Procedee de Diagnostic Imunologic2

download Procedee de Diagnostic Imunologic2

of 125

Transcript of Procedee de Diagnostic Imunologic2

Tehnici imunologice de diagnosticSistemul imun asigur mecanismele r spunz toare de men inerea (ap rarea) integrit ii organismului n fa a agresiunii microorganismelor i a altor antigene. Principala func ie a sistemului imun este aceea de a preveni sau de a limita infec ia produs de microorganisme cum ar fi bacteriile, virusurile, fungii, parazi ii. Protec ia este asigurat, n primul rnd de mecanisme mediate celular, umoral ale sistemului imun, ct i sistemul Complement i celulele fagocitare. DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC poate fi mp r it n: A. REAC II ANTICORP-ANTIGEN B. TESTE PENTRU EVALUAREA IMUNIT A. REAC IILE ANTICORP-ANTIGEN Reac iile antigenelor cu anticorpii prezint o mare specificitate. Un antigen va reac iona doar cu anticorpul a c rui sintez a fost indus de el sau de un alt antigen cu structur apropiat . Datorit gradului ridicat de specificitate, reac iile dintre antigene i anticorpi pot fi utilizate pentru identificarea unuia dintre componente. Exist dou situa ii: 1. Identificarea unui antigen (Ag) necunoscut izolat din proba de cercetat, folosind seruri standard (Ab) (care sunt seruri ob inute de la animale imunizate cu antigene purificate cunoscute). Ag + Ac Ag Ac 2. Eviden ierea anticorpului specific (Ac) din serul unui pacient, utiliznd antigenele standard (diagnosticul serologic). Ag + Ab Ag - Ac Antigene i anticorpi: defini ii de baz Antigenele sunt substan e care pot fi recunoscute i dependente de sistemul imun, n timp ce imunogenii sunt molecule care induc un r spuns imun. n majoritatea cazurilor, antigenele sunt imunogene, astfel nct se utilizeaz ambii termeni. ns , exist cteva excep ii cu importan deosebit, cum sunt haptenele. O hapten este o molecul care nu e imunogen prin ea ins i, dar poate reac iona cu anticorpul specific. Un epitop (determinantul antigenic) este structur molecular care interac ioneaz practic cu o singur molecul de anticorp. Antigenele i imunogenii con in de obicei, mai mul i epitopi, fiecare dintre ei fiind capabil s se lege de o molecul de anticorp diferit. Anticorpii sunt imunoglobuline care reac ioneaz specific cu antigenul care a stimulat II MEDIAT CELULAR

producerea lor. Ei reprezint 20% din proteinele plasmei sanguine. Anticorpii pot fi utiliza i ca elemente sensibile i specifice pentru detectarea, identificarea i dozarea antigenelor. Anticorpii specifici pot fi ob inu i de la pacien i n perioada de convalescen a anumitor afec iuni (de exemplu, anticorpii antivirali) sau pot fi purifica i de la animale imunizate cu antigenul care ne intereseaz . Un tip special de anticorpi, utiliza i n scopuri diagnostice, sunt anticorpii monoclonali care recunoa te un singur epitop, de aceea ace ti anticorpi au o mare specificitate Anticorpii monoclonali n special pentru antigenele de suprafa ale limfocitelor, se prepar pentru a fi comercializate. Datorit faptului c anticorpii monoclonali au revolu ionat att de profund metodele de detectare a antigenelor, producerea acestor molecule va fi prezentat ulterior. Un alt tip de anticorpi, sunt anticorpii policlonali, care sunt preparate heterogene de anticorpi, capabili s recunoasc mai multe tipuri de epitopi ai unui antigen. Reac ii Ag Ac utilizate n diagnosticul imunologic I. In vitro: 1. Reac ia de aglutinare (n care antigenul este particulat) 2. Reac ia de precipitare (n care antigenul este solubil) 3. Reac ia de fixare a complementului 4. Reac ia de neutralizare 5. Imunofluorescen a (IF), testul ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Radioimunotestarea (Radioimmunoassay RIA). II. In vivo: Intradermoreac ii (teste cutanate) 1. Prick - testul cutanat 2. Patch - testul cutanat I. In vitro 1. Reac ia de aglutinare n aceast reac ie, antigenul este particulat (de exemplu, bacterii sau eritrocite) sau este o particul inert (de latex) nvelit cu un antigen. Anticorpul, fiind bivalent sau multivalent, se leag de particulele antigenice multivalente i formeaz o re ea, reac ia de aglutinare devenind vizibil . Tehnica este sensibil i poate fi aplicat att pentru antigene dar i moleculele de anticorpi. 1.a Aglutinarea direct implic aglutinarea particulelor antigenice (cum sunt bacteriile sau fungi) cu participarea anticorpilor specifici. Determinarea antigenului Bacteriile sunt identificate n mod obi nuit, preparnd din cultura pur o suspensie lichidian pe o lam de sticl sau n tuburi i urmrind dac acestea sunt aglutinate sub forma unor agregate

