaluarea prompt a acestor pacieni (fig. 48). Primii trei parametri constituie elementele de baz ale unui diagnostic corect al leziunii. Pornind de la examenul clinic care, n cazul de fa, este mai puin concludent, medicul trebuie s stabileasc o baterie de teste care s-i confirme/infirme diagnosticul suspectat. ntr-o prim etap se efectueaz examenul imagistic radiografie plan care trebuie completat cu un examen CT sau/i RMN pentru o mai bun vizualizare a leziunii i a raporturilor acesteia cu esuturile moi nconjurtoare, oferindu-ne un diagnostic clinic al leziunii. Pe lng acestea trebuie efectuat i o scintigrafie osoas pentru urmrirea eventualelor diseminri la distan. Pentru obinerea unui diagnostic de certitudine se realizeaz examenul anatomopatologic - histopatologic calitativ, care, pe lng identificarea tipului de sarcom, are i rol prognostic prin stabilirea gradingului histologic tumoral. Pe lng acestea, pentru evaluarea prognosticului propun introducerea unei serii de parametri calitativi, imunohistochimici: Ki 67, p 53, CD-34, CD-45, dar i cantitativi cum ar fi: cuantificri stereologice ale volumelelor procentuale ale structurilor componente ale tumorii (celule tumorale, stroma, vase sanguine), indexul activitii mitotice (IAM), densitatea mitotic (mitoze/mm2), rata mitozei, cuantificarea angiogenezei. Atfel, printr-o bun colaborare ntre clinician, anatomopatolog, oncolog i chirurg, printr-un protocol de investigaii eficient, care s duc la un diagnostic i un prognostic prompt i corect, n stadii ct mai incipiente, se poate realiza un plan - 41 -

terapeutic adecvat, axat pe particularitatea fiecrui caz n parte, cu rezecii n limite oncologice i care s nu creeze un handicap major pacientului.EXAMEN CLINIC Biopsie

EXAMEN PARACLINIC (radiografie plan + CT i/sau RMN)

EXAMEN ANATOMOPATOLOGIC (histopatologic calitativ)

EXAMEN PARACLINIC (Scintigrafie osoas)

EXAMEN ANATOMOPATOLOGIC (imunohistochimic calitativ)

EXAMEN ANATOMOPATOLOGIC (histopatologic cantitativ)

Stereologie

Angiogenez

Activitate proliferativ

PLAN TERAPEUTIC

Fig. 48. Protocolul propus de diagnostic i prognostic a pacienilor cu osteo- i condrosarcom.

- 42 -

CAPITOLUL 12 CONCLUZII FINALE1. Urmrind mezoscopic aspectul i orientarea traveelor osoase

de la nivelul epifizelor oaselor lungi i msurnd gradul de deviaie al acestora raportat la axa mecanic a osului respectiv am observat c orientarea traveelor principale (longitudinale) este n lungul axului forelor ce acioneaz asupra lor atunci cnd axa mecanic i cea longitudinal coincid sau sunt paralele, sau prezint o dispoziie particular atunci cnd cele dou axe sunt diferite n cazul epifizei proximale humerale i femurale. 2. La nivelul epifizei proximale humerale traveele pot fi mprite ntr-un grup subcondral cu travee condensate ce sunt perpendiculare pe suprafaa articular, un grup corespunztor trohiterului cu travee ce sunt orientate sub aciunea muchilor capei rotatorilor n lungul axului diafizar i un grup metafizo-epifizar, inferior, a crui travee se ntretaie n partea central avnd o dispoziie radiar, n evantai, care pleac de la nivelul corticalei mediale i laterale i se ndreapt spre capul humeral. 3. La nivelul epifizei proximale a femurului traveele sunt orientate vertico-radiar n partea superioar a gtului i orizontoradiar n partea inferioar, descriindu-se prezena a dou tipuri principale de trabecule de stress, care alctuiesc benzi pe ambele fee ale extremitii - trabecule de tensiune i trabecule de compresie. 4. La nivelul epifizelor fibulei i distale humeral, radial, femural i tibial traveele sunt paralele cu axa mecanic a osului n cauz, unghiurile de nclinaie a acestora variind n intervalul de ncredere (2,5 - 4 epifiz proximal fibul, 1 - 1,5 epifiz distal fibul, 2 - 3,2 epifiz distal humerus, 4 - 6 epifiz distal radius, 2 - 7 epifiz distal femur, 2,3 - 3 epifiz distal tibie). 5. La nivelul epifizei proximale a radiusului valorile unghiurilor au fost ntre 12 i 15, traveele find convergente la axa mecanic. La nivelul epifizei proximale tibiale traveele mediane sunt paralele, cu un unghi de nclinaie fa de axa mecanic cuprins ntre 8 i 10 i divergena traveelor din zonele lateral i medial cu o nclinaie fa de axa mecanic variind n domeniul 10-25. - 43 -

