Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Stiinte Biologice Bucuresti

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC Proiect: PN-II-PT-PCCA-2013-4-0361 Valorificarea superioara a sub-produselor si reziduurilor vegetale pentru a asigura exploatarea durabila a resurselor naturale Acronim: HIVEGRES Contract nr. 145/2014 Etapa de raportare : Etapa II– Reciclarea reziduurilor si subproduselor vegetale si imbunatatirea randamentelor de extractie; tehnologii "safe-extraction"; evaluarea si stabilizarea produsilor de extractie. Perioada de raportare 05.12.2014-04.12.2015

Cuprins Pag Consortiu, obiective 1 Rezumatul etapei a II a de implementare a proiectului 2 A2.1. Dezvoltarea de metode de extractie "sigure" cu randament crescut de extractie a principiilor active (betacarotenoide, antociani)-partea 1

3

2.1.1. Protocoale de extractie bazate pe fenomene de cavitatie aplicate in masa de extractie (solvent-material vegetal) 2.1.2. Protocoale de extractie bazate pe extractie lichid-lichid A2.2. Evaluarea produsilor de extractie si stabilizarea principiilor active-partea 1 9 A2.3. Dezvoltarea de retea de senzori/biosenzori si validarea protocoalelor de analiza pentru determinarea continutului si activitatii principiilor active la nivel de prototip de laborator –partea 1

14

Concluzii 20 Proiectul HIVEGRES este realizat de un consortiu academic-industrial (IMM uri) format din :

• Institutul National CD pentru Stiinte Biologice Bucuresti, coordonatorul proiectului, (CO) • Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Chimie (P1) • Centrul de cercetare si prelucrare a plantelor medicinale Plantavorel SA, Piatra Neamt (P2) • Cosfel Actual S.R.L, Bucuresti (P3)

Scopul proiectului este acela de a obtine prin metode sigure un continut imbunatatit de compusi naturali cu valoare nutraceutica, care sa fie utilizati in obtinerea de produse alimentare ca si suplimente si aditivi de origine vegetala. (Domeniul 5: Agricultura, siguranta si securitate alimentara, directia prioritara 5.2. Modernizarea productiei alimentare si obtinerea de produse corespunzatoare principiilor dezvoltarii durabile si securitatii alimentare) Obiectivele proiectului HIVEGRES conform contract 145/01.07.2014:

• Valorificarea superioara, utilizarea durabila a resurselor naturale prin reciclarea reziduurilor si sub-produselor vegetale ca urmare a cresterii randamentului de extractie;

• Introducerea de noi instrumente pentru controlul si monitorizarea procesului de productie si pentru evaluarea calitatii produselor: retea de nano-biosenzori;

• Crearea de noi oportunitati pentru diversificarea produselor de tip alimente functionale si largirea segmentului de piata al partenerilor industriali –companii mici si mijlocii- din proiect catre industria alimentara, pe segmentul de piata care le implica.

Rezumatul etapei a II de implementare a proiectului Activitatile specifice etapei a II-a de raportare pentru proiectul HIVEGRES au fost A2.1. Dezvoltarea de metode de extractie "sigure" cu randament crescut de extractie a principiilor active (betacarotenoide, antociani)-partea 1; A2.2. Evaluarea produsilor de extractie si stabilizarea principiilor active-partea 1; A2.3. Dezvoltarea de retea de senzori/biosenzori si validarea protocoalelor de analiza pentru determinarea continutului si activitatii principiilor active la nivel de prototip de laborator–partea 1; A.2.4. Diseminarea rezultatelor-partea 1 in care au fost implicati toti partenerii din consortiul de realizare al proiectului, dupa cum urmeaza: coordonatorul proiectului, INCDSB Bucuresti, impreuna cu partenerii industriali (P2-Plantavorel si P3-Cosfel) au fost implicati in realizarea activitatilor care au vizat dezvoltarea de metode de extractie „sigure”; in ceea ce priveste activitatile de evaluare si stabilizare a produsilor de extractie precum si dezvoltarea de retea de senzori si biosenzori si validare a protocoalelor de analiza pentru determinarea continutului si a activitatii principiilor active fiind implicati coordonatorul, partenerul P1-Universitatea din Bucuresti si partenerul P2-Plantavorel. Rezultatele angajate contractual vizeaza dezvoltarea de protocoale de extractie care sa fundamenteze formularea de noi tehnologii de extractie a principiilor active de interes continute in materialele vegetale utilizate ca sursa de obtinere, dezvoltarea si validarea de protocoale de analiza pentru evaluarea produsilor de extractie obtinuti precum si dezvoltarea de noi instrumente de analiza bazate pe tehnologia biosenzorilor care ulterior, sa fie incluse intr-o retea de senzori pentru determnarea cantitativa a principiilor active si pentru estimarea eficacitatii acestora.

In aceasta etapa au fost elaborate procedee de extractie sigura, bazate atat pe procedee de extractie lichid-lichid, cat si pe metoda inovativa care a constituit baza incercarii de valorificare superioara a resurselor vegetale, si anume extractia asistata de camp de microunde. In cazul procedeelor de extractie asistata de microunde pentru extractele polare, cu continut ridicat in polifenoli si antociani toti produsii de extractie din surse de baza afin si merisor vor fi dublu standardizati, la nivel de continut de antociani (echivalent cianidin) si la nivel de continut de polifenoli (echivalent acid clorogenic); in cazul macesului, se propune standardizarea extractelor in vitamina C si polifenoli. In cazul procedeelor de extractie asistata de microunde pentru extractele nepolare, cu continut ridicat in carotenoide, din morcov si maces, se propune standardizarea extractelor in caroten si licopen. In cazul procedeelor de extractie lichid-lichid: pentru sursa merisor utilizarea alcoolului etilic 50° conduce la obtinerea unui fitocomplex mai bogat in principii active (se propune standardizarea extractului in polifenoli); pentru sursa afin utilizarea de alcool etilic 30° acidulat cu 1% acid citric este optima pentru obtinerea fitocomplexului, dublu standardizat in antociani si polifenoli (ac. clorogenic); pentru sursa maces extractia in alcool etilic 50° este optima pentru obtinerea produsului, de asemenea dublu standardizat in vitamina C si polifenoli.

De asemenea, au fost evaluati produsii de extractie atat din punct de vedere al continutului in principii active cat si al eficientei activitatii acestora, fiind elaborate protocoale de analiza specifice pentru fiecare tip de principiu activ: antociani, carotenoide, polifenoli, unele protocoale fiind validate.

Produsii de extractie hidro-alcoolici cu continut ridicat de antociani si polifenoli, formulati in solvent acidulat cu acid citric, constituie baza stabilizarii produsilor de extractie polari, in timp ce produsii de extractie cu continut ridicat de carotenoide formulati in ulei de masline sau ulei de floarea soarelui constituie baza stabilizarii produsilor de extractie nepolari.

A fost construit primul model, primul demonstrator pentru echipamentul de extractie asistata de microunde. Au fost dezvoltate primele unitati componente ale retelei de senzori si biosenzori: a fost construit, caracterizat si optimizat un biosenzor pe baza de materal compozit lacaza-grafit pentru

determinarea sensibila (limite de detectie de 10-7 molL-1) a continutului total de compusi polifenolici si polifenoli metoxi-subtituiti, care are o stabilitate operationala buna (minim 9 determinari) si o stabiliate de stocare excelenta (3 luni).

a fost dezvoltat un senzor pe baza de fosfatidil colina depusa pe suprafata conductiva de aur care are rezultate promitatoare in evaluarea activitatii antioxidante a extractelor cu continut ridicat de antociani, dar care necesita optimizari.

a fost dezvoltat un nanosenzor pe baza de oxid de ceriu pentru determinarea capacitatii antioxidante, propunandu-se o metoda inovativa de analiza care se bazeaza pe formarea unor spoturi colorate obtinute pe hartie de filtru impregnata cu nanoparticule de oxid de ceriu ca urmare a interactiei antioxidantilor din proba cu aceste nanoparticule.

