Producerea de metabolii n culturi de celule i esuturi vegetale potenialul lor aplicativ

Producerea de metabolii n culturi de celule i esuturi vegetale i potenialul lor aplicativn ultimii ani, interesul pentru metaboliii secundari de origine vegetal a crescut, dat fiind, pe de o parte efectul lor terapeutic, iar pe de alt parte, caracterul lor natural, n prezent aproximativ 60% dintre medicamentele utilizate pentru oameni fiind de natur vegetal. Dar utilizarea plantelor nu se rezum numai la domeniul farmaceutic sau agroalimentar, ci ea se poate extinde la cosmetic i parfumerie. Se apreciaz c un numr mare de compui noi sunt identificai anual n diferite specii de plante, dar este totodat semnalat i rapiditatea procesului de extincie a speciilor i de ngustare a bazei genetice a resurselor vegetale n lume. De exemplu, planta Pilocarpus pabonadi utilizat pentru producerea medicamentului pilocarpin, datorit colectrii neraionale este n prezent declarat specie ameninat cu dispariia n Himalaia i a fost nlocuit cu Pilocarpus microphyllus ca surs de principii farmacologic active (R. GUPTA, 1991). Acest fenomen a stimulat att reconsiderarea importanei vitale a resurselor genetice ct i interesul pentru obinerea metaboliilor secundari prin metode neconvenionale. nc din 1952 J.B. ROUTIEN i L.G. NICKEL au obinut un brevet cu titlul "Cultivarea celulelor vegetale" demonstrnd cu acest prilej c celulele vegetale pot s creasc n medii lichide i c aceste celule pot fi utilizate pentru obinerea de compui chimici utili. Dar abia 30 de ani mai trziu n 1982 Y. FUJITA i colab. au raportat producerea primului produs natural la scar comercial - shikoninul din culturi celulare de Lithospernum erythrorhizon.n ultimii ani numeroase cercetri au fost dedicate producerii de compui utili prin culturi de esuturi vegetale. Ca urmare s-au nregistrat progrese tehnologice remarcabile, astfel c n prezent studiile bazate pe culturi de celule i esuturi se desfoar att la nivel fundamental ct i sub forma cercetrilor aplicative care utilizeaz culturi la scar larg, industrial, pentru producerea comercial a metaboliilor secundari.Deoarece sinteza lor nu constituie o parte indispensabil a programului expresiei genice i dezvoltrii, aceasta poate fi modelat att prin modificri ale materialului genetic ct i prin modificri ale mediului sau prin utilizarea unor substane cu rol de semnal pentru declanarea cii biosintetice respective (M. LUCKNER, 1982; K. LINDSAY i M.G.K. JONES, 1989).

Tehnicile "in vitro" i propun stimularea exprimrii complete a unor secvene metabolice care au ca rezultat sinteza unui metabolit dorit, fapt ce ofer importante avantaje economice prin posibilitatea realizrii sintezei la scar industrial, n bioreactoare, ca i prin dirijarea selectiv a unor anumite secvene biosintetice, n funcie de scopul urmrit (B.E. ELLIS, 1982). De regul speciile vegetale productoare de compui secundari cresc numai n anumite zone climatice, iar sinteza acestor metabolii cu structur complex pe cale artificial este ne economic, dificulti care conduc la fluctuaii considerabile ale materiei prime i implicit ale preului de cost. n plus o serie de reglementri elaborate n multe ri limiteaz utilizarea produselor sintetice n special ca aditivi alimentari sau medicamente. Intensa concentrare a cercetrilor efectuate n diferite laboratoare din lume n scopul utilizrii culturilor de esuturi i celule vegetale ca surse poteniale de metabolii utili poate fi explicat prin avantajele importante oferite de acestea, ca de pild:

- metaboliii utili pot fi obinui n condiii controlate de mediu, n flux continuu, indiferent de factorii climatici sau de nsuirile solului; - culturile celulare sunt necontaminate cu microbi i insecte; - celulele oricrei plante, tropicale sau alpine, pot fi uor multiplicate n scopul producerii metaboliilor specifici;

- controlul automat al creterii celulare i reglarea proceselor metabolice contribuie la reducerea costului forei de munc i la mbuntirea productivitii; - ciclurile biosintetice ale culturilor celulare n bioreactoare sunt mult mai rapide dect cele ale plantei n condiii naturale. De exemplu n cazul sikoninului un ciclu de producie n bioreactoare dureaz cteva sptmni, n timp ce numai plantele n vrst de 5 ani sunt recomandate pentru extracia produsului farmaceutic (A.W. ALFERMANN i M. PETERSEN, 1995); - prin selecie clonal i mutagenez se pot izola linii celulare care sintetizeaz metaboliii secundari n cantiti chiar mai mari dect cele prezente n organele specializate ale plantei intacte (M. TABATA, 1977); - culturile celulare n suspensie pot fi utilizate i pentru biotransformarea unor substraturi pentru obinerea unor noi compui neidentificai n natur sau pentru producerea unor enzime utilizabile n sinteza chimic a compuilor naturali (K. HERBERS i colab., 1995).

