Reactii imunologice utilizate in laboratorul clinic 1.Reactii de precipitare care pot avea loc prin difuzie in gel :-simpla bidimensionala -dubla bidimensionala-combinate cu migrare in camp electric : a.imunoelectroforeza b.imunofixare c.contraimunoelectroforeza d.electroimunodifuzie -difuzie in mediu lichid : a. in inel b.imunonefelometrie

2.Reactii de aglutinare :-directa -indirecta-inhibarea aglutinarii -mediata de anticorpi anti-imunoglobuline (Coombs,Waaler-rose)

3.Reactii de neutralizare:- cu participarea complementului : -RFC -determinarea imunohemolitica a C-cu reactivi marcati : -fluorocromi(imunofluorescenta) -enzime(ELISA) -izotopi (RIA)

Reactie de precipitare :difuzia in gel

Difuziile in gel pot fi grupate in 3 categorii :difuzii simple ,difuzii duble si difuzii combinate cu migrare in camp electric .Aceste reactii utilizeaza geluri de agar sau agaroza in concentratie de 0,8-1,5 % ,continutul mare de apa permitand moleculelor de Ag si Ac sa migreze liber in gel ;migrarea poate fi accelerata (contraimunoelectroforeza )sau determinate (imunoelectroforeza )de un camp electric .

Imunodifuzia simpla bidimensionala sau imunodifuzia radiala simpla (IDRS) ,imaginata de Mancini ,Carbonara si Heremans ,presupune difuzia unui reactant (aflat in faza lichida) intr-un gel in care este inglobat celalalt reactant.In aceasta tehnica unul dintre reactanti (de obicei Ac) trebuie sa fie in stare pura . Marimea haloului de precipitare este direct proportionala cu concentratia antigenului ce difuzeaza ,si invers proportionala cu concentratia anticorpilor si inaltimea stratului de gel in care acestia sunt inglobati ,temperature neinfluentand decat timpul de atingere a ariei finale de precipitare.Valoarea concentratiei antigenului (proteinei) se stabileste in functie de curba etalon trasata cu 3 dilutii (concentratii) ale produsului de referinta .Rezultatele se exprima in UI/ml ,mg%, µmol/l sau procentual.

Aplicatii in laborator:determinarea imunogramei (IgG,Ig M,Ig A,),C3,C4 executata pe imunoplaci livrate de IC.Utilitate diagnostica :imunograma -mieloame,boala Waldenstrom ,hipergamaglobulinemii policlonale ,deficite immune;C3 –in maladii autoimmune (in special in lupus eritematos diseminat),glomerulonefrita acuta poststreptococica ,hepatite cornice ;determinarea alfa 1 antitripsinei in boli pulmonare si unele neoplasme ;determinarea siderofilinei in unele tipuri de anemii.

Imunodifuzie radiala dubla (IDRD) sau dubla difuzie Ouchterlony consta in folosirea a placilor cu 4-6 godeuri rotunde dispuse in jurul unui godeu central ;liniile de precipitare se formeaza la distante constant pt fiecare complex Ag-Ac .Se utilizeaza in special pt evidentierea unor protein patologice ca :proteina C reactiva ,proteinele Bence-Jones tip kappa si lambda ,beta 2 microglobulina ,alfa-fetoproteina ,produsi de degradare ai fibrinogenului.

Imunoelectroforeza (IEF) asociaza electroforeza in gel cu dubla difuzie ,reactia Ag-Ac vizualizandu-se prin linii de precipitare corespunzatoare sistemelor Ag-Ac din reactie .IEF furnizeaza numai informatii calitative ,ilustrand in cazul componentelor monoclonale ale Ig ,clasa si eventual tipul imunoglobulinei patologice. Nu este indicata pt punerea unui diagnostic, ea fiind folosita in scop didactic –educativ.

Contraimunoelectroforeza(CIEF) reprezinta o dubla difuzie in care deplassarea Ag si Ac este accelerata deun camp electric .In gel de agar sau agaroza la pH 8,2-8,6 ,Ac se deplaseaza la catod (-) ,iar antigenele cu migrare anodica (numai unele proteine ca de ex.AgHBs,AFP,produsii D si E de degradare ai fibrinogenului ) se deplaseaza spre polul pozitiv ).Aceste deplasari se fac in ‘’sens contrar ‘’,iar difuzia in alte directii este impiedicata .Reactia este mai sensibila si mai rapida decat dubla difuzie (rezultatele se obtin in 15-90 minute),intrucat complexul Ag-Ac se realizeaza la concentratiile initiale si nu in gradient.CIEF furnizeaza informatii calitative si eventual semmicantitative .