vizibile, n urma ad ug rii de antiseruri specifice care au fost ob inute ca rspuns la antigene bacteriene cunoscute. Determinarea anticorpului Suspensia de bacterii de aceast data cunoscute, poate fi utilizat invers, pentru determinarea i dozarea anticorpilor serici. Se efectueaz prin testarea pe o serie de dilu ii de ser a unei suspensie bacteriane standard i determinarea celei mai mari dilu ii de ser la care nc este prezent reac ia de aglutinare (care reprezint titrul reac iei). Reac ia de aglutinare are sensibilitate mai mare dect reac ia de precipitare. 1b. Aglutinarea pasiv n ceea ce prive te aglutinarea pasiv , pot fi detectate antigenele sau anticorpii, n func ie de reactantul legat de carrier. Antigene cunoscute legate de carrier, pentru determinarea anticorpului n aceast situa ie, antigenul este particulat avnd astfel particularitatea de a fi aglutinabil. Legarea de carrier este posibil prin fixarea antigenelor solubile la suprafa a unor particule care din punct de vedere immunologic sunt inerte. De exemplu, numeroase polizaharide ader u or, dar ferm la suprafa a eritrocitelor sp late; numeroase antigene proteice ader n mod similar la hematii tratate cu diferi i agen i, ori la particulele de polistiren, latex, bentonit , colodiu, c rbune. Determinarea anticorpilor antivirus rubeolic prin reac ia de aglutinare pe latex este realizat prin amestecarea antigenelor imunodominante de rubella virus fixate pe particulele de latex, cu probe de ser i urm rirea apari iei reac iei de aglutinare (fig. 38). Fig. 38 - Detectarea anticorpilor de rubella prin aglutinare pe latex

Determinarea antigenului Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici sunt aglutinate n prezen a unui antigen omolog (fig. 39). n practic acest test este folosit pentru determinarea: - Factorului reumatoid (FR) care este o protein care apare n mod patologic, avnd propriet ile clasei IgM, care apare n serul pacien ilor cu artrit reumatoid . Aceast protein mai poate apare i n cazul altor afec iuni: lupus eritematos, sindrom Sjgren, boli hepatice, tuberculoz , sifilis, infarct miocardic chiar i la persoane s n toase (mai ales la vrstnici); - Proteina C reactiv (PCR) n serul persoanelor s n toase este prezent n concentra ii minime

(foarte dificil de detectat prin tehnici obi nuite). Proteina C reactiv este una dintre proteinele de faz acut a c rei concentra ie cre te n decursul proceselor inflamatorii acute, n fazele de reactivare ale inflama iilor cronice i n procesele necrotice (infarct miocardic, tumori maligne); - Determinarea direct a antigenului streptococului de grup A din tampoanele faringiene este realizat prin tratarea probei fie la pH sc zut (cu acid azotic) fie cu diferite enzime; ulterior se pune n contact lichidul extras, cu particule de latex acoperite cu anticorpi anti-streptococ de grup A. Fig. 39 Detectarea antigenului prin aglutinarea pe latex ... 1c. Reac ia de coaglutinarea este utilizat , n special n detectarea antigenelor diferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae etc. Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC 12498) prezint un con inut ridicat de protein A de suprafa . Proteina A din peretele celular al stafilococului aureu se leag de fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulin , l snd liber fragmentul Fab pentru legarea antigenului. Aglutinarea vizibil a stafilococilor reprezint un test pozitiv care indic leg tura antigen-anticorp (fig. 40).

Fig. 40 - Coaglutinarea

Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici servesc ca baz pentru multe sisteme disponibile n comer , folosite pentru detectarea direct a antigenelor bacteriene. Una dintre aplica iile importante este identificarea antigenelor capsulare solubile n cazul mai multor agen i etiologici ai meningitei acute sau cronice, i anume: Haemophylus influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, streptococii de grup B, E.coli i Cryptococcus neoformans. 1d. Hemaglutinarea Testul hemaglutin rii active identific anticorpii pentru antigenele eritrocitare. Anticorpul este diluat succesiv n ser fiziologic i apoi depus n godeurile pl cii de hemaglutinare. Sunt utiliza i

ntotdeauna martori pozitivi i negativi. Se adaug n fiecare godeu o suspensie de eritrocite (care con ine o protein ce prevene aglutinareai nespecific a hematiilor). n cazul n care exist suficien i anticorpi pentru a produce aglutinarea vizibil (prin crossreac ii/reac ii ncruci ate) celulele se vor depune la fundul godeului, sub forma unui covor neomogen. Daca anticorpii sunt insuficien i, celulele se vor rostogoli pe pere ii oblici ai pl cii, formnd un buton ro u pe fundul godeului (fig. 41).