6. Prin reprezentarea grafic a valorilor unghiurilor traveelor am

observat c acesta urmrete conturul suprafeelor articulare demonstrnd orientarea perpendicular a traveelor principale pe suprafaa articular. 7. Cele 238 de cazuri cu tumori osoase raportate la populaia judeului Iai reprezint o morbiditate de 0,07%. 8. Distribuia cazurilor pe sexe arat o preponderen a celor de sex masculin n ambele loturi cu tumori maligne studiate: n osteosarcom 69,6% au fost brbai, raport M/F = 2,29 / 1, iar n condrosarcom 74,2% au fost brbai, raport M/F = 2,88 / 1. 9. Raportat la vrst, condrosarcomul se regsete la vrste semnificativ mai mari fa de osteosarcom - cel mai frecvent condrosarcomul a aprut la vrste cuprinse ntre 46 - 55 de ani (22,6%), iar osteosarcomul a aprut cel mai frecvent la vrste cuprinse ntre 16 - 25 de ani (41,3%). 10. Cea mai frecvent localizare este cea de la nivelul femurului n ambele loturi de tumori maligne (condrosarcom 41,9%, osteosarcom 50,0%), cu apariia preponderent distal (65,2% n cazul osteosarcoamelor i 53,8% n cazul condrosarcoamelor). Dup femur, n ordinea frecvenei tumora s-a localizat la nivelul tibiei (19,6% osteosarcom, 16,1% condrosarcom), humerusului (15,2% osteosarcom, 9,7% condrosarcom) i fibulei (2,2% osteosarcom) cu localizarea preponderent proximal la ambele tipuri tumorale. 11. Debutul insidios este caracteristic ambelor loturi investigate - 84,8% dintre osteosarcoame i 96,8% dintre condrosarcoame. 12. Tabloul clinic n ambele cazuri de tumori este redus, doar o oarecare tumefacie local nsoit de dureri cu caracter intermitent poate fi un semn indicator. Uneori tumora a fost diagnosticat cu ocazia investigaiilor pentru o fractur asociat (15,2% n cazul osteosarcoamelor i 3,2% n cazul condrosarcoamelor). 13. La examenul imagistic radiografiile plane trebuie completate cu examene CT sau/i RMN pentru o mai bun vizualizare a leziunii i a raporturilor cu structurile nvecinate i scintigrafie osoas pentru evaluarea diseminrilor la distan. 14. Diagnosticul de certitudine de tumor se realizeaz pe baza examenului anatomopatologic calitativ, dar metode - 44 -

imunohistochimice i cantitative faciliteaz un diagnostic precoce i au valoare predictiv sigur, obiectiv. 15. Utilizarea unor markeri imunohistochimici (Ki67, p53, CD34, CD-45 RO) este de un real folos n evaluarea prognosticului. 16. Volumele procentuale ale elementelor componente tumorale (celulelor tumorale, mitozelor, vaselor sarcomatoase, al matricei osteoide sau mixoide, ale celulelor binucleate i ale necrozei) au valoare prognostic independent permind aprecierea gradului de risc. 17. Cuantificarea activitii proliferative prin indexul activitii mitotice, rata mitozelor i densitatea mitotic au artat o cretere brusc a valorilor cu ct gradul tumoral este mai mare, toate cele trei metode avnd valoare predictiv independent i fiind facile de aplicat n practica curent de laborator. 18. Cuantificarea angiogenezei este o metod cu un grad de acuratee ridicat, densitatea microvaselor crescnd progresiv de la un grad tumoral la altul, fiind utile n evaluarea prognosticului. 19. Remodelarea osului n vecintatea procesului tumoral, demonstrat prin cuantificrile mezoscopice, sugereaz c epifizele nu i mai pot ndeplini eficient funcia de tampon fa de extinderea procesului sarcomatos, n special datorit reducerii numrului lor i, n al doilea rnd, datorit dezorganizrii lamelelor i orientrii anarhice a traveelor constituiente. 20. Studiile microanatomice au demonstrat c remodelarea osului n imediata vecintate a tumorii este patologic prin schimbarea structurii i compoziiei esuturilor, predominnd esutul osteoid, dar i densitatea osteoblastelor i osteoclastelor. Procesele de formare i resorbie a osului n esuturile limitrofe tumorii reflect rspunsul local la aciunea factorilor tumorali care nu reuete s limiteze extinderea osteo- sau condrosarcoamelor. 21. Rezultatele obinute demonstreaz c numai o bun colaborare ntre clinician, anatomopatolog, oncolog i chirurg, printrun protocol de investigaii eficient care s duc la un diagnostic i un prognostic prompt i corect, n stadii ct mai incipiente, se poate realiza un plan terapeutic adecvat, axat pe particularitatea fiecrui caz n parte, cu rezecii n limite oncologice i care s nu creeze un handicap major pacientului. - 45 -