Imunofixarea (IFX) cuprinde un grup de tehnici imunochimice care au in comun EF probei in gel,pe hartie ,combinata cu imobilizarea (fixarea) unui reactant de catre celalalt ,adica fie imobilizarea Ag de catre un Ac cunoscut ,fie invers .Urmeaza colorarea respectivelor precipitate .In laboratorul clinic tehnica se utilizeaza pt stabilirea clasei si tipului de imunoglobulina monoclonala ,pt diagnosticul imunochimic al bolii lanturilor grele si pt diag diferential al hipergamaglobulinemiilor policlonale de cele monoclonale .

Precipitare in mediu lichid :-reactia de precipitare in inel =Ag si Ac se pun astfel in contact incat sa nu se amestece ,la interfata celor 2 reactanti aparand un inel de precipitare .Reactia se foloseste in medicina legala pt identificarea originii petelor de sange si in industria alimentara pt stabilirea provenientei unor preparate pe baza de carne.-imunonefelometria =consta in faptul ca,in prezenta unei cantitati fixe de Ac sau Ag ,complexele Ag-Ac formate intr-o suspensie ,modifica intensitatea si dispersia luminii direct proportional cu concentratia Ag sau Ac.

Avantajele acestor reactii constau in rapiditatea obtinerii rezultatelor ,automatizarea determinarilor ,precum si in faptul ca determinarea cantitativa a unor polimeri se poate realize fara un preparat special de referinta .Dezavantajele nefelometriei rezida in costul ridicat al aparaturii si imposibilitatea determinarii directe a proteinelor in probele icterice ,hemolizate ,chiloase,metoda fiind limitata si de deficiente ce pot aparea in sistemele mecanice si electronice ale instalatiei .

Reactii de aglutinare

Aglutinarea reprezinta agregarea de particule prin anticorpi .Caracteristici :-aglutinarea are o sensibilitate mai mare decat precipitarea Ag fiind o particula si nu o molecula solubila -concentratiile mari de Ac pot inhiba reactia si produce fenomenul dde prozona -excesul de Ag nu inhiba reactia

Poate fi :-aglutinare directa (simpla ,clasica ) este aglutinarea antigenellor naturale ale unor particule de catre anticorpii specifici .Ex:determinarea grupelor sanguine ,aglutinerea bacteriana.-aglutinare indirecta (pasiva) este o reactie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii ,stafilococ-proteina A, latex ,bentonita)incarcate in vitro cu Agsau cu Ac ;ele sunt agglutinate de catre anticorpul respective antigenul ,omolog din proba .Ex .determinarea Proteinei C reactiva cu latex CRP,determinarea AgHBs cu latex HBs ,determinarea grupului streptococic cu ajutorul reactivului Streptic (strept-check),determinarea nivelului anticorpilor specifici anti –tetanici prin hemaglutinare.-inhibarea aglutinarii .Ex:diagnosticul immunologic de sarcina prin inhibarea aglutinarii hematiilor ,decelarea mioglobinei ,-aglutinarea mediate de anticorpi anti imunoglobulina:anticorpii anti-imunoglobuline aglutineaza particule incarcate (natural sau artificial) cu anticorpi .Ex.decelarea FR prin reactia Waaler-Rose sau Latex –FR,decelarea anticorpilor incompleti fixati la suprafata hematiilor prin testul Coombs.

Reactiile de aglutinare folosite in laborator pot fi calitative de screening (latex FR,reactia Coombs,DIS),effectuate pe lama sau in placi cu godeuri ,sau cantitative (reactia Waaler-Rose ,Coombs-cantitativ )executate in placi cu godeuri sau in tuburi.

Reactia de neutralizare

In cazul reactiilor de neutralizare ,Ag este reprezentat de un imunogen cu proprietati biologice (toxina ,enzima ,virus), anticorpii specifici determinand (in vivo sau/si in vitro)blocarea acestor proprietati .Ex.reactia ASLO

Reactii ce utilizeaza complementul

RFC=reactia de fixare a complementului –se foloseste complementul (alexina) si un system indicator (system hemolytic) .Complexul Ag-Ac fixeaza complementul iar hematiile sensibilizate adaugate ulterior raman intacte (absenta hemolizei=reactie pozitiva ) ;in lipsa complexului Ag-Ac specific (initial ) complementul se fixeaza pe hematiile sensibilizate (system indicator)producand hemoliza (hemoliza=reactie negativa).