A fost realizata diseminarea rezultatelor obtinute prin depunerea unei cereri de brevet (dosar numarul 00824/2015), acceptarea unui articol in revista ISI, participarea la conferinte internationale. A2.1. Dezvoltarea de metode de extractie "sigure" cu randament crescut de extractie a principiilor active (betacarotenoide, antociani)-partea 1

In conformitate cu obiectivele specifice ale HIVEGRES care se circumscriu obiectivului principal – utilizarea sustenabila si eficienta a resurselor agro-alimentare naturale, primul dintre obiective implica reciclarea reziduurilor si a sub-produselor vegetale si imbunatatirea randamentului de extractie prin tehnologii inovative pentru o extractie sigura si eficienta. HIVEGRES isi propune dezvoltarea si implementarea unei metode de extractie din reziduuri si sub-produse vegetale bazata pe utilizarea extractiei in camp de microunde (MAE), astfel incat majoritatea protocoalelor dezvoltate in aceasta faza de realizare a proiectului au implicat o etapa de extractie asistata de microunde. Dezvoltate in colaborare de catre coordonator, P2-Plantavorel si P3 –Cosfel, protocoalele de extractie au avut la baza urmatoarele principii:

a. Utilizarea de solventi „siguri” din punct de vedere al normelor de siguranta alimentara si al celor farmacologice si care, in acelasi timp, sa asigure un coeficient de partitie optim pentru extractia cantitativa a antocianilor (antocianidinelor si proantocianidinelor), acizilor polifenolpolicarboxilici, flavonelor si izoflavonelor precum si a carotenoidelor din materialul vegetal. Ca urmare in cazul antocianilor, polifenolilor si flavonelor/izoflavonelor au fost utilizati cu predilectie ca si solventi apa si amestecurile hidro-alcoolice, alcoolul utilizat fiind etanolul, iar in cazul carotenoidelor au fost utilizati ca si solventi de extractie uleiurile (floarea soarelui si masline).

b. Optimizarea parametrilor operationali ai proceselor de extractie astfel incat sa se asigure obtinerea cantitatii maxime de principiu activ de interes extras precum si mentinerea integritatii structurale a principiilor active determinante pentru fiecare sursa vegetala; ca urmare au fost studiate: - influenta solventului si a raportului solvent: material vegetal, - influenta timpului de extractie, - influenta temperaturii, - influenta puterii si, respectiv a frecventei (in cazul tehnologiilor de extractie care implica fenomene de cavitatie de tip ultrasunete si, respectiv microunde) asupra randamentului de extractie si asupra calitatii extractelor totale formulate ca urmare a aplicarii protocoalelor de extractie dezvoltate, - numarul de etape ale procesului de extractie in ideea eficientizarii timpului total de extractie si, implicit, al costurilor tehnologice.

c. Dezvoltarea de protocoale de extractie care sa conduca la produsi finali usor de stabilizat si de conditionat ulterior in diverse formule (suplimenti, cosmetice etc)

d. S-a urmarit eficientizarea utilizarii resursei naturale prin valorificarea reziduurilor vegetale astfel incat au fost formulate si caracterizate extracte totale si nu principii active izolate si purificate pe clase de compusi, discutand in cazul antocinilor, polifenolilor si falvonelor de un extract total apos sau hidro-alcoolic, in timp ce pentru xantofile si carotenoide au fost caracterizate extracte totale in uleiuri.

Rezultatele obtinute in etapa anterioara de implementare a proiectului au demonstrat prezenta unor cantitati insemnate de polifenoli in materialul vegetal, evidentiata prin metode specifice si confirmate, de exemplu, prin analiza HPLC a extratelor alcoolice si hidroalcoolice cu un continut mare de antociani in care s-a regasit si o izoflavona (daidzeinul). De asemenea in fructele de maces s-a determinat un continut ridicat in vitamina C. Tinand seama de posibilele efecte sinergetice ale principiilor active prezente in extracte, caracterizarea tuturor extractelor hidroalcoolice, respectiv alcoolice, formulate s-a facut nu doar in ceea ce priveste continutul de antociani ci si ca si continut de polifenoli si, unde a fost cazul, vitamina C. Consortiul a dezvoltat, complementar, doua directii pentru stabilirea tehnologiei optime de extractie sigura a principiilor active de interes, si anume:

1. o directie care are la baza utilizarea fenomenelor de cavitatie in prima etapa a procesului de extractie; au fost testate atat ultrasunetele cat si microundele, atat pentru extractele polare (apoase/hidroalcoolice) cat si pentru cele nepolare(ulei comestibil), schema procesului fiind prezentata in figura 1.

2. o directie pe baza de tehnologii de extractie lichid-lichid, schema procesului de extractie fiind prezentata in figura 2.

Figura 1. Schema generala a procesului de extractie care are la baza tehnici de cavitatie

Figura 2. Schema tehnologiei de extractie lichid-lichid

2.1.1. Protocoale de extractie bazate pe fenomene de cavitatie aplicate in masa de extractie

(solvent-material vegetal) 2.1.1.a. Protocoale realizare extracte apoase/alcooloce-hidroalcoolice bazate pe fenomene de cavitatie aplicate in masa de extractie.

Extractele apoase si hidro-alcoolice au fost realizate specific pentru fiecare tip de fructe, ajungandu-se la concluzia ca, pentru a dezvolta o tehnologie unitara de extractie care sa stea la baza proiectarii demonstratorului pentru sistemul de extractie cu microunde o solutie care sa satisfaca toate principiile enuntate mai sus este urmatoarea: cca 20 g material vegetal maruntit au fost cantarite, s-a adaugat un volum de solvent de 100 mL si amestecul astfel rezultat a fost supus extractiei utilizand fie ultrasunete (frecventa constanta, diferiti timp de aplicare) fie microunde (cu variatia puterii campului de microunde si a timpilor de aplicare a campului) dupa care amestecurile sunt fie filtrate imediat si apoi evaluate din punct de vedere al compozitiei si eficacitatii, fie lasate la macerat timp de 12 ore in solventii de extractie. Extractele hidroalcoolice au fost formulate intr-un amesctec apa: etanol absolut 30:70 (v:v), stabilit ca optim in etapa anterioara de executie a proiectului.

Pentru fiecare lot supus extractiei cu fenomene de cavitatie urmate de macerare s-a realizat si un lot „martor” in care materialul vegetal este supus exclusiv extractiei prin macerare, in aceleasi conditii de lucru, pentru a se stabili care este varianta optima de lucru din punct de vedere al randamentului de extractie precum si al eficientei antiradicalice si antioxidante a extractului formulat. La nivel de laborator au fost utilizati urmatorii parametri operationali in cazul extractiei cu:

• Ultrasunete: frecventa 25 kHz, putere 50 W, timpi de aplicare a cavitatiei cu ultrasunete: 30, respectiv 60 de minute;

• Microunde: putere 500 W, respectiv 750 W, timpi de aplicare a campului de microunde: 1 minut, respectiv 30 secunde.

Ulterior, in dezvoltarea echipamentului de extractie in camp de microunde unii parametrii au fost modificati, parametrii operationali pentru respectivul echipament fiind prezentati mai jos, intr-o sectiune dedicata acestuia.

Datorita limitarilor impuse de regulile de siguranta alimentara s-a renuntat in aceasta etapa la acidularea mediului de extractie cu acid clorhidric, in ciuda faptului ca in etapa anterioara de executie a proiectului rezultatele au demonstrat atat un randament de extractie mai bun, cat si o eficienta anti-radicalica imbunatatita. Ca urmare a discutiilor cu partenerul Plantavorel s-a ajuns la concluzia ca este utila o acidulare a mediului de extractie cu acid citric.

Tinand seama de caracteristicile structurale ale antocianilor care determina o stabilizare a ionului flavil la valori de pH s-au dezvoltat protocoale de extractie sigure utilizand ca si acidifiant al mediului acidul citric, asigurandu-se un pH de 2.40 al extractelor formulate. 2.1.1.b. Protocoale realizare extracte polare bazate pe fenomene de cavitatie aplicate in masa de extractie

Procedeul de extracţie s-a aplicat atat pentru material vegetal in stare proaspata (piure) şi uscata (pulbere), doua tipuri de ulei vegetal (ulei de masline şi ulei de floarea soarelui) şi doua metode de extracţie, sonicare timp de 1 ora şi jumatate şi macerare la temperatura camerei, timp de 12 de ore. Dupa cantarirea unei mase cunoscute de proba (cca 20 g) sub diferite forme (morcov ras, morcov marunţit, maceş macinat) se adauga unul dintre uleiurile vegetale (de masline respectiv floarea soarelui) in raport 1:4 (w/v) iar soluţia astfel obţinuta este sonicata timp de 1 ora şi 30 minute, adaugand gheaţa in baia de sonicare şi acoperind cu folie de aluminiu. Dupa sonicare soluţiile rezultate sunt filtrate pe hartie de filtru pentru indepartarea reziduului solid, apoi prin filtre Chromafil PVDF Ø:25mm şi sunt pastrate la frigider la temperaturi de 40 C pentru analiza HPLC. Inainte de injectare extractele obţinute sunt diluate 1:2 (v:v) cu THF iar soluţia obţinuta este inca o data diluata 1:2 (v:v) cu amestecul de solvenţi metanol: diclormetan (50:50, v:v).

