1

Institutul de Biologie Si Patologie CelularA“Nicolae Simionescu”

Strada B. P. Hasdeu, nr. 8, CP 35 - 14, BucurestiTel: (+4021) 319.45.18; Fax: (+4021) 319.45.19

Contractor: Institutul de Biologie si PatologieCelulara N. Simionescu

Finantator: Unitatea Executivă pentruFinanţarea Ȋnvăţământului Superior, a Cercetării,Dezvoltării şi Inovării

Proiect PN-II-ID-PCE-2011-3-0591

Noi proceduri terapeutice celulare anti-aterosclerotice bazate peapolipoproteina E

Raport stiintificprivind implementarea proiectului in perioada

25 noiembrie 2011 – 5 decembrie 2014

Director de Proiect: Dr. Anca Gafencu

2

Apolipoproteina E (ApoE) este o proteina care joaca un rol esential in metabolismullipidic si reprezinta o molecula cu potential anti-aterosclerotic important. Scopul proiectuluieste de a induce o expresie crescuta a apoE in doua tipuri de celule implicate in evolutia placiiaterosclerotice: monocite si celulele endoteliale (CE), în scopul de a preveni sau regresaprocesul aterosclerotic.

Proiectul are trei obiective majore: 1. Identificarea unor noi elemente si mecanismetranscriptionale pentru activarea expresiei apoE. In acest sens ne propunem: (1a)investigarea mecanismele reglatorii ale expresiei genice a apoE în monocite și macrofage.(1b) inducerea unei reglari pozitive a genei apoE in celule endoteliale. 2. Tintireamonocitelor exprimand apoE catre placile aterosclerotice. Pentru aceasta ne propunem: (2a)elaborarea unei metode pentru izolarea monocitelor din sânge de soarece si inducerea ex vivoa expresiei apoE în monocite, (2b) testarea nivelului minim de activare a monocitelor, carepermite infiltrarea eficientă in placile aterosclerotice; (2c) transplantul de monocite exprimandapoE la soareci apoE deficienti şi urmarirea regresiei placilor aterosclerotice. 3. Generareaunui model de soarece transgenic care sa exprime apoE specific in endoteliu si evaluareasensibilitatii la ateroscleroza. In acest scop se vor urmari: (3a) clonarea fragmentelor de ADNnecesare transgenezei; (3b) obținerea soarecilor transgenici cu expresie de apoE3 indusăspecific in endotelialiu; (3c) evaluarea asocierii apoE secretat de endoteliu și diferitelipoproteine (3d) evaluarea regresiei placilor aterosclerotice la soarecii care exprima apoE3 încelulele endoteliale. Proiectul va conduce la elaborarea unor noi strategii terapeutice anti –aterosclerotice bazate pe apolipoproteina E și va deschide noi orizonturi pentru dezvoltarea deterapii celulare specifice.

Pana in prezent au fost realizate total primele 4 faze ale proiectului. In cadrul acestorfaze au fost acumulate rezultate experimentale care conduc la indeplinirea celor 3 obiectiveale proiectului, asa cum este descris in continuare.

3

OBIECTIVUL 1: Identificarea unor noi elemente si mecanisme transcriptionalepentru activarea expresiei apoE, ca abordare terapeutica la nivelul reglarii genice".Mecanismele de reglare genica a apoE ar putea sta la baza unor noi terapii la nivel de reglaregenica pentru cresterea expresiei apoE in placa aterosclerotica. Un nivel crescut al expresieiapoE in anumite celule prezente in placa aterosclerotica (cum ar fi macrofagele si celuleleendoteliale) ar putea contribui la protectia anti-aterosclerotica si la regresia placii. Pentru acestobiectiv, avem două obiective specifice:(1a) Investigarea reglarii genei apoE în monocite şimacrofage; (1b) Inducerea reglarii pozitive a genei apoE în celulele endoteliale. Pana inprezent ne-am focalizat atentia asupra primului obiectiv spcific, urmand ca in faza urmatoaresa ne axam pe studiul reglarii genice in celulele endoteliale.In prima faza a proiectului am evidentiat efectul factorilor de transcriptie RXR si STAT1asupra expresiei apoE in macrofage. Pentru a determina efectul retinoizilor asupra exprimăriigenei apoE în macrofage, celule din linia RAW 264.7 au fost tratate cu acid 9-cis-retinoic.După o perioadă de 24 h, atât din celulele incubate cu acid 9-cis-retinoic, cât şi din celulelecontrol, a fost izolat ARN total, care a fost apoi supus reverstranscrieii pentru obţinere deADNc.

Cuantificarea nivelului de ARNm al apoE a fost realizată cu ajutorul unui aparat dereal-time PCR 7900HT, folosind SYBR® Green (Sigma) şi primeri specifici (Tabelul 1.1).Nivelul de ARNm determinat a fost normalizat la nivelul de ARNm al GAPDH. Cuantificarearelativă a fost realizată folosind metoda ΔCT, iar rezultatele au fost exprimate ca unitățiarbitrare (Pfaffl, 2001).

Tabelul 1.1 Primeri folosiţi în experimentele de real-time PCR.

Analiza real-time PCR a arătat că acidul 9-cis-retinoic a indus o creştere semnificativă(P<0.05) a nivelului de ARNm pentru apoE în celulele tratate faţă de celulele control,indicând un efect pozitiv asupra exprimării endogene a genei apoE în macrofage

Datele noastre au aratat ca supraexpresia STAT1 induce expresia apoE in macrofage.Monocitele din linia THP-1, incubate cu o serie de concentratii de PMA au fost omogenizatesi supuse electroforezei in gel denaturant, urmata de Western Blot. Rezultatele arata ca PMAinduce simultan expresia apoE si a STAT1.

In continuare am demosntrat ca STAT1 si RXRα interacţioneaza pentru reglarea apoE. Pentruaceasta am folosit tehnica GST pull down assay si imunoprecipitare. Pentru GST-assay,extracte celulare obtinute din macrofage RAW 264.7 care supraexprimau STAT1 au fost

SECVENŢA PRIMERI

apoE umansens: 5’- CCAGCGGAGGTGAAGGAC -3’anti-sens: 5’- CGCTTCTGCAG GTCATCG -3’

apoE murinsens: 5’- ACAGATCAGCTCGAGTGGCAAA -3’anti-sens: 5’- ATCTTGCGCAGGTGTGTGGAGA -3’

GAPDHsens: 5’- ACCACAGTCCATGCCATCAC -3’anti-sens: 5’- TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’

4

incubate cu GST-RXRα legate la particule magnetice si supuse apoi la Western blottingpentru STAT1. STAT1 se leaga eficient la GST-RXRα imobilizate pe legate la particulelemagnetice (banda GST-RXRα). Particulele magnetice cuplate cu GST au fost utilizate dreptcontrol negativ si nu au legat proteinele STAT1. Co-imunoprecipitarea STAT1 si RXRα a fostrealizata folosind extracte celulare obtinute din celule HEK293 care supraexprimau STAT1 siRXRα. Proteinele au fost imunoprecipitate folosind anticorpi anti-STAT1 si anti-RXRα si aufost supuse la Western blotting. Rezultatele au aratat ca proteinele STAT1 au fost eficientimunoprecipitate de anticorpii anti-STAT1, dar au fost si co-imunoprecipitate cu anticorpianti-RXRα. In controlul negativ realizat fara anticorpul primar, nu s-au obţinut în benzi.Western blot folosind extractul initial de celule .

In faza a doua a proiectului ne-am propus sa comparam mecanismele transcriptionale alegenei apoE in monocite versus macrofage. Datele anterioare au aratat ca expresia genica aapoE creste in timpul diferentierii monocitelor in macrofage (Trusca, JBC, 2011). In aceststudiu, ne-am propus sa comparam mecanismele transcriptionale ale genei apoE in monociteversus macrofage. Pentru a testa factorii de transcriptie care se leaga la elementele reglatoriiproximale si distale ale apoE in monocite si macrofage a fost utilizata tehnica “DNA pulldown assay”, schematizata mai jos:

Fragmentele de ADN, reprezentand promotorul proximal al apoE sau multienhancerulME.2, au fost amplificate si biotinilate prin PCR. Legarea ADN biotinilat (10 pmoli/legare)de particulele magnetice cu streptavidina s-a realizat cu acelaşi tampon timp de 30 minute peagitator, apoi au fost realizate trei spălări cu 500 ul tampon pentru îndepărtarea moleculelornelegate. Testarea biotinilării ADN s-a realizat prin tehnica Dot-blot folosind streptavidinăconjugată cu HRP. Pe scurt, 1 ul de probă s-a aplicat pe nitroceluloză; aceasta a fost blocatătimp de o oră cu o soluţie de lapte degresat 5 % în tampon fosfat salin suplimentat cu 0.05 %Tween 20 și apoi incubată o oră cu Streptavidină-HRP (1:1000). Vizualizarea s-a realizat princhemiluminiscenţă folosind un kit ECL și aparatul LAS-4000 (FUJIFILM, Germany).

5

Prepararea extractului nuclear s-a realizat folosind diferite tipuri celulare (THP-1, HTB11,HepG2). Pentru aceasta, celulele au fost raclate în tampon fosfat salin, centrifugate (10minute, 1850g) și apoi tratate cu tampon hipotonic (HEPES 10 mM, pH 7.9, MgCl2 1,5 mM,KCl 10 mM). Liza celulelor s-a realizat prin trecerea lor prin ac de seringă (cu diametrul de24G), iar gradul de liză a fost verificat cu colorant Trypan Blue. Omogenatul a fost centrifugat15 minute la viteză de 3300g, fracţia citosolică (supernatantul) a fost îndepărtată; iar fracţianucleară (sedimentul) a fost resuspendată în tampon cu concentrație salină scăzută (HEPES20mM, pH 7.9, glicerol 20%, MgCl2 1,5 mM, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM), apoi s-a adăugattampon cu concentrație salină crescută (HEPES 20mM, pH 7.9, glicerol 25%, MgCl2 1.5mM, KCl 1,2 M, EDTA 0,2 mM) pentru a asigura şocuri hipo- şi hiper-osmotice succesive.Extractul nuclear obţinut prin centrifugare la viteză de 25000g a fost dializat faţă de tamponconţinând HEPES 20mM, pH 7.9, glicerol 20%, KCl 0,1M, EDTA 0,2 mM timp de 18 ore la4ºC. Extractele nucleare obţinute au fost utilizate pentru testarea legării factorilor detranscripție din extractul nuclear de ADN imobilizat pe particule magnetice Dynal beads-streptavidin. S-au utilizat 100 µg extract nuclear, iar reacţia de legare s-a realizat în tamponBBRC (Tris pH 7.5 20mM, glicerol 10%, KCl 50mM, MgCl2 4mM, EDTA 0.2mM șicocktail de inhibitori de proteaze) timp de 18 ore la 4ºC. Înainte de reacţia de legare, în fiecareprobă s-a adăugat poli dI-dC (10 U/ml) pentru blocarea situsurilor nespecifice, iar la final s-aurealizat câteva spălări cu tampon BBRC și particulele magnetice au fost resuspendate întampon de solubilizare conținând β-mercaptoetanol și brom-fenol-blue. Identificareafactorilor de transcripţie (din extractul nuclear) legați de ADN a fost realizată prin separateprin electroforeza in gel de poliacrilamida in gradient (10-15%). Detectia proteinelor a fostrealizata prin colorarea gelurilor de poliacrilamida folosind un kit de la Pierce care utilizeazao metoda cu sensibilitate mare de colorare cu argint.

In faza a treia ne-am propus determinarea implicarii unor factori de transcriptie in reglareaapolipoproteinei E in macrofage. Pentru aceste studii au fost folosite urmatoarele plasmidecare contin fragmente ale elementelor reglatoare proximale sau distale ale apoE:

plasmida [-500/+73]apoE-luc (Figura 1.2, A), care a fost obţinută prin clonareapromotorului proximal apoE (-500/+73) în vectorul pGL3-Basic (Promega) (Figura 1.1) careconţine luciferaza (luc) drept genă raportor, dar fără promotor. Secvenţa promotorului apoE (-500/+302) uman a fost amplificată prin PCR folosind primeri specifici (Tabelul 2). Dupăamplificare, fragmentul obţinut a fost supus digestiei enzimatice cu enzimele de restricţieKpnI şi SacI (gena apoE conţine un situs de restricţie pentru SacI în poziţia +73) şi apoiclonat în vectorul pGL3-Basic, obţinându-se plasmida [-500/+73]apoE-luc.

plasmida (+)ME.2-luc (Figura 1.2, C), care a fost obţinută prin clonarea în sens aME.2 în situsul KpnI al vectorului pGL3-Basic. Secvenţa ME.2 (600 pb) a fost prin PCRfolosind primeri specifici (Tabelul 2).

plasmida (+)ME.2/[-500/+73]apoE-luc (Figura 1.2, B), care a fost obţinută princlonarea în sens a ME.2 în situsul KpnI al plasmidei [-500/+73]apoE-luc, în faţa promotoruluiproximal apoE.

plasmidele (+)ME.2-MLP-luc, [67–600]ME.2-MLP-luc, [145– 600]ME.2-MLP-luc, [249– 600]ME.2-MLP-luc, [321–600]ME.2-MLP-luc, [407– 600]ME.2-MLP-luc, careau fost obţinute prin clonarea în situsul KpnI al vectorului pGL3-MLP-luc a unei serii de

6

mutanţi de deleţie ai ME.2 din capătul 5' (Figura 1.2, D). Secvenţele mutanţilor de deleţie aufost amplificate folosind primeri specifici, care conţin situsul de restricţie pentru KpnI(Tabelul 2). Vectorul pGL3-MLP-luc conţine promotor minimal (MLP), iar mutanţii au fostclonaţi în faţa acestuia, în orientare 5’– 3’ (Figura 1.2).

Figura 1.1. Harta vectoruluipGL3-Basic (Promega).Vectorul pGL3-Basic nuconţine secvenţe promotor sauenhancer Ek, permiţândclonarea oricăror secvenţereglatoare putative. Expresiagenei luciferazei în celuletransfectate cu acest vectordepinde de inserarea şiorientarea corectă a unui promotor funcţional înaintea genei luc+. Potenţiale elementeenhancer pot fi inserate înainte de promotor sau după gena luc+. Descriere: luc+, secvenţăcDNA pentru luciferaza din P. pyralis modificată; Ampr, gena de rezistenţă la ampicilină în E.coli; f1 ori, originea replicării derivată din fagul filamentos f1; ori, originea replicării în E.coli. Săgeţile din luc+ şi gena Ampr indică direcţia transcrierii; săgeata din f1 ori indicădirecţia de sinteză a lanţului de ssDNA (single strand DNA) (www.promega.com).

Figura 1.2. Reprezentare schematică a plasmidelor folosite în experimentele de transfecţietranzientă: (A) plasmida [-500/+73]apoE-luc (B) plasmida (+)ME.2/[-500/+73]apoE-luc (C)plasmida (+)ME.2-luc (D) plasmida (+)ME.2-MLP-luc; plasmidele care conţin mutanţii dedeleţie au aceeaşi configuraţie, singura diferenţă fiind lungimea fragmentelor de ME.2 clonateîn faţa promotorului minimal MLP.

7

Pentru a determina importanţa diferitelor regiuni ale multienhancerului 2 în activareapromotorului apoE, a fost generată o serie de mutanţi de deleție ai ME.2. Pentru aceasta,diferite fragmente ale ME.2 au fost amplificate prin PCR cu primeri specifici şi apoi acestefragmente au fost clonate în faţa promotorului proximal al apoE în vectorul pGL3 basic, careconţine gena reporter pentru luciferază.

Figura 1.3.Reprezentareschematică afragmentelor dedeleție ale ME.2(atat din capatul 5'

cat si din capatul 3').

Tabelul 2. Secvenţele primerilor folosiţi pentru amplificarea fragmentelor clonate înplasmidele utilizate în experimentele de transfecţie tranzientă.

Plasmidele care conțin fragmentele de multienhancer 2 au fost verificate prin digestieenzimatică cu enzima KpnI care duce la excizia insertului ME.2 din vectorul pGL3 basic.Imaginea gelului obtinut după digestia enzimatică cu KpnI a fragmentelor de multienhancereste redată in figura următoare.