Fig. 41 Reac ia de hemaglutinare

Unii anticorpi nu au capacitatea de a aglutina direct hematiile i pot fi detecta i numai cu ajutorul testului de aglutinare indirect ; aceast reac ie are loc prin ad ugarea unui al doilea anticorp (cu propriet i hem-aglutinante) care se leag de anticorpul neaglutinant, ata ndu-l astfel (indirect) de eritrocit. Factorul reumatoid (FR) poate fi eviden iat n serul pacien ilor folosind reac ia de hemaglutinare: hematiile sensibilizate de berbec, sunt aglutinate n prezen a factorului reumatoid (reac ia Waaler-Rose). Reac ia de hemaglutinarea cu participarea virusuri: Unele virusuri, de exemplu virusul gripal, paragripal, urlian, adenovirusul i virusul febrei galbene pot produce aglutinarea eritrocitelor umane, precum i a eritrocitelor de coco , por de Guineea, oarece i alte animale. Aceast reac ie este utilizat pentru detectarea i titrarea virusurilor hemaglutinante n materialele de cultur . Pe de alt parte, inhibarea reac iei de hemaglutinare poate fi folosit pentru decelarea anticorpilor n probele de ser. Aceasta este cunoscut ca testul inhib rii hemaglutin rii virale (HAI). Prin legarea covalent sau necovalent de diferitele antigene de pe suprafa a hematiei, utilitatea testului poate fi extins i la detectarea anticorpilor pentru alte antigene dect cele aflate pe hematii.

1e. Testul Coombs Testul Coombs mai este cunoscut ca testul antiglobulinic. n multe cazuri de anemie hemolitic (de exemplu n boala hemolitic a nou-n scutului /incompatibilitate de Rh i anemii hemolitice determinate de medicamente) anticorpii sunt lega i pe suprafa a eritrocitului. Aceste imunoglobuline pot fi eviden iate prin testul Coombs antiglobulinic direct, n care antiserul antiimunoglobulin uman este folosit pentru aglutinarea hematiilor de la pacient (fig. 42).

Fig. 42 Testul Coombs direct

n unele cazuri, cantitatea de anticorpi lega i este prea mic pentru a fi detecta i prin testul Coombs direct i se recurge la testul antiglobulinic indirect pentru eviden ierea anticorpilor n serul pacientului. n acest test, serul de la pacient este amestecat cu eritrocite normale i se adaug antiser anti-imunoglobulin uman . Dac anticorpii sunt prezen i n ser, se produce reac ia de aglutinarea (fig. 43).

Fig. 43 Testul Coombs indirect

2. Reac ia de precipitare n aceast reac ie, antigenul se afl n solu ie. Tehnicile de precipitare sunt bazate pe: - capacitatea majorit ii anticorpilor de a interac iona cu mai mult de un epitop al unei proteine sau agent infec ios - faptul c fiecare molecul de anticorp interac ioneaz cu mai mult de un antigen (de exemplu,

imunoglobulina G are dou domenii pentru legarea antigenului). ntre anumite limite ale concentra iei antigenului i anticorpului (zona de echivalen ) anticorpul leag ncruci at antigenul ntr-un complex prea mare pentru a sta n solu ie (suspensie) i, de aceea precipit , iar supernatantul nu con ine n exces nici anticorpi, nici antigene. n zona excesului de anticorpi, exist o cantitate prea mare de anticorpi pentru formarea eficient a unei re ele de legturi, iar precipitarea este mai redus fa de intensitatea din zona de echivalen . n zona excesului de antigene, to i anticorpii sunt combina i, dar precipitarea este redus , deoarece complexe antigen-anticorp sunt prea mici pentru a precipita, ele r mn solubile (fig. 44). Fig. 44 Reac ia de precipitare

Reac iile de precipitare pot avea loc n solu ie sau n mediu semisolid (agar). A. Precipitarea n solu ie a) Reac ia de precipitare inelar Antigenul i serul sunt puse n contact n tuburi capilare, astfel nct s nu se amestece, dar s se p streze interfa a limpede. Rezultatul pozitiv este dat de apari ia unui precipitat alb la nivelul interfe ei, dup 15-20 minute (Figura 45).

Fig. 45 Reac ia de precipitare inelar

Reac ia poate fi utilizat n: - industria alimentar la diferen ierea originii c rnii; - medicina legal la identificarea originii petelor de snge; - diagnosticul microbiologic: i pentru gruparea streptococilor; i reac ia Ascoli folosit n diagnosticul retrospectiv al antraxului; i reac ia Vincent-Bellot utilizat n diagnosticul infec iilor meningococice.

b) Precipitarea n tub capilar Acest test este efectuat pentru detectarea proteinei C reactive (PCR) (fig. 46).

Fig. 46 Reac ia de precipitare n tub capilar

B. Precipitarea n gel de agar Poate fi simpl sau dubl difuzie. De asemenea, poate avea loc n prezen a unui cmp electric. Difuzia simpl sau imunodifuzia radial (RID) este o metod cantitativ pentru antigene care pot precipita. n aceast tehnic , anticorpul este ncorporat ntr-un strat sub ire de agaroz , n timp ce antigenul proteic difuzeaz din godeul n care a fost inoculat. Acolo unde concentra ia antigenului este optim pentru a produce reac ia de precipitare, apar inele albe. Diametre mai mari ale acestora indic o concentra ie crescut de antigen. Aceasta este o metod destul de sensibil , putnd detecta 1 10 g de protein i nu necesit

antigen pur pentru determinarea concentra iei. Durata tehnicii este de 24 48 ore i indic doar prezen a, nu i func ia proteinelor. Imunodifuzia radial este utilizat pentru m surarea IgA, IgM, IgG, componentelor complementului (C3), transferine i altor substan e din ser (IgE nu pot fi m surate deoarece concentra ia lor este prea sc zut ) (fig. 47).