Procedeul s-a aplicat atat pentru morcov cat si pentru maces. 2.1.1.c. Echipamentul de extractie MAE

Instalatia dezvoltata la nivel de pilot - care sta la baza realizarii demonstratorului din etapa ulterioara de implementare a proiectului- instalatie cu ajutorul careia s-au realizat extractele prin procedee de extractie care implica fenomene de cavitatie-camp de microunde, proiectata si construita de catre COSFEL SA, este prezentata in figura 3.

Figura 3. Echipament extractie in camp de microunde

In cadrul proiectului HIVEGRES s-a dezvoltat un nou concept de echipament de extracţie tip Soxhlet in

prezenţa sau absenţa microundelor. Echipamentul este dotat cu o interfata om-masina (tableta tip touch screen ce conţine programul de operare cu modurile de lucru) care permite selectarea modului de lucru specific. Incalzirea solventului pur sau in amestec se face cu ajutorul unei plite electrice comandate de programul de lucru.

Extracţia asistata de microunde (MAE) se realizeaza in vasul de acumulare tip Soxhlet. Nivelul de lichid se monitorizeaza prin intermediul unor senzori de proximitate de tip capacitiv. Pentru iradierea cu microunde se foloseşte o sursa cu frecvenţa de 2,45 GHz şi putere de microunde reglabila

in domeniul 0 – 300W. Temperatura din vasul de evaporare este monitorizata prin intermediul unui termocuplu. Temperatura din vasul tip Soxhlet este monitorizata prin intermediul unui pirometru cu emisivitatea reglabila.

In varianta constructiva actuala, echipamentul poate funcţiona in urmatoarele moduri: A. Modul “SIFONARE” : presupune o varianta in care nu se seteaza numarul de sifonari şi procesul este

oprit de operator, sau o varianta in care operatorul seteaza in fereastra de lucru numarul de sifonari şi echipamentul funcţioneaza pana la atingerea numarului setat de sifonari dupa care se opreşte automat.

B. Modul “EXTRACŢIE STATICA” : presupune acumularea de solvent in vasul de extracţie pana la un nivel predefinit, sesizat prin intermediul unui senzor de nivel; odata atins nivelul are loc oprirea plitei electrice urmata de iradierea cu microunde a probei un timp predefinit.

C. Modul “EXTRACŢIE IN PULS”: presupune acumularea de solvent in vasul de extracţie pana la un nivel predefinit, sesizat prin intermediul unui senzor de nivel situat sub nivelul de sifonare; odata atins nivelul are loc pornirea iradierii cu microunde a probei un timp predefinit astfel incat durata de acţiune a microundelor sa fie mai mica decat durata de acumulare de solvent pana la nivelul de sifonare.

In continuare sunt prezentate secvenţele de lucru pentru modurile de operare cu extractorul de substante in camp de microunde.

A. Modul “Sifonare”

Secventa Actiune Monitorizare AMC A11 Se porneste plita de incalzire Temperatura din balon termocuplu A12 Vaporizare solvent si condensare in

vasul de acumulare Temperatura din balon termocuplu

A13 Acumulare lichid pana la nivelul de sifonare

Nivel Numar sifonari

senzor capacitiv contor

Temperatura vasului de acumulare pirometru A14 Sifonare (golirea vasului de acumulare) A15 Se reia ciclul A2-A4 de un numar

nedeterminat de ori, cat este necesar pentru asigurarea randamentului maxim

A21 Se porneste plita de incalzire Temperatura din balon termocuplu A22 Setarea numarului de sifonari Numar sifonari contor A23 Vaporizare solvent si condensare in

vasul de acumulare Temperatura din balon termocuplu

A24 Acumulare lichid pana la nivelul de sifonare

Nivel Numar sifonari

senzor capacitiv contor

Temperatura vasului de acumulare pirometru A25 Sifonare (golirea vasului de acumulare) A26 Se reia ciclul A22-A25 de un numar

determinat de ori; realizarea numarului de sifonari va comanda oprirea plitei de incalzire

Numar sifonari contor

B. Modul “Extractie statica” Secventa Actiune Monitorizare AMC B1 Se porneste plita de incalzire Temperatura din balon termocuplu B2 Vaporizare solvent si condensare in vasul de acumulare Temperatura din balon termocuplu B3 Acumulare lichid pana la nivelul de lucru (mai jos

decat nivelul de sifonare Nivel senzor capacitiv

B4 Oprirea plitei de incalzire

B5 Pornire microunde pentru o durata determinata (setata in prealabil) la o temperatura de lucru predefinita

-durata de emitere microunde -temperatura vasului de acumulare

- Controler - pirometru - regulator tensiune reglat manual

B6 Oprire microunde C. Modul “Extractie in puls”

Secventa Actiune Monitorizare AMC C1 Se porneste plita de incalzire Temperatura din balon termocuplu C2 Vaporizare solvent si condensare in vasul de acumulare Temperatura din balon termocuplu C3 Acumulare lichid pana la nivelul de incepere iradiere

cu microunde (mai jos decat nivelul de sifonare) Nivel senzor capacitiv

C5 Pornire microunde pentru o durata determinata (setata in prealabil, in domeniul 5-20 secunde)

-durata de emitere microunde -temperatura vasului de acumulare

- Controler - pirometru - regulator tensiune, reglat manual

C7 Acumulare lichid pana la nivelul de sifonare / oprire microunde

Nivel Numar sifonari

senzor capacitiv contor

Temperatura vasului de acumulare

pirometru

C8 Sifonare (golirea vasului de acumulare) C9 Se reia ciclul C2-C8 de un numar nedeterminat de

ori,cat este necesar pentru asigurarea randamentului maxim

2.1.2. Protocoale de extractie bazate pe extractie lichid-lichid

Aceste protocoale au fost dezvoltate in consortiu indeosebi de catre partenerul P2, Plantavorel, care a realizat si caracterizarea produsilor de extractie prin cromatografie in strat subtire de inalta performanta. 2.1.2.1. Extractia fructelor de maces

Pentru a stabili care sunt conditiile optime de extractie a principiilor active din fructele de maces, s-a urmarit continutul in vitamina C si polifenoli, exprimat in echivalent acid galic si acid clorogenic in diferite stadii ale extractiei materialului vegetal.

Produsul vegetal, respectiv fructele de maces, uscate, au fost analizate fizico-chimic si s-a determinat o umiditate de 7,28% , extractibil in alcool etilic 50° de 38,6%, respectiv de 33% apa distilata. S-au realizat mai multe teste de extractie dintre care doua sunt reprezentative pentru a putea stabili tehnologia optima in raport cu randamentul de extractie, calitatea extractelor si a costurilor, respectiv in apa distilata si alcool etilic din cereale 50°. Parametrii de extractie sunt prezentati in tabelul 1.

Tabelul.1 Parametrii de extractie maces Etapa de extractie Solvent /test Raport

planta:solvent Temperatura, °C Timp, ore

UMECTARE Apa distilata/1 1:1 Camerei, ~22 2 Alcool etilic 50°/2 1:1 Camerei, ~22 2

EXTRACTIE 1 Apa distilata/1 1:4 80 6 Alcool etilic 50°/2 1:5 80 6

EXTRACTIE 2 Apa distilata/1 1:4 80 6 Alcool etilic 50°/2 1:4 80 6

CONCENTRARE la ½ din volum

Apa distilata/1 - 80 - Alcool etilic 50°/2

2.1.2.2. Extractia fructelor de merisor

Produsul vegetal, respectiv fructele de merisor, uscate, au fost analizate fizico-chimic si s-a determinat o umiditate de 7,35% , un extractibil in alcool etilic de 50° de 66 %, respectiv de 74% in alcool etilic 70° dar un continut de antociani si acid galic (raportat la substanta uscata) mai mare in alcoolul etilic de 50°. Parametrii de extractie sunt prezentati in tabelul 2.

