A. PROBOTICEI. Introduceren ultimii ani, probioticele comercializate sub form de alimente, suplimente alimentare cu bacterii vii sau produse farmaceutice au atras tot mai mult interesul att al cecettorilor ct i al consumatorilor. Interesul public general de descoperire a unui stil de via sntos, mpreun cu preocuparea medicilor de a descoperi terapii neinvazive i lipsite de reacii adverse, au reorientat atenia pe rolul potenial benefic al microbiotei umane n prevenirea i tratarea diferitelor boli. Modularea microbiotei intestinale poate fi influenat pozitiv prin consumarea de probiotice i/sau prebiotice. n cuprinsul acestui articol ne propunem s prezentm structura bacteriilor lactice cu potenial probiotic, mecanismele de aciune, interaciunile cu celulele corpului uman i cu bacteriile patogene, precum i tendinele actuale n utilizarea probioticelor pentru prevenirea i tratarea unor afeciuni dermatologice, care au reprezentat motivaia acestei teze de doctorat.II. Evoluia conceptului de probiotic

Spre sfritul secolului al XIX-lea, numeroi cercettori descoperiser c o gam larg de iaurturi au un termen de valabilitate mai extins i un gust mai plcut. Microbiologii au extins cercetrile de la bacteriile lactice din laptele fermentat la bacterilei lactice specifice organismului uman.Escherich, n 1885, a fost primul care a recunoscut importana bacteriilor existente n tractul intestinal i a subliniat rolul acestora n fiziologia digestiei, precum i n patologia i terapia bolilor intestinale de cauz infecioas. n 1900, doi microbiologi, Tissier i Moro, au prezentat studiul lor privind prezena anumitor bacterii n fecalele nou-nscuilor hrnii cu lapte. n 1908, au completat studiul, artnd o predominan a Bacillus bifidus n fecalele sugarilor hrnii la sn, comparativ cu a celor hrnii cu lapte-formul, unde era predominant Bacillus acidophillus.Ilia Ilici Mecinikov, laureatul Premiului Nobel pentru Medicin, n 1908, a fost primul care a formulat ipoteza tinific privind caracterul probiotic (pentru via) al unor bacterii[1], chiar dac termenul probiotic care descria substane produse de microorganisme, capabile de a iniia i susine creterea altor microorganisme, fusese inventat de Lilly i Stillwell n 1965[2]. Munca sa se bazeaz pe organisme izolate anterior, n 1905, de Grigoroff, utiliznd culturi starter pentru iaurtul bulgresc, i denumindu-le Lactobacillus bulgaricus. n timpul procesului, Grigoroff a identificat un alt microorganism, Streptococcus termophilus, care ns nu a fost cercetat suficient, fiind considerat pe atunci patogen. Experimentele lui mecinikov l-au condus pe acesta s afirme c L. Bulgaricus este capabil de a popula flora intestinal i de a preveni multiplicarea bacteriilor patogene. Urmtoarele experimente, ale lui Herter i Kendall n 1908 au euat n a demonstra aderena acestui Lactobacil n flora intestinal, dar au subliniat alte aspecte benefice ale prezenei Lactobacilului n flora intestinal.Ulterior, numeroi oameni de tiin au ncercat s demonstreze capacitatea de populare a intestinului cu anumite tulpini de L. acidophyllus, precum i modificrile benefice pe care le poate produce. Rettger i Horton n 1914 i Rettger i Cheplin n 1920 au prezentat concluzia unor studii care demonstrau modificare microflorei intestinale, prin obinerea unor culturi predominante de L. acidophyllus i B. biffidus, prin hrnirea cu lapte sau lactoz a cobailor, apoi in studiu clinic. Acest studiu a strnit interesul comercial pentru obinerea de produse fermentate coninnd L. acidophyllus (Burke, 1938). Alte cercetri i-au aparinut lui Minoru Shirota din Japonia, care a subliniat potenialul caracter terapeutic obinut prin modularea microflorei intestinale. n 1930, el reuete s izoleze o tulpin de Lactobacillus capabil s reziste pasajului gastro-intestinal. Ulterior, cultura identificat a fost denumit Lactobacillus casei tulpina Shirota i utilizat cu mare succes n obinerea produsului Yakult, produsul companiei cu acelai nume, fondat n 1935. Perioada dintre 1930 i 1950 este srac n studii i cercetri din cauza condiiilor neprielnice din timpul rzboiului. Interesul pentru microflora intestinal uman renate spre nceputul anilor 1960 i conduce spre un nou concept al termenului probiotic.Fuller redefinete termenul ca fiind suplimente pentru hrana oragnismelor vii animale, care afecteaz benefic gazda prin mbuntirea echilibrului florei intestinale.[3] O definiie mai recent, dar nicidecum ultima, definete probioticele ca microorganisme vii care, administrate oral, n cantiti adecvate, confer un efect benefic asupra gazdei [4]. n conformitate cu aceast definiie, care a fost adoptat i de o Comisie de Experi [5,6,101,102] microorganismele probiotice nu trebuie neaparat s colonizeze intestinul uman, ci trebuie s fie viabile i s se gseasc ntr-o concentraie suficient pentru a-i exercita efectul dorit, de a spori capacitatea de protecie a florei comensale mpotriva interaciunilor competiionale, antagonizrii patogenilor i/sau producerii de factori antimicrobieni bacteriocinele. n alte condiii clinice care presupun infecii cronice sau imunosupresie, interacinea dintre microflora probiot i imunitatea gazdei poate fi cu mult mai relevant n demonstrarea eficacitii probioticelor. Probioticele pot fi comercializate ca suplimente alimentare, aditivi alimentari sau produse farmaceutice.Comercializarea unei tulpini probiotice ca i produs farmaceutic necesit demonstrarea unei inte terapeutice bine definite, utilizndtrialuri clinice bine proiectate, care trebuie s fie controlate, randomizate i verificate dublu-orb [5-7]. Mai mult dect att, sunt necesare studii care s demonstreze stabilitatea i sigurana administrrii pe mucoasele diferitelor aparate. [5-8]. Diferite beneficii atribuite probioticelor sunt raportate n literatura de specialitate, cele mai multe viznd tulburrile gastro-intestinale[5-14], ns cteva ofer dovezi clare asupra beneficiilor aduse de probiotice la nivelul altor organe- int, cum este cazul vaginitelor bacteriene.[15]Scopul acestui articol de documentare este acela de a explora complexitatea multidisciplinar a cercetrilor desfurate pe probiotice, astfel inct s putem dezvolta o nou posibil aplicaie farmacologic a bacteriilor lactice n prevenirea i tratarea unor afeciuni dermatologice pentru care tratamentele consacrate s-au dovedit ineficiente sau a trebuit s se asume riscul efectelor secundare sau reaciilor adverse inerente.III. DefiniieTermenul probiotic a fost iniial utilizat ca i antonim al cuvntului antibiotic. Etimologia cuvntului se afl n limba greac: =pentru i =via (Hamilton-Miller, Gibson & Bruck, 2003). Originea primei utilizri a termenului poate fi detectat n 1953, de ctre Kollath, care l utilizeaz pentru a descrie restabilirea sntii unor pacieni subnutrii cu diferite suplimente organice i anorganice. Un an mai trziu, Vergin 1954 susine c dezechilibrul produs n organism de tratamentul antibiotic poate fi restabilit printr-o diet bogat n probiotice; o sugestie citat ulterior ca fiind prima referin la probiotice, aa cum sunt ele definite astzi. Similar cu aceasta, n 1955, Kolb recunoate efectele nedorite postantibiotice i propune terapia profilactic cu probiotice. Mai trziu, Lilly i Stillwell, n 1965, definesc probioticele ca substane produse de un microorganism care susin creterea altor microorganisme. Similar cu aceasta, Sperti n 1971 i Fuji&Cook n 1973 descriu probioticeleca i compui care fie stimuleaz creterea microbian, fie mbuntesc rspunsul imun al gazdei, fr a inhiba in vitro creterea culturii. O alt definiie oferit de Parker n 1974 se aseamn cu descrierile recente ale probioticelor organisme sau substane, care contribuie la meninerea echilibrului microbian intestinal. Aceast definiie a fost contestat de muli autori , deoarece puteau fi incluse multiple substane n aceast categorie, inclusiv antibiotice. Sfritul anilor 1980 i nceputul anilor 1990 a cunoscut un val de noi i diferite definiii ale probioticelor. O definiie frecvent citat este cea a lui Fuller din 1992, care definete probioticele ca suplimente pentru hrana oragnismelor vii animale, care au efecte benefice asupra gazdei animale prin mbuntirea echilibrului florei microbiene intestinale. Aceast definiie prea c se adreseaz i are aplicabilitate mai mult pe animale dect pe oameni. Ali autori au mers pe aceast linie, oferind propriile versiuni. Cteva din aceste definiii sunt listate n Tabelul 1. Dei toi autorii citai au fost de acord c termenul probiotic se refer la microorganisme vii, Salminen, Ouwehand, Benno i Lee n 1999 i-au prezentat propria versiune, incluznd i bacterii neviabile n definiie.Urmnd recomandarea FAO/WHO asupra evalurii probioticelor ca aditivi alimentari, n 2002, definiia sugerat descria probioticele ca microorganisme vii, care administrate n doze adecvate confer beneficiu asupra sntii gazdei. n consecin, o larg varietate de specii i genuri pot fi considerate potenial probiotice. (Holzapfel, Haberer, Snel, Schillinger & Huisint Veld, 1998); din punct de vedere comercial, cele mai importante tulpini sunt cele de bacterii lactice. (LAB)Tabel 1.Definiii i descrieri ale termenului probiotic de-a lungul anilorAnulDescriereSursa