Fig. 47 Imunodifuzia radial simpl

Dubla difuzie metoda Ouchterlony n aceast metod , antigenul i anticorpul sunt plasate n godeuri diferite efectuate n gelul de agar; cele dou componente pot difuza unul spre cel lalt, cu scopul stabilirii gradientului de concentra ie a fiec ruia. Acolo unde se atinge concentra ia optim , apar liniile de precipitare. Pe baza modelului liniilor de precipitare, acest test poate fi utilizat, de asemenea, pentru a determina daca probele sunt identice, dac particip sau nu to i epitopii (identitate par ial ) sau dac probele sunt diferite (fig. 48). Aceast tehnic se folose te pentru detectarea: proteinei C reactive, antigenului HBs, antigenului carcino-embrionar (care apare n unele tipuri de cancer), produ ilor de degradare ai fibrinogenului, antigenelor fungice (de exemplu: Histoplasma spp., Blastomyces spp., Coccidioides) etc.

Fig. 48 Imunodifuzia dubl

C. Precipitarea n gel de agar cu ajutorul cmpului electric Electroforeza reprezint metoda de separare a proteinelor ntr-un cmp electric. Metoda este utilizat n laboratorul clinic pentru detectarea valorilor concentra iei de imunoglobuline i a altor proteine serice. Cteva dintre bolile care pot fi diagnosticate, utiliznd aceast tehnic sunt: mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenstrm i hipergamaglobulinemia. De asemenea, electroforeza poate fi folosit pentru detectarea modific rilor n compozi ia lichidului cerebro-spinal al pacien ilor cu scleroz multipl . 1. Imunoelectroforeza folose te att separarea electroforetic , ct i precipitarea proteinelor. Se poate utiliza att pentru proteinele specifice (identificare i dozare) din serul sanguin, ct i din urin sau alte lichide. Astfel, o prob de ser este plasat ntr-un godeu realizat n gelul de agar turnat pe o lam de sticl . Un curent electric trece prin agar i proteinele se deplaseaz n cmpul electric, conform sarcinii electrice i dimensiunii lor. Apoi, n gelul de agar se taie un an care se va umple cu anticorp. Deoarece antigenul i anticorpul difuzeaz unul spre cel lalt, se vor forma o serie de arcuri de precipitare (fig. 49).

Fig. 49 Imunoelectroforeza Aceste arcuri permit caracterizarea proteinelor serice n func ie de: prezen /absen sau traiectul lor neobi nuit (de exemplu, human myeloma protein). Metoda este util pentru identificarea paraproteinelor cu lan greu i u or. Pot fi determinate de asemenea, sc derea sau absen a imunoglobulinelor n imunodeficien e, iar originea monoclonal a proteinei Bence-Jones din mielom poate fi confirmat . Imunelectroforeza este o metod valoroas n studiul bolilor autoimune i neurologice. 2. Radioimunoelectroforeza este utilizat n primul rnd ca tehnic de cercetare, care combin imunoelectroforeza cu folosirea antigenelor marcate. Metoda folose te culturi de esuturi. Cnd antigenele marcate reac ioneaz cu antiserurile antiumane i antiserurle ce con in lan uri grele i u oare, se confirm originea unei proteine specifice (de exemplu protein de: organ, esut sau popula ie celular crescut n cultur ). 3. Contraimunoelectroforeza (CIE) sau electroimunodifuzia dubl combin caracteristicile

imunodifuziei n gel i electroforezei. Probe din lichidele organismului n care se suspicioneaz prezen a agen ilor microbieni sunt plasate n godeuri separate realizate ntr-un mediu de difuzie tamponat (agaroz ). Godeuri similare situate la 3 mm distan sunt umplute cu anticorpi cunoscu i. Prin trecerea unui curent electric, antigenele polizaharidice care au tendin a de a fi nc rcate negativ la pH neutru migreaz n direc ia opus , spre catod. n 30 - 60 de minute antigenul i anticorpul se vor ntlni, se vor cupla n caz de specificitate structural formnd o linie de precipitare distinct . Principiul este acela i ca la imuno-dubladifuzie, dar sensibilitatea metodei este mai mare (de 10-20 de ori). CIE poate fi utilizat pentru identificarea att a antigenelor i a anticorpilor necunoscu i, de exemplu Ag HBs, a-feto-proteina, polizaharidul pneumococic (n sngele unui pacient cu pneumonie sau n lichidul cefalorahidian al unuia cu meningit ), criptococoz , meningit produs de Haemophylus influenzae, endocardit stafilococic (fig. 50). Fig. 50 Contraimunoelectroforeza

4. Electroforeza n rachet sau electroimunodifuzia unidimensional implic electroforeza antigenelor dintr-un godeu printr-un mediu de gel cu anticorp fixat. pH-ul gelului este ales n a a fel nct anticorpul s fie imobil, iar antigenul s aib sarcina negativ . Liniile de precipitare care rezult au forma de eap sau rachet iar n l imea lor este propor ional cu concentra ia de antigen. Principala aplica ie a acestei tehnici este determinarea cantitativ a antigenelor n lichidele biologice (fig. 51). Fig. 51 Electroforeza in racheta

3. Reac ia de fixare a Complementului (RFC) Sistemul complement este compus din 20 sau mai multe proteine plasmatice care interac ioneaz ntre ele i cu membrana celular . Fiecare component proteic trebuie s fie activat secven ial n condi ii potrivite pentru declan area reac iei.