Tabelul 2. Parametrii de extractie merisor Etapa de extractie Solvent Raport

mat vegetal : solvent

Temperatura, °C Timp, ore

UMECTARE Alcool etilic 50° 1:1 Camerei, ~22 2

EXTRACTIE 1 Alcool etilic 50° 1:5 80 6

EXTRACTIE 2 Alcool etilic 50° 1:4 80 6

CONCENTRARE la ½ din volum

Alcool etilic 50° - 80 -

2.1.2.3. Extractia fructelor de afin

Pentru a stabili care sunt conditiile optime de extractie a principiilor active din fructele de afin s-a urmarit continutul in antociani si polifenoli exprimat in echivalent acid clorogenic in diferite stadii ale extractiei materialului vegetal. Produsul vegetal, respectiv fructele de afin uscate, au fost analizate fizico-chimic si s-a determinat o umiditate de 6,02%, extractibil in alcool etilic 50° – 42,6%, alcool etilic 70°- 45,2% , respectiv de 34,2% in alcool etilic 95°.

S-au realizat mai multe teste de extractie pentru a putea stabili tehnologia optima in raport cu randamentul de extractie, calitatea extractelor, stabilitatea antocianilor si al costurilor. Pentru o mai buna extractie s-au utilizat pentru experimentari solutii hidroalcoolice acidulate. Pentru acidulare s-a utilizat acidul citric, rezultatele obtinute anterior (etapa I de executie) la identificarea principiilor active si realizarea profilului de compozitie al extractelor dupa extractia cu acidulare cu acidul clorhidric conducand la ideea ca este nevoie de mediu acid pentru asigurarea unei extractii optime. Intrucat acidul clorhidric nu este utilizabil pentru formulari alimentare si farmaceutice s-a trecut la utilizarea acidului citric in scopul obtinerii extractelor sigure pentru fabricatia suplimentelor alimentare, cu respectarea legislatiei specifice in vigoare - Directiva 95/2/CE/1995 privind aditivii alimentari. Parametrii de extractie sunt prezentati in tabelul 3. Tabelul 3. Parametrii de extractie afin

Etapa de extractie Solvent /test Raport mat vegetal:solvent

Temp. °C Timp, ore

UMECTARE Alcool etilic 70°/1 1:1 Camerei, ~22 2

Alcool etilic 70° acidulat 1% ac citric/3 Alcool etilic 30°acidulat 1% ac citric/4

EXTRACTIE 1 Alcool etilic 70°/1 1:5 60 6 Alcool etilic 70° acidulat 1% ac citric/3 6 Alcool etilic 30°acidulat 1% ac citric/4

EXTRACTIE 2 Alcool etilic 70°/1 1:4 60 6 Alcool etilic 70° acidulat 1% ac citric/3 6 Alcool etilic 30° acidulat 1% ac citric/4

CONCENTRARE la ½ din volum

Alcool etilic 70°/1 - 60 -

Alcool etilic 70° acidulat 1% ac citric/3 Alcool etilic 30° acidulat 1% ,ac citric/4

Instalatia de extractie utilizata pentru extractiile lichid-lichid este prezentata in figura 4.

Figura 4. Instalatia de extractie pentru stabilirea protocoalelor de extractie lichid-lichid Dupa formularea extractelor acestea au fost caracterizate din punct de vedere al profilului de compozitie prin

cromatografie in strat subtire de inalta performanta (HPTLC) precum si prin cromatografie de lichide de inalta performanta cu detectie specifica (diode array -spectrometrie de masa), HPLC-DAD-MS. A2.2. Evaluarea produsilor de extractie si stabilizarea principiilor active-partea 1

Evaluarea produsilor de extractie s-a facut atat din punct de vedere al profilului de compozitie al extractelor obtinute cat si din punctul de vedere al eficacitatii antioxidante, intrucat extractia prin fenomene de cavitatie poate reduce eficienta extractului obtinut datorita, de exemplu, formarii de radicali liberi in situ ca urmare a puterii campului de microunde aplicat sau datorita reducerii biodisponibilitatii principiilor active (polifenoli, vitamina C, carotenoide) ca urmare a aplicarii campului de microunde. Exista date stiintifice care confirma ca aplicarea unui camp de microunde de 100 kW cm-3 sec-1 conduce la scaderea biodisponibilitatii vitaminei C, vitaminei E, mineralelor etc.1

In continuare sunt prezentate majoritar rezultatele obtinute la extractia asistata de microunde si la extractia lichid-lichid, desi evaluarea produsilor de extractie din punct de vedere al compozitiei s-a realizat pentru fiecare dintre procedeele de extractie dezvoltate, deoarece este important sa se decida care sunt procedeele de extractie capabile sa conduca la standardizarea extractelor, si in raport cu ce principiu de interes. A.2.2.1. Evaluarea produsilor de extractie obtinuti prin procedee care implica fenomene de cavitatie in masa de extractie. A.2.2.1.a. Evaluarea produsilor de extractie pentru extractele polare.

Profilul de compozitie al extractelor obtinute s-a determinat pentru fiecare dintre procedeele de extractie dezvoltate, alegerea procedeelor optime - ai caror parametri operationali au fost prezentati anterior- facandu-se in raport nu doar cu randamentul maxim de extractie exprimat ca si cantintate de principii active de interes, determinate prin metode HPLC-DAD-MS, ci si in functie de mentinerea eficacitatii antioxidante a extractului formulat, determinate prin metodele TEAC si ORAC.

Rezultatele obtinute, exprimate ca echivalent total antociani, in µg per g material vegetal luat in lucru, pentru materialul vegetal dupa extractia in camp de microunde (30 secunde, frecventa 2.45 GHz si o putere de 150 W cm-3 sec -1) sunt prezentate in figura 5, pentru afin si merisor. In figura 5A sunt prezentate rezultatele obtinute pentru materialul congelat, la -17 oC stocat timp de 6, respectiv 9 luni, iar in figura 5B sunt prezentate rezultatele obtinute pentru materialul vegetal uscat, pastrat in conditii de umiditate si temperatura controlate, timp de 6-9 luni.

Rezultatele obtinute la evaluarea eficacitatii antioxidante, respectiv de anti-radicalice sunt prezentate in tabelul 4.

1 Kopp W. R. E. C. Research Operations, FORENSIC RESEARCH DOCUMENT TO61-7R10/10-77F05

A

B

A

B

Figura 5. Variatia profilului de concentratie (determinata HPLC-DAD-MS) in antociani in functie de tipul solventului, la extractia principiilor active in camp de microunde.

A- material vegetal congelat; B- material vegetal uscat.

Figura 6. Cromatogramele HPLC-MS (A), respectiv HPLC-DAD (B) obtinute pentru extractul din afin, material vegetal uscat.

C18 100A 50×4,6 mm, apa (5% acid formic): metanol (5% acid formic) 0.15 mL min-1, ESI-MS mod pozitiv

Tabelul 4. Variatia activitatii antiradicalice (TEAC) si a activitatii antioxidante (ORAC, exprimat echivalent Trolox) in functie de protocolul de extractie, tipul materialului vegetal si solvent

Proba

Material vegetal uscat MAE*

Material vegetal congelat MAE*

Material vegetal uscat, control**

TEAC µmolL-1/g

ORAC µmol/g

TEAC µmolL-1/g

ORAC µmol/g

TEAC µmolL-1/g

Merisor/H2O 67,45 142,00 21,86 4,60 82,29 Merisor/ H2O-

EtOH 1496,94 - 24,50 - 1946,02

Afin/H2O 197,74 111,20 21,34 1,20 241,24 Afin/ H2O-EtOH 2885,28 - 27,44 - 3750,86

Maces/ H2O 343,45 99,57 24,00 6,96 419,01 Maces/ H2O-EtOH 2106,67 - 30,36 - 2738,67

* MAE, extractie asistata de camp de microunde, timp de aplicare 30 secunde, frecventa 2.45 GHz, putere 150 W cm-3 sec -1, fara etapa de macerare ; raport material vegetal: solvent 1:4 (m:v) ** extractie prin macerare in solvent, raport material vegetal: solvent 1:4 (m:v), timp de macerare 12 h, sub agitare continuua, temperatura camerei (cca 20 oC)

Dupa cum se observa din rezultatele obtinute, pastrarea materialului sub forma congelata conduce la pierderea eficacitatii extractelor formulate, valorile capacitatii antioxidante, respectiv ale activitatii de radical scavenger scazand in 6 luni de cca 30 ori in raport cu materialul proaspat (conform determinarilor efectuate in etapa anterioara de executie a proiectului).

In schimb, dupa cum era de asteptat, rezultatele obtinute pentru materialul vegetal uscat, depozitat ca atare timp de 6-9 luni, conduc in unele cazuri la valori mai mari ale capacitatii antioxidante, respectiv ale eficientei antiradicalice, desigur la aceasta contribuind faptul ca, de data aceasta, raportarea se face la gram substanta uscata.