1953Probioticele sunt comune n legume ca vitamine, substane aromatice, enzime si, eventual, alte substane legate de procese vitaleKollath

1954Probioticele sunt opusul antibioticelorVergin

1955Efectele nocive ale antibioticelor pot fi prevenite prin tratamentul cu probioticeKolb

1965O substan secretat de un microorganism care stimuleaz creterea alteiaLilly and Stillwell

1971Extracte tisulare care stimuleaz creterea microorganismelorSperti

1973Compuii care construiesc rezistena la infecii, n gazd, dar nu inhib creterea microorganismelor in vitroFujii and Cook

1974Organisme i substane care contribuie la echilibrul microbian intestinalParker

1992Supliment pentru hrana organismelor vii microbiene, care afecteaz benefic animalul gazd prin mbuntirea echilibrului microbianFuller

1992Cultur mono-sau mixt de microorganisme viabile care, aplicate la animale sau la om, au un efect benefic asupra gazdei prin mbuntirea proprietilor microflorei indigeneHavenaar and Huis intVeld

1996Culturi microbiene sau produse lactate avnd culturi lactice care influeneaz benefic sntatea i nutriia gazdeiSalminen

1996Microorganisme vii care, la ingerarea n anumite doze, exercit beneficii pentru sntate, altele dect cele ale hranei de baz Schaafsma

1999Preparate de celule microbiene sau componente ale celulelor microbiene, care au un efect benefic asupra sntii i bunstrii gazdeiSalminen, Ouwehand, Benno and Lee

2001Un preparat sau un produs care conine microorganisme viabile, definite n numr suficient, care modifica microflora (de implantare sau colonizare), ntr-un compartiment al gazdei i care exercita efect benefic asupra sntii gazdeiSchrezenmeir and de Vrese

2002Microorganisme vii care, atunci cnd sunt administrate n cantiti adecvate confer un beneficiu asupra sntii gazdei.FAO/WHO

IV. Taxonomie i caracteristicile importante ale bacteriilor lacticeGenurile Lactobacillus i Bifidobacterium sunt cele mai utilizate ca probiotice i de aceea vor reprezenta genurile la care voi face referire n acest articol. Diferitele specii din genul Lactobacillus i Bifidobacterium pot include presupuse tulpini probiotice (Tabel 1.), dar numai cteva din aceste tulpini sunt considerate importante i utilizate n prepararea suplimentelor alimentare i produselor farmaceutice.

Genul LactobacillusLactobacilii sunt celule Gram+ sub form de bastonae sau cocobacili, bacterii lactice nesporulate (LAB), specii bacteriene capabile s produc acid lactic ca produs final de fermentaie a carbohidrailor. n conformitate cu Schema Taxonomic a Procariotelor [Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition], genul Lactobacillus (descris prima dat de Beijerinck n 1901) aparine: ncrengturai Firmicutes Clasa BacilliOrdin LactobacillalesFamilia Lactobacillaceaei este organizat n grupuri filogenetice 8 grupuri dup Dellaglio i Felis. Genul Lactobacillus este extrem de eterogen coninutul de guanin i citozin din structura ADN-ului variind de la 32% la 54%,incluznd 132 de specii i 27 de subspecii, a cror clasificare este ntr-o continu dinamic.Cea mai rapid cale de identificarea a unei specii de Lactobacili este combinarea unor teste fenotipice (teste de carbohidrai) i metode moleculare avansate (secvenierea total sau parial a genei 16S din ARN, electroforez pe gel n cmp pulsat i hibridizare ADN-ADN).[6,19,31-35]O identificare i o denumire corect a microorganismelor probiotice este fundamental pentru urmrirea tulpinilor probiotice i pentru asigurarea securitii unor mrci nregistrate ale unor produse probiotice.[34]Lactobacilii sunt aproape ubiquitari, fiind prezeni n mncare, plante, mucoasele membranelor animale sau umane (respiratorii, gastro-intestinale, genitale, orale) [31,32].

Genul Bifidobacterium

Bifidobacteriile sunt celule Gram+ polimorfe, sub form de bastonae, nesporulate i anaerobe, cu un metabolism de tip fermentativ (producnd acid, dar nu i gaz din carbohidrai). Conform Clasificrii Taxonomice a Procariotelor, genul Bifidobacterium aparine:ncrengtura ActinobacteriaClasa ActinobacteriaSubclasa ActinobacteridaeOrdinul BifidobacterialesFamilia BifidobacteriaceaeConinutul de guanin-citozin din structura ADN-ului variaz de la 42% la 67% [31]. Genul Bifidobacterium include 29 de specii i 6 subspecii [31]. Aceleai metode de identificare filogenetic i molecular care se aplic la Lactobacili, sunt utilizate i pentru identificarea Bifidobacteriilor. [33,34]. Bifidobacteriile sunt ntlnite att la animale, ct i la om, n special se izoleaz din fecale, vagin i carii.[31]Bacteriile lactice sunt microorganisme Gram pozitive, capabile s produc o cantitate mai mare sau mai mic de acid lactic, prin degradarea diverselor substraturi: hexoze: bacteriile care degradeaz 95% din glucoz n acid lactic sunt denumite homolactice; acidul malic: transformarea acidului malic in acid lactic, cunoscut sub numele de fermentaie malolactic.Alte substraturi degradate de bacteriile lactice sunt: pentozele, acidul tartric, acidul citric, glicerolul.

