1

RRAAPPOORRTT ŞŞTTIIIINNłłIIFFIICC ŞŞII TTEEHHNNIICC

EEttaappaa VV

22000099

CUPRINS

1. Obiective generale

2. Obiectivele fazei de executie

3. Rezumatul fazei

4. Descrierea stiintifica si tehnica

5. Concluzii

2

1. Obiective generale

Obiectivul general al proiectului de platforma (PYRAMID) propune crearea

infrastructurii necesare dezvoltarii cercetarilor in diagnosticarea precoce in patologia

maligna digestiva. Proiectul isi propune folosirea tehnicilor imagistice de ultima

generatie (autofluorescenta endoscopica, tomografie cu coerenta optica,

endomicroscopie confocala laser, etc.), generind crearea unui curent unificator, cu

integrarea cercetatorilor tineri in obiectivele si aria de cercetare FP7.

2. Obiectivele fazei de executie

In cadrul fazei de executie nr 5, derulata in intervalul 31/07/2009-27/09/2009,

s-a urmarit integrarea aparaturii de laborator achizitionate anterior precum si

efectuarea de masuratori comparative:

• A V.1. Integrarea laboratoarelor in cadrul platformei si interconectarea

aparaturii in circuitul retelei de calculatoare

• A V.2. Testare si masuratori comparative a dispozitivelor de tehnica medicala

3. Rezumatul fazei

Rezultatele obtinute folosind aparatura achizitionata în etapele anterioare au

fost selectate si comparate. Laboratoarele au fost integrate intr-un ciclu complet de

analiza.

4. Descrierea stiintifica si tehnica

Metodele folosite sunt proceduri de ultima generaŃie, ele completându-se

reciproc. O investigare completă asigura o şanse sporite de detecŃie precoce si

implicit reduce costurile afectate tratamentelor. Metodele folosite de catre platformă

3

îmbina tehnici standard noi precum autofluorescenta si microscopia confocala

laser cu tehnici aflate în fază incipientă de dezvoltare precum tomografia optic ă

coerenta şi cu analize genetice necesare cunoaşterii mecanismelor intrinseci ale

afecŃiunilor investigate.

Integrarea diferitelor laboratoare în cadrul platformei are ca rezultat o circulaŃie

optimă a rezultatelor şi imaginilor obŃinute cu ajutorul diferitelor metode în scopul

unei analize complete.

Caracteristicile si performantele sistemelor au fost descrise amanunŃit in

rapoartele anterioare, la momentul achiziŃiei. Integrarea lor se face prin intermediul

retelei IT achiziŃionate

Principiul autofluorescentei este bazat pe interactiunea dintre lumina cu o

anumita lungime de unda si fluoroforii din tesuturi. Sursele de lumina folosite includ

surse incoerente (ex. xenon) sau lumina laser monocromatica. Caracterul fluorescent

(profilul spectral) al fiecarui tesut este dependent de compozitia biochimica si

arhitectura morfologica. Cand un tesut este iluminat cu lumina ultravioleta sau cu

lungime de unda joasa din spectrul vizibil obtinute dintr-o sursa laser sau lampa cu

filtru, este emisa de moleculele endogene (fluorofori) tisulare o lumina fluorescenta

4

cu o lungime de unda mai mare. Aceasta autofluorescenta provine din componentele

tesutului conjunctiv (colagen, elastina), din enzimele metabolismului celular (NADH,

etc.), din produsii biosintezei hemului (porfirine) si din lipopigmenti (lipofuscina,

ceride).

Endoscopie cu autofluorescenŃă – esofagită non-erozivă cu leziuni minime vizualizate în autofluorescenŃă sub formă de leziuni liniare de culoare roz.

Endoscopie în mod NBI – esofagită non-erozivă cu leziuni minime. În mod NBI se vizualizează pattern-ul vascular dezorganizat datorită inflamaŃiei.

5

Endoscopie cu autofluorescenŃă – esofagită erozivă grd. A

Endoscopie cu autofluorescenŃă – cancer gastric precoce

Diferite lungimi de unda activeaza diferiti fluorofori, fiecare emitand intr-o alta

lungime de unda. Detectia leziunilor prin autofluorescenta depinde de schimbarile in

concentratia diferitilor fluorofori, modificarile arhitecturale tisulare sau ambele,

incluzand alterarea grosimii mucoasei sau circulatiei sangvine care pot afecta

intensitatea fluorescentei.