BIBLIOGRAFIE SELECTIV1. Al-Motabagani. The Arterial Architecture Of The Human Femoral Diaphysis. J Anat Soc India, 2002, 51(1):27-31. 2. Anderson SE, Steinbach LS, Schlicht S et all. Magnetic resonance imaging of bone tumors and joints. Top Magn Reson Imaging, 2007, 18(6):457-65. 3. Antonescu MD. Patologia aparatului locomotor. Bucureti: Ed. Medical, 2006. 4. Ardeleanu C, Comnescu V, Yaharia B. Imunohistochimie. Principii generale i aplicaii n diagnosticul histopatologic. Bucureti: Sitech, 1999. 5. Bjornsson J, McLeod RA, Unni KK, Ilstrup DM, Pritchard DJ. Primary chondrosarcoma of long bones and limb girdles. Cancer, 1998, 83:2105-19. 6. Bloem J, Kroon H. Osseous Lesions, Radiologic Clinics of North America, 1993, 31(2):261-77. 7. Blood Ch, Zetter BR. Tumor interactions with the vasculature: angiogenesis and tumor metastasis. Biochim Biophys Acta, 1990, 1032:101-22. 8. Bohm G, Salzer-Kunschik M, Lintner F. Morphometric analysis of cartilaginous tumors. Pathol Res Prat, 1992, 188(45):570-5. 9. Brookes M. The Blood Supply of Bone. London: Butterworths, 1971. 10. Bruzzaniti A, Baron R. Molecular regulation of osteoclast activity. Rev Endocr Metab Disord, 2006, 7:123-39. 11. Chenu C. Role of innervation in the control of bone remodeling. J Musculoskel Interact, 2004, 4(2):132-4. 12. Cohen J, Harris WH: The three-dimensional anatomy of haversian systems. J Bone Joint Surg, 1958, 40:419. 13. Cooper RR. Nerves in cortical bone. Science, 1968, 160:3278. 14. Crombrugghe B, Lefebvre V, Nakashima K. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr Opin Cell Biol, 2001, 13(6):721-8. - 46 -

15. Cuvelier CA, Roels HJ. Cytomorphometric studies of the nuclear DNA content in cartilaginous tumors. Cancer, 1979, 44(4):1363-74. 16. Dahlin CD. Bone Tumors: General Aspects and Data on 11,087 Cases. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996. 17. Daugaard S, Myhre-Jensen O, Schidt T, Jurik AG, Keller J, Mouridsen HT, Lund B. Clinical and Histopathological Prognostic Factors in Chondrosarcomas, Sarcoma, 1997, 1(1): 4754. 18. Dempster WT. Space requirements of the seated operator. WADC TR 55-159, AD-087-892. Wright-Patterson Air Force Base, Ohio,1955. 19. Dorfman HD, Czerniak B. Bone Tumors. Mosby: St Louis, 1998. 20. Edwards JR , Williams K, Kindblom LG et all. Lymphatics and bone. Hum Pathol, 2008, 39(1):49-55. 21. Enneking WF, Spanier SS, Goodman MA. A system for the surgical staging of musculoskeletal sarcoma. Clin Orthop Relat Res, 2003, (415):4-18. 22. Fanburg JC, Rosenberg AE, Weaver DL, et all. Osteocalcin and osteonectin immunoreactivity in the diagnosis of osteosarcoma. Am J Clin Pathol, 1997, 108(4):464-73. 23. Ferretti M, Palumbo C, Contri M, Marotti G. Static and dynamic osteogenesis: two different types of bone formation. Anat Embryol, 2002, 206:219. 24. Fletcher CDM, Unni KK, Mertens F. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics. Tumours of Soft Tissue and Bone. Lyon, France: IARC Press, 2002:225-85. 25. Folkman J. What is evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Canc Inst, 1990, 82:4-6. 26. Frncu DL, Chirana A, Frncu LL, Ciobanu A. Cuantificarea regiunii argirofile a organizatorilor nucleolari n unele tumori osoase primitive. Rev Med Chir Iai, suppl Clinica, 2000, 5(5):17-20. 27. Frncu DL, Frncu LL, Chirana A, Clin D, Ciobanu A. Semnificaia diagnosticului histopatologic cantitativ n condrosarcom. Rev Med Chir, Iai, suppl Clinica, 2002, 2(7):11-6. - 47 -