Complexele antigen-anticorp se num r printre activatori i reactia de fixare a complementului poate fi utilizat pentru identificarea unuia dintre ei, cnd cel lalt este cunoscut. In situa ia n care reac ia de fixare a complementului urmre te detec ia de anticorpi necunoscu i, procedura este urmtoare: (1) Serul de testat (de la pacient) se titreaz n dubl dilu ie i se adaug o cantitate stadardizat de antigen n fiecare tub sau godeu. Dac anticorpul specific este prezent n serul de testat se vor forma complexele imune. (2) Apoi, la acest amestec se adaug complementul (de obicei, ob inut de la porcul de Guineea). Dac sunt prezente complexele imune, ele vor lega complementul si l vor consuma. (3) n etapa final , este ad ugat sistemul indicator reprezentat de eritrocite sensibilizate [eritrocite de oaie sensibilizate cu anticorpi (n cantitate subaglutinant ) extra i din ser de iepure] (fig. 52). . Fig. 52 Reactia de fixare a complementului

Interpretarea rezultatului: - dac anticorpul se potrive te antigenului n prima faz a reac iei, complementul a fost fixat nemaifiind disponibil s se lege de hematiile sensibilizate; astfel, eritrocitele r mn nehemolizate testul fiind interpretat ca pozitiv (hematiile rmn n dop la baza tubului de reac ie); - dac anticorpul nu se potrive te cu antigenul (nu exist specificitate), complementul este liber i se leag la eritrocitele sensibilizate care vor fi lizate, iar testul va fi negativ (aspectul n tubul de reac ie va fi de hemoliz/ro u difuz). Folosind cantit i standardizate de anticorp cunoscut i e antion de antigen, metoda poate fi utilizat pentru testarea antigenelor. Complementul trebuie standardizat cu grij , iar serul de testat trebuie prelucrat n vederea inactiv rii oric rei activit i a complementului seric. Efectuarea controalelor recomandate (martorii probei de reac ie) este foarte important n aceast tehnic deoarece anumite preparate de anticorpi folosesc complement f r ad ugarea antigenului, de exemplu, dac este vorba de ser care con ine deja complexe imune. De asemenea, unele antigene pot avea activitate anticomplement. De aceea, controlul trebuie s includ anticorp singur, respectiv antigen singur, pentru a verifica dac nu cumva unul dintre ace tia nu fixeaz complementul f r interven ia celuilalt. Exprimarea rezultatelor: - concentra ia anticorpilor este exprimat ca cea mai ridicat dilu ie a serului care indic fixarea complementului (dilu ie la care nu apare hemoliza)

- concentra ia de antigen este exprimat ca fiind titrul de antigen care limiteaz ac iunea hemolitic a complementului. Reac ia de fixarea a complementului este foarte mult utilizat n cercetare i n laboratoarele clinice n scopul diagnosticrii infec iei cu M. pneumoniae, micozelor, pentru identificarea parazi ilor, virusurilor, a infec iei cu Treponema pallidum (testul Wassermann).

4. Reac ia de neutralizare Aceast reac ie se bazeaz pe capacitatea anticorpului de a bloca efectul antigenelor toxice, litice sau infectante prin combina ii specifice dintre antigen i anticorp in vivo sau in vitro. Neutralizarea virusurilor Neutralizarea activit ii virale este cea mai sensibil i specific metod pentru determinarea identit ii unui izolat i pentru determinarea anticorpilor specifici n serul pacientului. Dac anticorpul neutralizant este prezent, virusul nu poate ataca celulele, iar infectivitatea este blocat . O frac iune a virusului infectant poate r mne chiar i n prezen a antiserului specific, astfel nct infec ia poate fi mai degrab amnat , dect blocat complet. Pentru identificarea izolatelor virale, se folosesc antiserurile specifice cu reactivitate cunoscut . Pentru testarea serologic , suspensia din virusurile de referin este testat mpotriva serurilor de testat. Aceast reac ie se poate folosi pentru eviden ierea: - efectului citopatic (cel mai frecvent); - hemadsorb iei i hemaglutinrii pentru eviden ierea orthomyxovirusurilor i paramyxovirusurilor; - inhibi iei metabolice (colorimetric): acidifierea mediului cu ro u-fenol prin dezvoltarea celulelor, dac replicarea virusurilor a fost neutralizat ; - reducerii plcii: celulele infectate de numeroase virusuri pot fi detectate a ezarea monostratificat cu solu ie de agar nutritiv, care con ine un colorant vital, cum ar fi ro u neutru; celulele infectate apar ca plci necolorate fa de fundalul ro u format de celulele viabile; reducerea num rului de plci indic reac ia de neutralizare. Neutralizarea toxin -antitoxin Cnd o toxin este pus n contact cu antitoxina corespunz toare, efectul toxic al toxinei este neutralizat. Se poate utiliza: 1) In vivo: testul Schick este folosit pentru determinarea susceptibilit ii unui individ la difterie. Prin injectarea intradermic a unei cantit i mici de exotoxin difteric , toxina este neutralizat de antitoxinele din ser dac individul respectiv este imun i nu se produce nici o reac ie. Situa ia invers este apari ia unei zone erimatoase necrotice n cazul n care individul nu prezint antitoxine (individul este susceptibil la acest infec ie). 2) In vitro: testul ASLO (Antistreptolizin O) este o reac ie de neutralizare folosit pentru a m sura titrul de antistreptolizin O= anticorp indu i de streptolizina O un antigen virulent