MORFOLOGIA BACTERIILOR LACTICE Structura general a celulei bacteriene se apropie de aceea a celulei vegetale. Forma bacteriilor este un caracter destul de stabil, de aceea constituie unul dintre criteriile fundamentale ale clasificrii acestor microorganisme. Bacteriile lactice se prezint la microscop de forme variate. Astfel se disting: coci, de form rotunjit sau oval i bacili sau bastonae, de form cilindric, mai mult sau mai puin groase, uneori sinuoase. Cocii au diametrul de la 0,4 pana la 1,0m, iar bacilii au grosimea de 0,5 m i 2-5 m sau mai mult n lungime. Atunci cnd dou celule de coci, rezultate n urma unei diviziuni, se separ imediat, apar la microscop drept coci izolai; cnd rmn alipite un anumit timp, apar ca grupri celulare caracteristice: diplococi (celule alipite cte dou), streptococi (celule n irag), sarcini (celule n aglomerri cubice), stafilococi ( celule n aglomerri neregulate). Bacilii, ca i cocii, pot rmne alipii dup diviziune, formnd diplobacili sau streptobacili, nlnuiri prezentnd aspect de filamente mai mult sau mai puin lungi, mai mult sau mai puin sinuoase. Lungimea filamentelor depinde de condiiile de cultur, n special pH-ul mediului, temperatur, prezena alcoolului, viteza de multiplicare i agitaia lichidului. STRUCTURA CELULEI LA BACTERIILE LACTICE Bacteriile sunt celule procariote. Ele se deosebesc esenial de celulele eucariote (celulele vegetale i animale) att prin talia net inferioar, ct i prin organizarea lor, caracterizat de absena membranei ce separ nucleul de citoplasm i prin mecanismul lor de diviziune. Marea varietate a bacteriilor se datoreaz mai curnd diferenelor n ceea ce privete metabolismul i fiziologia lor dect deosebirilor morfologice. Structura tuturor celulelor bacteriene este foarte asemntoare i cuprinde trei elemente principale: nveliul celular, citoplasma i nucleul. NVELIUL CELULAR nveliul celular cuprinde peretele i membrana. Celula este delimitat de membrana citoplasmatic, dublat spre exterior de perete. Constituia membranei este relativ constant, n schimb a peretelui este mai variabil i permite diferenierea unor grupe mari de bacterii. ntre perete i membran, spaiul periplasmic este un gel mai mult sau mai puin fluid n care se deplaseaz proteina. Peretele care dubleaz membrana citoplasmatic poate fi el nsui nconjurat de un nveli exterior de natur organic vscoas, ea este perfect delimitat, constituind capsula. Importana sa este adesea legata de condiiile de cultur. La unele specii sau sue, capsula polizaharidic, adesea groas, particip la rezistena bacteriei contra unor agresiuni.

PERETELE CELULAR Peretele este scheletul rigid al celulei; el d celulei forma sa caracteristic sferic sau cilindric. Foarte solid, el rezist la presiunea osmotic intracelular enorm, care poate varia ntre 5 i 20 atmosfere. Plasat ntr-un mediu hipotonic, far el, celula se sparge; de aceea este un element esenial. Comportamentul celulelor n timpul testului colorat se explic prin structura peretelui: la Gram (+), peptiloglicanul este gros i este singurul constituent, la cele Gram(-), el este mai subire i acoperit de membrana exterioar. Substraturile nutritive, ionii minerali, vitaminele, apa traverseaz liber peretele, la fel ca i produii metabolismului bacterian. De asemenea, peretele asigura alte funcii importante n viaa celulei: este suportul antigenelor specifice i receptorilor bacteriofagilor. Constituentul principal i caracteristic al peretelui celulei bacteriene este peptidoglicanul, care este o macromolecul enorm ce nconjoar celula printr-o reea de lanuri polizaharidice i peptidice. Lanurile polizaharidice, lineare, paralele sunt reunite ntre ele prin puni peptidice.MEMBRANA CITOPLASMATIC Membrana celulei bacteriene are aceeai structur fundamantal ca i celelalte membrane biologice, fiind un dublu strat fosfolipidic n care sunt inserate proteine. Membrana citoplasmatic este unul dintre elementele vitale ale celulei bacteriene. Alterarea sa ncetinete schimbul cu mediul i mpiedic meninerea pH-ului intracelular. n special, mecanismele generatoare de energie care se deruleaz la nivel membranar sunt inhibate i viabilitatea celulelor este afectat. Lipidele membranare constituie totalitatea lipidelor bacteriene (95-99%). Ele cuprind puini acizi grai liberi dar mai ales glicerofosfolipide. Acizii grai din constituia lipidelor au lanuri carbonate de 10-20 atomi de carbon. Majoritatea sunt acizi cu 16-18 atomi de carbon, saturai sau nu. La bacteriile lactice exist i un acid ciclopropanic n C19 - acidul lactobacilic. Acizii grai posed o caten lung hidrocarbonat i o funcie acid carboxilic terminal. Lungimea catenei, nesaturarea ei, conformaia cis- sau trans- a dublelor legturi i, pentru bacteriile Gram pozitive, ramificarea izo- sau anteizo- caracterizeaz aceste molecule. Sinteza acizilor grai este realizat prin condensri succesive ale malonil-CoA pe acidul acetic pentru catenele cu numr par de atomi de carbon i pe acidul propionic pentru catenele cu numr impar de atomi de carbon. Acizii nesaturai sunt sintetizai la bacteriile anaerobe prin aciunea unei dehidrataze asupra acidului hidroxidecanoic format prin adiia unei uniti malonil asupra acidului octanoic. Prelungirea progresiv a acestui acid conduce la acidul cis-vaccenic (C18), el nsui precursor al acidului lactobacilic (C19). Aceast ultim trecere de la un acid nesaturat la acidul ciclopropanic corespunztor se realizeaz prin metilarea dublei legturi. Fosfolipidele cele mai abundente sunt constituite dintr-o molecul de glicerol la care o funcie alcool primar i funcia alcool secundar sunt esterificate de acizii grai. Cealalt funcie alcool primar este esterificat de acidul fosforic, el nsui esterificat de o nou molecul de glicerol. Bacteriile lactice conin, de asemenea, difosfatidil glicerol i esteri aminai ai fosfatidil glicerolului cu alanina i lizina. Coninutul n fosfolipide al bacteriilor variaz n funcie de stadiul de cretere i de condiiile de cultur. Glicolipidele, n general glicozide ale digliceridelor, se formeaz prin legtur ozidic la nivelul funciei alcool primare a unei gliceride cu un mono sau dizaharid glucoz, fructoz, ramnoz. Proteinele sunt de dou feluri: proteine intriseci (70%), care fac parte complet din membran i proteine periferice (30%). Primele sunt integrate n lipide prin partea lor hidrofob. Partea lor hidrofil iese la suprafa la interior sau la exterior. Proteinele periferice sunt legate prin interaciuni slabe de proteinele integrate sau de lipide. La interiorul dublului strat, proteinele sunt relativ mobile lateral. Fluiditatea membranei este legat de constituia sa n acizi grai. Astfel, de exemplu, bacteriile se pot adapta la o diminuare a temperaturii crescnd proporia de acizi grai nesaturai. CITOPLASMA Citoplasma conine enzimele metabolismului bacterian, dar reprezint i sediul sintezei proteinelor. Ansamblul metabolismului, reacii de degradare i de sintez se realizeaz n mod programat, n funcie de schimburile cu mediul exterior pentru a produce energia necesar creterii. La microscopul electronic cu transmisie, interiorul unei celule bacteriene apare granulos. Acest aspect este dat de ribozomi, care au un rol esenial n sinteza proteinelor, ei asigurnd traducerea codului genetic. Ribozomii sunt formai din dou subuniti de talie diferit, 50 S i 30 S. Ribozomul asamblat are o constant de sedimentare de 70 S (Svedberg). Subunitatea 30 S conine o molecul de ARN ribozomal 16 S (1542 nucleotide) i 21 molecule de proteine diferite. Masa molecular a acestui ansamblu este de 900 Da. Subunitatea 50 S conine dou molecule de ARN ribozomal, molecula 23 S i molecula 5 S de 2904 i 120 nucleotide. Ea conine, de aemenea, 35 proteine i are o mas molecular de 1600 kDa.NUCLEUL I MATERIALUL GENETIC Cromozomul bacterian este reprezentat de o singur molecul de ADN, de form circular i de talie diferit, n funcie de specie: 2400 kilobaze la Lactobacillus plantarum, 1400 kilobaze la Leuconostoc oenos, 1200 kilobaze la Pediococcus pentosaceus. Cromozomul nu este separat de citoplasm printr-o membran. El este localizat n partea central a celulei dar pare ataat n mai multe de membrana citoplasmatic, n special la nivelul mezozomului. Pot exista mai multe nuclee n celul deoarece diviziunea nucleului i a celulei nu sunt sincrone. Secvena nucleotidic dup care sunt asamblate cele patru nucleotide caracterizate de cele patru baze A, T, G i C constituie suportul genetic care este decodat n timpul traducerii. Cromozomul codific majoritatea informaiilor privind funciile vitale ale celulei, dar o serie de funcii, mai mult sau mai puin vitale, sunt determinate de plasmide, mici molecule de ADN circulare, complet independente de cromozom. Ele sunt n numr i talie variabile dup speciile i suele de bacterii i determin, n general, funcii ca alimentaia anumitor zaharuri, hidroliza proteinelor, rezistena la fagi, la antibiotice, la metale grele etc. Plasmidele se divizeaz dup acelei principiu de replicare ca i cromozomul sau n moduri mai specifice dar n orice caz n mod total independent. Una dintre caracteristicile plasmidelor este instabilitatea lor astfel nct anumite caractere fenotipice pot fi pierdute spontan n cursul generaiilor, dar adesea exist mai multe copii pe celul ale unor plasmide.CARACTERISTICI ALE LACTOBACILILOR Genul Lactobacillus cuprinde specii oarecum asemntoare, dar morfologia i gruparea celulelor lor permit diferenierea acestora, unele specii prezint numeroase caractere metabolice identice, precum capacitatea de a asimila numeroase substraturi. Diferenierea speciilor de bacterii lactice se bazeaz pe morfologia lor i pe caracterul homofermentativ sau heterofermentativ al acestora. Bacteriile homofermentative produc peste 85% din acidul lactic pornind de la glucoz. Bacteriile heterofermentative produc, n afar de acid lactic, CO2, alcool etilic i acid acetic. Lactobacilii pot prezenta ambele componente i sunt mparii n trei grupe: strict homofermentativi (grupa I); heterofermentativi facultativ (grupa a II-a); heterofermentativi obligatoriu (grupa a III-a) Lactobacilii homofermentativi strict nu fermenteaz pentozele i formeaz, pornind de la o molecul de glucoz, dou molecule de acid lactic pe calea Embden-Meyerhoff. La heterofermentativii facultativ, din glucoz rezult, de asemenea, dou molecule de acid lactic, dar pentozele sunt metabolizate n acid lactic i acid acetic pe calea heterofermentativ a pentozofosfailor. Bacteriile heterofermentative obligatoriu nu posed fructozo-1,6-difosfat-aldolaza, caracteristic pentru calea Embden-Meyerhoff. Ele metabolizeaz glucoza pe calea pentozofosfailor n CO2, acid lactic, acid acetic i alcool etilic; pentozele sunt transformate n acid lactic i acid acetic, ca i n cazul bacteriilor din grupa a II-a.