SECVENŢA PRIMERI

(-500/+302)apoE

sens 5'–TTTGGTACCGCTGGTCTCAAACTCCTACCTTAAGTGATTCG–3'

anti-sens 5'–TTTAAGCTTAACTCGTGGAGTCCTGCTATGGCTTACATCCC–3'

ME.2

ME.2 + 19 sens 5'–GGGGTACCTCACTGAGCCCTACTGGATGTTCTTGGTTG–3'

ME.2 + 619 anti-sens 5'–GGGGTACCTTCAGCTGCAAAGCTCTGAGTGTATGCCCCT–3'

Mutanţi de deleţie ai ME.2 în 5'ME.2 + 67 sens 5'–GGGGTACCATAGCAGAGGGGAGGATG–3'

ME.2 + 145 sens 5'–GGGGTACCGGGTGGATGTTTGGGGAATGC–3'

ME.2 + 249 sens 5'–GGGGTACCTGCCAGGGTCTTGTCTATGC–3'

ME.2 + 321 sens 5'–GGGGTACCGCACAAGGCCAGCCGAACTA–3'

ME.2 + 407 sens 5'–GGGGTACCCTGGTGGGGAAGGAATTGGAC–3'

8

Figura 1.4. Verificarea fragmentelor de deleție a multienhancerului 2. Digestia cu enzimeaKpnI a dus la excizia fragmentelor de multienhancer din vectorul pGL3 basic. În culoarul 12este redat marcherul de greutate moleculară.

Evaluarea interactiei dintre diferiti factori de transcriptie cu elementele reglatoare aleapoE in macrofage a fost realizata prin experimente de transfectie tranzienta, folosind metodaprecipitării ADN cu fosfat de calciu. Metoda presupune amestecarea uşoară a moleculelor deADN plasmidial aflate într-un tampon fosfat cu clorură de calciu, ceea ce determină formareaunui co-precipitat fin de ADN-fosfat de calciu. Precipitatul se depune pe celule şi uneleparticule sunt preluate prin endocitoză sau fagocitoză, fosfatul de calciu asigurând protecţiamoleculei de ADN faţă de acţiunea nucleazelor intracelulare sau prezente în serul din mediulde cultură.

Celulele au fost însămânţate în plăci cu 12 godeuri, la o densitate de 4 x 105

celule/godeu. A doua zi, în mediul de cultură a fost adăugat un precipitat fin de ADN (125µl/godeu) obţinut dintr-un mix de transfecţie conţinând 14 µl (0.5µg/µl) plasmidă cu luc+ şi 4µl (0.5µg/µl) plasmidă cu β-galactozidază, 146 µl apă, 187.5 µl tampon HBSx2 (HEPES50mM, NaCl 280mM, Na2HPO4 1.5mM, pH 7.05 - 7.15) peste care s-au adăugat 23.5 µlCaCl2, în picătură sub agitare continuă. După 18 h de la transfecţie, mediul de cultură a fostschimbat cu mediu de cultură suplimentat sau nu cu RA 1 µM. La 24h după incubarea cu RA,celulele au fost lizate pentru determinarea activităţii luciferazei, printr-o metodăbioluminiscentă, folosind un kit (Promega). Activitatea luciferazei a fost măsurată cu ajutorulunui luminometru Berthold, emisia de lumină rezultată în urma reacţiei de bioluminiscenţăfiind proporţională cu activitatea luciferazei din probă. Rezultatele au fost normalizate laactivitatea β-galactozidazei, care a fost determinată prin metoda colorimetrică cu ONPG(orto-nitrofenil-β-galactopiranozid), dozarea făcându-se cu ajutorul unui spectofotometrupentru placi. Experimentele au fost realizate în triplicat, iar rezultatele obținute au fostprezentate ca medie ± deviație standard (DS). Analiza statistică s-a făcut folosind testul One-way ANOVA; valorile P<0.05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic.

Secventele factorilor de transcriptie au fost clonate in vectorul pSPORT6, o plasmidacare permite expresia in celulele eucariote. Macrofagele RAW 264.7 au fost co-transfectatetranzient cu vectori de expresie pentru factorii de transcriptie şi plasmide în care promotorulproximal al apoE a fost clonat în vectorul pGL3 basic (constructul [-500/+73]apoE). Deasemenea, au fost folosite si plasmide continand mutantii de deletie ai acesteia (continandfragmente [-450/+73], [-397/+73], [-350/+73], [-300/+73], [-250/+73], [-193/+73], [-150/+73], [-100/+73] și [-55/+73]), cat si plasmide continand elementul reglator distal-

9

multienhancerul 2 (ME2), După 36-48 ore de la transfecţie, a fost determinată activitatealuciferazei, iar rezultatele obţinute au fost normalizate la expresia β-galactozidazei.

► Efectul acidului retinoic asupra elementelor reglatoare ale genei apoEPentru a determina mecanismul prin care acidul 9-cis-retinoic induce creşterea

exprimării genei apoE în macrofage, celule RAW 264.7 şi HepG2 au fost transfectatetranzient fie cu plasmida [-500/+73]apoE-luc, fie cu plasmida (+)ME.2-luc, fie cu plasmida(+)ME.2/[-500/+73]apoE-luc. La 18 ore după transfecţie, mediul a fost schimbat cu mediu decultură suplimentat sau nu cu acid 9-cis retinoic (RA) 1 µM.

Rezultatele experimentelor de transfecţie au arătat faptul că în macrofagele RAW264.7 acidul retinoic nu influenţează activitatea promotorului apoE proximal. Aceste rezultatesunt în concordanţă cu faptul că analiza in silico indică absenţa situsurilor de legare a RXR înaceastă regiune. În schimb, acidul retinoic creşte semnificativ (P<0.05) activitateamultienhancerului ME.2 în celulele incubate faţă de celulele control.Rezultatele obţinute în hepatocite HepG2 arată că acidu 9-cis-retinoic (RA) nu influenţeazănici activitatea promotorului, nici pe cea a ME.2. Acest lucru este normal având în vedere căîn hepatocite exprimarea genei apoE este constitutivă şi este controlată de elemente reglatoaredistale diferite, şi anume de regiunile HCR.

► Identificarea regiunii din multienhancerul ME.2 susceptibilă la acţiunea aciduluiretinoic

Pentru a identifica domeniul minim al ME.2 care poate fi activat de acţiunea RA, amtransfectat celule RAW 264.7 cu o serie de plasmide conţinând mutanţi de deleţie în capătul5’ ai ME.2.

Rezultatele au demonstrat faptul că în macrofagele RAW 264.7 toate fragmenteletestate sunt reglate de acidul retinoic, cu excepţia fragmentului [407– 600]ME.2

Aceste rezultate se corelează cu analiza in silico a acestei regiuni care indică prezenţaunei secvenţe consens imperfecte de tip DR4 (direct repeats 4) – gggtcactggcggtca), secventade recunoaştere a retinoizilor în regiunea 405-420 a multienhancerului 2.

► Evaluarea in vivo a efectului retinoizilor asupra exprimării genei apoE în macrofageÎn acest studiu au fost folositi șoareci masculi C57BL/6 (Charles River Laboratories).

Animalele au fost crescute și menținute cu dietă standard pentru rozătoare, avand acces lahrană și apă ad libitum şi fiind expuse unui ciclu zi/noapte de 12h/12h. La vârsta de 10săptămâni, animalele au fost împărțite în 3 loturi experimentale:

șoareci cărora li s-a administrat vitamina A (Biofarm S.A.) în ulei vegetal defloarea soarelui, 2000 U.I./şoarece/zi, prin gavaj (Marks, 1908), timp de 3săptămâni (n = 6);

șoareci cărora li s-a administrat ulei vegetal de floarea soarelui, 50µl/şoarece/zi,prin gavaj, timp de 3 săptămâni (grup control, n = 6);

şoareci care nu au primit nici un tratament, dar cărora li s-a facut gavaj în fiecare zicu apă, 50µl/şoarece/zi, timp de 3 săptămâni (grup control, n = 6).

La sfârșitul perioadei de tratament (la vârsta de 13 săptămâni) animalele au fostinjectate intraperitoneal cu câte 1.5 ml de tioglicolat în vederea recoltării de macrofage

10

peritoneale (MP). După 72h de la injectare, animalele au fost sacrificate prin dislocarecervicală, urmată de recoltarea macrofagelor peritoneale prin lavaj peritoneal cu mediuDMEM cu 1‰ glucoză.

Rezultatele experimentelor de Real-Time PCR au arătat ca tratamentul cu vitamină Aa indus o creştere de aproape 2 ori a nivelului de expresie genica a apoE în macrofageleperitoneale de la şoarecii C57BL/6, faţă de macrofagele peritoneale de la soarecii control

Acest studiu a urmărit investigarea efectului retinoizilor asupra exprimării genei apoE înmacrofage. Rezultatele obținute demonstrează faptul că retinoizii induc creșterea expresieiendogene a genei apoE în macrofage, atât in vitro, cât și in vivo. Astfel, acidul 9-cis-retinoicinduce creșterea nivelului de ARNm al apoE în linia de macrofage murine RAW 264.7, iarvitamina A creste expresia genica a apoE în macrofage peritoneale de șoarece. Acidul 9-cis-retinoic nu acționează direct asupra promotorului genei apoE, ci își exercită efectul asupramultienhancerului ME.2, prin intermediul căruia induce creșterea semnificativă a activitățiipromotorului (creștere demonstrată în experimentele de transfecţie prin creșterea activitățiiluciferazei). Analiza seriei de mutanți de deleţie ai ME.2 au indicat existența unui situs delegare a RXR în regiunea 405 – 420 a ME.2. Creșterea expresiei apoE de către acidul 9-cis-retinoic sau vitamina A în macrofage reprezintă un nou efect cu potențial benefic alretinoizilor, sugerând că acești compuși ar putea avea o utilizare terapeutică pentru reglareametabolismului lipidic, precum și în prevenția și/sau ameliorarea aterosclerozei.

► Efectul hormonilor tiroidieni asupra elementelor reglatoare proximale si distaleale apoE

Rolul hormonilor tiroidieni in reglarea apoE a fost testat prin experimente de tranfectietranzienta. Pentru aceasta, celulele au fost transfectate tranzient cu plasmide care continpromotorul proximal al apoE in prezenta multienhancerului 2 (constructul (-500/+73)apoEME) si vectori de expresie pentru receptorii hormonilor tiroidieni (THR), iardupa 16 ore de la transfectie celulele au fost tratate cu T3 (triiodotironina), liganzi ai THR.

Rezultatele experimentelor de transfectie tranzienta au aratat ca supraexpresiahormonilor tiroidieni in prezenta T3 a indus o crestere semnificativa a activitatii promotoruluiproximal al apoE in prezenta ME.2

In continuare a fost testat daca hormonii tiroidieni induc cresterea activitatiipromotorului apoE actionand in mod indirect prin intermediul multienhancerului 2 sauactionand in mod direct asupra promotorului proximal al apoE. Pentru aceasta, au fostrealizate experimente de transfectie tranzienta folosind plasmide care contin multienhancerul2 clonat in prezenta unui promotor minimal (constructul ME2-MLP) sau plasmide care continpromotorul proximal al apoE (constructul (-500/+73)apoE) precum si vectori de expresiepentru receptorii hormonilor tiroidieni.

Rezultatele experimentelor de transfectie tranzienta au aratat ca supraexpresiahormonilor tiroidieni in prezenta T3 a determinat o crestere de aproximativ zece ori aactivitatii promotorului apoE si o crestere usoara a activitatii multienhancerului 2, sugerandca hormonii tiroidieni actioneaza in mod preponderent asupra elementelor reglatoareproximale ale apoE.

11

► Modularea activităţii promotorului proximal al apoE de cătrefactorii de transcriptie SP1

Analiza in silico a elementelor reglatoare proximale si distale ale apoE a indicatprezenta situsurilor de legare a unor factori de transcripție cu rol esential in reglarea apoE.Trei situsuri de legare a factorilor de transcriptie SP1 au fost identificate in regiunile -184/-173, -169/-140 si respectiv -59/-45 ale promotoului proximal al apoE (Kim, 2005).

Pentru a evalua rolul factorilor de transcripție SP1 in reglarea apoE, au fost realizateexperimente de transfectie tranzienta. Celulele HEK293 au fost co-transfectate tranzient cuvectori de expresie pentru SP1 si plasmide care conțin promotorul proximal al apoE (regiunea-500/+73) clonat in vectorul pGL3 care contine gena raportor luciferaza. După 36-48 ore de latransfecţie, a fost determinată activitatea luciferazei, iar rezultatele obținute au fostnormalizate la expresia β-galactozidazei. Activitatea promotorului apoE in absența SP1 a fostconsiderată 100 unități arbitrare.

Rezultatele experimentelor de transfectie tranzienta au aratat ca supraexpresia factorilorde transcriptie SP1 a indus o crestere de aproximativ nouă ori a activitatii promotoruluiproximal al apoE, sugerand faptul ca factorii transcriptionali SP1 pot influenta activitateaacestuia prin legarea la una sau mai multe regiuni ale promotorului apoE.

► Modularea activităţii elementelelor reglatoare proximale si distale ale apoE de cătrefactorii de transcriptie c-Myb

Evaluarea interactiei factorilor de transcriptie c-Myb cu elementele reglatoareproximale si distale ale apoE a fost evaluat prin experimente de transfectie tranzientă. Pentruaceasta, macrofagele RAW 264.7 şi hepatocitele HepG2 au fost transfectate tranzient cuvectori de expresie pentru c-Myb şi plasmide care conţin promotorul proximal al apoE(constructul (-500/+73)apoE-luc) sau plasmide care conţin ME.2 clonat în faţa promotorului(constructul ME.2(-500/+73)apoE-luc).

Rezultatele experimentelor de co-transfectie tranzientă a macrofagelor RAW 264.7 auarătat că supraexpresia factorilor de transcriptie c-Myb a indus creşterea semnificativă aactivităţii promotorului apoE atât în absenţa cât şi în prezenţa multienhancerului 2. Efectulpozitiv al c-Myb asupra activităţii promotorului apoE a fost mai pronunţat atunci cândpromotorul apoE a fost clonat în prezenţa ME.2 în vectorul pGL3 basic.

În mod similar cu rezultatele experimentelor de transfectie realizate in macrofage,supraexpresia factorilor de transcriptie c-Myb în hepatocite HepG2 a indus activareapromotorului proximal al apoE atât în absenţa cât şi în prezenţa ME.2.

Efectul supraexpresiei factorilor c-Myb asupra activitatii promotorului apoE a fostevaluat si în celule HTB-11, iar rezultatele au aratat ca c-Myb induce o crestere de ~5ori aactivitătii promotorului apoE.

Efectul c-Myb asupra expresiei genice a apoE a fost evaluat prin experimente de Real-Time PCR după supraexpresia factorilor de transcriptie c-Myb realizată prin transfecțiatranzientă a celulelor HEK 293 cu vectori de expresie pentru c-Myb.

12

După ~40 ore de la transfecție, din celule a fost izolat ARN total. Reverstranscrierea a fostrealizată cu 1ug ARN, apoi expresia genică a apoE şi β-actinei a fost analizată prin Real TimePCR folosind primeri specifici (pentru genele umane apoE şi β-actină) şi sonde TaqMan de laApplied Biosystem. Rezultatele experimentelor Real Time PCR au arătat că supraexpresiafactorilor de transcriptie c-Myb în celule HEK 293 a indus o creştere de ~două ori a expresieigenice a apoE.

Rezultatele experimentelor de transfectie tranzienta a celulelor si cele aleexperimentelor de Real-Time PCR evidenţiază faptul că factorii de transcripţie c-Myb au unrol pozitiv în reglarea activitatii promotorului proximal al apoE si in reglarea expresiei genicea apoE.

► Modularea activităţii promotorului apoE de către factorii de transcriptie KLF4KL4 (Krüppel-like factor 4) sunt factori de transcriptie care prezinta efecte anti-

inflamatorii si a caror expresie creste puternic in celulele endoteliale din artere, vene sauendocard in conditii inflamatorii. Recent, a fost indicat faptul ca factorii KLF4 promoveazadiferentierea macrofagelor către fenotipul M2 anti-inflamatoriu si inhiba diferentiereaacestora către fenotipul M1 pro-inflamatoriu (Liao, 2011).