(hemolizina) al bacteriei Streptococcus pyogenes. Acest test este valoros mai ales pentru confirmarea sau infirmarea diagnosticului de febr reumatic sau glomerulonefrit acut , situa ii n care poate fi determinat, atunci cnd streptococul (Streptococcus pyogenes de grup A) nu mai este prezent. Principiul n acest test, dilu ia succesiv dublu seriale a unei probe de ser de la pacient este pus n contact cu o cantitate de streptolizin O standard (Ag) i, apoi, dup o scurt incubare necesar pentru combinarea specific , se adaug o suspensie de eritrocite, ca sistem indicator. n tuburile (godeurile) n care dilu iile de ser con in suficient streptolizin O (anticorp) efectul litic al antigenelor este inhibat, ceea ce nseamn lipsa hemolizei, n timp ce n tuburile (godeurile) n care anticorpii nu sunt suficien i pentru a neutraliza antigenele, efectul litic al acestora va fi sugerat de prezen a hemolizei. Titrul reac iei este dat de dilu ia din ultimul tub (godeu) n care nu se observ hemoliza; valori normale: 166 250 U/ml. Titruri crescute exist n boli streptococice i post-streptococice: angina, scarlatina, febra reumatic , glomerulonefrita acut . 5. Teste care utilizeaz antigene sau anticorpi marca i Imunofluorescen (IF) Principiul Proteinele, inclusiv anticorpii serici, pot fi marca i folosind coloran i fluorescen i (de exemplu, fluoresceina si auramina) prin combina ii chimice, f r a altera ori a interfera cu propriet ile biologice sau imunologice ale proteinelor. Apoi, aceste proteine pot fi observate n preparatele microscopice folosind microscopul cu fluorescen (n lumina ultraviolet ). Astfel de anticorpi marca i pot fi utiliza i pentru identificarea antigenelor pe suprafa a bacteriilor (streptococi, neisserii, treponeme) n celule sau sec iuni histologice ori n alte probe. Imunofluorescen a este folosit frecvent pentru detectarea anticorpilor si a autoanticorpilor pentru antigenele tisulare i celulare (de exemplu, anticorpi antinucleari, anticorpi antimu chi netezi, anticorpi anticelule parietale). Autoanticorpii apar n bolile autoimune. Imunofluorescen a poate detecta anticorpi in situ. Dintr-o mas congelat de esut, cu ajutorul criostatului, se realizeaz o sec iune; aceasta confer siguran a c antigenele labile nu sunt distruse de substan e fixatoare. Imunofluorescen a (IF), (fig. 53) poate fi:

Fig. 53 Imunofluorescen a direct i indirect

IMUNOFLUORESCEN DIRECTA, cnd anticorpul marcat cunoscut interac ioneaz direct cu un antigen necunoscut i se folose te, n mod obi nuit, pentru detectarea antigenului. Anticorpul specific este conjugat cu un compus fluorescent (de obicei, izotiocianat de fluorescein ), rezultnd un sistem trasor vizibil cu reactivitate imunologic nealterat . Serul conjugat este adugat la celule sau esuturi pe o lam i se fixeaz pe antigen, formnd un complex imun stabil. Substan ele care nu au participat la reac ie sunt ndep rtate prin sp lare, apoi preparatul este colorat i examinat la microscopul cu fluorescen . Antigenul specific legat la anticorpul fluorescent poate fi observat ca un element str lucitor de culoare verde deschis sau galben-portocaliu pe fond ntunecat, n func ie de fluorocrom i de filtrele utilizate. Aspectul fluorescen ei este caracteristic pentru fiecare antigen tisular. IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA. n acest test se folose te un proces cu dou etape. Un antigen cunoscut se fixeaz pe lam , se adaug ser necunoscut, apoi preparatul este sp lat; dac anticorpul seric necunoscut corespunde antigenului, va r mne fixat pe acesta pe lam i va putea fi detectat prin ad ugarea unui anticorp antiglobulin marcat fluorescent i examinarea cu ajutorul microscopului cu fluorescen . Imunofluorescen a indirect este de multe ori mai sensibil dect cea direct , deoarece pe locul antigenului ader mai mul i anticorpi marca i. n plus, antiglobulina marcat devine un reactiv universal independent de antigenul utilizat, va intra n reac ie cu toate imunoglobulinele G ale acelei specii. Teste cu marcaj enzimatic (ELISA) Exist multe variante ale acestei metode n func ie de legarea unei enzime de antigen sau anticorp. Enzima este detectat prin testarea activit ii enzimatice cu substratul s u. Pentru m surarea anticorpului, se folose te metoda indirect : antigene cunoscute se fixeaz pe un suport solid (de exemplu, micropl ci din material plastic) se incubeaz cu dilu ii din serul de testat, se spal , apoi se reincubeaz cu o anti-imunoglobulin marcat cu o enzim (de exemplu, fosfataza alcalin , peroxidaza). Activitatea enzimatic este m surat prin ad ugarea unui substrat enzimatic, care -n generaldetermin formarea unui produs colorat, care poate fi detectat vizual sau cu ajutorul spectrofotometrului. O reac ie pozitiv indic faptul c anticorpul a fost prezent n proba, iar