Tabelul 2.

BaciliHeterofermentativi facultativ (grupa a II-a)Lactobacillus casei

Lactobacillus plantarum

Heterofermentativi obligatoriu (grupa a III-a)Lactobacillus hilgardii

Lactobacillus fructivorans

Lactobacillus brevis

Determinarea genului bacteriilor lactice din genul LactobacillusMorfologieCelule alungiteBacili

Aranjarea celulelorPerechi sau lnioare

Fermentarea glucozeiHeterofermentativ sau homofermentativ

Izomerul acidului lacticL, D sau D, L

Pentru stabilirea cu rigurozitate a speciei de bacterie probiotic se impun metode fenotipice i genotipice (bazate pe structura ADN) [6]. Denumirea bacteriei trebuie s fie conform cu Lista Denumirilor Aprobate pentru Bacterii [6,104] sau lista de validare publicat n Jurnalul Internaional de Microbiologie Sistematic i Evolutiv [6,105] sau n Codul Internaional al Nomenclaturii Bacteriilor [5,31]. Pnetru stabilirea cu exactitate a tipului de tulpin, electroforeza pe gel n cmp pulsat este standardul maxim [6,26]. Tulpina probiotic trebuie depozitat ntr-o colecie de culturi recunoscute i standardizate genomic.V. Mecanisme de aciuneModularea sistemului imunitar esutul limfoid intestinal este cel mai mare n dimensiuni comparativ cu alte zone ale corpului. Este binecunoscut faptul c bacteriile sunt extrem de importante pentru dezvoltarea i funcionarea sistemului imunitar la acest nivel, fiind de fapt mecanismul de aprare mpotriva infeciei cu ageni patogeni ( Cebra, 1999, Falk et al, 1998 ) . esutul limfoid intestinal are contact cu componentele alimentare, antigenii i cu bacteriile benefice sau patogene . Antigenele, substane care pot declana un rspuns imun, intr n organism prin mucoasa intestinal, care are un rol esenial n controlarea imunitii la invazia bacteriilor patogene . Adaptabilitate la diferite antigene este extrem de important dac avem n vedere c masa intestinal are o compoziie frecvent schimbat. Cea mai mare cantitate de antigen este eliberat de la primul contact cu mucoasa intestinal ( Sanderson i colab., 1993). Dup traversarea barierei epiteliale prin transcitoz, ele sunt restructurate printr-un proces de degradare lizozomal. Un test suplimentar este prezena celulelor M (celule de epiteliu folicular asociate cu esutul limfoid ), urmate de celulele T ( celule limfocitare aparinnd grupului de celule albe din snge ), care sunt apoi difereniate ca celule care mediaz un rspuns imun i promoveaz diferenierea celular i secretoare de IgA ( imunoglobulina A ) ( Strober i colab., 1998). IgA este un anticorp care joac un rol crucial n imunitatea mucoaselor. Prin intermediul receptorilor TLR ( Toll- like receptori ), celule dendritice ( DC) i celule T, probioticele duc la scderea secreiei de TH-1 ( limfocite implicate ntr-un rspuns imun mbuntit ), IL-12 (interleukina care este produs n mod natural de celulele dendritice ), TNFa ( citokine inflamatorii ) i IFN- ( citokine care sunt vitale pentru imunitatea nnscut i dobndit), toate fiind responsabile pentru izbucnirea proceselor inflamatorii intestinale.Mecanismele prin care celulele epiteliale fac diferena dintre microorganisme probiotice i patogene par s fie diferite. Bacteriile patogene induc un rspuns pro-inflamator n celulele epiteliale prin activarea factorului de transcripie NF - kB. Comparativ cu aceste bacterii, speciile nepatogene pot atenua rspunsul pro - inflamator prin blocarea acestui factor ( Neish et al., 2000) .S-a constatat c administrarea de L. rhamnosus HN001 i Bifidobacterium lactis HN019 stimuleaz activitatea limfocitelor citotoxice. Stimularea activitii limfocitelor citotoxice este corelat cu secreia de IL - 12, o alt citokin implicat n activitile probioticelor, asemntor studiului n care s-a administrat L. casei Shirota ( Takeda i colab., 2006 ) . Aceste studii sugereaz c probioticele pot juca un rol important n stimularea activitii limfocitelor citotoxice care au un rol direct n prevenirea dezvoltrii tumorilor maligne. De asemenea, se pare c rolul probioticelor n fagocitoz i activitatea limfocitelor citotoxice este vital n special la vrstnici, care au un sistem imunitar compromis ( Arunachalam et al., 2000, Gill et al., 2001, Gill et al., 2001).Calitatea i cantitatea de probiotic din preparat influeeaz secreia de IL-8 prin intermediul enterocitelor. IL-8 este asociat cu dezvoltarea inflamaiei intestinale. Date recente arat c atunci cnd celulele epiteliului intestinal sunt incubate cu L. rhamnosus GG, este redus cantitateade IL-8 produsde enterocite(Zhang et Co., 2005). n multe cazuri, s-a observat c enterocitele produc IL-8 i alte citokine n prezena probioticelor, precum IL-6 (Ruiz i Co., 2005). Stimularea IL-6 a fost obinut prin administrarea L. casei CRL431 i a L. helveticus R389 (Vinderola i Co., 2005).Deci, fiecare probiotic este caracterizat prin prisma influenei sale asupra sistemului imun. Urmtorul obiectiv ar putea fi determinarea componentelor exacte din fiecare tulpin probiotic, care ar fi direct implicate n declanarea rspunsului imun. Probioticele pot influena sistemul imunitar prin diferii metabolii, prin componentele peretelui celular sau prin ADN.Inhibarea bacteriilor patogeneMediul gastrointestinal conine o mare varietate de elemente, de la flora benefic alimentar i microbian la bacteriile patogene duntoare. Organismul mamiferelor lupt mpotriva acestor bacterii patogene prin diferite moduri: blocarea efectelor bacteriilor patogene prin producerea de substane bactericide i prin competiie cu ageni patogeni i toxinele acestora necesare aderrii la epiteliul intestinal, reglementarea raspunsurile imune prin creterea imunitii nnscute i modularea inflamaia indus de agentul patogen, prin intermediul cilor semnalizatoare care regleaz rspunsul receptorilor toll-like; reglementarea homeostaziei epiteliului intestinal prin stimularea supravieuirii enterocitelor, mbuntirea funciei de barier i stimularea rspunsurilor protectoare ( Corcionivoschi i Co., 2009). Strategia se bazeaz pe capacitatea bacteriilor probiotice de a lega patogeni n esutul epitelial intestinal. Aciunea anti-patogen a probioticelor const n producia de acid lactic care scade pH-ul, interaciunea cu toxinele produse de agenii patogeni, producerea de peroxid de hidrogen i sinteza bacteriocinelor.