Avand in vedere importanta factorilor de transcriptie KLF4 in diferentiereamacrofagelor, a fost evaluat rolul factorilor de transcripţie KLF4 în reglarea apoE inmacrofage. Pentru aceasta au fost realizate experimente de co-transfecție tranzientă a celulelorRAW 264.7 folosind plasmide care contin diferite fragmente ale promotorului apoE (-455/+73, -397/+73, -350/+73, -300/+73) clonate in vectorul pGL3 sau plasmide care contindiferite fragmente ale ME.2 (1-600, 489-600, 321-600, 1-468, 1-366) clonate intr-un vectorcare contine un promotor minimal (MLP), precum si vectori de expresie pentru factorii detranscripţie KLF4.

Rezultatele experimentelor de co-transfectie tranzientă a macrofagelor RAW 264.7 auarătat că supraexpresia factorilor de transcriptie KLF4 a indus cresterea semnificativa aactivitatii fragmentelor de promotor -455/+73 si -397/+73, dar nu a crescut activitateafragmentelor de promotor -350/+73 si -300/+73. Aceste rezultate indica existenta unui situsde legare al factorilor KLF4 in regiunea -397/-350 a promotorului proximal al apoE.

Supraexpresia factorilor de transcriptie KLF4 in macrofagele RAW 264.7 a induscreşterea semnificativă a activităţii urmatoarelor fragmente ale ME.2: 1-600, 489-600 sirespectiv 321-600, dar nu a crescut activitatea fragmentelor 1-468 si 1-366. Astfel, utilizareafragmentelor de deletie ale ME2 (clonate in vectorul pGL3 in care a fost introdus un fragmentde promotor minimal) a dus la identificarea unui situs de legare a factorilor KLF4 in regiunea489-600 a multienhancerului 2.

► Modularea activităţii promotorului apoE de către factorii de transcriptie CHOPProcesul inflamator reprezintă un factor important în evoluţia bolii aterosclerotice. În

condiţiile inflamatorii din placa aterosclerotică, expresia apoE în macrofage scade, avândefect negativ asupra efluxului de colesterol în exces. Există numeroşi agenţi inflamatorii, însămecanismele prin care aceştia induc scăderea expresiei apoE nu sunt deplin elucidate. Rolulfactorilor de transcripţie CHOP în reglarea activităţii promotorului apoE a fost evaluat prin

13

experimente de co-transfecție tranzientă. Plasmida care conţine secvenţa CHOP (956 pb)inserată în vectorul pCMV-Sport6 a fost obţinută prin clonare moleculară, parcurgândurmătoarele etape:1. Obţinerea insertului

Insertul reprezentat de secvenţa CHOP (956 pb) a fost obţinut prin excizie din vectorulpOTB7 (Figura 1.25) folosind enzimele de restricţie EcoRI şi XhoI. Fragmentele ADNrezultate în urma digestiei au fost separate prin electroforeză în gel de agaroză, iar ADNcorespunzător insertului CHOP (956 pb) a fost excizat din gel şi purificat folosind un kitPromega (Wizard SV gel and PCR Clean-up System).

Figura 1.5. Harta vectorului pOTB7.

2. Linearizarea vectorului pCMVSport6Vectorul pCMVSport a fost linearizat prin digestie cu enzimele de restricţie EcoRI şi

XhoI, ADN rezultat după digestie a fost separat prin electroforeză în gel de agaroză, apoibanda corespunzătoare vectorului pGL3 linearizat a fost izolată şi purificată din gel.

3. Ligarea insertului CHOP în vectorul pCMVSport6Reacţia de ligare a insertului CHOP în vectorul pCMVSport6 a fost realizată cu

enzima T4 DNA ligaza timp de 16 ore la 18oC. A fost folosit un raport de 10 moli insert : 1mol vector, ţinând cont că insertul are 956 pb, iar vectorul are 4396

pb.Figura 1.7. Harta vectorului pCMV-SPORT6.

14

4. Selecția clonelor pozitive (care au integrat insertul CHOP in vectorul pCMVSport6)Produşii de ligare au fost utilizaţi la transformarea celulelor bacteriene E. coli DH5α

competente. Pentru selecţia clonelor care au preluat vectorul pCMVSport6, a fost folositantibioticul ampicilină, întrucât acest vector conţine gena pentru rezistență la ampicilină.

Coloniile formate au fost cultivate în mediu lichid Luria Bertani, apoi a fost izolat ADNplasmidial. Pentru selecţia clonelor care au integrat insertul CHOP în vectorul pCMVSport6,ADN plasmidial a fost izolat şi migrat în gel de agaroză. ADN izolat din clonele care au avutsecvenţa CHOP (956 pb) inserată în vectorul pCMVSport6 a fost întârziat în gel spredeosebire de ADN izolat din clonele care au integrat doar vectorul. Testarea clonelor care auintegrat insertul CHOP în vectorul pCMVSport6 a fost realizată prin digestia ADN plasmidialcu enzimele de restricţie EcoRI şi XhoI. ADN rezultat după reacția de digestie a fost separatprin electroforeză în gel de agaroză.

Figura 1.8. Verificarea integrării secvenţei CHOP învectorul pCMVSport6. Prin digestia cu enzimele derestricţie EcoRI şi XhoI, secvenţa CHOP a fostexcizată din vectorul pCMVSport6 în cazul clonelorpozitive (godeurile 3, 4, 5 şi 6); In godeul 2 esterezultatul pentru o clona negativă.5. Multiplicarea plasmidelor

După identificarea plasmidelor dorite, s-aizolat o cantitate mai mare de ADN plasmidial,necesară transfecţiei celulelor eucariote, folosindu-se unkit Midiprep de la Qiagen, iar puritatea ADN a fost testat spectrofotometric folosind aparatulNanodrop.

După obtinerea plasmidei CHOP clonate in vectorul SPORT, a fost evaluat efectulsupraexpresiei factorilor de transcripţie CHOP asupra activităţii promotorului proximal alapoE prin experimente de co-transfecție tranzientă. Pentru aceasta, macrofagele RAW 264.7au fost co-transfectate tranzient cu vectori de expresie pentru CHOP şi plasmide în carepromotorul apoE a fost clonat în vectorul pGL3 basic (constructul (-500/+73)apoE). După 36-48 ore de la transfecţie, a fost determinată activitatea luciferazei, iar rezultatele obţinute aufost normalizate la expresia β-galactozidazei. Rezultatele experimentelor de co-transfecțietranzientă au arătat că supraexpresia factorilor de transcripție CHOP a indus scădereasemnificativă a activității promotorului proximal al apoE (regiunea -500/+73) atât înhepatocite cât şi în macrofage (Figura 1.26).

► Modularea activităţii elementelor reglatoare proximale si distale ale apoE de cătrefactorii de transcriptie PU.1

Rolul factorilor de transcripție PU.1 in reglarea apoE a fost evaluat prin experimentede transfectie tranzientă in macrofage RAW 264.7 si hepatocite HepG2. Pentru aceasta,celulele au fost co-transfectate tranzient cu vectori de expresie pentru PU.1 si plasmide careconțin promotorul proximal al apoE (regiunea -500/+73), plasmide care conțin secventamultienhancerului 2 (ME.2), precum si plasmide in care ME.2 a fost clonat in fata

15

promotorului apoE (constructul ME.2(-500/+73)apoE) in vectorul pGL3. După 36-48 ore dela transfecţie, a fost determinată activitatea luciferazei, iar rezultatele obținute au fostnormalizate la expresia β-galactozidazei. Activitatea elementelor reglatoare proximale sidistale in absența PU.1 a fost considerată 100 unități arbitrare.

Rezultatele experimentelor de co-transfecție tranzientă au arătat că supraexpresiafactorilor PU.1 în macrofage nu a indus o creştere semnificativă a activităţii promotoruluiapoE, însă a indus creşterea semnificativă a activităţii multienhancerului 2 precum şi apromotorului proximal al apoE în prezenţa ME.2. Aceste rezultate evidenţiază că factorii detranscripţie PU.1 au rol specific în reglarea apoE în macrofage, acţionând indirect asuprapromotorului apoE prin intermediul multienhancerului 2.

Spre deosebire de rezultatele obţinute în macrofage, supraexpresia factorilor detranscripţie PU.1 în hepatocite nu a determinat creşterea activităţii promotorului proximal alapoE sau a multienhancerului 2.

► Modularea activităţii elementelor reglatoare proximale si distale ale apoE de cătrefactorii de transcriptie C/EBP

Având în vedere datele din literatură care arată că secvenţa elementului reglator distal,ME.2 conţine situsuri de legare pentru factorii de transcripţie C/EBP, ne-am propus să testămrolul C/EBP în reglarea apoE. Pentru aceasta, am testat efectul supraexpresiei factorilor detranscripţie C/EBPα şi C/EBPβ asupra activităţii promotorului apoE prin experimente detransfecție tranzientă. Astfel, celulele RAW 264.7 şi HepG2 au fost co-transfectate cu vectoride expresie pentru C/EBPα sau C/EBPβ, plasmide care conţin promotorul proximal al apoE(constructul (-500/+73)apoE-luc) sau plasmide în care multienhancerul 2 a fost clonat în faţapromotorului apoE (constructul ME.2(-500/+73)apoE-luc) în vectorul pGL3 basic careconţine gena luciferaza. După 36-48 ore de la transfecţie, a fost determinată activitatealuciferazei şi rezultatele au fost normalizate la activitatea β-galactozidazei. Rezultatele acestorexperimente de transfecție tranzientă au arătat că supraexpresia factorilor de transcripţieC/EBPα sau C/EBPβ în macrofage a indus scăderea activităţii promotorului apoE precum şicea a promotorului proximal al apoE clonat în prezenţa multienhancerului 2. În plus,supraexpresia C/EBPβ a avut un efect de scădere a activităţii promotorului apoE mult maipronunţat decât supraexpresia C/EBPα.

Supraexpresia factorilor de transcripţie C/EBPα sau C/EBPβ în hepatocite HepG2 aindus creşterea semnificativă a activităţii promotorului proximal al apoE, precum şi cea apromotorului apoE în prezenţa multienhancerului 2. Prin urmare, rezultatele experimentelorde transfectie tranzientă arată că factorii de transcripţie C/EBPα şi C/EBPβ au un efect opus înreglarea apoE în macrofage şi hepatocite.

Întrucât activitatea promotorului apoE a fost crescută puternic prin supraexpresiaC/EBPβ în hepatocite, în continuare ne-am propus să identificăm regiunea minimă apromotorului apoE care este activată de către C/EBPβ. Pentru aceasta, au fost realizateexperimente de co-transfecție tranzientă folosind vectori de expresie pentru CEBPβ şiplasmide care conţin diferite fragmente ale promotorului proximal al apoE clonate în vectorulpGL3 basic care conţine gena pentru luciferaza. Rezultatele experimentelor de transfectietranzientă folosind următoarele fragmente ale promotorului proximal al apoE: (-55/+73), (-

16

100/+73), (-300/+73), (-397/+73), (-445/+73) şi respectiv (-500/+73) au arătat căsupraexpresia CEBPβ a determinat creşterea activităţii tuturor fragmentelor testate. Acesterezultate care arată că supraexpresia factorului de transcripţie CEBPβ induce creştereaactivităţii şi a celui mai mic fragment de promotor testat (-55/+73) sugerează că CEBPβprezintă un situs de legare în regiunea -55/+73 a promotorului proximal al apoE.

Modularea activităţii promotorului apoE de către factorii de transcriptieCTNNB1

Proteinele CTNNB1 (catenina beta 1, proteina asociata cu caderina) fac parte dintr-uncomplex de proteine care alcatuiesc jonctiunile aderente, esentiale pentru mentinerea stratuluide celule epiteliale si transmiterea semnalelor intracelulare. Deficienta CTNNB1 induceaparitia defectelor in organizarea tesuturilor, adeziunea si proliferarea celulelor. Avand invedere importanta CTNNB1, rolul acestor factori de transcripţie în reglarea activităţiipromotorului apoE a fost evaluat prin experimente de co-transfecție tranzientă folosindvectori de expresie pentru CTNNB1 si plasmide care contin promotorul proximal al apoE.Rezultatele au indicat faptul ca supraexpresia proteinelor CTNNB1 a indus o cresteresemnificativa a activitatii promotorului apoE in celule HEK 293.

► Modularea expresiei apoE de către factorii transcripționali ATF

Supraexprimarea factorilor de transcriptie ATF2 (din familia AP-1) in macrofage sihepatocite a evidentiat o actiune diferita asupra activitatii promotorului apoE. In celuleleHepG2, supraexpresia factorilor de transcriptie ATF2 determina activarea promotorului apoE(Fig. 1.32. A), in timp ce in celulele RAW 264.7 supraexpresia ATF2 determina o scadere aactivitatii promotorului apoE

Activitatea 1.2. Testarea interactiei dintre factori de transcriptie si evaluarea unor efectesinergice ale actiunii lor in macrofage.

1.2.1.Rolul interacţiei factorilor de transcriptie STAT1 si RXR în reglarea apoEPentru a testa dacă interactia dintre factorii de transcripție STAT1 si RXR este

implicata în reglarea activităţii promotorului apoE au fost realizate transfecţii tranziente alecelulelor HTB-11 cu plasmide care conţin fragmente ale promotorului apoE (constructul[-500/+73]apoE) în absenţa (control) sau prezenţa vectorilor de expresie pentru STAT1 siRXR si a diferitelor concentratii de interferon gama. Asadar, activitatea promotorului apoE afost analizată dupa supraexpresia STAT1 si RXR în condiţii bazale sau după tratamentul cuinterferon gama. Rezultatele experimentelor de transfecţie tranzientă au arătat căsupraexpresia STAT1 si RXR simultan cu tratamentul cu interferon gama a crescut activitateapromotorului proximal al apoE la un nivel mai mare decât fiecare activator în parte.

1.2.2. Testarea efectului sinergic al proteinelor c-Myb şi CBP în reglarea apoEAvând în vedere datele din literatură care au arătat că proteinele c-Myb pot

interacţiona cu co-activatorii CBP pentru a-şi exercita funcţia de reglare a transcripţiei genice,ne-am propus să evaluăm rolul interacţiei proteinelor c-Myb şi CBP în reglarea apoE. Pentruaceasta, au fost realizate experimente de co-transfectie tranzientă a macrofagelor şi

17

hepatocitelor folosind vectori de expresie pentru CBP şi c-Myb, precum şi plasmide careconţin promotorul apoE, respectiv constructul (-500/+73)apoE-luc.

Rezultatele experimentelor de co-transfectie tranzientă a macrofagelor RAW 264.7 auarătat că supraexpresia factorilor de transcripţie CBP sau c-Myb a indus creşterea activităţiipromotorului apoE (regiunea -500/+73), supraexpresia simultană a celor doi factori detranscripţie avâ nd un efect similar cu cel al supraexpresiei factorilor de transcripţie c-Myb.Activitatea promotorului proximal al apoE în prezenţa ME.2 a fost crescută semnificativ decătre supraexpresia CBP şi c-Myb, însă supraexpresia simultană a celor doi factori detranscripţie nu a avut un efect mai pronunţat decât cel al supraexpresiei factorilor detranscripţie c-Myb.

1.2.3. Rolul interacţiei proteinelor C/EBPβ cu C/EBPα sau c-Jun în reglarea apoEUn posibil efect sinergic al factorilor C/EBPα şi C/EBPβ în reglarea activităţii

promotorului apoE a fost testat prin supraexpresia simultană a factorilor de transcripţieC/EBPα şi C/EBPβ, urmarindu-se efectul acesteia asupra activităţii promotorului apoE înmacrofage. Rezultatele experimentelor de transfectie tranzientă realizate folosind macrofageRAW 264.7 au arătat că supraexpresia C/EBPα sau C/EBPβ a scăzut semnificativ activitateapromotorului proximal al apoE, supraexpresia factorului C/EBPβ având un efect maipronunţat decât supraexpresia factorului C/EBPα. Supraexpresia concomitentă a C/EBPα şiC/EBPβ în macrofage nu a avut un efect de scădere a activităţii promotoului apoE maipronunţat decât supraexpresia C/EBPβ.