intensitatea reac iei este propor ional cu concentra ia de anticorpi din produs (fig. 54).

Fig. 54. Testul ELISA metoda indirect 1. Antigen adsorbit pe faza solida; 2. Anticorp de testat, in ser; 3,5. Spalare; 4. Antiglobulina marcata enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii . Pentru a m sura un antigen se folose te metoda cu doi anticorpi, specifici unul fa de altul. Un anticorp cunoscut este fixat pe un suport solid. Se adaug proba de testat care con ine antigenul, iar excesul se spal . Se adaug un anticorp specific marcat enzimatic. Dup o nou sp lare, se adaug un substrat i activitatea enzimatic este m surat colorimetric i raportat la concentra ia antigenului (fig. 55).

Fig. 55 Tehnica identificrii unui antigen test ELISA 1. Anticorp adsorbit pe faza solida; 2. Antigen de testat; 3,5. Spalare; 4. Anticorp specific marcat enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii

Tehnica Western blot este o variant a metodei ELISA. n aceast tehnic , proteinele virale separate prin electroforez n func ie de greutatea lor molecular sau sarcina electric sunt transferate (blotted) pe o hrtie de filtru (de exemplu, nitroceluloz , nylon). Cnd hrtia este expus serului unui pacient, proteinele imobilizate captureaz anticorpul viral specific i este vizualizat cu ajutorul unui anticorp antiuman legat enzimatic. Tehnica Western blot este utilizat pentru a confirma rezultatele ob inute prin ELISA la pacien ii suspecta i c ar fi infecta i cu HIV, hepatite virale. Radioimundozarea (Radio Immune Assay) Principiul de baz al radioimunotest rii este similar celui prezentat la testul ELISA. Diferen a esen ial este aceea c markerul utilizat la ELISA este o enzim , iar cel folosit n RIA este un izotop radioactiv (I125, P32). Etapa final a acestei metode o reprezint detectarea activit ii

radioactive cu ajutorul unui contor de scintila ie, care sesizeaz att emisiile , ct i pe cele . De i are un grad ridicat de sensibilitate i specificitate, aceast metod prezint dezavantajul c este costisitoare, reactivii expir repede (short-life), iar n ceea ce prive te izotopul este necesar ndeplinirea unor condi ii deosebite. Cele mai multe variante RIA folosesc un sistem de testare competitiv. n testul cantitativ pentru anticorpi, suportul solid este nti standardizat prin legarea unui antigen nemarcat i o concentra ie standard pentru anticorp care este marcat cu o substan radioactiv . Proba (necunoscut ) care con ine anticorpul ce trebuie testat ( i care este nemarcat) se adaug la mediul de reac ie. Concentra ia anticorpului n proba necunoscut este determinat prin citirea comparativ a valorilor pe o curb standard. Curba e func ie de gradul de inhibi ie a leg rii anticorpului marcat combinat cu valorile dilu iilor n serie ale cantit ilor cunocute de anticorp nemarcat. Metoda de lucru este similar cnd antigenele sunt cele care se detecteaz , cu excep ia situa iei n care antigenul marcat este folosit pentru dozarea antigenului liber n prob . RIA se folose te pe scar larg n chimia clinic , endocrinologia clinic i toxicologie, dar nu reprezint un test de rutin n microbiologia clinic . n practica curent , metodele RIA includ teste pentru hormoni steroizi (cum ar fi aldosteronul, cortizonul, progesteronul) hormoni peptidici (corticotropina, hormonul corticostimulant, vasopresina). n unele laboratoare se mai utilizeaz metoda RIA pentru testarea markerilor pentru hepatita B (Ag HBs, Ac HBs, Ac HBc, Ag Hbe, Ac HBe) dar a fost, n genral, nlocuit de tehnica ELISA. Testul RAST (radioallergosorbent test) este o variant specializat a RIA, utilizat pentru a m sura cantitatea de anticorpi IgE serici care reac ioneaz cu un alergen cunoscut (antigen).