Figura 1. Schema diferitelor mecanisme de aciune a probioticelor prin care se obin diverse efecte terapeuticeProducerea de substane antimicrobiene (bacteriocine), in situ, n intestin poate fi mbuntit prin creterea capacitii bacteriilor probiotice de a adera la mucoasa intestinal. Colostrul bovinelor conine substane care pot tripla capacitatea speciilor de Lactobacillus casei de a adera la linie de celule intestinale. Cu toate acestea, producia in situ de substane microbiene afecteaz microflora intestinal benefic a organismului gazd (Sanders, 1993). Studiile in vitro pe linie de celule umane ajut la nelegerea modului n care probioticele reuesc s adere la epiteliul intestinal. Ulterior, ele mimeaz bariera intestinal pe care microorganismele patogene trebuie s o treac pentru a intra n circulaia sistemic i reuesc, cu ajutorul receptorilor, s lege aceste microorganisme, mpiedicnd adeziunea la epiteliul intestinal i, deci, manifestarea efectelor duntoare.Inhibarea aciunii patogenilor se mai realizeaz i prin producerea unor metabolii, de exemplu acidul lactic sau peroxidul de hidrogen, care creeaz implicit o scdere a pH-ului, la care patogenii sunt oprii din dezvoltare (Apella & Co., 1992). Supernatantul derivat de la culturi de L. rhamnosus Lcr35 au efect inhibitor asupra a nou tipuri de bacterii patogene: E. coli (ETEC), E. coli (EPEC), Klebsiella pneumoniae, Shigella flexnerii, salmonella typhimurium, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis i Clostridium difficile (Forestier & Co., 2001).Eficacitatea probioticelor a fost demonstrat nu numai n ce privete tulburrile tractului gastro-intestinal, dar i n prevenirea i tratarea infeciilor tractului uro-genital, fiind testate pe pacieni sntoi, de sex feminin, diagnosticai cu infecii uro-genitale. Rezultatele testelor au sugerat efectele benefice ale utilizrii probioticelor n prevenirea infeciilor de tract uro-genital. (Petricevici & Co., 2008). Studiile ulterioare ar trebui s se axeze pe stabilirea cu o mai mare acuratee a spectrului de aciune, a tipului de bacterie patogen, asociat cu stabilirea dozei eficace i a timpului de derulare a tratamentului.Pn n acest punct am prezentat mai mult sau mai puin exhaustiv mecanismele prin care probioticele sunt implicate n prevenirea efectelor duntoare ale patogenilor, precum competiia pentru nutrieni, inhibarea interaciunii patogenilor cu mucoasa intestinal, ocuparea competitiv a siturilor de adeziune la substrat, producerea de metabolii cu rol inhibitor n multiplicarea bacterian i stimularea imunitii mucozale (Steer & Co., 2000).