Datele din literatură au arătat că proteinele C/EBPβ pot interacţiona cu c-Jun pentru a-şi exercita funcţia de reglare a expresiei genice. Prin urmare, ne-am propus să testăm efectulsupraexpresiei simultane a C/EBPβ şi c-Jun asupra activităţii promotorului proximal al apoE.Au fost realizate experimente de transfecție tranzientă a macrofagelor şi hepatocitelor folosindplasmide care conţin promotorul apoE (regiunea -500/+73) în prezenţa vectorilor de expresiepentru c-Jun şi C/EBPβ.

Rezultatele au arătat că supraexpresia c-Jun şi C/EBPβ a indus scăderea semnificativăa activităţii promotorului apoE în macrofage şi creşterea activităţii promotorului apoE înhepatocite, efectul supraexpresiei concomitente a celor doi factori de transcripţie fiind similarcu efectul supraexpresiei fiecărui factor în parte (Figura 1.36). Aceste rezultate evidenţiază căfactorii de transcripţie c-Jun şi C/EBPβ reglează expresia apoE în mod diferit în funcţie detipul celular, iar supraexpresia celor doi factori nu are efect sinergic asupra activităţiipromotorului apoE.

1.2.4. Rolul interacţiei factorilor de transcriptie GATA3 cu SP1/c-myb în reglarea apoEDatele din literatură au arătat că proteinele GATA3 pot interacţiona cu SP1 sau cu c-

myb pentru a-şi exercita funcţia de reglare a expresiei genice. Prin urmare, ne-am propus sătestăm efectul supraexpresiei simultane a GATA3 si SP1 cat si a combinatiei GATA3 si c-myb si asupra activităţii promotorului apoE.

Rezultatele au arătat că supraexpresia GATA3 si SP1 a indus cresterea semnificativă aactivităţii promotorului apoE, insa supraexpresia celor doi factori nu are efect sinergic asupraactivităţii promotorului apoE. Prin contrast, rezultatele experimentelor de transfectietranzienta au arătat că supraexpresia GATA3 si c-myb a indus cresterea semnificativă a

18

activităţii promotorului apoE, iar supraexpresia celor doi factori are efect sinergic asupraactivităţii promotorului apoE.

1.2.5. Rolul interacţiei factorilor de transcriptie KLF4 cu SP1, CTNNB1 si C/EBP înreglarea apoE

Datele din literatură au arătat că proteinele KLF4 pot interacţiona cu SP1, cuCTNNB1 si cu C/EBP pentru a-şi exercita funcţia de reglare a expresiei genice. Ca urmare,ne-am propus să testăm efectul supraexpresiei simultane a KLF4 cu SP1, cu CTNNB1 si cuC/EBP asupra activităţii promotorului apoE. Rezultatele au aratat ca nu exista un efectsinergic al acestor factori asupra expresiei apoE.In concluzie, experimentele noastre arata ca exista interactii sinergice in reglarea expresieigenice a apoE intre urmatorii factori de transcriptie: RXR si T3R, RXR si STAT1, GATA3şi c-Myb.

Activitatile prevazute in faza a patra a proiectului in cadrul primului obiectiv:Determinarea implicarii unor factori de transcriptie in reglarea apolipoproteinei E incelulele endoteliale.

Implicarea unor factori de transcriptie in reglarea activitatii promotorului apoE in celuleendoteliale a fost testata prin experimente de transfectie tranzienta. Celulele endoteliale EAhy926au fost transfectate tranzient prin tehnica precipitării ADN cu clorură de calciu, metodă carepresupune formarea unui precipitat din ADN plasmidial cu ioni de calciu într-o soluţie cu pHstabilizat de către tamponul HBS (HEPES buffered saline). După 36-48 ore de la transfecţie,celulele au fost colectate şi lizate, apoi a fost determinată activitatea luciferazei printr-o metodăbioluminiscentă, folosind un kit Promega. Rezultatele experimentelor de transfecţie au fostnormalizate la activitatea β-galactozidazei, co-transfectata.

Rezultatele au aratat: (1.) Cresterea activitatii promotorului apoE in celuleleendoteliale sub actiunea (1a) hormonilor tiroidieni si a factorului de transcriptie c-Myb (1b); 2.Scaderea activitatii promotorului apoE in celulele endoteliale sub actiunea: (2.a) hormonilorglucocorticoizi;( 2b.) factorilor de transcriptie SP1, (2c.) factorilor de transcriptie C/EBPβ ;(2d.)factorilor de transcriptie AP1; (2e.) factorilor de transcriptie CTNNB1; (2f.)factorilor detranscriptie KLF4; (2g.) factorilor de transcriptie NFATC4 si (2h) enzima PIN1. Rezultatele auaratat ca factorii nu influenteaza expresia apoE in endoteliu.

1.a. Reglarea activităţii promotorului apoE prin activarea RXRα-ThRβ. Pentru ainvestiga rolul heterodimerilor RXRα-ThRβ în reglarea activitatii promotorului apoE în celuleendoteliale, celulele EAhy926 au fost transfectate tranzient folosind plasmide care continpromotorul proximal al apoE clonat in vectorul pGL4 precum si vectori de expresie pentru RXRαsi ThRβ in prezenta liganzilor specifici, acid 9-cis-retinoic si T3. Rezultatele experimentelor detransfectie tranzienta au aratat ca supraexpresia si activarea homodimerilor RXRα cu acid 9-cis-retinoic a crescut de aproximativ doua ori activitatea promotorului apoE. In plus, Supraexpresiaheterodimerilor RXRα-ThRβ a crescut semnificativ activitatea promotorului proximal al apoE incelule EAhy926.

19

1.b.Transactivarea promotorului apoE de către factorii de transcripție c-Myb. Rolulfactorilor de transcriere c-Myb în reglarea apoE a fost evaluat prin experimente de transfectietranzientă. Pentru aceasta, celulele EAhy926 au fost transfectate tranzient cu vectori de expresiepentru cMyb şi plasmide care conţin promotorul proximal al apoE (regiunea -500/+73) clonat invectorul pGL4. Supraexpresia cMyb in celule EAhy926 a indus o crestere de aproximativ douaori a activitatii promotorului proximal al apoE.

2.a. Modularea activităţii promotorului apoE de catre glucocortizoizi. Glucocorticoiziisunt utilizati in tratamentul a numeroase boli inflamatorii si auto-imune datorita proprietatilor loranti-inflamatorii. Acestia isi exercita actiunea in special prin legarea la receptorul pentruglucocorticoid (GR), un factor de transcriptie din familia receptorilor nucleari. In absentaligandului, GR se gaseste inactiv in citoplasma, in complex cu proteine chaperone HSP90. Dupalegarea ligandului, are loc disocierea complexului determinand schimbari conformationale careexpun secventele de localizare nucleara. GR activ este translocat in nucleu si regleaza pozitivtranscriptia genelor tinta prin legarea la elemente de raspuns la glucocorticoizi (GRE) dinregiunile reglatorii genice. In ciuda numeroaselor studii care au evidentiat proprietatile anti-inflamatorii ale glucocorticoizilor, efectul acestora in reglarea apoE nu a fost raportat. In acestproiect a fost testat efectul activarii glucocorticoizilor asupra activitatii promotorului apoE incelule endoteliale EAhy926. Pentru aceasta au fost realizate experimente de co-transfectietranzienta folosind plasmide care contin promotorului proximal al apoE (-500/+73) clonat invectorul pGL4 precum si vectori de expresie pentru GRα in prezenta dexametazonei (ligandsintetic pentru glucocorticoizi). Rezultatele acestor experimente au aratat ca activareaglucocorticoizilor prin tratament cu dexametazona a indus o scadere a activitatii promotoruluiproximal al apoE in celule endoteliale. In plus, supraexpresia receptorilor pentru glucocorticoiziconcomitent cu tratamentul cu dexametazona a scazut semnificativ activitatea promotoruluiapoE.

2.b.Reglarea activitatii promotorului apoE de către factorii de transcripție SP1.Deoarece prin analiza in silico s-au evidentiat unele posibile situsuri de legare a factorului detranscriptie SP1, am testat posibila reglare a genei apoE de catre acest factor de transcriptie.Supraexpresia SP1 in celule EAhy926 a redus la jumatate activitatea promotorului proximal alapoE.

2.c. Modularea activitatii promotorului apoE de către factorii de transcripție C/EBPβ.Testarea efectului supraexpresiei factorilor de transcripţie C/EBPβ asupra activităţii promotoruluiapoE in celule endoteliale a fost realizata prin experimente de co-transfecție tranzientă folosindvectori de expresie pentru C/EBPβ, plasmide care conţin promotorul proximal al apoE(constructul (-500/+73)apoE-luc) clonat în vectorul pGL4 care conţine gena luciferaza.Rezultatele acestor experimente de transfecție tranzientă au arătat că supraexpresia factorilor detranscripţie C/EBPβ în celule endoteliale a indus scăderea activităţii promotorului apoE laaproximativ 40%.

2.d. Modularea expresiei apoE de către factorii transcripționali AP-1. Avand in vederedatele din literatură care indică un rol crucial al factorilor de transcripţie din complexul AP-1 înactivarea unor gene implicate în inflamaţie şi ateroscleroză, am testat efectul supraexpresiei

20

factorilor de transcripţie cJun în controlul expresiei apoE. Pentru aceasta au fost realizateexperimente de co-transfecție tranzientă a celulelor endoteliale folosind plasmide care conţinpromotorul proximal al apoE (regiunea -500/+73) clonat în vectorul pGL4 precum şi vectori deexpresie pentru cJun. Rezultatele experimentelor de transfecție tranzientă au arătat căsupraexpresia factorilor c-Jun in celule EAhy926 a determinat o scădere semnificativă aactivităţii promotorului apoE.

2.e. Modularea expresiei apoE de către factorii transcripționali CTNNB1.Rezultateleexperimentelor de transfectie tranzienta au aratat ca supraexpresia factorilor de transcriptieCTNNB1 (catenina) în celule EAhy926 a scazut la ~20% activitatea promotorului apoE.

2.f. Modularea expresiei apoE de către factorii transcripționali KLF4.Rezultateleexperimentelor de transfectie tranzienta au aratat ca supraexpresia KLF4 în celule EAhy926 ascazut la ~17% activitatea promotorului apoE.

2.g. Modularea expresiei apoE de către factorii transcripționali NFATc4. Rezultateleexperimentelor de transfectie tranzienta au aratat ca supraexpresia NFATC4 în celule EAhy926 ascazut la ~8% activitatea promotorului apoE.

2.h. Modularea expresiei apoE de către PIN1. Rezultatele experimentelor de transfectietranzienta au aratat ca supraexpresia PIN1 în celule EAhy926 a redus la ~10% activitateapromotorului apoE.

3.a. Factorii transcripționali PU1 . Experimentele de supraexpresie a factorului detranscriptie PU.1 in celule endoteliale EAhy926 au aratat ca activitatea promotorului apoE nueste influentata de catre acest factor de transcriptie, in ciuda existentei unor posibile situsuri delegare, detectate in silico. .

3.b. Factorii transcripționali CHOP. Rezultatele experimentelor de transfectietranzienta au aratat ca supraexpresia factorilor de transcriptie CHOP în celule EAhy926 a scazutcu ~10% activitatea promotorului apoE.

21

OBIECTIVUL 2. Tintirea monocitelor exprimand apoE catre placile ateroscleroticeIn prima faza a proiectului am stabilit protocolul optim pentru izolarea monocitelor din

sangele murin. Aceasta metoda se bazeaza pe centrifugare in gradient de Histopaque (30min,400g). Apoi inelul de celule albe a fost recoltat, si celulele au fost spalate in solutie DMEM sisedimentate prin centrifugare (110g, 10min). Monocitele au fost apoi purificate pe coloane cuparticule magnetice de care era legat anticorpul anti CD11 (kit pentru selectie pozitiva de laMilteni Biotech). Fracţia de monocite purificata a fost folosita în continuare pentru studii deactivare si experimente de transplant.

In faza a doua am realizat urmatoarele activitati:Activitatea II.2a. Inducerea expresiei apoE in monocyte. Pentru aceasta a fost

clonata gena proteinei apoE3 umane intr-o plasmida pLION (furnizata de Dr. K. Kypreos,Univ.Patras, Greece). Constructul a fost verificat prin digestive enzimatica, iar monocitele aufost transfectate. Datorita gradului mic de transfectie, expresia apoE a fost indusa prinincubarea monocitelor provenite de la soareci C57Black si selectate cu ajutorului unui kitpentru selectie pozitiva de la Milteni Biotech. cu forbol-miristat acetat (PMA) si cumacrophage colony stimulating factor (MCSF).

Rezultatele au aratat ca expresia apoE este indusa atat de PMA cat si de MCSFFigura 2.2. Evidentierea inducerii apoE prin incubarea cu MCSF, evidentiata prin RT-PCR.

In plus, pentru corelarea inducerii expresiei apoE cu expresia unor marcheri demacrofage, a fost testata expresia ccr2, cd62l, cd11a, cd11b, cd11c, ly6c. Cele maisemnificative rezultate au fost obtinute pentru expresiile CD11b si Ly6c

Activitatea II.2b. Testarea nivelului minim de activare care sa permita infiltrareaeficienta a monocitelor in placa aterosclerotica.

Un lot de 22 soareci apoE deficienti a fost fost hranit timp de 4 saptamani cu hranaaterosclerotica continanad colesterol 1% si unt 15%. Lotul a fost impartit in 5 grupe astfel: 2animale control, 4 animale injectate cu monocite neactivate, 4 animale injectate cu monociteactivate 2h cu PMA, 4 animale injectate cu monocite activate 18h cu PMA, 4 animaleinjectate cu monocite activate 2h cu MCSF, 4 animale injectate cu monocite neactivate 2h cuMCSF. Fiecare animal a fost injectat prin vena caudala de 3 ori la interval de 3 zile, cu cate100000 celule activate sau neactivate, exceptand controlul, caruia i s-a administrat numaimediu pentru celule.

Pentru fiecare injectie a fost recoltat sangele de la 10 soareci masculi C57Black a fostcolectat prin punctie cardiaca, ventricul stang, pe anti-coagulant (heparina). Dupa lizahematiilor cu clorura de amoniu, fractia de leucocite a fost sedimentata prin centrifugare.Monocitele au fost izoate cu ajutorul unui kit pentru selectie negative de la firma StemCellTechnologies. Celulele au fost marcate cu PKH, pentru vizualizare cu aparatura IVISSpectrum.

Rezultatele au aratat ca:1. Monocitele se infiltreaza in placile aterosclerotice din

aorta soarecilor apoE deficienti.In figura alaturata este redata inima si aorta (ascendenta, carja

aortica si descendenta toracica) unui animal caruia i s-au administrat

22

monocite activate cu MCSF 18h, dupa spalarea vasculaturii cu tampon fosfat salin siprelevare. Se observa ca monocitele s-au infiltrat in placile aterosclerotice (coloratia inverde), in timp ce autofluorescenta tesuturilor este redata cu rosu. Se observa o acumulareintensa la nivelul aortei ascendente si a carjei aortice, dar si in restul aortei.

2. Plamanul este un alt organ in care sunt atrasemonocitele. Se observa plamanul, splina si ficatul unuianimal caruia i s-au administrat monocite activate cuMCSF 18h, dupa spalarea vasculaturii cu tampon fosfatsalin si prelevare. Se observa ca monocitele s-au infiltratin numar mare in plaman (stanga, coloratia in verde), intimp ce splina nu a retinut monocitele injectate, iar ficatul, desi are o auto-fluorescenta mare, (rosu), retine o anumita cantitate de celule marcate (verde).