6

Principiul endomicroscopiei confocale laser este bazat pe integrarea unui

microscop confocal laser in virful unui endoscop conventional. In timpul endoscopiei

se foloseste apoi o raza laser care genereaza o unda de excitatie de 488 nm,

permitind obtinerea de sectiuni optice tisulare de 7 µm cu o rezolutie laterala de 0,7

µm si o penetratie intre 0 si 250 µm.

Avantajul major consta in obtinerea unor imagini histologice in vivo cu

posibilitatea de a obtine biopsii ghidate. Desi microvascularizatia, celulele individuale

si tesutul conjunctiv au vizibilitate buna, diferentierea dintre displazia joasa si inalta

nu sunt inca posibile cu agenti de contrast topici de tipul fluoresceinei, deoarece

contrastul nu penetreaza nucleii celulelor. Alti agenti de contrast de tipul acriflavinei

sunt folositi cu grija deoarece au risc potential de activitate mutagenic.

Endomicroscopia confocala laser are aplicatii multiple: screening-ul carcinomului

colorectal, in special postpolipectomie si in colita ulcerativa, permitind diagnosticul

unor neoplazii intraepiteliale cu acuratete mai buna decit endoscopia conventionala.

Supravegherea esofagului Barrett si a leziunilor preneoplazice gastrice este de

asemenea mai usoara cu microendoscopie confocala laser. Desi confirmarea

diagnosticului necesita inca examene anatomopatologice conventionale, este

posibila folosirea tehnicilor de telemedicina care permit transmisia in timp real a

datelor imagistice catre specialistii anatomopatologi, in timpul examinarilor

endoscopice de catre gastroenterologi.

7

Endomicroscopie confocală laser – aspect normal al mucoasei gastrice cu vizualizarea celulelor columnare, glandelor gastrice şi lumenului acestora în secŃiune transversală

Endomicroscopie confocală laser – aspect normal al mucoasei colonului superficial (a) şi profund (b)

8

Endomicroscopie confocală laser – cancer de colon - arhitectură tisulară complet dezorganizată cu pierderea criptelor şi celulelor caliciforme (a) şi invadarea vaselor cu ieşirea substanŃei de contrast în spaŃiul intercelular (b)

Endomicroscopie confocală laser – colită ulcerativă - alterarea arhitecturii tisulare cu infiltrat inflamator cronic şi creşterea distanŃei dintre cripte (a) şi vascularizaŃie abundentă (b)

9

Metoda tomografiei optice coerente (OCT) este o metoda nou intrata in

domeniul medical. Metoda se bazeaza pe folosirea unei surse partial coerente intr-

un montaj de tip interferential cele mai des intalnite find cele de tip Michelson sau

Mach –Zender si isi are originea in masuratorile din domeniul transmiterii informatiei

(determinari ale defectelor aparute in fibre optice si/sau in microchipuri). Este o

metoda neinvaziva care, pe baza analizei semnalului interferential permite scanarea

tesuturilor biologice pe o adancime de cativa mm avand o rezolutie de ordinal

micronilor.

Sistemul OCT THORLABS OCS1300SS

Imagine OCT a mucoasei gastrice normale

10

Imagine OCT a mucoasei colonice normale

Imagine OCT a mucoasei de acoperire a unui polip colonic

Imagine 3D-OCT a mucoasei gastrice normale

11

Sistemul automat de secven Ńiere Beckman Coulter CEQ 8000 permite

detecŃia mutaŃiilor, deleŃiilor şi ambiguităŃilor, detecŃia automată a heterozigoŃilor,

identificarea automată a alelelor cu scor SNP, instabilitatea microsateliŃilor, pierderea

heterozigoŃilor.

Specificitatea sistemul de secvenŃiere a fost evaluată prin analizarea secvenŃei

nucleotidice a unui fragment de ADN plasmidic cu secvenŃă cunoscută.

De asemenea au fost evaluate mutaŃiile de la nivelul codonului 12 al genei K-

ras la pacienŃii cu cancer colorectal. ADN-ul a fost izolat şi purificat atât din probe de

Ńesut tumoral provenind de la pacienŃii cu cancer colorectal, cât şi din materiile fecale

12

ale acestor pacienŃi. Un fragment de 82 de perechi de baze de la nivelul exonului 1,

care conŃine codonul 12, a fost apoi amplificat prin PCR. SecvenŃa fragmentelor

amplificate a fost apoi analizată cu ajutorul sistemului automat Coulter CEQ 8000.