28. Frncu DL, Frncu LL, Chirana A, Clin D, Niescu A, Crian-Dabija R. Criterii histopatologice cantitative de apreciere a gradingului tumorilor osoase cu celule gigante. Rev Med Chir, Iai, 2002,1(106):147-53. 29. Frost HM. Bone Remodeling Dynamics. IL: Springfield, 1963. 30. Gebhardt MC, Hornicek FJ. Osteosarcoma. In: Orthopaedic Knowledge Update: Musculoskeletal Tumors. Rosemont: American Academy of Orthopaedic Surgeons. 2002, 175-86. 31. Gelderblom H, Hogendoorn PC, Dijkstra SD et all. The clinical approach towards chondrosarcoma. Oncologist. 2008, 13(3):320-9. 32. Gibbs, Jr. CP, Weber K, Scarborough MT. Malignant bone tumors. J Bone Jt Surg, 2001, 83(11):1728-45. 33. Hameetman L, Kok P, Eilers PH et all. The use of Bcl-2 and PTHLH immunohistochemistry in the diagnosis of peripheral chondrosarcoma in a clinicopathological setting. Virchows Arch, 2005, 446:430-7. 34. Hoang BH, Dyke JP, Koutcher JA. VEGF expression in osteosarcoma correlates with vascular permeability by dynamic MRI. Clin Orthop, 2004, 426:32-8. 35. Ishida T, Kikuchi F, Machinami R. Histological grading and morphometric analysis of cartilaginous tumours. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol, 1991, 418(2):149-55. 36. Jaff HL. Tumors and Tumorous Conditions of the Bones and Joints. Philadelphia: Lea and Febiger, 1958. 37. Kakar S, Mihalov M, Chachlani NA. Correlation of c-fos, p53, and PCNA expression with treatment outcome in osteosarcoma. J Surg Oncol, 2000, 73:125-6. 38. Kern SE, Kinzler KW, Bruskin A et all. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science, 1991, 252(5013):170811. 39. Ladanyi M, Gorlick R. Molecular pathology and molecular pharmacology of osteosarcoma. Pediatr Pathol Mol Med, 2000, 19:391-413.

- 48 -

40. Li Z, Kong K, Qi W. Osteoclast and its roles in calcium metabolism and bone development and remodeling. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 343(2):345-50. 41. Mach DB, Rogers SD, Sabino MC. Origins of skeletal pain: sensory and sympathetic innervation of the mouse femur. Neuroscience, 2002, 113:15566. 42. Mackie EJ. Osteoblasts: novel roles in orchestration of skeletal architecture. Int J Biochem Cell Biol, 2003, 35(9):1301-5. 43. McCarville MB. New frontiers in pediatric oncologic imaging. Cancer Imaging, 2008, 8:87-92. 44. Meister P, Konrad E, Lob G, Janka G, Keyl W, Sturz H. Osteosarcoma: histological evaluation and grading. Arch Orthop Trauma Surg, 1979, 94(2):91-8. 45. Miller MR, Kasahara M. Observations on the innervation of human long bones. Anat Rec, 1963, 145:1323. 46. Morris CD, Gorlick R, Huvos G. Human epidermal growth factor receptor 2 as a prognostic indicator in osteogenic sarcoma. Clin Orthop, 2001, 382:59-65. 47. Nakanishi K, Kobayashi M, Nakaguchi K et all. Whole-body MRI for detecting metastatic bone tumor: diagnostic value of diffusion-weighted images. Magn Reson Med Sci, 2007, 6(3):147-55. 48. Nakaoka R, Hsiong SX, Mooney DJ. Regulation of chondrocyte differentiation level via co-culture with osteoblasts. Tissue Eng, 2006, 12(9):2425-33. 49. Noble BS, Reeve J. Osteocyte function, osteocyte death and bone fracture resistance. Mol Cell Endocrinol, 2000, 159:713. 50. Ollivier L, Vanel D, Leclere J. Imaging of chondrosarcomas. Cancer Imaging, 2003, 4(1):36-8. 51. Olsen BR, Reginato AM, Wang W: Bone development. Annu Rev Cell Dev Biol, 2000, 16:191-220. 52. Palumbo C, Ferretti M, De Pol A. Apoptosis during intramembranous ossification. J Anat, 2003, 203(6):58998. 53. Park YB, Kim HS, Oh JH. The co-expression of p53 protein and P-glycoprotein is correlated to a poor prognosis in osteosarcoma. Int Orthop, 2001, 24(6):307-10. 54. Polykandriotis E, Arkudas A, Beier JP et all. Intrinsic axial vascularization of an osteoconductive bone matrix by means of an - 49 -