3. Capacitatea de infiltrare creste in urmatorul sens:Monocite neactivate < monocite activate cu PMA 2h < monocite activate cu PMA 18h

< monocite activate cu MCSF 2h < monocite activate cu MCSF 18hAcest lucru a fost determinat prin evaluarea intensitatii colorantului din monocitele

infiltrate. Astfel,- monocite activate cu PMA 18h: intensitatea relativa este de ~4.09E+07- monocite activate cu MCSF 2h: intensitatea relativa este de ~4.53E+07- monocite activate cu MCSF 18h: intensitatea relativa este de ~ 5.72E+07In faza a treia au fost realizate experimente prin care s-a evidentiat eficienta

transplantului de monocite in soarecii cu placi aterosclerotice incipiente (activitatea 2.1) siavansate (activitatea 2.2), dupa cum urmeaza:

Activitatea 2.1. Primului lot de soareci apoE deficienti i s-a administrat timp de o luna,hrana aterosclerotica continanad colesterol 1% si unt 15%. In acest timp s-au dezvoltat placiaterosclerotice incipiente (placile ocupau ~20% din suprafata aortei). Lotul a fost impartit in 3grupe: a. Control; b. animale injectate cu monocite neactivate; c. animale injectate cumonocite activate 2h cu MCSF. Monocitele au fost izolate pe gradient de Histopaque sipurificate folosind un kit de la Milteni-Biotech. Fiecare animal a fost injectat prin venacaudala de 4 ori la interval de 3 zile, cu ~100000 celule activate sau neactivate, exceptandcontrolul, caruia i s-a administrat numai mediu pentru celule. Dupa 3 saptamani de la ultimainjectie animalele au fost sacrificate si s-au recoltat sangele, aorta, ficatul si plamanii.

Cuantificarea leziunilor ateromatoase la nivelul aortei a fost realizata prin coloratie cuOil RedO, dupa disectia longitudinala a aortelor si etalarea acestora pe suport de silicon, prinprinderea laterala cu ace subtiri.

Rezultatele au aratat ca: (1.) transplantantul de monocitele neactivate la soarecii apoEdeficienti avand placi incipiente (o luna tratament atero) a redus marimea placiloraterosclerotice la ~21.4%; (2.) Monocitele activate ex-vivo cu MCSF timp de 2ore si apoitrasplantate soarecilor apoE deficienti avand placi incipiente (o luna tratament atero), au redusdimensiunea placilor aterosclerotice la ~18%.

Colestelul liber, trigliceridele si colesterolul din HDL au fost dozate cu ajutorul kiturilorde la firma Dialab). Asa cum reisese din figura 2.8, soarecii C57 black au nivele mult maiscazute de colesterol decat soarecii apoE-/- de control (ctr). Desi transplantarea monocitelor

23

induce diminuarea ariilor lezionale, secretia de apoE a acestora este probabil locala (ininteriorul placii atero) si nu conduce la o imbunatatire a nivelelor lipidelor plasmatice.

Pentru detectarea infiltrarii monocitelor transplantate a fost testata prezenta genei sry siexpresia apoE. Lotul de soareci apoE-/- a fost realizat numai din femele, iar monociteletransplantate au fost izolate de la masculi. ADN s-a izolat utilizant un kit Promega. Au fostrealizate experimente de Real Time PCR, utilizand sonde si primeri specifice, folosind 1ugADN in cazul plamanului si ficatului si ~250ug ADN din tesutul aortic. Rezultatele arata cagena sry (prezenta numai in celulele animalelor mascule transplantate) a fost detectata si inplaman, insa monocitele rezidente nu au fost detectate in ficat. Rezultatele sunt similare curezultatele obtinute la IVIS Spectrum, cu monocite colorate cu PKH, obtinute in fazaanterioara. Rezultatele obtinute au aratat ca gena sry a fost prezenta in unele aorte obtinute dela animalele transplantate cu monocite; totusi, trebuie mentionat ca ADN care s-a putut obtinedintr-o aorta a unui animal a fost de ~250ug, iar semnalul de amplificare pentru sry a aparutdupa ciclul 35. In ceea ce priveste cantitatea de apoE secretata la nivelul placii aortice de catremonocitele care se infiltreaza, aceasta nu a putut fi evidentiata prin experimente de RT-PCR,deoarece este sub limita de detectie a metodei.

Activitatea 2.2. Celui de-al doilea lot de soareci apoE deficienti i s-a administrat timp de 3luni hrana aterosclerotica continand colesterol 1% si unt 15%, timp suficient pentrudezvoltarea unor placi avansate (dimensiunea placilor ocupa ~53.5% din suprafata aortei).Lotul a fost impartit in 4 grupe: a. Control; b. animale injectate cu monocite neactivate; c.animale injectate cu monocite activate 2h cu MCSF; d. animale injectate cu monocite activate24h cu MCSF. Monocitele au fost izolate asa cum s-a descris mai sus. Fiecare animal a fostinjectat prin vena caudala de 4 ori la interval de 3 zile, cu cate ~100000 celule activate sauneactivate, exceptand controlul, caruia i s-a administrat numai mediu pentru celule.Cuantificarea leziunilor ateromatoase la nivelul aortei a fost realizata prin coloratie asa cumam descris mai sus. Rezultatele au aratat ca: (1.) transplantantul de monocitele neactivate lasoarecii apoE deficienti avand placi avansate (3 luni tratament atero) nu au reusit sa reducasemnificativ marimea placilor aterosclerotice (reducere la ~97%); (2.) Monocitele activateex-vivo cu MCSF timp de 2ore si apoi trasplantate soarecilor apoE deficienti avand placiavansate (3 luni tratament atero), au redus dimensiunea placilor aterosclerotice la ~50%; (3.)Monocitele activate ex-vivo cu MCSF timp de 24ore si apoi trasplantate soarecilor apoEdeficienti avand placi avansate (3 luni tratament atero), au redus dimensiunea placiloraterosclerotice la ~63%

Colesterolul liber, trigliceridele si colesterolul din HDL au fost dozate asa cum a fostdescris mai sus, insa nici in cazul animalelor cu placi vansate, transplantul de monocite nuconduce la o imbunatatire a nivelului plasmatic de lipide nici la 3 zile dupa tramsplant, nicidupa 3 saptamani de la transplant.

Evaluarea prezentei genei sry si a expresiei apoE la nivelul placii atero a fost sub limitade detectie a metodei PCR si respectiv RT-PCR.

Celui de-al treilea lot de soareci apoE deficienti i s-a administrat timp de 6 luni hranaaterosclerotica continand colesterol 1% si unt 15%, timp suficient pentru dezvoltarea unorplaci foarte avansate. Lotul a fost impartit in 3 grupe: a. Control; b. animale injectate cumonocite neactivate; c. animale injectate cu monocite activate 2h cu MCSF. Monocitele au

24

fost izolate asa cum s-a descris mai sus. Fiecare animal a fost injectat prin vena caudala de 4ori la interval de 3 zile, asa cum este descris pentru loturile precedente. Placile dezvoltate deanimalele apoE-/- au fost extinse si au prezentat calcifieri. Analiza placilor in urmatransplantului monocitelor neactivate si activate la soarecii apoE deficienti cu placi foarteavansate ( la 6 saptamani de la transplant) nu a aratat diminuari semnificative in dimensiune,insa s-a observat o scadere a colesterolului plasmatic la soarecii apoE-/- transplantati cumonocite activate 2h cu MCSF.

Activitatile prevazute in cadrul fazei a patra a proiectului: Transplantareamonocitelor transfectate pentru a supraexprima apoE3 uman in soareci apoEdeficienti cu placi incipiente.

Pentru acest obiectiv au fost realizate urmatoarele:

1. Transfectia stabila a macrofagelor murine din linia RAW 264.7Celulele din linia de macrofage RAW 264.7 au fost transfectate stabil cu

complexul format intre FuGENE (un agent de transfectie neliposomal care are eficientamare si toxicitate redusa pentru celule) si ADN-ul plasmidial reprezentat de plasmidapLNC apoE (DNA pentru apoE clonat in vectorul pLNCX). Celulele transfectate au fostselectate pe baza rezistentei la geneticina, fiind considerate positive coloniile formate inmediul de cultura cu geneticina. Eficienta transfectiei a fost evaluata la nivel genic, prinamplificarea secventei apoE prin tehnica PCR si vizualizarea fragmentului amplificat ingel de agaroza si la nivel proteic prin evidentierea apoE cu anticorpi specifici prin tehnicaWestern Blot.

2. Obtinerea particulelor virale purtand ADN pentru apoE3 uman

Particulele virale care sa codifice gena apoE3 au fost generate in urmatransfectarii celulelor HEK293FT cu complexele liposomale formate intre FuGENE siplasmidele pLION-apoE-HRP sau a pLION-apoE, la care au fost adaugati vectorii deexpresie pentru proteinele capsulei virale si vectorul de transfer de generatia a treia. La 48ore dupa infectie a fost recoltat mediul care contine particulele virale al caror ADN continecDNA pentru apoE sau pentru apoE-HRP. Suspensiile cu cele doua tipuri de particulevirale (notate PV-apoE si PV-apoE-HRP) au fost folosite in experimentele de infectare amonocitelor izolate de la soareci apoE deficienti.

2. Izolarea monocitelor din sangele periferic de la soareci

Sangele periferic de la soarecii C57Bl6 (n=30 per experiment) sau de la cei apoE-/-

a (n=30 per experiment) a fost recoltat in vacutainere cu citrat de sodiu, a fost centrifugat ingadient de densitate pe Histopaque 1077mg/dl, la 1000xg, 40 minute, iar fractia de celulealbe rezultata a fost incubata cu minibeads-uri magnetice cuplate cu CD11b (anticorpspecific pentru monocite murine). Suspensia celulara rezultata a fost trecuta printr-ocoloana care a fost plasata in camp magnetic care a retinut complexele mini-beads-anticorp–celula. Colectarea acestor complexe a fost realizata prin indepartarea coloanei din campul

25

magnetic si elutia cu un tampon fosfat cu albumina serica bovina si EDTA. Celulelerezultate au fost numerate si procesate astfel:

1. Monocitele izolate de la soareci C57Bl6 au fost impartite in doua parti: o partedintre celule au fost mentinute nestimulate si netransfectate in mediu de cultura specific(RPMI; aceste celule au fost injectate soarecilor din grupul MN), iar cealalta parte au fost

incubate timp de 2 ore cu MCSF (10g/ml) la 37C pentru a le induce fenotip de macrofag(aceste celule au fost injectate soarecilor apoE deficient din grupul MCSF).

2. Monocitele izolate de la soareci apoE deficienti au fost impartite in 3 parti,astfel unele au fost incubate 24 ore cu suspensia de particule virale ce contin o formachimera a genei apoE care a fost fuzionata cu gena pentru peroxidaza din hrean (HRP;celulele au fost injectate soarecilor din grupul MN-PV-apoE-HRP), celelalte doua parti dinsuspensia de monocite au fost incubate cu particule virale ce contin gena apoE. Dupainfectare, o parte dintre celule au fost incubate 2 ore la 37C cu MCSF (10 g/ml; acesteaau fost injectate grupului de soareci MN-PV-apoE-MCSF), cealalta parte fiind mentinutain stare neactivata (au fost injectate grupului de soareci MN-PV apoE)

Eficienta infectiei cu particule virale a fost sporita prin adaugarea de Polybrene,un polimer cationic ce neutralizeaza repulsia datorata sarcinii electrice dintre virioni siacidul sialic aflat la suprafata celulelor.

4. Constituirea grupelor si tratamentul soarecilor apoE deficienti

Soarecii apoE deficienti (n=50), femele, au fost mentinuti in conditii standard,fara patogeni („SPF – specific pathogen free”) cu acces liber la apa si hrana standardpentru rozatoare, cu un ciclu lumina/intuneric de 12 ore. Incepand cu saptamana a 10-a deviata, hrana acestor animale de laborator a fost inlocuita cu o dieta bogata in lipide saturate(cu 1% colesterol si 15% unt) timp de 4 saptamani in scopul accelerarii procesuluiaterosclerotic. La sfarsitul perioadei de dieta, soarecii au fost impartiti aleator in 9 grupedistincte in functie de tipul suspensiei celulare administrate prin injectie intravenoasa invena caudala:

- grup CONTROL (n=8) – soarecii din acest grup au fost injectati cu cate

200l ser fiziologic

- grup MN (n=4) - animalele din acest grup au fost injectate intravenos cu osuspensie celulara de monocite isolate din sange periferic de la soareci C57Bl6 in RPMI,mentinute in stare nativa (230 000 celule in 200l RPMI per animal/injectie)

- grup MCSF – soarecii au fost injectati intravenos cu o suspensie de monociteisolate din sange periferic de la soareci C57Bl6; monocitele au fost activate 2 ore la 37ºCcu MCSF(10mg/ml) pentru a dobandi fenotip de macrofage

- grup MN- PV apoE - animalele din acest grup au fost injectate intravenos cumonocite prelevate de la soareci apoE-/- infectate cu particule virale al caror ADN contine

secventa semnal pentru apoE, (aproximativ 200000 celule infectate/200l mediu decultura/soarece)

- grup MN- PV apoE-HRP – soarecii din acest grup au fost injectati intravenoscu monocite de la soareci apoE-/- infectate cu particule virale al caror ADN contine

26

secventa semnal pentru apoE si secventa pentru HRP (cca. 200 000 celule/200l mediu decultura/soarece)

- grup MN-PV apoE-MCSF - animalele din acest grup au fost injectate cumonocite prelevate de la soareci apoE-/- care au fost infectate cu particule virale al carorADN contine secventa semnal pentru apoE; dupa infectie celulele au fost activate cu

MCSF (10g/ml, 2 ore, 37ºC) (cca. 200 000 celule/200l mediu de cultura/soarece) pentru adobandi fenotip de macrofage

- grup RPMI - animalele din acest grup au fost injectate intravenos cu mediu decultura pentru monocyte (RPMI, 200µl/animal)

- grup RAW C – animalele din acest grup au fost injectate intravenos cumacrofage murine din linia RAW 264.7 in stare native (nestimulate, netransfectate)

- grup RAW 2 – soarecii au fost injectati intravenos cu macrofage murine dinlinia RAW 264.7 care au fost transfectate in prealabil cu plasmida pLNCX ce contine

secventa de ADN care codifica gena apoE3 umana (250g/ml)Injectarile in vena caudala au fost repetate de 3 ori, la interval de 3 zile. Dupa 3

saptamani de la ultima injectare, soarecii din cele 9 grupuri au fost anesteziati cu uncocktail de ketamina (24mg/kg corp), xilazina (14 mg/kg corp), acepromazina (6 mg/kgcorp), li s-a prelevat inima si aorta (toracica si abdominala) care au fost pastrate inparaformaldehida 4% pentru colorarea cu Oil Red in vederea cuantificarii suprafeteiplacilor de aterom.

5. Coloratia lipidelor din placile aterosclerotice cu Oil Red

Cuantificarea placilor de aterom existente la nivelul aortei de la soarecii apoE-/- afost realizata prin colorarea cu Oil Red. Arterele aorta prelevate de la grupele de soareciapoE-/- luati in studiu au fost spalate cu tampon fosfat salin (pH 7,4), li s-a indepartatexecesul de tesut adipos, au fost sectionate longitudinal pentru expunerea fetei luminaleunde se afla placile de aterom. Arterele aorta astfel procesate au fost incubate in solutie deOil Red 0,3% in isopropanol 60% timp de o ora, spalate cu alcool izopropilic 60% sifotografiate. Imaginile au fost preluate cu ajutorul microscopului Stemi 2000 (Carl Zeiss)dotat cu camera digital a.si a softului AxioVision. Cuantificarea suprafetei placilor deaterom de pe imaginile digitale preluate a fost realizata cu ajutorul softului Image J(imagej.nih.gov/ij) iar rezultatele au fost prezentate ca medie ± S.E.M.

In figura de mai jos sunt redate imagini ale aterelor aorta prelevate de la cele 9grupe de soareci apoE deficienti sectionate longitudinal si colorate cu Oil Red 0,3% pentruevidentierea placilor aterosclerotice.

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul control

27

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul MN

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul MCSF

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul MN-PV-apoE

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul MN-PV-apoE-HRP

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul MN-PV-apoE-MCSF

28

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul RPMI

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul RAWnetransfectate

Imagini reprezentative pentru colorarea cu Oil Red a arterelor aorta de la 4 soareci din grupul RAWtransfectate cu apoE

Cuantificarea suprafetei placilor de aterom de pe imaginile digitale preluate a fostrealizata cu ajutorul softului Image J (imagej.nih.gov/ij) iar rezultatele au fost calculate camedie ± S.E.M.

