Proiectul ADER 6.2.1. Studii privind efectul nutrienților/contaminanților din hrana suinelor

asupra funcțiilor de absorbție/barieră imună a tractusului gastro-intestinal; dezvoltarea de noi strategii nutriționale în vederea

îmbunătățirii statusului imun

Faza 3/2017

Scopul proiectului ADER 6.2.1.:

Dezvoltarea prin cercetare fundamentala si aplicativa a unor solutii

nutritionale bazate pe utilizarea de subproduse/reziduuri vinicole bogate in

nutrienți bioactivi care pot fi asimilate ca noi surse furajere care să

îmbunatățească statusul imun și procesele de absorbție intestinală la purcei

după înțărcare, performatele de spor si consum de hrana, precum si sa

contracareze actiunea unor contaminanti din furaje si nutreturi combinate

Etapa a 3-a/2017: Investigarea efectelor unor retete de nutret combinat continând

faina de tescovina asupra performantelor si a unor biomarkeri sanguini, intestinali

si hepatici importanti pentru purcei in perioada post intarcare (experimentare in

vivo-purcei dupa intarcare- Experiment in vivo 2).

Parteneri implicați:

Coordonator proiect (CO): -INCDBNA-IBNA Balotesti,

Partener 1 (P1): – ICA R&D SRL)

Activitati realizateActivitati realizate (I)(I)

• Activitatea 3.1. Conditionarea si pregatirea (teste macinare) tescovinei; fabricare retete nutret combinat experimentale

-Determinarea compozitiei chimice a tescovinei macinate

-Extractia de polifenoli si determinarea continutului fenolic total al extractului de tescovina

-Determinarea activitatii antioxidante (antiradicalica) a extractului de tescovina

-Determinarea compozitiei si concentratiei in polifenoli a tescovinei macinate, prin metoda

HPLC cuplata cu spectroscopie de masa (HPLC –MS)

-Determinarea compozitiei recepturilor de nutret combinat

-Determinarea compozitiei si concentratiei in polifenoli a furajelor experimentale, prin

metoda HPLC cuplata cu spectroscopie de masa (HPLC –MS)

Item %

Substanta uscata (SU) 87.63

Proteina bruta (PB) 10.32

Extract eteric (EE) 5.14

Celuloza bruta (CB) 25.01

NDF (neutral detergent fiber) 58.01

ADF (acid detergent fiber) 52.26

Cenusa (CEN) 5.75

Energia metabolizabila (EM,

kcal/kg)

1912

Compozitia chimica a tescovinei macinate (g/100 g)

Item %

Polifenoli totali (mgGAE/100g) 3619.80

DPPH (µM TRE/g proba) 27.05

Continutul in polifenoli si activitatea antiradicala a

extractului de tescovina

FAINA DE TESCOVINA CARACTERIZARE (I)

Cantitatile de compusi fenolici din faina de tescovina, exprimate in mg/100g

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

10

20

30

40

50

Ab

so

rba

nce

(m

AU

)

Retention time (min)

12

4

5

13

18

Cromatograma extractului de tescovina

uscata si macinata (absorbtie la 280 nm).

FAINA DE TESCOVINA CARACTERIZARE (II)

Nr crt. Analit (clasa de polifenoli) Proba (tescovina uscata)

1 Gallic acid-glucoside 2,223

2 Gallic acid 2,709

3 Resveratrol -

4 Procyanidin trimer 10.62

5 Procyanidin trimer 10.16

6 Catechin 11.63

7 Procyanidin dimer 0.0

8 Epicatechin 51.96

9 Gallocatechin 6.90

10 Epigallocatechin 9.20

11 Procyanidin dimer 22.79

12 Malvidin 3-O-glucoside 6.75

13 Malvidin 3-O-(6’’- coumaroyl –glucoside) 7.44

14 Isorhamnetin 3-O-glucoside 0.0

15 Delfinidin 16,73

16 Quercetin 3-β-D-glucozida 1,10

17 Quercetin 5,04

18 Acid elagic 5,13

19 Miricetin 1,10

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

0

50

100

150

200

250

300

350

Ab

so

rba

nce

(m

AU

)

Rtention time (min)

220

21

22

23

24

25

2627

28

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

0

50

100

150

200

250

300

350

Ab

so

rba

nce

(m

AU

)

Retention time (min)

4132

20

21

22

23

24

25

2627

28

Cromatograma extractului de furaj Control (A) si cel cu adaos (5%) de faina de tescovina (B) (absorbtie la 280 nm).