De asemenea, daca se compara rezultatele obtinute pentru extractia MAE, respectiv pentru cea prin procedee de macerare de 12 ore, se observa o scadere a valorilor TEAC in cazul extractiei asistate de microunde, pierderea ca atare reprezentand cca 25% din valorile masurate ceea ce indica necesitatea optimizarii conditiilor de aplicare a campului de microunde pentru diminuarea efectelor asupra eficientei extractelor astfel formulate.

Trebuie subliniat faptul ca, totusi, chiar si in conditiile unei reduceri a eficacitatii produselor de extractie in cazul procedeelor de extractie asistata de microunde, toti produsii de extractie din surse de baza afin si merisor pot fi standardizati atat la nivel de continut de antociani (echivalent cianidin) cat si la nivel de continut de polifenoli (echivalent acid clorogenic), iar in cazul macesului, datorita continutului ridicat de vitamina C (in produsii de extractie MAE au fost determinate concentratii de vitamina C de 120 µg/g produs uscat), se propune standardizarea extractelor in vitamina C si polifenoli. A.2.2.1.b. Evaluarea produsilor de extractie pentru extractele nepolare.

In cazul extractelor polare acestea au fost formulate utilizand, dupa cum am mai mentionat, ulei de floarea soarelui, respectiv ulei de masline, in incercarea de a rezolva concomitent doua probleme: aceea a extractiei sigure si aceea a stabilizarii produsilor de extractie. Pe baza rezultatelor obtinute anterior principiile active de interes, determinate pentru maces si morcov sunt β- Caroten, licopen si luteină. Utilizand metoda de analiza HPLC-DAD al carei protocol a fost raportat in detaliu in etapa I, si care in aceasta etapa a suportat o validare partiala in termeni de limita de detectie, limita de cuantificare, repetabilitate, precizie intermediara si exactitate. Rezultatele obtinute pentru cele doua surse sunt prezentate in tabelul de mai jos, atat din punct de vedere al continutului cat si al eficacitatii antioxidante, pentru fiecare dintre cele doua uleiuri utilizate ca solvent de extractie.

Tabelul 5. Profilul de compozitie al produsilor de extractie pentru morcov si maces si activitatea antioxidanta a acestora

Proba Principiu activ

Material vegetal uscat MAE*

Material vegetal proaspat MAE*

Material vegetal uscat, Control**

Concentratie µg/g

ORAC µmol/g

Concentratie µg/g

ORAC µmol/g

Concentratie µg/g

ORAC µmol/g

Ulei floare

Ulei masline

Ulei floare

Ulei masline

Ulei floare

Ulei masline

Morcov β- Caroten 916,05 2783,25 561,81 25,72 45,45 172,45 2318,35 2942,75 291,70 Licopen 68,93 162,34 6,61 0 166,22 163,28 Luteină 0 75,77 0 1,95 33,97 1789,73

Maces β- Caroten 69,21 - 304,83 16,93 - 289,90 - - - Licopen 586,45 - 428,04 - - - Luteină 0 - 0 - - -

* MAE, extractie asistata de camp de microunde, timp de aplicare 30 secunde, frecventa 2.45 GHz, putere 150 W cm-3 sec -1, fara etapa de macerare ; raport material vegetal: solvent 1:4 (m:v) ** extractie prin macerare in solvent, raport material vegetal: solvent 1:4 (m:v), timp de macerare 12 h, sub agitare continuua, temperatura camerei (cca 20 oC)

Trebuie mentionat ca, pentru determinarea activitatii antioxidante a carotenoidelor s-a elaborat un protocol de analiza de tip ORAC utilizand sisteme micelare. Micelele sunt obtinute pe baza de dodecil sulfat de sodiu (SDS) cu un continut de borat de sodiu si hexan/tetrahidrofuran (THF). In cazul utilizarii sistemului micelar s-a inregistrat blank-ul ca fiind curba de variatie a emisiei de fluorescenta in prezenta sistemului micelar. Sistemul micelar este compus din SDS/borat de sodiu / hexan sau THF /H2O in rapoart de 10:10:10:70, apoi diluat 1:5 in tampon fosfat PBS (pH=7,33), raportul proba: micela fiind 1:20.

Produsele vor fi standardizate la continul de caroten si licopen. A.2.2.2. Evaluarea produsilor de extractie obtinuti prin procedee de extractie lichid-lichid

Intr-o prima etapa s-a realizat indentificarea principiilor active din produsii de extractie lichid-lichid, prin cromatografie in strat subtire de inalta performanta (HPTLC), acolo unde a fost posibil efectuandu-se si determinarile cantitative, imaginile cromatogramelor in strat subtire obtinute fiind date in figurile 7-8.

Figura 7. Cromatograma in strat subtire pentru antociani in extractele de merisor si afine Dupa cum se observa din cromatograme, determinand Rf specific in functie de solutiile etalon (E1-E5) se

regasesc in produsii de extractie de merisor si afin cu certitudine cianidin, sub forma glicozidata, la afin prezenta pelargonidinului forma glicozidata fiind de asemenea evidenta, precum si prezenta altor antociani sub forma glicozidica.

Me1- merisor fructe uscate; Me2- extract de merisor in alcool etilic 50°; Af1- afine fructe uscate; Af2- extract de afine in alcool etilic 70°; Af3-extract de afine in alcool etilic 70°acidulat 0,5%HCl; Af4- extract de afine in alcool etilic 70°acidulat 1% acid citric, Af6- extract de afine in alcool etilic 30° acidulat 1% acid citric; E1 –delfinidin -0,95 si delfinidin 3-O-ß-D- glucoside – 0,6; E2 –cianidin – 0,96 si cianidin glicoside – 0,7 E3- peonidin – 0,97 si peonidin glicoside – 0,75 E4 – pelargonin- 0,98 si pelargonin glicoside – 0,79 E5- malvidin – 0,95

vitamina C acclorogenic

ac galic

test 1test20

5

10

15

20

EXTRACTIE MACES

test 1 test2

A B C

Figura 8. Cromatograma in strat subtire pentru polifenoli si izoflavone in extractele de maces, merisor si afine

In urma identificarii cu certitudine in toti produsii de extractie ai celor trei surse (maces, merisor, afine) a acidului clorogenic (Rf- 0,53 un spot albastru) si hiperozidei (Rf- 0,64 un spot galben portocaliu) s-a studiat posibilitatea standardizarii produsilor de extractie in raport cu continutul de polifenoli, mai ales ca in produsii de extractie din merisor uscat si afin uscat s-au identificat si alti acizi polifenol policarboxilici cum sunt acidul cafeic (Rf- 0,96 un spot albastru fluorescent) si acidul galic (Rf – 0,93 un spot difuz albastru).

Figura 9. Variatia continutului in principii active in produsii de extrcatie din maces (A), merisor (B) si afine (C)

Determinarile cantitative (vezi figura 9) au condus la urmatoarele concluzii in cazul procedeelor de extractie lichid-lichid:

• Pentru extractia din sursa merisor utilizarea alcoolul etilic 50° conduce la obtinerea unui fitocomplex mai bogat in principii active cu costuri mai mici; se propune standardizarea extractului in polifenoli a caror concentratie este mai usor cuantificabila pe etapele fluxului de fabricatie la nivel industrial.

• Pentru extractia din sursa de afin utilizarea de alcool etilic 30° acidulat cu 1% acid citric este optima pentru obtinerea unui fitocomplex bogat in principii active, dublu standardizat in antociani si polifenoli (ac. clorogenic), procedeu care se poate realiza cu costuri mai mici si este sigur in raport cu normele de siguranta alimentara.

• Pentru extractia din sursa de baza maces extractia in alcool etilic 50° este optima pentru obtinerea unui fitocomplex bogat in principii active dublu standardizat in vitamina C si polifenoli.

Ma1- maces fructe uscate; Ma2- extract de maces cu alcool etilic 50°; Ma3- extract de maces in apa; Me1- merisor fructe uscate; Me2- extract de merisor in alcool etilic 50°; Af1- afine fructe uscate; Af2- extract de afine in alcool etilic 70°; Af3-extract de afine in alcool etilic 70° acidulat 0,5%HCl; Af4- extract de afine in alcool etilic 70°acidulat 1% acid citric, Af5- extract de afine in alcool etilic 30°acidulat 1% acid citric; Af6-extract de afine in solutie de acid citric 5%; E1, E2,E3- solutii de referinta.