Orientri privind evaluarea microorganismelor probioticeTulpinile probiotice umane ar fi de preferat s aib o origine uman. Mai mult, dezvoltarea unui probiotic include multe etape i stadii intermediare, precum descrierea caracteristicilor fiziologice i metabolice, evaluarea proprietilor biologice (rezistena la secreiile gastrice, biliare i pancreatice sau la spermicide pentru probioticele vaginale), producerea de compui antimicrobieni, adeziunea la celulele epiteliale i colonizarea mucoasei, determinat n general prin teste in vitro, dar mai ales eficacitatea terapeutic dovedit prin studii in vitro i in vivo preclinice i clinice [5-14,26,36-38].Pentru o presupus tulpin probiotic, este important de stabilit mecanismul de aciune. De fapt, un singur mecanism de aciune pentru toate probioticele poate genera efecte diferite [39]. Dei nu este esenial, este foarte util, din motive tiinifice, s se stabileasc mecanismul de aciune, pentru a fi asociat cu orice efect fiziologic aprut. Multiplele interaciuni microb-microb sau microb- gazd sunt observate pentru a stabili versatilitatea aciunilor probioticului i efectele sale asupra patogenilor, asupra epiteliului intestinal sau asupra sistemului imunitar al gazdei. [4-6,8,22,39-44]. Multe tulpini probiotice pot produce in vitro una sau mai multe substane antimicrobiene peroxid de hidrogen, acizi organici, diacetil, bacteriocine sau molecule bacteriocin-like- care pot proteja gazda de invazia i multiplicarea patogenilor. Multiple mecanisme, altele dect activitatea antimicrobian, pot fi de asemenea implicate: adeziunea microbian competitiv la celulele peretelui intestinal prin receptori de legtur pentru enteropatogeni stimularea factorilor intrinseci de activare a sistemului imunitar. Oricum, niciunul din aceste mecanisme de aciune nu s-a dovedit a fi componenta cheie n meninerea sntii umane, de aceea cerecetrile n acest domeniu continu [9,41].Pentru a studia proprietile funcionale i principiile de operare a coloniilor microbiene intestinale, precum i a consecinei administrrii probioticelor, este important s studiem sisteme model simplificate. Un studiu recent pe un cobai gnotobiotic (ale crui tulpini microbiene sunt cunoscute) a oferit date despre cum microflora rezident i tulpini ale unor probiotice frecvent utilizate i pot adapta substratul ca rspuns una alteia i ilustreaz att relaiile generale ct i pe cele specifice dintre o gazd, un component al microbiotei indigene i o specie microbian administrat intenionat [45].Mai mult, tulpinile probiotice pot genera att rspuns imun nespecific, ct i specific la subieci sntoi sau bolnavi [22,3640,42,46].Una din cerinele de baz ale unui produs terapeutic este i sigurana terapeutic. De aceea, tulpinile utilizate ca probiotice trebuie s fie sigure [6,11], dei teoretic, ele pot fi responsabile de numeroase efecte adverse, incluznd infecii sistemice, efecte metabolice, imunodeprimare sau efecte mutagene [8,13,26,39]. Corelaii documentate ale unor cazuri de infecii generate de consumul de probiotice septicemie sau endocardit- sunt extrem de rare i ntlnite numai la pacieni imunocompromii sau postoperator, unde translocaia bacterian este o cauz major de infecii ce poate rezulta din multiplicarea bacterian extrem, i care produce creterea permeabilitii sau chiar distrugerea barierei mucoasei intestinale i prbuirea sistemului imun [6,47]. Tulpina incriminat de producerea infeciei a fost Lactobacillus rhamnosus GG, dar este foarte posibil ca identificarea la nivelul genului sau speciei sa fi fost defectuoas [6,32,39,47]. Niciun studiu bine documentat despre infecii produse de Bifidobacterii nu a fost raportat [6]. Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis i Saccharomyces boulardii au fost suspectate i propuse ca poteniale cauze de infecii clinice, n special septicemie [6,39].Cteva proprieti intrinseci ale Lactobacillilor i Bifidobacteriilor, asociate sau nu cu activitatea lor metabolic, au fost incriminate de a fi implicate n tulburri patologice umane. Aceste proprieti includ deconjugarea i dehidroxilarea excesiv a srurilor biliare, degradarea stratului de mucus intestinal de ctre glicozidaze i proteaze, alte activiti enzimatice, agregarea trombocitelor, colonizarea i producerea de metabolii toxici i factori viruleni, precum i mutagenitatea [6,23,26,32,39]. Mai mult dect att, este ectrem de important s cunoatem contraindicaiile specifice fiecrui grup. Besselink & Co. Au demonstrat recent c utilizarea profilactic a probioticelor poate fi asociat cu ischemie intestinal la pacienii cu predispoziie la pancreatit acut sever [48].Rezistena la antibiotice a LAB, inclusiv a Lactobacililor, poate aciona ca un rezervor de gene rezistente la antibiotice, care pot prezenta un posibil risc asupra sntii, prin transferul acestor gene asupra microbiotei indigene a TGI, i de aici la bacteriile patogene, oferind patogenilor o nou surs de rezisten antibiotic, alta dect cea intrinsec. Speciile de Lactobacilli i Bifidobacterii pot afia rezisten intrinsec non transmisibil (specie-dependent) sau o susceptibilitatea variabil la cteva antibiotice i chimioterapice glicopeptide, aminoglicozide, metronidazol, acid fusidic, cefalosporine, sulfamide, chinolone sau fluorochinolone. Genele care confer rezisten intrinsec au fost caracterizate pentru speciile de Lactobacilli, dar sunt necunoscute pentru Bifidobacterii [32,39,47,49-65,106]Pentru speciile Lactobacillus i Bifidobacterium, niciun test de sensibilitate standard nu este general acceptat. Institutul pentru Standarde Clinice i de Laborator a publicat n 2006 liniile directoare pentru testarea sensibilitii antimicrobiene a bacteriilor izolate rar sau foarte pretenioase, incluznd aici speciile de Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus, i au oferit puncte de reper interpretative pentru a putea previziona succesul clinic [66]. Pentru a preveni transferul nedorit al genelor responsabile de rezistena antibiotic bacteriilor endogene, probioticele umane sau animale nu ar trebui s prezinte elemente mobile purttoare de rezisten. Evaluarea siguranei probioticelor ar putea fi limitat la prezena markerilor transmisibili ai rezistenei la antibiotice. Din moment ce nu exist limitri pentru a distinge tulpini probiotice cu rezisten transmisibil la antibiotice, au fost definite n mod oficial pentru LAB sau Bifidobacterii, punctele de reper microbiologice sugerate de Grupul tiinific pentru Aditivii i Produsele sau Substanele utilizate n Hrana Animalelor (FEEDAP) sunt, n general, utilizate [52].Un criteriu important pentru evaluarea funciilor probiotice este fundamentarea funcionalitii acestora, caracterizat prin studii umane i pe animale, dar i prin analiza in vitro pentru a gsi markeri valizi ai structurii i funciei n corpul uman (de exemplu, nivelurile grupelor de microorganisme din fecale sau concentraii sanguine de markeri imunitari).Grupul de lucru al FAO(Food and Agriculture Organization) recomand ca metodele standard pentru evaluarea clinic s se desfoare n 4 stadii: Faza I evaluarea siguranei Faza II evaluarea eficacitii prin studii randomizate, dublu orb, controlate placebo i a efectelor adverse Faza III evaluarea eficienei terapeutice prin comparare cu un standard terapeutic (doar pentru suplimentele alimentare i produsele farmaceutice) Faza IV farmacovigilena. Rezultatele din trialurile pe indivizi trebuie repetate pentru confirmare. n unele cazuri, modelele animale exist pentru a oferi fundamentarea efectelor in vitro i determinarea mecanismelor de aciune ale probioticelor.Testele ulterioare pentru studierea mecanismelor de aciune ale tulpinilor probiotice i impactul acestora asupra activitilor metabolice ale microbiotei intestinale, ar putea s se bazeze pe cobai model gnotobiotic mai elaborat, aa cum a fost propus de Sonnenburg & Co. [45].n ceea ce privete caracteristicile tehnologice ale potenialelor tulpini probiotice, prezint o egal importan stabilitatea genetic n timpul creterii, meninerea viabilitii pe perioada conservrii, transportul i depozitarea [6,11,13,26,69,70].Studiile diferiilor autori au artat c unele produse comerciale nu dein o identificare adecvat i nici o cuantificare corect a UFC ale speciilor prezente[56,70-72]. Mai mult, unele produse folosesc denumire incorect, care nu se regsete n clasificarea Colecia American a Tipurilor de Culturi, de aceea nu are validitate tiinific. De aceea, produsele care au o utilizare specific pentru sntatea uman sunt permise numai dup o evaluare atent a probioticelor-medicamente, care trebuie obligatoriu s treac prin faza III a studiilor clinice [8].

VI. Proprieti ale bacteriilor lacticeLAB sunt, n general, microorganisme Gram+, lipsite de citocrom, care prefer condiii anaerobe, dar sunt i facultativ aerobe, pretenioase, toleran la pH acid, strict fermentative, producnd acid lactic ca i component de baz (Stiles&Holzapfel, 1997). Cele mai importante genuri sunt: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc i Bifidobacterium. Bazndu-ne pe coninutul de guanin-citozin, bacteriile Gram+ se impart n dou ramuri filogenetice principale: ramura Actinomycetes, unde sunt incluse bifidobacteriile care au un coninut crescut de G-C n structura ADN, mai mare de 55-67%, celelalte genuri, cu un coninut mai mic de 55% fcnd parte din ramura Clostridium. Totui, datorit unor proprieti fiziologice i biochimice asemntoare cu LAB tipice, bifidobacteriile sunt considerate ca fcand parte din grupul mare al bacteriilor lactice. (Stiles&Holzapfel, 1997)Microorganismele ce fac parte din grupul bacteriilor lactice sunt, n general, mprite n dou grupuri distincte, lund n considerare metabolismul carbohidrailor. Astfel, grupul homofermentativ constituit din Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus i civa lactobacili utilizeaz calea glicolitic Embden- Meyerhoff-Parnas pentru a transforma glucoza n acid lactic. n opoziie cu acest grup, grupul heterofermentativ produce amestecuri echimolare de acid lactic, CO2, etanol i acid acetic din glucoz, pe calea pentozofosfailor. n acest grup includem genurile Leuconostoc, Weissella i unii lactobacili. Exist ntre acetia i specii care sunt att homofermentative, ct i facultativ heterofermentative.