A B

FURAJE EXPERIMENTALE – CARACTERIZARE (I)

Nr crt. Analit (clasa de polifenoli) Proba

Furaj cu 5% faina de tescovina Furaj Control

1 Gallic acid-glucoside - -

2 Gallic acid 4,611 4,601

3 Resveratrol - -

4 Procyanidin trimer 2,118 -

5 Procyanidin dimer 1,803 -

6 Ferulic acid derivate (Ferulic ac dehydrotrimer) 12,919 12,917

7 Caffeoylquinic acid 43,983 43,973

8 Daidzin (Daidzein-7-O-glucoside) 14,239 14,231

9 p-Coumaroylquinic acid 24,566 24,556

10 6”-O-Malonyldaidzin 11,882 11,879

11 Genistin( Genistein-7-O-glucoside) 16,224 16,214

12 Ferulic acid 15,331 15,321

13 6”-O-Malonylgenistin 17,266 17,252

14 Dicaffeoylquinic acid 18,965 18,960

Cantitatile de compusi fenolici din furajele experimentale, exprimate in mg/100g

FURAJE EXPERIMENTALE – CARACTERIZARE (II)

Activitatea 3.2. Evaluarea efectelor nutreturilor combinate cu tescovina (analize zootehnice,

biochimice si imunologice).

-parteneri implicați: CO, P1

Activitati desfasurate:

• -pregatire loturi de animale

• -supravegherea desfasurarii experimentului in vivo

• -recoltarea de probe biologice (sange si organe)

• -evaluare parametri zootehnici, biochimici si imunologici:

- Analiza biochimica a markerilor biochimici plasmatici

- Analiza parametrilor plasmatici ai raspunsului imun umoral (subclasele de imunoglobuline

- Masurarea activitatii principalelor enzime antioxidante din probele de organe

- Evaluarea efectului NC-TSV asupra inmagazinarii de polifenoli la nivel plasmatic si in diferite organe (ficat, splina)

- Evaluarea efectului NC-TSV asupra concentratiilor de elemente minerale din ficat, splina

Activitati realizateActivitati realizate (II)(II)

Experiment in vivo (biobaza INCDBNA Balotesti)

2 loturi de purcei aflati in

perioada post-intarcare :

TSS

Parametri masurati: Performantele animale (CO)

Markeri biochimici plasmatici (CO)

Molecule cu rol in raspunsul inflamator general (CO)

Markeri cu rol in raspunsul inflamator local intestinal (CO)

Enzime antioxidante (CO)

Acumularea de polfenoli in plasma si in tesuturi (CP)

Acumularea de oligoelemente in tesuturi (P1)

control

30 zile

Efectele nutretului combinat cu adaos de faina de tescovina asupra performantelor purceilor la intarcare

Evolutia greutatii medii (kg) a animalelor luate in studiu evaluata la

inceputul experimentului (greutatea initiala), la jumatatea perioadei

experimentale (greutatea intermediara) si la sfarsitul experimentului

(greutatea finala)

Lot

experimental

spor mediu zilnic (kg)

valoare medie ± SEM

spor total (kg)

valoare medie ± SEM

lot NC-Control 0,587 ± 0,033 20,556 ± 1,171

lot NC-T 0,659 ± 0,025 22,100 ± 1,260

Sporul mediu zilnic (kg/zi) si sporul total (kg) in cadrul celor doua

loturi luate in studiu.

NC-T

Lot experimental Glicemie

(mg/dL)*

Colesterol

(mg/dL)*

Trigliceride

(mg/dL)*

NC- Control 89,1 ± 3,2 83,3 ± 1,4 62,9 ± 3,8

NC-T 83,9 ± 5,2 85,6 ± 1,6 48,1 ± 3,4

t-test vs NC-Control 0,421 0,299 0,011

Efectele NC-T asupra profilului glucidic si lipidic

plasmatic al purceilor la intarcare

Analiza efectelor NC cu adaos de faina de tescovina (5%)

asupra starii generale de sanatate a animalelor

analize biochimice

Lot experimental Proteina totala

(g/dL)*

Albumina

(g/dL)*

Bilirubina totala

(mg/dL)*

Creatinina

(mg/dL)*

Uree

(mg/dL)*

NC- Control 5,1 ± 0,1 3,9 ± 0,0 0,1 ± 0,0 0,9 ± 0,0 21,0 ± 1,3

NC-TSV 5,2 ± 0,1 3,9 ± 0,0 0,1 ± 0,0 1,0 ± 0,0 19,1 ± 1,6

t-test vs NC-Control 0,635 0,419 0,628 0,214 0,381

Efectele NC-T asupra profilului proteinelor plasmatice in cazul purceilor la intarcare

Lot experimental Fosfor

(mg/dL)

Calciu

(mg/dL)

Magneziu

(mg/dL)

Fier

(µg/dL)

NC- Control 8,6 ± 0,1 8,9 ± 0,3 1,9 ± 0,0 130,2 ± 8,6

NC-T 8,6 ± 0,1 9,2 ± 0,3 1,4 ± 0,0 127,3 ± 3,0

t-test vs NC-Control 0,717 0,617 0,754 0,761

Efectele NC-T asupra parametrilor plasmatici ai

metabolismului mineral in cazul purceilor la intarcare

Lot experimental ALAT (TGP)