A2.3. Dezvoltarea de retea de senzori/biosenzori si validarea protocoalelor de analiza pentru determinarea continutului si activitatii principiilor active la nivel de prototip de laborator –partea 1

2.3.1. Dezvoltarea retelei de senzori/ biosenzori Dezvoltarea retelei de senzori si biosenzori pentru determinarea continutului si activitatii principiilor active implica mai intai dezvoltarea de unitati independente de biosenzori/senzori, care sa raspunda specific si sensibil si sa furnizeze informatii privind continutul in principii active, respectiv care sa furnizeze informatii despre activitatea principiilor active, in cazul prezentului proiect activitatea antioxidanta/antiradicalica fiind cea urmarita. Dezvoltarea unui senzor/biosenzor are la baza o succesiune de etape de constructie si caracterizare care incepe cu asigurarea unei detectii adecvate pentru analitul de interes, ceea ce inseamna alegerea unui element de biorecunoastere moleculara (care poate fi: enzima, celula intreaga, ADN, etc.) care sa asigure specificitatea raspunsului. Aceasta inseamna ca trebuie ales un element de biorecunoastere moleculara care sa reactioneze specific cu analitul, astfel incat sa genereze un produs de reactie chimica/biochimica a carui acumulare (in cazul detectiei directe) sau scadere a concentratiei (in cazul detectiei prin inhibitie) sa poata fi usor masurata in urma transformarii semnalului chimic/biochimic in semnal masurabil de catre un traductor (care poate fi electrochimic, optic, de frecventa etc). La nivelul traductorului poate avea loc si amplificarea semnalului. Senzorul/biosenzorul astfel construit este apoi caracterizat din punct de vedere al performantelor analitice: domeniu dinamic de raspuns, sensibilitate, limita de detectie, reproductibilitate, stabilitate operationala si stabilitate la stocare etc. Avand in vedere faptul ca in urma dezvoltarii de procede de extractie specifice, pe baza rezultatelor obtinute la evaluarea produsilor de extractie s-a ajuns la concluzia ca produsii de extractie din sursele afin si merisor sunt standardizabili la nivel de compusi polifenolici (acid clorogenic) si antociani (cianidin), produsii de extractie din sursa maces sunt standardizabili la nivel de compusi polifenolici (acid clorogenic) si vitamina C, pentru realizarea retelei de biosenzori pentru determinarea continutului de principii active s-a ales ca si elemnt de biorecunoastere moleculara lacaza, o polifenol-oxidaza cu specificitate de grup (polifenoli disubtituiti). Pentru realizarea unitatilor de senzori dedicati evaluarii capacitatii antioxidante a produsilor de extractie au fost incercate doua abordari, una care se bazeaza pe constructia unor senzori utilizand un substrat oxidabil, fosfatidil colina, celalta abordare fiind bazata pe utilizarea nanoparticulelor de oxid de ceriu. 2.3.1.a. Biosenzor pe baza de lacaza pentru determinarea continutului de polifenoli si fenoli metoxisubstituiti

Procedeul de constructie al biosenzorului are la baza imobilizarea unei cantitati optime de material compozit lacaza-grafit pirolitic, pe electrodul de lucru din carbune al unei celule electrochimice screen-printate de tip DRP110 (comercializata de Dropsens Spania), astfel incat sa se asigure o activitate de 280 mU lacaza pe electrodul de lucru. Protocolul optim de obtinere a biosenzorului este original si consta in: o cantitate de 2 mg pulbere de grafit conductiv suspendata in 1 mL solutie tampon acetat 0,1 molL-1, pH = 5,00 prin sonicare timp de 30 minute la 26 °C; un volum de 500 µL din suspensie este apoi vortexat timp de o ora cu 3 mg lacaza pulbere liofilizata (continut de 25 U/mg pulbere). Din acest amestec compozit se depun cate 5 µL pe electrozii de lucru C-SPE care sunt lasati sa se stabilizeze timp de 2 ore la 16-18 °C si apoi stocati la 4 °C. Protocolul de masura a cantitatii de compusi polifenolici se bazeaza pe masurarea intensitatii curentului de reducere inregistrat in urma reducerii pe electrod a produsilor de reactie obtinuti prin cataliza enzimatica (de catre lacaza) a compusilor de interes. Reducerea are loc la o valoare a potentialului aplicat pe electrodul de lucru care este specifica produsului de reactie obtinut din reactia enzimatica. Cu cat cantitatea de compus de interes (polifenol) este mai mare, cu atat cantitatea de produs de reactie enzimatica este mai mare si, ca urmare, intensitatea curentului masurat asociata reducerii acestuia este mai mare. Pentru stabilirea potentialului optim de lucru s-au inregistrat voltamogramele ciclice ale principiilor active frecvent identificate atat in fructele de afin, maces, merisor cat si in produsii de extractie pe electrodul de lucru modificat cu materialul compozit lacaza-grafit (vezi figura 10) si anume acid clorogenic, acid cafeic, quercetin.

Figura 10. Voltamogramele ciclice ale acidului cafeic 2,5 mmolL-1 (1) ; acidului clorogenic 2,5 mmolL-1 (2); quercetin 2,5 mmolL-1 (3) in tampon acetat 0,1 M pH 5,00 (4), v=100mVsec-1, electrod de lucru CSPE-lacc-C

Avand in vedere partea comuna de structura a acidului sinapinic si a polifenolilor metoxi-subtituiti de tip malvidin si cianidin, s-a testat posibilitatea de a utiliza lacaza ca element de biorecunoastere pentru dezvoltarea de biosenzori pentru determinarea acestor principii active. Din inregistrarea voltamogramei ciclice a acidului sinapinic (figura 11) pe o celula screen-printata al carei electrod de lucru este modificat cu materialul compozit lacaza-grafit se observa formarea produsilor reactiei enzimatice care se reduc la nivelul electrodului, la un potential de cca -0,025 V vs. Ag/AgCl.

Figura 11. Voltamogramele ciclice ale acidului sinapinic 2,5 mmolL- in tampon acetat 0,1 M pH 5,00, v=100mV sec-1, electrod de lucru CSPE-lacc-C

Protocolul de masura utilizand biosenzorul amperometric pe baza de lacaza pentru determinarea continutului de polifenoli din extractele obtinute avand ca surse material vegetal provenit din fructe de padure este urmatorul: -Tehnica de lucru: cronoamperometrie la potential controlat -Potential de lucru: -0,025 V (±0,05) vs. pseudoelectrod de referinta Ag/AgCl (electrod de referinta printat) -Mediu de lucru: tampon acetat 0,1 molL-1, pH=5,00 -Volum de solutie: 30 µL pe electrod -Echilibrare biosenzor: 120 secunde, aditie substrat (sau proba), masurare raspuns cu citire la 10 secunde Caracteristicile de performanta pentru biosenzorul pe baza de material compozit lacaza-grafit sunt prezentate in tabelul 6.

Constructia senzorului: dintr-o suspensie apoasa de PC se pipeteaza un volum de 5 µL pe suprafata conductiva de aur a unei celule screen-printate DRP 220AT, astfel incat sa se asigure o cantitate de 2 ng PC pe electrodul de lucru. Senzorul este uscat rapid la temperatura camerei si apoi stocat pe silicagel si in atmosfera inerta, la frigider.

Figura 12. Cronoampeorgrama obtinuta pentru biosenzorul pe baza de lacaza-grafit pentru aditii multiple de acid clorogenic

Tabelul 6. Unele caracteristici de performanta pentru biosenzorul pe baza de lacaza utilizabil pentru determinarea continutului in principii active polifenolice

Analit Domeniu dinamic de raspuns, molL-1

Sensibilitate, mA mol-1

Limita de detectie molL-1

Acid clorogenic 7,4 × 10-6 – 5,4× 10-5 99,2 7,00 × 10-7 Acid cafeic 7,4 × 10-6 – 4,0× 10-5 78,4 1,00 × 10-6

Acid sinapinic 1,5 × 10-6 – 3,16 × 10-4 14,0 2,50 × 10-7

Trebuie mentionat ca biosenzorul astfel construit necesita optimizari pentru a se asigura o discriminare a raspunsului pe clase de polifenoli, insa, la acest nivel este aplicabil pentru determinarea continutului total in compusi polifenolici si compusi polifenolici metoxi-subtiuiti din extractele formulate anterior, rezultatele obtinute fiind confirmate de rezultatele obtinute prin metodele HPLC-DAD-MS (vezi tabelul 7).