Un numar de 9 placi aterosclerotice prelevate de la soarecii luati in studiu au fostdetasate de pe fata luminala arterelor aorta colorate cu Oil Red (cate una de la fiecare grupde soareci apoE deficienti), dupa care au fost folosite pentru identificareaimunofluorescenta (whole mount staining) a monocitelor/macrofagelor existente la nivelulplacii. Astfel, placile au fost permeabilizate timp de 3 ore cu o solutie de 1% albuminaserica bovina cu 0,3% Triton X 100 in tampon fosfat salin, pH 7,2, urmata de blocarealegarii nespecifice a anticorpului secundar intr-o solutie de 1% BSA in tampon fosfatpentru 1 ora. Tesutul a fost incubat peste noapte la 4ºC cu anticorpul primar F4/80 sau cuanti apoE uman diluat in solutia de blocare. Identificarea anticorpului primar a fostrealizata prin incubarea cu un anticorp secundar cuplat cu Alexa 563. Imaginile au fostpreluate la microcopul AxioObserver dotat cu camera digitala monocroma MRm siprogram ZEN.

In concluzie, s-a obtinut o diminuare a ariei leziunilor aterosclerotice in douacazuri: Transplantul monocitelor activate cu MCSF si in cazul transplantului macrofagelortransfectate stabil pentru expresia apoE3 umana. Transfectia virala a monocitelor proaspetea condus la activarea monocitelor si la o crestere a ariilor placilor aterosclerotice. Caurmare putem concluziona ca, desi tintirea macrofagelor exprimand apoE e benefica pentrudiminuarea placilor atero, este de evitat inducerea virala a supraexpresiei in apoE inmonocite care urmeaza sa fie transplantate. De asemenea, pre-tratamentul monocitelor cuMCSF este benefic, probabil inducand diferentierea acestora in macrophageantiinflamatoare M2.

29

OBIECTIVUL 3.“Generarea unui model de soarece transgenic care sa exprime apoEspecific in endoteliu si evaluarea sensibilitatii la ateroscleroza”.

Experimentele prezentate în studiul de faţă urmăresc crearea unui model murintransgenic, de tip condiţional, în care expresia izoformei apoE3 umane să poată fi indusă înmod controlat, în absenţa genei apoE endogene murine.

Principiul mecanistic folosit pentru generarea acestui model este cel al transactivăriitranscripţionale. Tansactivarea transcriptională are loc doar atunci când transactivatorul esteprezent, iar în cazul sistemelor inductibile, activarea transgenei poate fi oprită în oricemoment, permiţând controlul exprimării. Sistemul binar de transactivare a transcrieriidependent de tetraciclină a fost descris de Gossen şi Bujard în 1992 (Gossen şi Bujard, 1992).În acest sistem, proteina efector este un produs de fuziune între secvenţele care codificăpentru domeniul de transactivare VP16 al virusului Hepes simplex şi proteina represor (TetR)din Escherichia coli, şi leagă specific atât tetraciclina cât şi secvenţele operator de 19-pb(tetO) ale operonului tet din transgena ţintă, ceea ce duce la transcrierea acesteia. Există douăversiuni ale acestui sistem. Varianta originală în care transactivatorul controlat de tetraciclină(tTA) nu se poate lega la ADN atunci când inducătorul este prezent (‘tet-off ’), şi vesiuneamodificată, în care transactivatorul invers ‘reverse tTA’ (rtTA) leagă ADN doar cândinducătorul este prezent (Gossen et al., 1995). Inducătorul este doxiciclina (Dox), un derivatsintetic al tetraciclinei, preferată pentru că are un cost mic, este disponibilă comercial şiactivează rtTA şi inactivează tTA în mod eficient la doze sub nivelele citotoxice. Principaladiferenţă dintre tTA şi rtTA este dată de cinetica inducerii transgenei ţintă. În sistemul tTA,suprimarea transgenei necesită administratrea continua a Dox, inducerea este determinată deîndepărtarea Dox, fiind dependentă de rata de metabolizare a Dox. Astfel, la şoareciitransgenici adulţi, inducerea transcrierii poate dura de la 24 h la o săptămână, în funcţie deţesutul de interes (Kistner et al., 1996). În schimb, în sistemul rtTA, adăugarea Dox poateinduce rapid exprimarea transgenei, chiar şi într-o oră. Represia ulterioară a transgeneidepinde de rata de eliminare a din ţesutul de interes (Lewandoski, 2001). Sistemul Tet-On 3G(Clontech) reprezintă a treia generaţie de vectori de expresie Tet-On. Principiul de funcţionareal sistemului este redat în Figura nr. 3.1.

Figura nr. 3.1. Principiul defuncţionare al sistemului Tet-On 3G

(www.clontech.com).

Sistemul are două componente:1. o plasmidă pCMV-TET3G care conţine proteina transactivator Tet-On 3G care este o

variantă modificată şi îmbunătăţită a reglatorilor transcripţionali din generaţiile anterioare

30

2. o plasmidă pTRE3G care conţine promotorul inductibil PTRE3G care este caracterizatde o expresie bazală extrem de scăzută şi o expresie maximală crescută după activare. Acestpromotor este alcătuit din 7 secvenţe repetitive de 19pb ale operonului tet localizate după unpromotor minimal CMV.

În prezenţa Dox, Tet-On 3G se leagă specific la PTRE3G şi activează transcrierea genei deinteres. PTRE3G nu conţine situri de legare pentru factori de treanscriere endogeni mamiferi,astfel că este practic inactiv în absenţa inducătorului Dox.

În cazul de faţă, am folosit acest sistem binar pentru a produce două transgene:1.Transgena Tek/Tie2promoter-Tet3G-Tek/Tie2enhancer (denumită scurt Tek-

Tet3G) care conţine gena Tet-On3G sub controlul promotorului specific endotelial Tek/Tie2care asigură exprimarea în mod specific în endoteliu. Transgena conţine şi enhancerulspecific endotelial Tek/Tie2, care reglează activitatea promotorului asigurând o expresiesusţinută.

2. Transgena TRE-hapoE3 care conţine gena de interes pentru izoforma apoE3 umanăsub controlul promotorului PTRE3G.

Fiecare dintre cele două transgene a fost folosită pentru crearea unui animaltransgenic: un şoarece care să poarte transgena Tek-Tet3G şi un şoarece care să poartetransgena TRE-hapoE3. Prin împerecherea celor două animale se va obţine un şoarece dublutransgenic care va purta ambele transgene şi care va exprima izoforma apoE3 umană doaratunci când i se va administra tratament cu Dox.

Pentru a obţine expresia izoformei apoE3 umane în absenţa genei apoE endogenemurine, acest şoarece dublu transgenic va fi împerecheat cu şoareceleApoE-/- (Figura 3.2.).

Figura. 3.2.Schema de obţinere aşoarecelui dublutransgenic.

In prima fazaam analizat secventele de ADN necesare pentru realizarea soarecelui transgenic. Astfel, aufost desemnati primerii necesari pentru amplificarea promotorului receptorului tyrosin kinazei

31

(Tek), cat si a enhancerului care amplifica expresia specifica in endoteliu pentru amplificareafragmentelor respective si clonarii acestora in vectorul din sistemul “Tet-on regulatorysystem” (Clontech), in vederea generarii soarecilor transgenici avand expresia apoEinductibila in celulele endoteliale (EC-ApoE3 Tg mice).

In faza a doua am obtinut constructii necesari.A.I. Obținerea transgenei Tek/Tie2promoter-Tet3G-Tek/Tie2enhancerPentru obţinerea transgenei s-a urmărit schema de mai jos:

32

A.I.1. Amplificarea secvențelor PTek/Tie2 și ETek/Tie2 din ADN genomicSecvențele PTek/Tie2 și ETek/Tie2 au fost amplificate din ADN genomic murin. Amorsele

(primerii) folosite pentru amplificarea PTek/Tie2 au fost desenate astfel încât fragmentul PTek/Tie2

amplificat să conțină în capătul 5' un situs de restricţie pentru enzima MluI, iat în capătul 3' unsitus de restricţie pentru enzima NheI. Primerii folosiţi pentru amplificarea ETek/Tie2 au fostconstruiţi astfel încât secvenţa fragmentului ETek/Tie2 amplificat să conţină în capătul 5' un situsde restricţie pentru enzima BamHI, iat în capătul 3' un situs de restricţie pentru enzima SalI.

Fragmentele amplificate (PTek/Tie2 – 2129pb şi ETek/Tie2 – 1623pb) au fost vizualizateprin electoforeză în gel de agaroză (Figura nr. 55), benzile de interes fiind excizate în vedereaizolării şi purificării de ADN, folosit mai departe pentru clonare.

Figura nr. 3.3. Amplificarea secvenţelor PTek/Tie2 şi ETek/Tie2 din ADN genomic.Fragmentele au fost vizualizate prin electroforeză în gel de agaroză.

A.I.2. Clonarea fragmentului PTek/Tie2 în vectorul pGL3-Basic şi obţinereaplasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor

Fragmentul PTek/Tie2 a fost clonat în vectorul de expresie pGL3-Basic, obţinându-seplasmida pGL3-Tek/Tie2promotor (6929pb) (Figura nr. 3.4, A).

Pentru aceasta, fragmentul PTek/Tie2 şi vectorul pGL3-Basic au fost supuşi digestieienzimatice cu enzimele de restricţie MluI şi NheI. După digestie, insertul PTek/Tie2 (2117pb) şivectorul pGL3-Basic defosforilat au fost supuşi reacţiei de ligare, urmată de transformarebacteriană. In urma digestiei fragmentului amplificat de 2129pb al promotorului rezultă uninsert de 2117pb, datorită faptului că situsurile de restricţie pentru enzimele folosite au fostintroduse prin secvenţa primerilor folosiţi la amplificare. După transformare, au fostselecţionate colonii din care s-a extras ADN plasmidial. Pentru testarea clonării, coloniileselectate au fost supuse digestiei enzimatice cu enzimele de restricţie MluI şi NheI (Figura nr.3.4, B).

33

Figura nr. 3.4. Testarea prin digestie enzimatica a integrării insertului PTek/Tie2 învectorul pGL3-Basic. (A) Schema plasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor, cu localizareasitusurilor enzimelor MluI şi NheI, folosite pentru testare; (B) Rezultatului digestieienzimatice prin electroforeză în gel de agaroză (gel reprezentativ). În cazul coloniilorpozitive, digestia enzimatică produce 2 fragmente: PTek/Tie2 (2117pb) şi vectorul pGL3linearizat. „+”, colonii pozitive; „-”, colonii negative; NA, not applicable.

A.I.3. Clonarea fragmentului ETek/Tie2 în vectorul pGL3-Basic şi obţinereaplasmidei pGL3-Tek/Tie2enhancer.

Fragmentul ETek/Tie2 a fost clonat în vectorul de expresie pGL3-Basic, obţinându-seplasmida pGL3-Tek/Tie2enhacer (6428pb) (Figura nr. 3.5, A). Pentru aceasta, fragmentulETek/Tie2 şi vectorul pGL3-Basic au fost supuşi digestiei enzimatice cu enzimele de restricţieBamHI şi SaII. După digestie, insertul ETek/Tie2 (1616pb) şi vectorul pGL3-Basic defosforilatau fost supuşi reacţiei de ligare, urmată de transformare bacteriană. Trebuie făcută menţiuneacă în urma digestiei fragmentului amplificat de 1623pb al enhancerului rezultă un insert de1616pb, datorită faptului că situsurile de restricţie pentru enzimele folosite au fost introduseprin secvenţa primerilor folosiţi la amplificare. După transformare, din coloniile selecţionates-a extras ADN plasmidial, care a fost folosit pentru testarea prin digestie enzimatică ainserării enhancerului în vector (Figura nr. 3.5, B).

Figura nr. 3.5. Testarea prin digestie enzimatica a integrării insertului ETek/Tie2 învectorul pGL3-Basic. (A) Schema plasmidei pGL3-Tek/Tie2enhacer, cu localizareasitusurilor enzimelor BamHI şi SalI, folosite pentru testare; (B) Rezultatului digestieienzimatice prin electroforeză în gel de agaroză (gel reprezentativ). În cazul coloniilorpozitive, digestia enzimatică produce 2 fragmente: ETek/Tie2 (1616pb) şi vectorul pGL3linearizat. „+”, colonii pozitive; „-”, colonii negative.

A.I.4. Subclonarea fragmentului PTek/Tie2 în plasmida pGL3-Tek/Tie2enhancer şiobţinerea plasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor-Tek/Tie2enhancer

34

Pentru a putea verifica funcţionalitatea promotorului (PTek/Tie2) şi a promotoruluiîmpreună cu enhancerul său (PTek/Tie2 + ETek/Tie2) a fost necesară construirea unei plasmidecare să conţină ambele elemente (Figura nr. 3.6). Având în vedere faptul că enzima derestricţie BamHI (folosită pentru clonarea enhancerului) taie în interiorul secvenţeipromotorului, s-a făcut subclonarea fragmentului PTek/Tie2 în plasmida pGL3-Tek/Tie2enhancer, şi nu invers.

În vederea subclonării, fragmentul PTek/Tie2 a fost excizat din plasmida pGL3-Tek/Tie2promotor prin digestie cu MluI şi NheI. Fragmentul PTek/Tie2 (2117pb) a fostvizualizat prin electoforeză în gel de agaroză, banda de interes fiind excizată în vedereaizolării şi purificării de ADN, care a fost folosit mai departe pentru subclonare. PlasmidapGL3-Tek/Tie2enhacer a fost digerată enzimatic cu MluI şi NheI, fiind apoi vizualizatăprin electoforeză în gel de agaroză, izolată şi purificată, şi apoi supusă defosforilării. InsertulPTek/Tie2 şi plasmida pGL3-Tek/Tie2enhacer defosforilată au fost supuşi reacţiei de ligare,urmată de transformare bacteriană. Din coloniile obţinute, a fost izolat ADN plasmidial.Pentru a verifica clonarea şi obţinerea plasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor-Tek/Tie2enhancer,s-a făcut digestia enzimatică a ADN-ului plasmidial izolat din colonii cu enzimele de restricţieBamHI, SalI, MluI şi NheI (Figura nr. 3.6, B).

Figura nr. 3.6. Obţinereaplasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor-Tek/Tie2enhancer. (A) Schemasubclonării fragmentului PTek/Tie2 înplasmida pGL3-Tek/Tie2enhancer;(B) Testarea subclonării prindigestie enzimatică cu BamHI, SalI,MluI şi NheI; (C) Fragmenteleobţinute prin digestia enzimatică.Fragmentele MluI/BamHI şiBamHI/SalI nu se pot individualizape gel pentru că au mărimi similare.

A.I.5. Verificareafuncţionalităţii promotorului si aenhancerului în construcţii obţinuţi

35

Pentru a testa funcţionalitatea plasmidelor pGL3-Tek/Tie2promotor şi pGL3-Tek/Tie2promotor-Tek/Tie2enhancer s-au realizat transfecţii tranziente în trei tipuri celulare:macrofage din linia murină RAW264.7, astrocite din linia umană tumorală HTB-11 şi încelule BPAEC. Celulele au fost transfectate cu una dintre cele două plasmide, sau cu plasmidapGL3-CMV sau cu plasmida apoE-luc (control pentru transfecţie).

Rezultatele obţinute au arătat că promotorul endotelial Tek/Tie2 este activat doar înBPAEC. Acest fapt demonstrează funcţionalitatea fragmentului de promotor clonat, precum şispecificitatea sa celulară. Fiind un promotor specific endotelial, el nu este activat în celuleleRaw 264.7 sau HTB-11 (Figura nr. 59).

De asemenea, datele arată că enhancerul endotelial Tek/Tie2 este capabil să crească de≈ 1.8 ori activitatea promotorului Tek/Tie2 în mod specific în BPAEC transfectate cuplasmida pGL3-Tek/Tie2promotor-Tek/Tie2enhancer. În schimb, enhancerul nu are nici oefect asupra activităţii promotorului în celule Raw 264.7 sau HTB-11 (Figura nr. 3.7.).

Figura nr. 3.7. Testarea funcţionalităţii plasmidelor pGL3-Tek/Tie2promotor şipGL3-Tek/Tie2promotor-Tek/Tie2enhancer.