Reactii cu reactivi marcati

Imunofluorescenta (IF)=unul dintre reactanti (antigenul sau anticorpul de cercetat)trebuie sa constituie o parte dintr-o structura biologica ,celula sau tesut ,reactivul marcat cu fluorocrom relevand reactia Ag-Ac.Poate fi directa si indirecta (tehnica ‘’sandwich’’,folosita pt decelarea de antigene si anticorpi in boli transmisibile , autoimmune , maligne. Imunofluorescenţa este folosită frecvent pentru detectarea anticorpilor si a autoanticorpilor pentru antigenele tisulare şi celulare (de exemplu, anticorpi antinucleari, anticorpi antimuşchi netezi, anticorpi anticelule parietale). Autoanticorpii apar în bolile autoimune.

Radioimunoanaliza (RIA) utilizeaza marcarea cu radioizotopi (125I, 131I, 3H, 14C, 32P);Principiul de bază al radioimunotestării este similar celui prezentat la testul ELISA. Diferenţa esenţială este aceea că markerul utilizat la ELISA este o enzimă, iar cel folosit în RIA este un izotop radioactiv (I125, P32).Tehnica ,initiata in cadrul endocrinologiei ,este obiectiva de mare sensibilitate ,in mare parte automatizata ,dar supusa unei legislatii restrictive (datorita radioizotopilor nocivi).RIA se foloseşte pe scară largă în chimia clinică, endocrinologia clinică şi toxicologie, dar nu reprezintă un test de rutină în microbiologia clinică. În practica curentă, metodele RIA includ teste pentru hormoni steroizi (cum ar fi aldosteronul, cortizonul, progesteronul) hormoni peptidici (corticotropina, hormonul corticostimulant, vasopresina). În unele laboratoare se mai utilizeazã metoda RIA pentru testarea markerilor pentru hepatita B (Ag HBs, Ac HBs, Ac HBc, Ag Hbe, Ac HBe) dar a fost, în genral, înlocuită de tehnica ELISA.

Testul RAST (radioallergosorbent test) este o variantă specializată a RIA, utilizată pentru a măsura cantitatea de anticorpi IgE serici care reacţionează cu un alergen cunoscut (antigen).

Analiza imunoenzimatica (ELISA ,EIA)Reactiile imunoenzimatice se pot realize in system omogen ,utilizate pt determinarea haptenelor si in system heterogen (metoda ELISA-enzime-linked-imuno-sorbent-assay). Enzimele cel mai des folosite sunt peroxidaza din hrean, fosfataza alcalina, beta-galactozidaza, glucozoxidaza, ureaza si catalaza. In functie de substratul clivat enzimatic utilizat se disting:

- EIA colorimetrice: utilizeaza substraturi cromogene, cum ar fi ABTS (sarea diamoniu a 2,2`-azino-di (3-etil-benzotiazolin-6-sulfonat) care formeaza cu H2O2 sub actiunea peroxidazei culoarea verde sau p-nitrofenil fosfat care formeaza culoarea galbena sub actiunea fosfatazei alcaline. Un spectrofotometru masoara densitatea optica a cromogenului rezultat.- EIA cu fluorescenta (FEIA): utilizeaza substraturi fluorescente, in urma reactiei enzimatice fiind generat un fluorofor, care emite lumina de o lungime de unda caracteristica in urma excitatiei sale luminoase optime. Instrumentul utilizat (fluorometru) necesita o sursa de lumina si un tub fotomultiplicator pentru detectia emisiei fluorescente. In proba de analizat pot exista substante care emit lumina fluorescenta care pot interfera cu sensibilitatea testului. Comparativ cu EIA colorimetrice testele fluorescente genereaza o intensitate a semnalului mai mare cu cel putin un ordin de marime. In laborator metoda FEIA este folosita pentru determinarea IgE specifice pentru diversi alergeni si a markerilor pentru afectiuni reumatismale.- EIA cu chemiluminiscenta (CL-EIA) utilizeaza substraturi chemiluminiscente care reactioneaza cu diferitele enzime folosite pentru marcare; reactia enzimatica chemiluminiscenta genereaza lumina.Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): reprezinta o metoda sensibila deoarece fiecare molecula de enzima poate converti multe molecule de substrat servind ca amplificator al reactiei. Enzimele produc produsi colorati care precipita, astfel incat nu difuzeaza de la locul de formare. In laborator testele ELISA sunt automatizate (ex: determinarea de testosteron liber, 17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac anticardiolipinici IgG, Ac antispermatozoizi, serologie paraziti, etc.).Avantajele analizei imunoenzimatice :tehnica este obiectiva ,poate fi automatizata ,foloseste reactivi cu o valabilitate convenabila ;este utilizata pt evidentierea anticorpilor (boli infectioase,boli autoimmune atat pt diagnosticare cat si pt monitorizare )sau a antigenelor (boli infectioas,boli neoplazice,endocrinologice ,farmacologie).Tehnica Western blot este o variantă a metodei ELISA. În această tehnică, proteinele virale separate prin electroforeză în funcţie de greutatea lor moleculară sau sarcina electrică sunt transferate (blotted) pe o hârtie de filtru (de exemplu, nitroceluloză, nylon). Când hârtia este expusã serului unui pacient, proteinele imobilizate capturează anticorpul viral specific şi este vizualizat cu ajutorul unui anticorp antiuman legat enzimatic.Tehnica Western blot este utilizată pentru a confirma rezultatele obţinute prin ELISA la pacienţii suspectaţi că ar fi infectaţi cu HIV, hepatite virale.