(U/L)*

ASAT (TGO)

(U/L)*

Fosfataza

alcalina (U/L)*

Gamma- glutamil

trasferaza (U/L)*

LDH

(U/L)* Creatin kinaza (U/L)*

NC- Control 52,3 ± 2,5 46,8 ± 2,7 138,0 ± 8,3 26,1 ± 2,2 1324,8 ± 63,2 2034,2 ± 382,5

NC-T 56,5 ± 4,1 28,7 ± 3,0 140,4 ± 5,1 26,8 ± 2,4 1407,1 ± 81,7 1706,3 ± 310,3

t-test vs NC-Control 0,394 0,000 0,807 0,821 0,437 0,515

Efectele NC-T asupra profilului enzimelor plasmatice la purceii la intarcare

Efectele NC- T asupra raspunsului imun prin anticorpi in cazul

purceilor aflati in perioada post-intarcare (I)

Efectul NC- T asupra sintezei de IgA, IgM si IgG plasmatice la purceii la intarcare

Loturi

IgA

(mg/mL)

IgM

(mg/mL)

IgG

(mg/mL)

NC-control 1,60 ± 0,17 2,87 ± 0,26 19,35±1,15

NC-T 1,64 ± 0,18 2,79 ± 0,33 17,87±1,06

Efectele NC- T asupra raspunsului inflamator in cazul

purceilor aflati in perioada post-intarcare (I)

0

5000

10000

15000

duoden colon

Co

nc

en

tra

tie

IL

-8 (

pg

/ml)

NC- Control

NC- TSV

0

100

200

300

400

500

600

700

duoden colon

Co

nc

en

tra

tie T

NF

-α (

pg

/ml)

NC- Control

NC- TSV

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

duoden colon

IL-1

be

ta (

pg/

mL)

NC-Control

NC-T

0

500

1000

1500

2000

2500

duoden colon

IL-6

(p

g/m

L)

NC-Control

NC-T

NC-T NC-T

Efectele NC-T asupra activitatii enzimelor antioxidante in ficat si splina

Efectele NC-T asupra peroxidarii lipidice la nivel de organ

Lot experimental

CATALAZA

activitate enzimatica

(µmol/min/g tesut)

GPx

activitate enzimatica

(µmol/min/g tesut)

SOD

Activitate enzimatica

(U/g tesut)

duoden Ficat splina duoden ficat Splina duoden ficat splina

NC- Control 2,12±0,3 464,4 ± 21,6 6,2 ± 0,1 1,18±0,2 15,1 ± 0,6 3,9 ± 0,4 437,8±5,6 3186,4 ± 80,1 1920,2 ± 27,2

NC-T 2,36±0,4 517,6 ± 11,5 7,2 ± 0,2 1,28±0,1 15,1 ± 0,9 4,1 ± 0,3 479,4±6,3 3620,0 ± 66,2 2447,9 ± 53,7

t-test vs NC-

Control NS NS 0,042 NS NS NS < 0.006 0,019 < 0.001

Efectul NC- T asupra capacitatii totale antioxidante in tesuturi

0

100

200

300

400

500

Co

nc

en

tra

tie

pla

sm

ati

ca p

oli

fen

oli

to

tali

(m

g/L

GA

E)

NC- Control

NC- TSV

0

100

200

300

400

500

600

Ficat Splina

Co

nc

en

tra

tie p

olife

no

li t

ota

li i

n

org

an

e (

mg

/L

GA

E)

Lot Control

Lot TSV

Efectul NC- T asupra concentratiei polifenolilor totali la purceii

aflati in perioada post-intarcare in plasma (A), respectiv organe

(ficat si splina –B)

A B NC-T

NC- Control

NC-T

Efectele NC-T asupra concentratiilor de elemente minerale

din ficat, splina

0

20

40

60

80

100

Ficat Splina

Co

nc

en

tra

tie

Fie

r (m

g/k

g)

NC- Control

NC- TSV

0

2

4

6

8

10

Ficat Splina

Co

nc

en

tra

tie

Cu

pru

(m

g/k

g)

NC- Control

NC- TSV

0

10

20

30

40

50

Ficat Splina

Co

nc

en

tra

tie

Zin

c (m

g/k

g)

NC- Control

NC- TSV

NC-T

NC-T

NC-T

Rezultatele obținute în acestă etapa au aratat ca

reziduurile vinicole, respectiv faina de tescovina prin

continutul in compusi bioactivi de tipul polifenolilor este o

sursa alternativa furajera avand capacitatea de a reduce

raspunsul inflamator prin scaderea nivelului moleculelor

pro-inflamatoare si a stresului oxidativ prin cresterea

capacitatii antioxidante totale si a activitatii enzimelor

antioxidante la purcei dupa intarcare.

CONCLUZII