A.I.6. Obţinerea genei Tet3G cu coadă poliA din plasmida pCMV-Tet3GGena transactivator Tet3G cu coadă poliA (1232pb) a fost obţinută prin digestia

enzimatică a plasmidului pCMV- Tet3G (Clontech) cu enzimele de restricţie EcoRI şi HindIII(Figura nr. 3.8). Fragmentele obţinute au fost vizualizate prin electroforeză în gel de agaroză,iar banda de interes a fost tăiată din gel pentru izolarea şi purificarea fragmentului de ADN.

36

Figura nr. 3.8. Obţinerea genei Tet3G-poliA din plasmida pCMV-Tet3G. (A)Harta pCMV-Tet3G; (B) Rezulatul digestiei enzimatice a pCMV-Tet3G.

A.I.7. Clonarea genei Tet3G cu coadă poliA în plasmida pGL3-Tek/Tie2enhancerşi obţinerea plasmidei pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer

Pentru a obţine plasmida pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer, gena Tet3G cu coadă poliA afost clonată între situsurile SmaI şi HpaI ale plasmidei pGL3-Tek/Tie2enhancer (Figura nr.3.9). Având în vedere faptul că enzima de restricţie HpaI taie în interiorul secvenţeipromotorului, clonarea Tet3G-poliA s-a făcut în plasmida pGL3-Tek/Tie2enhancer, urmândca ulterior secvenţa promotorului PTek/Tie2 să fie subclonată în plasmida obţinută pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer.

Figura nr. 3.9. Schema de clonare a fragmentului Tet3G-poliA în plasmida pGL3-Tek/Tie2 enhancer şi obţinerea plasmidei pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer.

În vederea clonării, fragmentul Tet3G-poliA obţinut în pasul anterior a fost supus uneireacţii enzimatice de umplere a capetelor lipicioase, rezultate în urma digestiei cu EcoRI şiHindIII, cu ADN polimeraza Klenow (New England Biolabs). Acest lucru a fost necesardatorită faptului că enzimele folosite pentru excizarea genei Tet3G au fost diferite de

37

enzimele cu care s-a realizat clonarea în plasmida pGL3-Tek/Tie2enhancer. Ca urmare,siturile SmaI şi HpaI vor dispărea din plasmida nou generată.

Pentru clonare, plasmida pGL3-Tek/Tie2enhancer a fost digerată cu enzimele SmaI şiHpaI, obţinându-se două fragmente de 1874pb şi de 4554pb. Fragmentul de 4554pbreprezentând vectorul a fost supus defosforilării. Fragmentul Tet3G-poliA cu capete teşite şivectorul defosforilat au fost supuse reacţiei de ligare, al cărei produs a fost folosit pentrutransformare bacteriană. Din coloniile obţinute, a fost izolat ADN plasmidial, iar succesulclonării a fost testat prin digestie cu BamHI (Figura nr. 3.10).

Figura nr. 3.10. Testarea prin digestie enzimatica a integrării insertului Tet3G-poliA în vectorul pGL3-Tek/Tie2enhancer. (A1) Reprezentare schematică a plasmideipGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer care a integrat insertul în sens; (B1) Rezultatul digestieienzimatice cu BamHI şi identificarea a două colonii în sens; (A2) Reprezentare schematică aplasmidei pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer care a integrat insertul în anti-sens; (B2) Rezultatuldigestiei enzimatice cu BamHI şi identificarea unei colonii în anti-sens.

Pentru că enzima BamHI taie de două ori în plasmida pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer(o dată în interiorul fragmentului Tet3G-poliA şi o dată la poziţia 1362), digestia enzimatică aprodus în cazul clonelor pozitive două fragmente, şi anume: (i) dacă gena s-a integrat în sens,BamHI taie o dată la poziţia 791 şi o dată la poziţia 1362, generând un fragment de 572pb şiunul de 5214pb (Figura nr. 3.11); (ii) dacă gena nu s-a integrat în sens, BamHI taie o dată lapoziţia 498 şi o dată la poziţia 1362, generând un fragment de 838pb şi unul de 4948pb(Figura nr. 3.11).

38

Figura nr. 3.11. Testarea prin digestie enzimatica a sensului integrării insertuluiTet3G-poliA în vectorul pGL3-Tek/Tie2 enhancer în coloniile pozitive. Digestia cu SmaInu linearizează plasmida pentru că în urma integrării fragmentului Tet3G-poliA cu capeteteşite situl specific SmaI nu a fost recontituit.

A.I.8. Subclonarea fragmentului PTek/Tie2 în plasmida pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer şi obţinerea plasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer

Pentru a obţine plasmida pGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer careconţine transgena Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer (denumită scurt Tek-Tet3G),promotorul PTek/Tie2 a fost subclonat în plasmida pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer (Figura nr.3.12).

Figura nr. 3.12. Schema de subclonare apromotorului PTek/Tie2 în plasmidapGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer şi obţinerea plasmideipGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer.

Pentru aceasta, fragmentul PTek/Tie2 a fost tăiat prin digestie enzimatică cu MluI şi NheIdin plasmida pGL3-Tek/Tie2promotor, iar produsul a fost vizualizat pe gel de agaroză şibanda de interes a fost excizată pentru izolarea şi purificarea fragmentului de ADN. Plasmida

39

pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer a fost la rândul său digerată enzimatic cu MluI şi NheI, iarprodusul a fost vizualizat pe gel de agaroză şi banda de interes a fost excizată pentru izolareaşi purificarea fragmentului de ADN. Apoi, vectorul a fost supus defosforilării.

Fragmentul PTek/Tie2 digerat şi vectorul pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer digerat şidefosforilat au fost supuşi reacţiei de ligare, produsul fiind folosit pentru transformarebacteriană. Din coloniile obţinute s-a izolat şi purificat ADN plasmidial care a fost vizualizatpe gel de agaroză pentru a selecta colonii în vederea testării. Succesul clonării a fost testat încoloniile selectate prin digestie enzimatică cu MluI şi NheI, obţinând în cazul coloniilorpozitive două fragmente de 2117pb şi respectiv 5780pb (Figura nr. 3.13).

Figura nr. 3.13. Testarea prin digestie enzimatica a integrării promotoruluiPTek/Tie2 în plasmida pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer. (A) Schema plasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer; (B) Plasmida a fost digerată cu MluI şi NheI,obţinându-se două fragmente (2117pb şi 5780pb) (C); pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancer a fostfolosit drept control.

A.I.9. Obţinerea transgenei Tek/Tie2promoter-Tet3G-Tek/Tie2enhancer (Tek-Tet3G). Transgena Tek-Tet3G a fost obţinută din plasmida pGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer prin digestie cu enzimele Eco47III şi MluI (Figura nr. 3.14).

Figura nr. 3.14. Schema de obţinere atransgenei Tek-Tet3G din plasmidapGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer.

Cele două fragmente rezultate în urmadigestiei au fost vizualizate prin electroforeză în gel de agaroză (Figura nr.3.15), iar banda corespunzătoare transgenei Tek-Tet3G (5200pb) a fost excizatădin gel pentru izolarea şi purificareaADN în vederea transgenezei.

40

Figura nr. 3.15. Vizualizarea fragmentelor rezultate în urma digestiei plasmideipGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer cu enzimele Eco47III şi MluI.

A.II. Obţinerea transgenei TRE-hapoE3Pentru obţinerea transgenei TRE-hapoE3 s-a urmărit schema de mai jos (Figura 3.16):

Figura nr. 3.16.Obtinerea TRE-hapoE3

41

A.II.1. Amplificarea secvenţei hapoE3 din ADN genomicSecvenţa hapoE3 a fost amplificată din ADN genomic uman. Amorsele (primerii)

folosite au fost construite astfel încât fragmentul amplificat să conţină în capătul 5' un situs derestricţie pentru enzima HindIII, iar în capătul 3' un situs de restricţie pentru enzima EcoRV.Fragmentul astfel amplificat (3600pb) a fost vizualizat prin electoforeză în gel de agaroză(Figura nr. 3.17), banda de interes fiind excizată ţn vederea izolării şi purificării de ADN carea fost folosit mai departe pentru clonare.

Figura nr. 3.17. Amplificarea secvenţei hapoE3 dinADN genomic. Fragmentul de 3600pb a fost vizualizat prinelectroforeză în gel de agaroză.

A.II.2. Clonarea fragmentului hapoE3 în vectorul pBSK şi obţinerea plasmideipBSK-hapoE3. Fragmentul hapoE3 a fost clonat în vectorul de expresie pBSK, obţinându-seplasmida pBSK-hapoE3 (6552pb). Insertul hapoE3 şi vectorul pBSK au fost supuşi digestieienzimatice cu enzimele de restricţie HindIII şi EcoRV. După digestie, insertul hapoE3 şivectorul pBSK defosforilat au fost supuşi reacţiei de ligare, urmată de transformarebacteriană. După transformare, au fost selecţionate 12 colonii din care s-a extras ADNplasmidial. Pentru testarea clonării, coloniile selectate au fost supuse digestiei enzimatice cuenzimele de restricţie SmaI şi EcoRI. Analiza secvenţelor vectorului pBSK şi a insertuluihapoE3 arată faptul că enzima SmaI taie în interiorul vectorului la poziţia 713 şi în interiorulinsertului la poziţia 561, iar enzima EcoRI taie în interiorul vectorului la poziţia 701 şi îninteriorul insertului la poziţia 2312. Această analiză a prefigurat obţinerea a trei fragmentevizibile de ≈ 1294pb, 1751pb şi 3495pb. În Figura nr. 3.18 se observă rezultatul digestiei înurma căreia s-au identificat patru colonii pozitive (benzile 9-12).

Figura nr. 3.18. Testarea prin digestie enzimatica a integrării insertului hapoE3 învectorul pBSK. (A) Localizarea în plasmida pBSK-hapoE3 a situsurilor enzimelor SmaI şiEcoRI (indicate cu culoarea mov) folosite pentru testare; (B) Fragmentele obţinute prindigestia enzimatică cu SmaI şi EcoRI a plasmidei pBSK-hapoE3. Fragmentul EcoRI/SmaI de12pb nu poate fi vizualizat din cauza mărimii foarte mici; (C) Electroforeza fragmentelorrezultate prin digestie enzimaica. Dintre cele 12 colonii testate, patru au fost pozitive (Benzilede la 9 la 12).

A.II.3. Clonarea hapoE3 în vectorul pTRE3G şi obţinerea plasmidei pTRE3G-hapoE3

42

Pentru clonare în vectorul pTRE3G, insertul hapoE3 a fost excizat din plasmidapBSK-hapoE3 prin digestie cu enzimele de restricţie SalI, EcoRV şi ScaI. Conform analizeisecvenţei plasmidei pBSK-hapoE3, în urma digestiei enzimatice cu SaI şi EcoRV s-ar fiobţinut două fragmente foarte apropiate ca mărime, unul de 3615pb, corespunzător hapoE3, şiunul de 2952pb. Aceste mărimi apropiate fac dificilă excizia cu acurateţe a benziicorespunzătoare fragmentului hapoE3 din gelul de agaroză. Drept urmare, am optat pentru aface digestia cu enzimele de restricţie SalI, EcoRV şi ScaI, ceea ce a dus la obţinerea a treifragmente de mărimi diferite (3615pb, 1829pb şi 1108pb). Enzima ScaI taie în interiorulplasmidei pBSK-hapoE3 la poziţia 6118. Fragmentul hapoE3 (3615pb) a fost vizualizat prinelectoforeză în gel de agaroză, banda de interes fiind excizată în vederea izolării şi purificăriiADN, care a fost folosit mai departe pentru clonare (Figura nr. 3.19).

Figura nr. 3.19. Obţinerea fragmentului hapoE3 din plasmida pBSk-hapoE3. (A)Localizarea în plasmida pBSK-hapoE3 a situsurilor enzimelor SalI, EcoRV şi ScaI (indicatecu culoarea mov); (B) Plasmida pBSk-hapoE3 a fost digerată cu enzimele de restricţie SalI,EcoRV şi ScaI, obţinându-se trei fragmente de mărimi diferite (3615pb, 1829pb şi 1108pb)(C).

Clonarea insertului obţinut în vectorul pTRE3G s-a făcut după digestia în prealabil avectorului cu enzimele SalI şi EcoRV, urmată de defosforilare. Mixul rezultat în urma reacţieide ligare dintre insert şi vectorul defosforilat a fost folosit pentru transformare bacteriană. Dincoloniile obţinute, a fost izolat ADN plasmidial care a fost vizualizat prin electroforeză în gelde agaroză (Figura nr. 3.20) pentru a determina clonele pozitive.

Figura nr. 3.20. Testareacoloniilor după transformarebacteriană cu produsul de ligaredintre vectorul pTRE3G şi insertulhapoE3. Din 24 de coloniiselecţionate, 14 au fost pozitive.

Pentru a verifica clonarea şiobţinerea plasmidei pTRE3G-hapoE3, s-a făcut digestia enzimatică aADN-ului plasmidial izolat din coloniile pozitive cu enzimele de restricţie SalI, EcoRV şi

43

XbaI. În Figura nr. 3.21 este prezentat rezultatul digestiei enzimatice pentru două dintrecoloniile pozitive (1 şi 9).

Figura nr. 3.21 Testarea prin digestie enzimatica a integrării insertului hapoE3 învectorul pTRE3G. (A) Localizarea în plasmida pTRE3G-hapoE3 a situsurilor enzimelorSalI, EcoRV şi XbaI (mov); (B) Plasmida pTRE3G-hapoE3 a fost digerată cu enzimele derestricţie SalI, EcoRV şi XbaI, obţinându-se patru fragmente de mărimi diferite (3615pb,91pb, 852pb şi 2455pb) (C).

A.II.4. Obţinerea transgenei TRE-hapoE3Transgena TRE-hapoE3 a fost obţinută din plasmida pTRE3G-hapoE3 prin digestie

enzimatică cu enzimele de restricţie ScaI şi SapI (Figura nr. 3.22).

Figura nr. 3.22. Schema de obţinere a transgenei TRE-hapoE3 din plasmidapTRE3G-haopE3.

Cele două fragmente rezultate în urma digestiei au fost vizualizate prin electroforeză îngel de agaroză (Figura nr. 3.23), iar banda corespunzătoare transgenei hapoE3 (5523pb) a fostexcizată din gel pentru izolarea şi purificarea ADN în vederea transgenezei.

Figura nr. 3.23. Vizualizarea fragmentelorrezultate în urma digestiei plasmidei pTRE3G-hapoE3 cu enzimele ScaI şi SapI. Banda a doua

44

reprezintă fragmentele rezultate în urma digestiei plasmidei pGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer cu enzimele Eco47III şi MluI.

A.III. Testarea funcţionalităţii transgenelorFuncţionalitatea celor două transgene, adică capacitatea lor de a induce exprimarea

genei apoE3 umane în mod specific în CE în mod condiţionat, a fost testată prin experimentede co-transfecţie în liniile celulare BAEC, PBAEC şi HTB-11, folosind următoarelecombinaţii de plasmide:

pCMV-Tet3G + pTRE3G-hapoE3pGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer + pTRE3G-hapoE3pGL3-Tet3G-Tek/Tie2enhancerA doua zi după transfecţie, celulele au fost incubate 24h cu mediu cu sau fără Dox

(1 µg/ml), iar apoi au fost solubilizate pentru determinarea prin Western Blot a exprimăriiproteinei apoE3.

Rezultatele obţinute au demonstrat faptul că celulele BAEC şi BPAEC co-transfectatecu plasmidele pGL3-Tek/Tie2promotor-Tet3G-Tek/Tie2enhancer şi pTRE3G-hapoE3 auexprimat proteina apoE3 doar atunci când în mediul de cultură a fost adăugată Dox (Figura nr.3.24). În schimb, în aceleaşi condiţii experimentale, celulele HTB-11 nu exprimă proteinaapoE3.

Figura nr. 3.24. Determinareaexprimării genei apoE3 în celule înprezenţa sau absenţa Dox.

Rezultatele demonstrează nu numai funcţionalitatea celor două transgene, dar şispecificitatea exprimării lor în tipurile celulare endoteliale dată de specificitatea promotoruluiTek/Tie2 şi a enhancerului Tek/Tie2.