Teste imunochimice cu detectie prin electrochemiluminiscenta se bazeaza pe utilizarea unui complex al ruteniu cu tripropilamina (TPA) care genereaza lumina electrochimic in legatura cu un ciclu de reactie oxido-reducator.Chemoluminiscenta(emisie de lumina) =are la baza luminolul ,o ftalihidrazida ciclica care in mediu alcalin ,in prezenta peroxidului de hydrogen ,reactioneaza exoterm transformandu-se in aminonaftalat dianion in stare excitata si care prin dezexcitare emite o cuanta de lumina cu lungimea de unda maxima de 430 nm.Luminolul este folosit in politia criminalistica (pt deterctarea urmelor de sange sau amprente) ,in domeniul divertismentului dar si medical.

Necesar pt reactii imunochimice

Reactivii imunochimici sunt produse biologice (anticorpi, antigene, complement, hematii ) ce se utilizeaza pt determinari calitative sau/si cantitative de antigene sau anticorpi .Ex. seruri monospecifice antiproteina folosite in IDRS.-Persoanele care executa tehnici imunochimice trebuie sa verifice in permanenta instructiunile de utilizare a produselor ,intrucat permanenta optimizarea a acestora se reflecta si in modificarea instructiunilor respective .-Manipularea reactivilor imunochimici trebuie facuta tinand seama de toate normele de protectie in vigoare ,intrucat pt prezervare ,ei contin substante toxice (azida de sodium,mertiolat de sodium),iar prin prelucrarea lor (absorbtii in diferite lichide biologice) sau prin natura lor(amestecuri de seruri umane) ei pot contine AgHBs.

Imunoplacile sunt utilizate pt determinari cantitative a diverselor antigene ;ele sunt alcatuite din cutii de plastic transparente in interiorul carora este turnat gel .Pt utilizarea lor se tine cont de urmatoarele :-Nu vor fi introduse seruri hemolizate sau icterice in lucru -este gresita executarea determinarilor fara dispozitive (micropipette )care sa asigure introducerea unei cantitati de strict 5 µl de proba sau ser de referinta in godeurile placilor -in cazul de terminarilor de C3 serurile nu vor fi pastrate mai mult de 3-4 zile de la recoltare .In caz contrar ,chiar cu serurile pastrate la +4º C ,valorile obtinute sunt mai mari decat cele reale ,datorita clivarii componentei C3 a sistemului complement .Produse de referinta :serul uman de referinta ,care nu reprezinta un ser uman normal ,ci are o anumita concentratie de Ig care nu se schimba de la un lot la altul ,prezentat in forma liofilizata (care se dizolva in apa distilata si se pastreaza intr-un recipient inchis etans ,la +4º C.Truse :care contin reactivi ,produse de control sau standarde ,diluenti, tuburi, placi, pipete . Acest mod de livrare contribuie la simplificarea executarii tehnicii ,asigurarea unui control de calitate , posibilitatea obtinerii unor rezultate compatibile intre unitati.