0 analiz efectuat de specialitii japonezi privind metodele brevetate, ncepnd cu anul 1975 pentru producerea de compui utili prin culturi de esuturi i celulele vegetale, au evideniat o cretere semnificativ a numrului acestora, n special n domeniul produselor farmaceutice. n l977 M. H. ZENK i colab. au publicat o strategie menit s contribuie la obinerea n cantiti crescute a compuilor chimici naturali prin culturi de celule vegetale care n esen stabilete parcurgerea urmtoarelor etape: 1. - testarea i selecia unor plante iniiale caracterizate prin capacitate crescut de acumulare a compusului natural urmrit;

2. - stabitirea culturilor de calus de la plantele donor selectate;3. - analize chimice pentru stabilirea concentraiei produsului natural n culturile de calus;

4. - stabilirea de culturi celulare n suspensie;

5. - analize chimice la nivelul liniilor celulare n suspensie;

6. - selecia de linii celulare nalt productoare prin clonri unicelulare ca rezultat al variabilitii somaclonale sau al unor tratamente mutagene;

7. - obinerea de linii celulare nalt productoare stabile n bioreactor;

8. - ameliorarea producerii de metabolii secundari prin optimizarea parametrilor de

cultur fizici i chimici.

Cu toate c aceast strategie a fost adoptat i utilizat de numeroi specialiti, obinerea la scar comercial a unor astfel de compui prin culturi de celule i esuturi se limiteaz la cteva produse.

O dificultate major se semnaleaz de diveri autori const n instabilitatea liniilor celulare n ce privete acumularea de metabolii secundari i faptul c parametrii optimizai individual n faza de laborator nu acioneaz sinergic i nu conduc la rezultate reproductibile n bioreactoare cu volum mare (A.W. ALFERMANM i M. PETERSEN, 1995). Utilizarea eficient a culturilor celulare n scopul producerii de compui secundari, implic satisfacerea urmtoarelor condiii:

rata creterii celulare i a biosintezei trebuie s fie suficient de ridicat pentru a se obine o cantitate semnificativ de produs final ntr-o perioad de timp;

culturile trebuie s fie stabile genetic pentru a produce cantiti ridicate de metabolii secundari n mod constant; metaboliii s se acumuleze n celule fr a fi catabolizai rapid sau, preferabil, s fie eliberai n mediu lichid; preul produciei, incluznd costul mediului de cultur, precursorii i extracia chimic, s fie suficient de sczut pentru a fi profitabil (M. TABATA, 1977).Pentru rentabilizarea acestor tehnologii n sensul reducerii cheltuielilor de producie, se au n vedere dou obiective: creterea productivitii culturilor celulare i creterea produciei pe unitatea de volum a culturilor din bioreactoare. n acest scop se procedeaz la selecia de linii celulare nalt productoare de la nivelul micilor agregate celulare sau la clonare unicelular, corelate cu optimizarea compoziiei mediului de cultur pentru a stimula capacitatea maxim a celulei de a produce metabolitul de interes. 0 contribuie important la depirea limitelor prezente n acest domeniu este ateptat de la experimentarea unor strategii recente dintre care deosebit de promitoare par a fi: tehnica de cultur a esuturilor i organelor difereniate (ca de exemplu a lstarilor multiplii sau a rdcinilor transformate cu Agrobacterium), biotransformarea precursorilor n compui de baz i stimularea biosintezei prin utilizarea unor elicitori (Y. FUJITA, 1990). Dei celulele din culturi posed ntregul potenial biochimic al genomului plantei ntregi, adesea noile condiii de mediu determin modificri ale metabolismului, exprimate prin tipul i cantitatea metaboliilor sintetizai, pn la dispariia total a unora dintre acetia sau la formarea unui compus cu totul nou. Trebuie deci precizat c incapacitatea unor culturi de a sintetiza anumite substane nu este rezultatul pierderii potenialului biochimic, ci a faptului c acesta nu se poate exprima n anumite condiii, pe parcursul diferenierii biochimice i citochimice (L. MERAVY, 1987). Instabilitatea capacitii biosintetice caracteristic culturilor celulare poate fi i consecina unor modificri la nivelul materialului genetic, att intercromozomale, exprimate prin aneuploidie i poliploidie, ct i restructurri intracromozomale, care au ca rezultat modificri ale tipului de expresie genic (M. J. C. RHODES i colab., 1987). Dar tocmai heterogenitatea caracteristic sistemelor celulare "in vitro" a fcut posibil selecia unor linii celulare de un deosebit interes practic ca de pild celule fotoautotrofe (YAMADA i SATO, 1978; YASUDA i colab., 1980); celule rezistente la factori de stress (PALMER i WIDHOLM, 1975; NABORS i colab., 1980); celule nalt productoare de vitamine (NATSUMOTO i colab., 1980; WATANABE i YAMADA, 1982) celule nalt productoare de pigmeni (KINERSLY i DOUGALL, 1980; YAMAMOTO i colab., 1982); celule productoare de alcaloizi (ZENK i colab., 1977; YAMADA i HASHIMOTO, 1982). Meninerea unor linii celulare caracterizate printr-o productivitate ridicat i stabil de metabolii secundari poate fi realizat prin modificarea compoziiei mediului de cultur, a parametrilor fizici, prin inducerea, identificarea i selecia unor clone derivate de la celule cu capacitate sintetic ridicat. n acest mod s-a reuit de pild producerea unor cantiti ridicate de ajmalicin, folosit ca medicament antihipertensiv, din culturi celulare de Chatarantus roseus, ca i cultivarea la scar comercial a celulelor de Lithospermum erythrorhizon, pentru producerea pigmentului rou ca aciune antiinflamatoare shikonin, obinndu-se o cretere a productivitii de la 0,4 la 23% substan uscat. Tot n acest scop s-a experimentat suplimentarea mediului de cultur ca anumii precursori (compui intermediari ai procesului biosintetic), fapt ce are ca rezultat n final producerea metabolitului secundar specific, n situaia n care cultura celular posed competena bioconversiei intermediarului respectiv i deci reactivarea activitii biosintetice. Pe de alt parte nc din anul 1974 COSTABEL i colab. au sesizat c sinteza i acumularea metaboliilor secundari sunt dependente de unele procese biochimice i structurale care se petrec la nivelul esuturilor cultivate "in vitro". Este bine cunoscut faptul c o serie de compui secundari se acumuleaz n anumite esuturi i organe specializate, cum sunt rdcini, fructe, lstari, saci glandulari, canale pentru uleiuri eterice, etc. De exemplu nicotina i alcaloizii nrudii sunt sintetizai n sistemul radicular al plantelor de tutun, dar sunt transportai i se pot acumula predominant n prile aeriene ale plantei. Capsaicina este sintetizat i se acumuleaz ntr-o anumit faz a dezvoltrii fructelor de Capsicum frutescens, enzima-cheie fiind activ numai n esutul placentar. Uleiul eteric al mentei se acumuleaz n celulele glandulare din frunze, iar cel de mueel n capitule. La Datura ferox hiosciamina este sintetizat n rdcini de unde este transportat n frunze. Pe traseul parcurs spre situsul de depozitare hiosciamina este apoi oxidat n scopolamin. Este deci evident c n multe cazuri biosinteza i biotransformarea metaboliilor secundari sunt corelate cu diferenierea morfologic i c aceste fenomene sunt nscrise n genomul speciilor.