Tabelul 7. Continutul total in compusi polifenolici si polifenol metoxi-substituiti din extractele MAE avand ca surse macesul, afinul si merisorul.

Extract Continut total µg/g material vegetal (echivalent acid clorogenic)

Merisor/H2O 217,19 Merisor/H2OEtOH 279,10

Afin/H2O 182,21 Afin/H2OEtOH 230,42

Maces/H2O 18,29 Maces/H2OEtOH 16,32

S-a studiat atat stabilitatea operationala a biosenzorului astfel construit, obtinandu-se un raspuns stabil pentru minim 9 determinari succesive (deviatia relativa standard fiind 2,48 %) cat si cea la stocare, dupa 2 luni raspunsul biosenzorului fiind la fel ca cel de la constructie, iar dupa 3 luni fiind de 86,7% din raspunsul intitial.

2.3.1. b. Senzor pe baza de fosfatidil-colina pentru determinarea activitatii antioxidante a compusilor polifenolici din extractele de plante

Acest sistem de determinare a capacitatii antioxidante se bazeaza pe proprietatea antioxidantilor de a elimina radicalii peroxil, sau pe cei lipoperoxidici. Radicalii peroxil generati termic prin descompunerea unei solutii apoase a unui azoinitiator (clorhidrat de 2,2'-azobis(2-amidinopropan), AAPH) reactioneaza cu un substrat oxidabil, in cazul nostru fosfatidil-colina (PC), rezultand peroxizi de tipul PCOO care sunt electro- activi.

Calibrarea senzorului in raport cu concentratia de radicali peroxid generati se face prin masuratori in picatura, dupa echilibrarea senzorului, timp de 3 minute, la +0,200V vs Ag/AgCl, acesta fiind potentialul de reducere al radicalilor PCOO. pe electrodul de aur, prin aditii de concentratii diferite de azo-initator. Ecuatia curbei de calibrare este I (nA) = 586,4 × C ng mL-1+ 36,81. Pentru o concentratie cunoscuta de peroxizi generati in sistemul de masura s-a testat potentialul senzorului de a fi aplicat la evaluarea activitatii antioxidante a compusilor polifenolici standard, utilizandu-se in teste Trolox, malvidin si cianidin, calculandu-se capacitatea antioxidanta in echivalent Trolox (tabelul 8) . Tabelul 8. Capacitatea antioxidanta determinata cu senzorul PC-AuSPE, exprimata in echivalent Trolox.

Antioxidant Concentratie µmolL-1 Capacitate antioxidanta echivalent Trolox, µmolL-1

Cianidin 6,84 0,41 Malvidin 82,08 0,33 Afin/H2O Dilutie 1:150 1,22

Afin/H2OEtOH Dilutie 1:150 1,97 Acest senzor trebuie optimizat, solutiile de standarde de antociani precum si extractele din surse de tip afin si merisor fiind afectate de interferente electrochimice datorate reducerii electrochimice a gruparilor chinona formate pe lantul cromanolic.

2.3.1. c. Nanosenzor pe baza de de oxid de ceriu (nanoceria) pentru determinarea capacitatii antioxidante

Acest sistem de determinare a capacitatii antioxidante a fost dezvoltat in principal de partenerul P1, Univeristatea din Bucuresti. Dezvoltarea acestui tip de senzor se bazeaza pe faptul ca antioxidantii de tip fenoli, ca si alti antioxidanti prezenti in probele de interes, reduc Ce(IV) la Ce(III) si pot forma complecsi cu transfer de sarcina colorati cu acesti ioni. Realizarea senzorilor pe baza de nanoparticule de oxid de ceriu. Pregatirea hartiei impregnate cu nanoparticule de oxid de ceriu Se foloseste hartie FILTRAK Grade 3 hw, sub forma de discuri cu diametrul de 110 mm. In cutii Petri cu diametrul de aproximativ 12-13 cm se introduc 20 mL de solutie 4% de nanomaterial. S-au folosit doua tipuri de nanoparticule de oxid de ceriu: I. Oxid de ceriu, sub forma de pudra cu dimensiunile particulelor mai mici de 25 nm. Amestecul de pudra si apa distilata 4% se ultrasoneaza timp de 30 minute. Se obtine o suspensie cu aspect laptos din care particulele de oxid de ceriu nu se depun. Suspensia se introduce in vasul petri. In solutie se introduc pe rand harti de filtru care se umecteaza bine pe ambele fete iar apoi se scot cu o penseta. Se scurge bine excesul de lichid, iar hartiile de filtru se pun la uscat pe marginea unui pahar de aprox 250 mL (fiecare pe un pahar separat). Hartiile de filtru se introduc cu pahar cu tot intr-o etuva la aprox. 80-90 °C timp de 7 minute. Hartiile se scot si se lasa la aer aprox. 1 ora. Hartiile de filtru astfel preparate pot fi folosite pentru efectuarea determinarilor. S-a constatat ca in 20 mL solutie din vasul petri se pot umecta aproximativ 10 hartii de filtru. II. Oxid de ceriu dispersie 20% in acid acetic 2,5% cu dimensiunile particulelor de 30-50 nm din care s-au preparat 20 mL dispersie 4% in acid acetic 2,5%. Se lucreaza ca mai sus. In acest caz insa, lichidul in care se umecteaza hartiile de filtru este o dispersie foarte buna (putin opalescenta, slab galbuie) de oxid de ceriu. Modul de lucru pentru efectuarea determinarilor Pe o hartie de filtru impregnata cu CeO2 se pipeteza volume de 2.5 μL din probele de analizat de diferite concentratii (solutii etalon de antioxidant sau solutii de extracte vegetale). Fiecare proba este pipetata de cate 6 ori. Dupa pipetare hartia de filtru se usuca la aer (aproximativ 20 minute). Apoi se scaneaza imaginea obtinuta si se analizeaza folosind softul ImageJ. Rezultatele obtinute se folosesc in continuare pentru trasarea dreptei de calibrare si efectuarea analizelor. In figurile 13 si 14 sunt prezentate imaginile hartiei de filtru impregnata cu dispersie de oxid de ceriu 4% cu dimensiunile particulelor de 30-50 nm pe care s-au depus solutii etalon de acid galic si respectiv acid cafeic.

Figura 13. Imaginea hartiei impregnate cu dispersie oxid de ceriu 4% cu dimensiunile particulelor de 30-50 nm, avand depuse solutii etalon de acid galic de diferite concentratii.

Figura 14. Imaginea hartiei impregnate cu dispersie de oxid de ceriu 4% cu dimensiunile particulelor de 30-50 nm, avand depuse solutii etalon de acid cafeic de diferite concentratii.

S-a masurat intensitatea culorilor rosu, verde si albastru si in final s-au ales valorile BCI (blue color intensity).

S-a determinat valoarea medie a intensitatii culorii albastre pentru cele 6 probe de aceeasi concentratie. Datele au fost copiate si prelucrate ulterior in Microsoft EXCEL. S-a calculat media valorilor 1/BCI obtinute pentru probe de apa bidistilata depuse pe hartie, valoare care s-a scazut din fiecare valoare 1/BCI a probelor/etaloanelor. S-au calculat mediile acestor diferente si s-au reprezentat grafic in functie de logaritmul concentratiilor solutiilor etalon.

Figura 15. Curbele de calibrare 1/BCI vs. logaritmul concentratiei acidului galic, respectiv cafeic . BCI = intensitatea culorii albastre. Hartie cu dispersie de oxid de ceriu 4% in 2,5% acid acetic in apa, cu

dimensiunile particulelor de 30-50 nm.

Ecuatia dreptei de calibrare pentru acidul galic este: y = 2,927x + 10,49; unde y = 1/BCI, iar x = logaritmul concentratiei acidului galic (molL-1). Se constata o buna liniaritate pe un domeniu de concentratii cuprins intre 4×10-4 molL-1 si 10-2 molL-1, coeficientul de determinare fiind: r2 / n = 0,9867 / 8 (n = numarul de puncte de pe dreapta de calibrare). Ecuatia dreptei de calibrare pentru acidul cafeic este y = 1,568x + 6,723 unde y = 1/BCI x 1000, iar x = logaritmul concentratiei acidului cafeic (molL-1). Se constata o buna liniaritate pe un domeniu de concentratii cuprins intre 10-4 molL-1si 2,5 × 10-3 molL-1. Coeficientul de determinare este: r2 / n = 0,989 / 7 (n = numarul de puncte de pe dreapta de calibrare). Daca la trasarea dreptei de calibrare pentru acidul galic, din valorile 1/BCI nu se scade valoarea pentru blanc (apa distilata), atunci ecuatia dreptei de calibrare devine y = 2,927x + 14,76 care va fi utilizata in continuare pentru simplitate in toate calculele pentru determinarea capacitatii antioxidante a extractelor analizate. In figura 16 se prezinta grafic rezultatele obtinute la determinarea capacitatii antioxidante a extractelor analizate, diluate de 80 (“x 80”) respectiv de 10 ori (“x 10”).