O a doua componentă a sistemului achiziŃionat, luminometrul Glomax 20/20

(Promega), a fost utilizat pentru evaluarea calitativă a acizilor nucleici, în paralel cu

evaluarea prin spectrofotometrie (biofotometrul Eppendorf), real-time PCR (în

13

prezent dispunem de un sistem RotorGene 6200 + HRM de la compania Corbett) şi

cu ajutorul sistemului de fotodocumentare cu camera CCD (Syngene G:Box HR).

Mikro-Dismembratorul U (Sartorius), cu o viteză de agitare de 2000 min-1,

este utilizat în etapa iniŃială de omogenizare a izolării acizilor nucleici. Acest aparat

permite omogenizarea rapidă a probei în condiŃiile reducerii riscului degradării ADN,

ARN şi proteinelor, evitându-se utilizarea enzimelor şi reducând riscul degradării

probelor.

In cadrul laboratorului, aparatul a fost utilizat pentru omogenizarea probelor de

Ńesuturi recoltate de la pacienŃii cu cancer colorectal şi cancer gastric, în vederea

izolării şi purificării ARN-ului.

Pentru extracŃia şi purificarea acizilor nucleici, a fost achiziŃionat extractorul

automat Maxwell® 16 (Promega). Cu ajutorul extractorului automat, a fost izolat

ADN din 32 de probe de sânge şi ARN dintr-o probă de Ńesut malign colorectal.

ConcentraŃiile şi purităŃile acizilor nucleici, măsurate spectrofotometric, sunt redate în

tabelul de mai jos.

NR. crt. Proba ADN µg/ml ADN

260/280 ADN

260/230

1 SP110 48,06 1,72 1,15 2 SP111 35,90 1,81 1,22 3 SP112 44,18 1,88 1,29 4 SP113 44,76 1,80 0,98 5 SP114 27,17 1,75 1,00 6 SP115 36,37 1,65 1,13 7 SP116 43,38 1,77 1,26

8 25Reu 56,92 1,76 1,22

9 FB6 51,46 1,62 1,01 10 FB7 13,97 1,44 0,53 11 71 26,22 1,49 0,83 12 72 26,68 1,83 1,13 13 73 95,28 1,63 1,37 14 73 20,09 1,57 0,99 15 29 36,02 1,74 0,87 16 29 30,24 1,77 1,20 17 SP158 27,99 1,86 0,41 18 SP159 44,82 1,69 1,13 19 SP160 100,33 1,76 1,14 20 SP161 58,32 1,80 1,12 21 SP162 55,65 1,78 1,22 22 SP163 50,19 1,79 1,03 23 SP169 52,04 1,79 1,32 24 SP170 42,73 1,82 1,04

14

25 SP171 67,26 1,48 1,10 26 SP172 29,05 1,83 0,90 27 SP174 23,83 1,84 0,78 28 SP175 44,30 1,78 1,16 29 SP176 10,18 1,90 0,53 30 SP177 40,66 1,81 1,05 31 SP178 60,99 1,80 1,46

32 SP179 58,48 1,84 1,46

ARN µg/ml ARN

260/280 ARN

260/230 33 CRC5 15,2 1,09 0,23

5. Concluzii

Proiectul PYRAMID completează si dezvoltă infrastructura de cercetare a

UMF Craiova determinind valorificarea potentialului si a resurselor CDI in plan

regional si national, respectiv participarea Centrului de Cercetare in

Gastroenterologie in colaborare cu Disciplinele de Patologie si Biologie Moleculara,

la programe nationale si internationale de cercetare.

In cadrul acestei faze s-au realizat măsurători cu echipamentele de cercetare

achiziŃionate şi totodată au fost examinaŃi pacienŃi utilizând aparatura medicală de

înaltă performanŃă.

Infrastructura IT a fost armonizată şi astfel concepută pentru a putea prelua

toate imaginile şi datele medicale obŃinute în scopul revederii şi prelucrării ulterioare.

Director contract,

Prof. Univ. Dr. Adrian Săftoiu