S-a constatat c i n cazul culturilor de esuturi i celule de la unele specii, biosinteza metaboliilor specifici este n mod obligatoriu corelat cu un anumit nivel al diferenierii celulare i tisulare (H. A. COLLIN i M. WAT'I'S, 1984).

Se cunosc numeroase exemple cnd celulele aglomerate n agregate sintetizeaz produsul caracteristic speciei n timp ce suspensiile celulare fine nu realizeaz sinteza.

n alte sisteme de culturi celulare organizarea multicelular sub form de embrioni somatici, lstari sau rdcini, favorizeaz sinteza i acumularea metaboliilor secundari, probabil datorit limitelor impuse diviziunilor celulare de condiia multicelular, n care exist gradieni ai nutrienilor, oxigenului i presiunii mecanice. Din aceast categorie fac parte de pild speciile la care n condiii naturale acumularea metaboliilor secundari se realizeaz n rdcini, ntre care i Rubia tinctorum.

0 tehnic apreciat ca avnd un potenial superior pentru producerea anumitor metabolii secundari "in vitro", bazat pe corelaia dintre organizarea structural i acumularea produilor secundari utilizeaz sistemul de transformare cu Agrobacterium rhizogenes. Rspunsul fenotipic determinat de inseria ADN-T al plasmidei Ri n genomul plantei const n proliferarea rapid de rdcini la situsul de infecie, care pot fi detaate i cultivate pe perioade nelimitate, n scopul producerii metaboliilor specifici. Aceste rdcini pstreaz caracteristicile biosintetice ale plantei de origine, la care metaboliii secundari se sintetizeaz i se acumuleaz n rdcini.In figura 3 sunt prezentate diferite modaliti de obinere a metaboliilor secundari, dar ele trebuie s in cont de:

aprovizionarea cu plante, n vederea unei eventuale extracii; facilitatea sintezei sau a hemisintezei chimice; capacitatea microorganismelor de a produce compuii de interes.

Figura 3. Posibiliti de producere a metaboliilor secundari (dup G. Freyssinet, M.Lebrun, B. Pelissier i T. Hardy, 1993).Dac nici una dintre aceste ci nu este posibil sau dac ele sunt limitate, se va putea realiza producia substanelor cercetate de ctre culturile celulare vegetale in vitro, evitndu-se concepia conform creia acest procedeu poate fi lung i riscant. Numeroasele avantaje ale aplicaiilor culturilor celulare vegetale in vitro contrazic aceast concepie:

Prin valorificarea potenialului de biosintez sau de biotransformare se pot obine produi noi (domeniul farnaceutic);

Eticheta produs natural permite cucerirea unei pri rentabile de pia, fa de produii de sintez.