VII. Criterii de selectare a Lactobacililor cu proprieti probioticeImportana cunoaterii aprofundate a caracteristicilor fiziologice, fizico-chimice i biologice ale tulpinilor de probiotice a fost subliniat n multiple articole, pe ea bazndu-se, de fapt, succesul terapiei cu Lactobacilli. Pentru aceasta este necesar ca preparatul s ndeplineasc o serie de cerine: tulpina trebuie s reprezinte un locatar normal al aparatului, non-patogenic, capabil s colonizeze zona int i s elibereze bacteriile benefice n concentraii mari, de 107-109 UFC/mL-1. Dei au existat de-a lungul timpului numeroase criterii sugerate i recunoscute (Mattile-Sandholm, Myllarinen, Crittenden, Fonden&Saarela, 2002; Ouwehand, Kirjavainen, Shortt&Salminen, 1999; Reid, 1999), s-a realizat o list de criterii de ctre FAO/WHO, n 2002, expus n Tabelul 2,Tabelul 2. Criterii de selectare a probioticelor i proprietile vizate

Criteriul Proprietatea

SiguranaOriginea

Patogenitatea i capacitatea de infectare

Factori de virulen-toxicitate,activitate metabolic i proprieti intrinseci( rezistena antibiotic)

TehnologiaTulpini stabile genetic

Viabilitate crescut n timpul procesrii i stocrii

Proprieti senzoriale bune

Rezistena la fagocitoz

Producere pe scar larg

FuncionalitateaToleran la acid gastric i sruri biliare i pancreatice

Tolerana la aciunea biliar

Adeziunea la suprafaa mucoaselor

Efecte benefice asupra sntii validate i documentate

Proprieti fiziologice doriteImunomodularea

Activitate antagonic mpotriva patogenilor gastrointestinali (Helicobacter pylori,Candida albicans)

Metabolizarea colesterolului

Metabolizarea lactozei

Proprieti antimutagene, anticancerigene

Primul pas n selectarea probioticului este ncadrarea sa taxonomic, care ne ofer indicii asupra originii, habitatului normal i caracteristicilor sale fiziologice. Clasificarea bacteriilor lactice se realizeaz n funcie de structura fenotipic i genotipic. De-a lungul timpului s-au descoperit metode rapide i de o acuratee crescut care fac posibil clasificarea corecta a tulpinii. Tulpini nrudite se pot separa utiliznd metode bazate pe investigarea ADN profilul plasmidic, analiza enzimatic, tipul ribonucleic, electroforeza n cmp pulsat (Holzapfel, Haberer, Geisen, Bjorkroth&Schillinger, 2001; Vuaghan, Heilig, Ben-Amor& de Vos, 2005). Pn de curnd, era imperativ specificarea originii tulpinii probiotice, ns noile reglementri ale FAO/WHO consider c este mai important specificitatea probioticului dect originea sa, avnd n vedere c, la natere, intestinul uman este, teoretic, steril. Este solicitat, de asemenea, testarea siguranei i a profilului facultativ patogenic al tulpinilor incluse n uz comercial, dei au existat extrem de puine cazuri documentate de infecii generate de unele specii de Lactobacili (Salminen & Co., 2006). Un alt aspect important este rezistena la antibiotice a probioticelor, datorat unor gene codificate de plasmide, deoarece, n cazul acestora, rezistena poate fi transmis ntre microorganisme, ceea ce ar duce n timp la crearea rezistenei crescute la antibiotice i a patogenilor. Un studiu a sugerat c prezena antibioticului poate facilita creterea rezistenei antibiotice a mutanilor (Marteau, 2001). De aceea, tulpinile probiotice trebuie testate asupra rezistenei antibiotice i, mai mult, asupra capacitii de a tranfera aceast proprietate, pentru a preveni instalarea unei rezistene antibiotice la bacteriile endogene sau chiar patogene.

VIII. Tulpini probiotice cu larg utilizare comercial

Plecnd probabil de la teoria lui Mecinikov, conform creia ranii bulgari dovedeau a avea o rat mai mare de supravieuire datorit consumului de bacterii lactice, industria lactat a nceput s dezvolte o serie ntreag de noi produse funcionale coninnd bacterii lactice benefice. Se estimeaz la ora actual c exist peste 70 produse cu coninut probiotic, comercializate n ntreaga lume (Shah, 2004). n mod tradiional, probioticele au fost ncorporate n iaurturi punctul de plecare ulterior s-a extins utilizarea lor n maionez (Khalil&Mansour, 1998), pine (Arihara&Co., 1998), brnzeturi i paste de brnz (Henriksson&Shah, 2006). Probioticele se pot ntlni i n lapte, kefir, sucuri de fructe, ngheat, diverse produse de panificaie. Consumul de produse cu coninut probiotic a crescut cu 12% din 2005 pn azi, n Europa de Vest, America i Japonia, ultima fiind cea mai prolific, avnd 53 de produse cu diferite tulpini de Lactobacili pe pia. Produsele conin n general lactobacili i bifidobacterii, unele neprezentnd importan ca i efecte benefice, ci doar cu rol de aditivi, pentru a crete perioada de valabilitate a produsului.Lactobacilii sunt ubiquitari n natur, se gsesc n orice mediu bogat n carbohidrai. Sunt microorganisme Gram+, nesporulate, non-catalazice-cu unele excepii- cu form de bastonae sau coci. Sunt organisme fermentative, microaerofilice i chemoorganotropice. Pe baza compoziiei G-C a structurii ADN, ele au, n general, un coninut 108 UFC/mL n colon. Meninerea viabilitii lactobacililor depinde de gazd, de vehicul, precum i de rezistena intrinsec a tulpinii selectate. Cteva dintre probiotice sunt distruse de sucul gastric, n timp ce doar cteva ating niveluri crescute n scaun. O mbuntire a modelelor in vitro, a alegerii tehnicilor de eantionare n intestin i a gsirii unor modaliti de ncredere pentru identificarea probioticelor n ecosisteme complexe, ar oferi perspective mari pentru nelegerea mai profund a parametrilor farmacocinetici reali i corelarea corect a relaiei doz-rspuns farmacologic (94). Condiionarea i etichetarea produselor cu coninut probioticMaterialele utilizate pentru condiionarea produselor cu coninut probiotic trebuie, n primul rnd, s fie impermeabile, rezistente la umiditate, de aceea unul dintre cele mai preferate materiale este sticla, deoarece este non-toxic, sigur pentru mediu i reciclabil. Plasticul nu se recomand, deoarece nu este complet impermeabil, uneori producnd i diverse mirosuri neplcute. La aceste condiionri trebuie adugai desicani, precum silicagelul, n sachete sau miniflacoane (15).Etichetarea produselor cu coninut probiotic se face conform standardelor NNFA (National Nutritional Food Association). O etichet convenional a unui produs probiotic trebuie s conin informaii despre: identificarea microorganismelor dup gen i specie, declaraie a numarului minim de celule viabile sau UFC/unitate de msur, dat de expirare sau termen de valabilitate i recomandri privind depozitarea. Produsele probiotice sunt nsoite de un prospect, care conine mai multe informaii pentru consumator, precum i pentru medic, informaii privind indicaiile terapeutice, posibilele efecte secundare i avertizarea de ase adresa medicului sau farmacistului n cazul apariiei oricrei reacii adverse (95).