arteriovenous vascular bundle. Plast Reconstr Surg, 2007, 120(4):855-68. 55. Pritchard DJ, Lunke RJ, Taylor WF, Dahlin DC, Medley BE. Chondrosarcoma: a clinicopathologic and statistical analysis. Cancer, 1980, 45:149-57. 56. Roodman GD. Regulation of osteoclast differentiation. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1068:100-9. 57. Salas S, de Pinieux G, Gomez-Brouchet A et all. Ezrin immunohistochemical expression in cartilaginous tumours: a useful tool for differential diagnosis between chondroblastic osteosarcoma and chondrosarcoma. Virchows Arch, 2009, 454(1):81-7. 58. Sikora J, Slodkowska J, Kobos J, Radomyski A. Tumour angiogenesis within lung adenocarcinoma and its correlation with metastasis - application of cd34 endothelial marker. EJ Pathol Histol, 1996, 2(2):962-3. 59. Sisask G, Bjurholm A, Ahmed M, Kreicbergs A. Ontogeny of sensory nerves in the developing skeleton. Anat Rec, 1995, 243:234 40. 60. Skawina A, Litwin JA, Gorczyca J. The architecture of internal blood vessels in human fetal vertebral bodies. J Anat, 1997, 191(2): 25967. 61. Standring S. Grays Anatomy. The Anatomical Basis of Clinical Practice. 38th ed, New York: Churchill Livingstone, 2005. 62. Thurston TJ. Distribution of nerves in long bones as shown by silver impregnation. J Anat, 1982, 134:71928. 63. Vlker T, Denecke T, Steffen I et all. Positron emission tomography for staging of pediatric sarcoma patients: results of a prospective multicenter trial. J Clin Oncol, 2007, 25(34):5435-41. 64. Watkins B. Factors involved in the local regulation of bone growth. Bone Biology and Skeletal Disorders, 1992, 5,67-86. 65. Willems SM, Schrage YM, Baelde JJ et all. Myxoid tumours of soft tissue: the so-called myxoid extracellular matrix is heterogeneous in composition. Histopathology, 2008, 52(4):465-74. 66. Yonezu H, Wakoh M, Otonari T et all. Osteoma of mandibular condyle as cause of acute pain and limited-mouthopening: case report. Bull Tokyo Dent Coll, 2007, 48(4):193-7. - 50 -

LUCRRI DIN TEZA DE DOCTORATLUCRRI PUBLICATE N EXTENSO (REVIST CATEGORIA B)

1. Veliceasa B, Alexa O, Frncu DL. Orientarea traveelor osoase la nivelulepifizei proximale tibiale. Revista Roman de Anatomie funcional i clinic, macro- i microscopic i de antropologie, 2009, 8(3):356-9.

2. Veliceasa B, Alexa O, Frncu DL. Experiena personal n stabilireaalgoritmului de explorare i evaluare a pacientului cu condrosarcom. Revista Romn de Anatomie funcional i clinic, macro- i microscopic i de Antropologie, 2009, 8(4):557-563.

3. Frncu DL, Veliceasa B, Frncu LL, Alexa O. Modelarea osoas nvecintatea osteosarcomului cu localizare la nivelul epifizei distale femurale. Revista Romn de Anatomie funcional i clinic, macro- i microscopic i de Antropologie, acceptat pentru publicare in print.