In faza a treia, transgena TRE3- hapoE a fost utilizata pentru injectare in ovulelefertilizate (obiectivul specific 3.1) si au fost obtinute primele animale purtatoare de transgene(obiectivul specific 3.2). Experimentele de transgeneză au fost realizate în colaborare cu Dr.Şerban Moroşan, Centrul de Experimentare Funcţională al Facultăţii de Medicină de la

45

Universitatea Pierre et Marie Curie, Paris, Franţa şi împreună cu Dr. Sébastien Dussaud,responsabilul Platformei de Transgeneză de la acelaşi centru.

Pentru procedura de transgeneză s-au folosit patru tipuri de animale: (i) femeledonatoare de ovule fecundate; (ii) masculi fertili folosiţi pentru obţinerea de ovule fecundate;(iii) femele pseudo-gestante folosite drept mame surogat; (iv) masculi vasectomizaţi folosiţipentru obţinerea de femele pseudogestante.

Pentru inducerea supraovulaţiei la femelele donatoare au fost realizate următoareleinjectari: (i) cu 72 h înainte de prelevarea ovulelor fecundate, femelele FVB donatoare învârstă de 4 săptămâni au fost injectate cu 5 UI de PMSG; (ii) cu 22 h înainte de prelevareaovulelor fecundate, aceleaşi femele FVB donatoare au fost injectate cu 5 UI de hCG şi apoipuse imediat la împerecheat cu masculi fertili din linia FVB. Pentru fiecare runda detransgeneză realizată în lucrarea de faţă, am folosit câte 14 femele FVB donatoare, la care s-aindus supraovulaţia şi care au fost împerecheate cu 14 masculi FVB. La şoarece, fecundareaovocitelor are loc în segmentul superior al oviductului, într-o regiune denumită ampulă. Drepturmare, ovulele fecundate care urmează a fi prelevate sunt localizate în această zonă.

Anterior începerii procedurii chirurgicale, am pregătit o plăcuţă Petri în care am pipetat8 – 10 picături (80 µl) dintr-o soluţie de hialuronidază în mediu M2 (0,3mg/mL). Mediul M2este o soluţie Krebs-Ringer modificată cu un tampon HEPES, folosit pentru colectarea şimanipularea embrionilor în afara incubatorului (Nagy A., 2003). Plăcuţa se acoperă şi sepăstrează pe masă. De asemenea, am pregătit o placuţă cu 4 godeuri în care am pipetat 500 µlde mediu M16. Mediul M16 este o soluţie Krebs-Ringer bicarbonatată modificată, care estefolosită pentru păstrarea embrionilor în incubator (Nagy A., 2003). Plăcuţa a fost pusă laechilibrat, în incubator cu 5 % CO2, la 37°C.

În vederea prelevării ovulelor fecundate, femelele FVB donatoare au fost sacrificateprin dislocare cervicală. Imediat după sacrificare, abdomenul fiecărui animal fost dezinfectatcu o soluţie de alcool 70%. Cu ajutorul unor foarfece drepte s-a realizat o incizie ventrală,urmată de evidenţierea uterului. Înainte de prelevarea oviductului, s-au înlăturat grăsimea şieventualele aderenţe din jurul acestuia. Oviductul a fost separat de ovar prin alunecarea uneipense fine curbe în lungul ovarului. Folosind pensa drept ghid, s-a secţionat oviductul de ovaravând grijă să nu fie atinsă ampula. Aceasta poate fi distinsă bine între serpentinele încolăciteale oviductului pentru că este umflată(Figura nr. 3.25).. Apoi, oviductul a fost separat de uterşi plasat într-una dintre picăturile din plăcuţa Petri pregătită anterior începerii procedurii.

B.I.3. Recuperarea ovulelor fecundate din oviduct şi spălarea lor. Oviductelerecoltate au fost plasate (câte 2-3) în plăcuţa Petri cu picături de mediu M2 cu hialuronidază.Ampula a fost vizualizată la stereomicroscop (Leica) şi ruptă cu ajutorul acelor a două seringide 1 ml, eliberând ovulele fecundate înpicătura de mediu M2 cu hialuronidază.Ovulele se disting la microscop înconjurate decelule foliculare

Figura nr. 3.25. Evidenţiereaanatomică a oviductului, anterior prelevării.

46

Sub acţiunea hialuronidazei, aceste celule s-au desprins de ovulele pe care le înconjurau.Ovulele au fost apoi spălate pentru îndepărtarea hialuronidazei prin trecerea succesivă prin 6picături (100 µl) de mediu M2 pipetate pe o plăcuţă Petri şi acoperite de ulei mineral (Figuranr. 3.26). După spălare, ovulele au fost transferate în plăcuţa cu patru godeuri cu mediu M16pregătită anterior şi lăsate la echilibrat între 1 h şi 2 h în incubator cu 5 % CO2, la 37°C.Ovulele au fost manipulate prin aspirare controlată cu gura cu ajutorul unui capilar tras laflacără, montat la capătul unui tub flexibil din cauciuc.

Figura nr. 3.26. Procedura de spălare aovulelor fecundate.

47

B.II. Microinjecţia de ADNÎn procedura de transgeneză clasică, transferul de ADN se face prin microinjectare în

pronucleul mascul al unui ovul fecundat. Microinjecţia de ADN s-a realizat cu ajutorul uneistaţii de microinjecţie compusă dintr-un microscop inversat cu sistem Hoffman de modulare acontrastului (Nikon) la care s-au montat două micromanipulatoare (TransferMan NK2 5188,Eppendorf), un sistem de injectare cu presiune înaltă (FemtoJet, Eppendorf) şi un sistem decontenţie prin aspirare şi eliberare de aer (CellTram Air, Eppendorf), aşezată pe o masă anti-vibraţie

Figura nr. 3.27. Microinjectare pronucleară de ADN.

Volumul de soluţie de ADN injectat per ovul a fost de ordinul picolitrilor, iarconcentraţia de ADN folosită a variat între 1 şi 5ng/μl. Injectarea s-a făcut direct în pronucleulmascul – cel mai mare dintre cele două prezente, al unui ovul fecundat în stadiul de 1 celulă(Figura nr. 3.27). În cazul unei injectări reuşite, pronucleul îşi măreşte măreşte vizibilvolumul, fără a se sparge. Având în vedere faptul că microinjectarea de ADN poate determinaliza embrionilor, după injectare ovulele au fost ţinute la incubator cu 5 % CO2, la 37°C, celpuţin 1 h pentru a putea diferenţia în mod clar ovulele viabile faţă de cele moarte. Ovuleleviabile au fost reimplantate în femele pseudogestante în după-amiaza recoltării, sau au fostlăsate la incubator peste noapte şi reimplantate a doua zi, în stadiul de 2 celule.

Pentru studiile prezente, am folosit pentru obţinerea de femele pseudogestante femelehibrid din prima generaţie (F1) B6CBAF1, produse prin încrucişarea dintre liniileconsangvine C57BL/6 şi CBA. Femelele B6CBAF1 sunt folosite în acest scop datorităcalităţilor lor de excelente mame purtătoare. Starea de pseudogestaţie a fost indusă prinîmperecherea femelelor B6CBAF1 cu masculi vasectomizaţi din aceeaşi linie, în pre-ziuareimplantării embrionilor, obţinându-se astfel femele pregătite din punct de vedere hormonalşi fiziologic pentru a primi embrionii de reimplantat. A doua zi după împerechere, îndimineaţa zilei când a avut loc procedura de transgeneză, aceste femele au fost sortate,alegându-se acelea dintre ele care au prezentat dop vaginal, semn că acuplarea a avut loc.

48

Pentru obţinerea de masculi vasectomizaţi s-au folosit masculi B6CBA în vârstă de 6săptămâni. Procedura chirurgicală s-a realizat la stereomicroscop (Leica), instalat într-o nişăcu flux laminar. Procedura de vasectomie s-a realizat la animalul aflat sub anestezie generală.Anestezia a fost indusă prin injectarea animalelor cu 40µl dintr-un amestec de ketamina 10 %/ xilazina 2% (v/v). După instalarea anesteziei, pe globii oculari s-a aplicat gel ocular pentru aevita uscarea acestora şi orbirea. Apoi, animalul a fost aşezat pe spate şi abdomenul a fosttuns cu ajutorul unui aparat de tuns pentru animale mici. Suprafaţa abdomenului a fostdezinfectată cu o soluţie de betadina. Cu ajutorul unor foarfece drepte, s-a realizat o incizieventrală joasă în pielea de pe abdomen, pe linia imaginară care uneşte genunchii labelor dinspate. Cu ajutorul unor foarfece fine, s-a incizat peretele abdominal. După vizualizareatesticulului, masa de grăsime din jurul său a fost prinsă cu o pensă şi testiculul a fost scos înafara abdomenului. După vizualizarea canalului deferent şi decolarea cu grijă a vasului desânge care îl însoţeşte, acesta a fost prins cu o pensă fină astfel încăt sa formeze o buclă care afost tăiată cu o foarfece fină. Capetele tăiate au fost apoi cauterizate cu un cauterizatorelectric. Procedura s-a realizat pentru ambele testicule. După reaşezarea testiculelor încavitatea abdominală, având grijă să nu fie atinsă vezica urinară, peretele abdominal a fostsuturat cu un fir monocryl 6.0 (0,7 mm Ethicon), folosind un ac de 13 mm cu vârf micropointşi curbură 3/8. Apoi pielea a fost clipsată cu agrafe chirurgicale.

Figura nr. 3.28. Mascul vasectomizat.

Masculii vasectomizaţi au fost izolaţi timp de 2 săptămâni pentru vindecare şi de-abiaapoi au folosiţi pentru împerechere. Reuşita operaţiei de vasectomie a fost evaluată prinîmperecherea masculilor vasectomizaţi cu femele fertile. Masculii vasectomizaţi pot fi folosiţipentru obţinerea de mame purtătoare între 12 şi maxim 18 luni.

Femelele pseudogestante au fost anesteziate cu 40µl dintr-un amestec de ketamina 10%/ xilazina 2% (v/v). După dezinfectarea pielii cu o soluţie de betadină, s-a practicat cuajutorul unei foarfece drepte o incizie la nivelul pielii, pe linia imaginară care uneşte labeledin spate. Reimplantarea embrionilor s-a făcut în infundibulum, în sensul ovar – oviduct –

49

uter, asigurând astfel embrionilor un traseu normal de maturare. După transferul embrionilor,ovarul a fost reaşezat cu grijă în animal, iar apoi pielea şoarecelui a fost clipsată cu agrafechirurgicale. În practică s-a observat că nu este necesară suturarea peretelui muscular.Reimplantarea embrionilor s-a realizat pe una sau pe ambele părţi ale aceleiaşi femelepurtătoare, în funcţie de numărul de embrioni viabili şi de numărul de femele pseudogestanteobţinute. După terminarea procedurii, femelele purtătoare au fost cazate împreună (maxim 5femele/cuşcă).

Figura nr. 3.29. Femelă pseudogestantă la care s-a realizat reimplantarea de ovulefecundate. Între vârfurile pensei se poate observa bula de aer de la nivelul oviductului.

Au fost realizate doua experimente de transgeneza pentru transgena Tek-TetOn si unulpentru TRE-apoE. Au fost obtinuti 69 soareci: 42 pentru TRE-apoE si 27 pentru Tek-TetOn.

În vederea genotipării pentru determinarea animalelor pozitive pentru transgenă, au fostprelevate falange de la degetele puilor de 10 zile. Probele de ţesut au fost digerate cuproteinază K, iar după digestie, probele au fost denaturate timp de 10 min. la 95°C pentru ainactiva enzima. ADN-ul a fost apoi izolat şi purificat cu un kit Promega, urmândinstrucţiunile prodicătorului. Reactia de PCR pentru transgena Tek-TetOn au fost sens 5'–TGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGC si anti-sens5'– TCGTCAAGAGCGTCAGCAGGCAG, iar pentru transgena TRE-hapoE3 primerii au fostsens 5'– GCAGACTTTACTCCCTATCAG si anti-sens5'– AGTCCCCTGCTGCTTGCCTCACC – 3'.

IDENTIFICAREA FONDATORILORCele două transgene linearizate şi purificate au fost folosite pentru pentru microinjectare

pronucleară în ovule fecundate recoltate de la femele din linia FVB.S-au realizat trei runde de transgeneză – două pentru transgena TRE-hapoE3 şi una

pentru transgena Tek-Tet3G, ale căror detalii sunt sumarizate în Tabelul nr. 3.1.

Tabelul nr. 3.1

50

TransgenaFond

genetic

Nr. ovulefecundatestadiu 1celula

Nr. ovulefecundatestadiu 2celule

Nr. femele pseudogestantereimplantate/non-

pseudogestanteNr. pui

TRE-hapoE3

FVB64 - 3 1 14

50 - 4 2 28

Total 42

Tek-Tet3G

FVB20 - 1 2 10

- 40 3 2 17

Total 27

Aşa cum se poate observa din Tabelul nr. 3.1, în urma procedurilor de transgenezăpentru transgena TRE-hapoE3 s-au născut 42 de pui. Dintre aceştia unul (nr. 22) a fostpozitiv pentru transgenă (fig 3.29). Acest animal va fi folosit mai departe pentru întemeiereaunei linii de şoareci transgenici pentru TRE-hapoE3.

Figura nr. 3.29. Electroforeza produsilor de PCR pe aparat Agilent cu microcipuri. Seobserva produsul de reactie pntru animalul cu nr22.

Aşa cum se poate observa din Tabelul nr. 3.1, în urma primei runde de transgenezapentru transgena Tek-Tet3G s-au născut 27 de pui. Dintre aceştia nici unul nu a fost pozitivpentru transgenă, iar procedura a fost reluata. In urma noii procedurii de transgeneza, s-auobtinut 4 fondatori (F0) (Fig. 3.1), doua femele si doi masculi.

51

Activitatile prevazute in cadrul faze a patra a proiectului: Obtinerea soarecilordeficienti la apoE cu transgenele TRE-apoE/Tek-tet-on.

Soarecii TRE-hapoE3 (care exprima gena apoE3 umana sub controlul promotorului PTRE3G).Din fondatorul unic obtinut in urma procedurii de transgeneza, s-a dezvoltat linia transgenicaTRE-hapoE3, aflata in prezent la generatia F3. Soarecii transgenici TRE-hapoE3 au fostfolositi pentru a) dezvoltarea mai departe a liniei si b) pentru impererecherea cu soareci ApoEdeficienti pentru a genera animale dublu-transgenice TRE-hapoE3/ApoE-/-. Cateva dingenotiparile efectuate sunt redate mai jos, in figura 3.1. Benzile amplificate pentru uneleanimale (numerotate in partea de sus a imaginii), ilustreaza prezenta transgenelor la soareciirespectivi.

52

Soarecii Tek-Tet3G (care exprima proteina transactivator Tet-On3G sub controlulpromotorului endotelial Tek/Tie2 si a enhancerului endotelial Tek/Tie2). In urma proceduriide transgeneza, s-au obtinut 4 fondatori (F0) (Fig. 3.1), doua femele si doi masculi. Avand invedere faptul ca prin procedura de microinjectie pronucleara integrarea transgenei se facealeatoriu in genomul soarecelui recipient, cei patru fondatori transgenici obtinuti au genotipdiferit, ceea ce impune generarea a 4 linii transgenice diferite, in care expresia transgenei deinteres trebuie analizata pentru selectarea acelui fenotip care asigura cel mai bun nivel deexpresie. Astfel, fiecare dintre cei 4 fondatori a fost imperecheat cu masculi, respectiv femele,din linia FVB, pentru generarea de pui din prima generatie (F1). Pana in prezent, s-au obtinut11 pui de la 1 mascul fondator, pui ce urmeaza a fi genotipati pentru identificarea animalelortransgenice care vor fi ulterior folosite pentru a) dezvoltarea mai departe a liniei si b) pentruimpererecherea cu soareci ApoE deficienti pentru a genera animale dublu-transgenice Tek-Tet3G/ApoE-/-.

Animalele din cele doua linii dublu-transgenice TRE-hapoE3/ApoE-/- si Tek-Tet3G/ApoE-/-

urmeaza a fi imperecheate pentru a obtine modelul conditional dublu-transgenic EC-hapoE3,in care izoforma apoE3 umana va fi exprimata specific in endoteliul vascular. Acest model vapermite investigarea modului in care apoE secretat de endoteliu isi poate realiza rolul,macrofagelor in placa aterosclerotica si dezvoltarea de noi strategii terapeutice inateroscleroza.