XII. Caracterizarea proprietilor probioticuluiDiversele beneficii nutriionale i terapeutice ale probioticelor pot fi pe deplin exploatate numai dup acceptarea lor n lumea tiinific i definirea reglementrilor. De aceea sunt necesare nelegerea mecanismului lor de aciune i validarea complet. Diferitele modele in vitro au fost concepute pentru a verifica, cuantifica i certifica proprietile probioticelor, precum i mecanismele care stau la baza activitii lor (6). Dei este dificil s investighezi proprietile bacteriilor in vitro, aceste modele prezint beneficii din mai multe puncte de vedere (96).Probiotice orale Caracteristicile culturiiTrebuie controlate urmtoarele aspecte privind puritatea culturii, procesele de fermentaie i produii metabolici, deoarece toate acestea pot afecta stabilitatea sau chiar altera caracteristicile funcionale (97). Rezistena la aciditatea gastricAceast proprietate este asigurat in vitro prin incubarea culturilor alturi de o soluie tampon, la pH =2-3,4 i numrarea bacteriilor viabile la anumite intervale de timp. Acest aspect nu s-a realizat i in vivo, deci nu exist o validare a ratei de supravieuire realizabil n stomac (98). Rezistena la acizi biliariPlcile sunt analizate ntr-o manier similar testrii de rezisten la aciditatea gastric, fiind incubate cu bil porcin sau bovin de concentraie 0,3-7,5%, la 37oC, n condiii anaerobe, iar multiplicarea baterian este nregistrat dup 24, apoi 48 de ore (97). Tolerana la tranzitTolerana produsului la tranzit digestiv se realizeaz determinnd cantitatea de lactobacili viabili, la diferite intervale de timp, dup expunerea la mediu simulat gastric (pH=2) sau suc pancreatic (pH=8) i NaCl (0,5% m/V) a suspensiei de celule bacteriene (99). Capacitatea de multiplicareAcest parametru a fost testat in vivo pe oricei tineri, urmnd o metod validat. Astfel, s-a determinat greutatea iniial, cantitatea de mncare administrat, cantitatea de ap administrat i diferena de greutate nregistrat la un anumit interval de timp. Rezistena in vivoTradiional, aceast determinare se realiza prin analiza scaunului unor pacieni sntoi crora li s-au administrat probiotice trei luni de zile i determinarea cantitii totale de lactobacili, nainte, n timpul i dup sistarea administrrii produsului (87). Deoarece testele au condus la o subestimare a capacitii de colonizare, acest parametru este msurat astzi n mucoasa colonului prin colonoscopie i biopsie (101). Diverse proprieti ale probioticelor oraleSimulatorul Ecosistemului Intestinal Uman este un model bine caracterizat pentru probioticele orale, avnd 6 compartimente cu o compoziie microbian diferit, corespunznd stomacului, duodenului, jejunului, ileonului, colonului ascendent i descendent, expus la o temperatur normal a organismului uman de 37oC. Fiecare compartiment are un timp de remanen diferit i un volum de lucru diferit, astfel nct efectele pot fi studiate separat. Acest model simuleaz cu exactitate condiiile in vivo i influena microbiotei intestinale asupra activitii metabolice.Probiotice vaginale Capacitatea producerii de biosurfactaniAceast proprietate poate fi caracterizat fie prin metoda picturii, folosind Analiza Axisimetric a Formei Picturii, fie prin msurarea capacitii de inhibare a aderrii patogenilor la suprafaa polimerilor. Ultimele analize utilizate implic aderarea suspensiei de celule la pereii plcilor de polistiren, urmat de incubare, dup care bacteria aderent este evideniat prin colorare (107,108). Capacitatea producerii de peroxid de hidrogen H2O2Lactobacillus este cultivat ntr-un mediu coninnd tetrametilbenzidin i peroxidaz din hrean n condiii de anaerobioz. Timpul necesar apariiei coloraiei albastre este o msur a capacitii de producere a peroxidului de hidrogen.

Parametri de multiplicare intravaginalModelul Gompertz este unul dintre modelele statistice utilizate pentru a obine date despre creterea bacterian. Unul din avantajele acestui model este acela de a permite calcularea ratei maxime de cretere utiliznd doar un punct de pe curb (numit punctul de maxim ndoire), ceea ce nu era posibil cu metodele tradiionale (109). Testul de co-agregareSuspensia cu lactobacili i uro-patogeni este incubat, apoi proba analizat n microscopie cu lumin inversat, cu sau fr coloraie Gram, pentru determinarea gradului de agregare, unde 0 reprezint lipsa agregrii, iar 4 reprezint maxim de agregare (75).Proprieti comune att probioticelor orale ct i celor vaginale AdeziuneaAceasta proprietate presupune detrminarea unor proprieti diverse, precum legarea de suprafee solide ca polistirenul, capacitate de agregare, hemaglutinare i adeziune la straturi unicelulare de culturi celulare (110,111). Sub acest aspect, exist numeroase rezultate obinute pe modele in vitro, precum non-mucus/linie celular secretoare de mucus (112); intestinul gros/modelul colon, esut colonic uman obinut prin rezecie (113) sau mucus din intestinul subire canin (114). Activitate antimicrobianAceast analiz poate fi modificat i aplicat la preparate cu mediu de cultur solid sau lichid, unde uro-patogenii i lactobacilii sunt adugai n mediu, iar creterea este comparat cu martorul (115-117.) Viabilitate i proprieti n timpul procesrii i depozitriiTehnica numrrii n plac este cea mai frecvent utilizat metod n acest scop, ns au aprut i noi tehnici, precum flow cytometry i fluorimetria (36).XIII. Aspecte privind sigurana probioticelorMajoritatea utilizrilor iniiale ale lactobacililor au vizat domeniul nutriie muli ani. Faptul c utilizarea lor ndelungat i originea lor uman, a fcut s nu existe suspiciuni asupra siguranei utilizrii acestora (6). Totui, s-a ajuns n acest moment la necesitatea de a demonstra sigurana utilizrii lor, deoarece au existat cteva cazuri documentate de infecii ale unor rni, endocardite bacteriene i chiar infecii n snge produse prin asocierea Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus i Bifidobacteria. De asemenea, datorit recentelor descoperiri n domeniul geneticii, tehnicile de recombinare i nu n ultimul rnd probioticele vectori, demonstrarea siguranei este imperios necesar, mai ales n cazul pacienilor imunocompromii (118). Acest aspect al siguranei devine cu att mai important de demonstrat atunci cnd vrem s administrm un produs cu bacterii vii la o gravid sau la sugari. Nu s-au raportat nc efecte adverse la L. rhamnosus GG (95).De aceea, probioticele trebuie cercetate i evaluate cu mare atenie, n funcie de urmtorii factori: ncadrare taxonomic Patogenitate i infeciozitate Activitate metabolic Activitatea de agregare plachetar i degradarea mucosal Transferul genelor i rezistena plasmidelor codificateXIV. Evaluarea i controlul calitii produselor probioticeXV. ReglementriXVI. Probioticele viitoruluiXVII. ConcluziiXVIII. Referine 1. Metchnikoff, E., The prolongation of life optimistic studies- Lactic acid as inhibiting intestinal putrefaction, 1907, Ed. Heinemman, London, UK 161- 183.2. Lilly, D.M.; Stillwell, R.M., Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms, 1965, Revista Science 147, pg. 747-748.3. Fller, R., Probiotics in man and animal, 1989, Journal of Applied Bacterilogy 66, pg. 365-378.5. Joint FAO/WHO Expert Consultation. Health and Nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. Joint FAO/WHO Expert Consultation, Cordoba, Argentina, 1-4 October 2001. *Clear and detailed introduction to the multidisciplinary aspects of probiotics.6. Guidelines for the evaluation of probiotics in food: Joint FAO/WHO Working Group meeting, London, UK, ON, Canada, 30 April-1 May, 2002.7 Guarner F, Malagelada JR. Gut flora in health and disease.Lancet361, 512-519 (2003).8 Saarela M, Mogensen G, Fondn R, MttJ, Mattila-Sandholm T. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties.J. Biotechnology84, 197-215 (2000).9 Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCornick JK. Potential uses of probiotics in clinical practice.Clin. Microbiol. Rev.16(4), 658-672 (2003).10 Mercenier A, Pavan S, Pot B. Probiotics as biotherapeutic agents: present knowledge and future prospects.Curr. Pharm. Des.9(2), 175-191 (2003). *Stresses the multidisciplinary complexity of the research field and addresses the existing crossreaction between a number of key issues.11 O'Hara AM, Shanahan F. Mechanisms of action of probiotics in intestinal diseases.ScientificWorldJournal7, 31-46 (2007).12 Del Piano M, Morelli L, Strozzi GPet al.Probiotics: from research to consumer.Dig. Liver. Dis.38(Suppl.2), S248-S255 (2006). *Examines the sequential steps of research, from the identification of a possible probiotic strain to its production and marketing.13 Parvez S, Malik KA, Ah Kang S, Kim HY. Probiotics and their fermented food products are beneficial for health.J. Appl. Microbiol.100, 1171-1185 (2006). *Objective and up-to-date review of the health benefits of probiotics.14 Holzapfel WH, Schillinger U. Introduction to pre- and probiotics.Food Res. Int.35, 109-116 (2002).15 Falagas ME, Betsi GI, Athanasiou S. Probiotics for the treatment of women with bacterial vaginosis.Clin. Microbiol. Infect.13, 657-664 (2007).101 Food and Agriculture Organization of the United Nations www.fao.org102 World Health Organization www.who.int