Figura 16. Rezultate obtinute la determinarea capacitatii antioxidante a extractelor analizate. „x 80” si „x 10”

reprezinta gradul de dilutie al extractelor

În tabelul 9 se prezintă o comparație între valorile capacității antioxidante a unor extracte formulate in etapa I de excutie a proiectului, determinate prin metoda chemiluminometrica, spectrofotometrică cu ABTS•+ și cea care utilizeaza oxid de ceriu sub forma de nanoparticule. Capacitatea antioxidanta a fost exprimată în echivalenți milimoli standard (trolox sau acid galic)/1000 mL extract.

Tabelul 9. Capacitatea antioxidantă a extractelor analizate determinată prin metoda chemiluminometrica, metoda cu ABTS•+ si metoda cu oxid de ceriu sub forma de nanoparticule

(nanoceria). PROBA SOLVENT Capacitatea antioxidantă

(milimoli/1000 mL) echivalenti trolox echivalenti acid

galic metoda

chemiluminometrică metoda TEAC

metoda cu nanoceria

AFINE MeOH 70% 5,11 4,69 28,6 AFINE MeOH cu HCl 0,5% 8,99 8,49 29,3

MACESE MeOH 70% 5,19 12,98 4,97 MACESE MeOH cu HCl 0,5% 5,95 11,9 4,68

MERISOARE MeOH 70% 1,24 1,03 4,11 MERISOARE MeOH cu HCl 0,5% 1,31 1,04 4,40

Metoda de determinare a capacitatii antioxidante cu nanoparticule de oxid de ceriu prezinta o sensibilitate foarte redusa pentru determinarea troloxului si din acest motiv pentru aceasta metoda s-a ales drept standard acidul galic. Se poate constata ca valorile capacitatii antioxidante determinate prin metoda cu nanoparticule de ceriu sunt mult mai mari (28,6 milimoli acid galic /1000 mL la extractia in metanol si 29,3 milimoli acid galic/1000 mL la extractia in metanol acidulat) fata de valorile obtinute prin celelalte doua metode (metoda chemiluminometrica si metoda cu ABTS•+) si pentru care se obtin valori comparabile ale capacitatii antioxidante. Metoda va fi optimizata in etpa urmatoare de executie a proiectului.

2.3.2. Validarea metodei HPLC-DAD pentru identificarea si cuantificarea carotenoizilor din extracte uleioase de morcov si maces Metoda de analiza HPLC-DAD a suportat o validare partiala in termeni de limita de detectie, limita de cuantificare, repetabilitate, precizie intermediara si exactitate. Metoda dezvoltata este aplicabila pentru determinarea continutului de carotenoide β-caroten, luteina, licopen din probe cu matrice de baza de tip ulei. Detectia: diode-array, in functie de coeficientii de extinctie moleculara ale celor trei compusi, la lungimile de unda specifice : λmax= 449 nm – luteina, λmax= 456 nm – β-caroten, λmax= 476 nm-licopen

Parametrii operationali ai metodei sunt: f.m. A-ACN, B-MeOH: CH2Cl2 (50:50, v:v); elutie izocratica la raport A:B 40:60 (v:v) cu un debit de 0,8 mL min-1. Domeniul de liniariate: luteina 1 - 40 µg mL-1; β-caroten 0.1 – 15 µg mL-1; licopen: 0.5 – 50 µg mL-1. Limita de detectie : luteina 0,40 ± 0,1 µg mL-1; β-caroten 0,46 ± 0,02 µg mL-1; licopen: 0,39 ± 0,01µg mL-1. Limita de determinare: luteina 1,11 ± 0,1 µg mL-1; β-caroten 0,60 ± 0,02 µg mL-1; licopen: 0,43 ± 0,01µg mL-1. Rezultatele experimentale obţinute la exactitatea metodei sunt prezentate in tabelul10 Tabelul 10. Regasirea medie pentru probe imbogatite cu principii active.

Proba Principiu activ

Conc µg mL-1 initiala

Conc µg mL-1

adaugata Conc µg mL-1

regasita Regasire %

Morcov Luteina - 276,51 273,02 98,7 Licopen 0,55 7,90 8,25 97,6 Caroten 4,63 91,85 99,70 103,3

Maces Luteina - 276,51 316,55 114,5 Licopen 26,69 7,90 32,56 94,1 Caroten 1,06 91,85 81,58 87,8

CONCLUZII

In aceasta etapa de executie a proiectului HIVEGRES au fost indeplinite toate obiectivele specifice etapei, rezultatele estimate fiind realizate: au fost elaborate procedee de extractie sigura, bazate atat pe procedee de extractie lichid-lichid cat si pe

metoda inovativa care a constituit baza incercarii de valorificare superioara a resurselor vegetale, si anume extractia asistata de camp de microunde. In cazul procedeelor de extractie asistata de microunde pentru extractele polare, cu continut ridicat in polifenoli si antociani toti produsii de extractie din surse de baza afin si merisor vor fi dublu standardizati, la nivel de continut de antociani (echivalent cianidin) si la nivel de continut de polifenoli (echivalent acid clorogenic); in cazul macesului, se propune standardizarea extractelor in vitamina C si polifenoli. In cazul procedeelor de extractie asistata de microunde pentru extractele nepolare, din morcov si maces, cu continut ridicat in carotenoide se propune standardizarea extractelor in caroten si licopen In cazul procedeelor de extractie lichid-lichid: • Pentru merisor utilizarea alcoolului etilic 50° conduce la obtinerea unui fitocomplex mai bogat in principii active; se propune standardizarea extractului in polifenoli a caror concentratie este mai usor cuantificabila pe etapele fluxului de fabricatie la nivel industrial; • Pentru afin utilizarea de alcool etilic 30° acidulat cu 1% acid citric este optima pentru obtinerea fitocomplexului, dublu standardizat in antociani si polifenoli (ac. clorogenic); • Pentru maces extractia in alcool etilic 50° este optima pentru obtinerea produsului, de asemenea dublu standardizat in vitamina C si polifenoli.

au fost evaluati produsii de extractie atat din punct de vedere al continutului in principii active cat si al eficientei activitatii acestora, fiind elaborate protocoale de analiza specifice pentru fiecare tip de principiu activ: antociani, carotenoide, polifenoli, unele protocoale fiind validate.

Produsii de extractie hidro-alcoolici cu continut ridicat de antociani si polifenoli, formulati in solvent acidulat cu acid citric, constituie baza stabilizarii produsilor de extractie polari, in timp ce produsii de extractie cu continut ridicat de carotenoide formulati in ulei de masline sau ulei de floarea soarelui constituie baza stabilizarii produsilor de extractie nepolari.

a fost construit primul model, primul demonstrator pentru echipamentul de extractie asistata de microunde

Au fost dezvoltate primele unitati componente ale retelei de senzori si biosenzori: a fost construit, caracterizat si optimizat un biosenzor pe baza de materal compozit lacaza-grafit

pentru determinarea sensibila (limite de detectie de 10-7 molL-1) continutului total de compusi polifenolici si polifenoli metoxi-subtituiti, care are o stabilitate operationala buna (minim 9 determinari) si o stabiliate de stocare excelenta (3 luni).

a fost dezvoltat un senzor pe baza de fosfatidil colina depusa pe suprafata conductiva de aur care are rezultate promitsatoare in evaluarea activitatii antioxidante a extractelor cu continut ridicat de antociani, dar care necesita optimizari.

a fost dezvoltat un nanosenzor pe baza de oxid de ceriu pentru determinarea capacitatii antioxidante, propunandu-se o metoda inovativa de analiza care se bazeaza pe formarea unor spoturi colorate obtinute pe hartie de filtru impregnata cu nanoparticule de oxid de ceriu ca urmare a interactiei antioxidantilor din proba cu aceste nanoparticule.

A fost realizata diseminarea rezultatelor obtinute prin depunerea unei cereri de brevet (dosar numarul 00824/2015), acceptarea unui articol in revista ISI, participarea la conferinte internationale.