II. in vivo Intradermoreac ia (test cutanat) 1. Prick test-ul este un test u or de efectuat i foarte eficient n diagnosticul diferitelor alergii. Alergenii introdu i la nivel tegumentar (de obicei la nivelul antebra ului) n cteva minute induce eliberarea de mediatori preforma i ce cauzeaz secundar vasodilata ie local, edem local i prurit. Acest tip de reac ie caracterizeaz hipersensibilitatea de tip I. Testul este pozitiv la pacien ii cu o varietate mare de tulburri atopice i de obicei se coreleaz cu testul RAST (Radioallergosorbent test) pozitiv pentru IgE seric specific i testul de provocare cu alergeni specifici, pozitiv la nivelul mucoasei nazale sau bron ice. Faptul c ace ti pacien i cu tulburri atopice dezvolt o reac ie imediat la locul de inoculare (prick test) demostreaz c molecule de IgE sunt fixate pe suprafa a celulelor mastocitare, chiar dac simptomatologia este nazal sau bronhial. 2. Patch test-ul implic aplicarea alergenului pe suprafa a normal tegumentar tears n prealabil. De exemplu pacien ii cu eczem atopic ce posed Ac specifici (IgE) fa de acarienii

din praful de cas, vor dezvolta un patch test pozitiv. Este interesant c o parte din pacien ii cu rinit alergic cauzat de praful de cas (ce con ine acarieni) dezvolt o reac ie patch pozitiv la acest allergen, manifestat printr-un infiltrat bazofilic local, sugernd faptul c infiltrarea nu este specific eczemei atopice. Keratina de suprafa a unei zone neafectate este ndeprtat printr-o tergere u oar i extractul este plasat pe tegument, ntr-o manier ocluziv, pentru 48 de ore, dup care urmeaz examinarea local. Leziunile ce apar sunt macroscopice eczematoase, iar microscopic con in infiltrate de eozinofile i bazofile. Metode de izolare a anticorpilor Cercettorii imunologi au deseori nevoie de izolate pure de anticorpi, care pot fi imunoglobuline nespecifice sau antigen nespecifice. Izolarea imunoglobulinelor nespecifice din ser, se poate ob ine prin frac ionare secven ial a proteinelor serice, etape ce includ : - precipitarea gama-globulinelor n solu ie de 30-50% sulfat de amoniu - filtrarea gelului, pentru ob inerea de molecule de dimensiuni corecte - cromatografie de schimb ionic pentru a izola moleculele care sunt ncrcate pozitiv, la un pH neutru. - Cromatografia de afinitate pentru liganzii naturali ai imunoglobulinelor, cum sunt proteina A (proteina A fiind un component al peretelui celular al Stafilococului, ce are capacitatea de a lega regiunile C 2 i C 3 a majorit ii subclaselor de IgG, de exemplu: IgG1, IgG2 i IgG4). Izolarea anticorpilor antigen-specifici se poate realiza prin cromatografia de afinitate, utiliznduse antigenul cuplat cu Sepharoz ; anticorpul pur este izolat prin metoda imunoabsorbant. Producerea de anticorpi monoclonali Inten ia tehnicilor serologice imunologice sunt de a reduce heterogenicitatea antiserurilor utilizate n terapie. Moleculele de antigen ce posed un singur epitop sunt rar ntlnite de-a lungul vie ii unui individ. Cele mai multe antigene, con in sute chiar mii de determinan i antigenici ce exis pe suprafa a celular sau n interiorul unor mixturi de substan e. Cnd ace ti antigeni mixa i sunt injecta i unui animal, un numr egal de clone limfocitare sunt stimulate. Chiar dac fiecare clon produce un anticorp specific, rezultatul final este o mixtur heterogen de molecule de anticorpi, a crei specificitate i afinitate este deseori necunoscut i dificil de a fi controlat. Cnd aceste seruri policlonale sunt utilizate n sistemele de testare bacteriene, pot apare crossreac ii, fie din cauza determinan ilor antigenici care se regsesc la diferite specii sau din cauza muta iilor care pot induce apari ia unor epitopi suficient de apropia i ca specificitate pentru a produce reac ii detectabile. Inten ia de a produce antigene pure prin tehnici de absorb ie au avut parte de un succes par ial. Cum tiin a testrii serologice a evoluat, impresia a fost c disponibilitatea unui anticorp ce posed un grad nalt de heterogenicitate molecular cu o specificitate ngust pentru un singur epitop antigenic, fr dezvoltarea unor cross-reac ii, ar putea rezolva multe din problemele cu

care se confrunt utilizarea anticorpilor monoclonali. Specificitatea nalt a anticorpilor monoclonali, ca i produs al unei singure clone de celule limfoide, s-a putut ob ine prin investiga ii n fuziunea celular i tehnologia hibridoamelor, cercetri efectuate pe oarecei, de Kohler i Milstein. Prin descoperirile acestor 2 oameni de tiin , este acum posibil s se izoleze linii de clone a unui singur limfocit care este capabil s produc un singur tip de molecul de anticorpi. Cea mai mare realizare a fost nu numai izolarea unei singure linii celulare capabile s sintetizeze un singur tip de molecul de anticorp ci i fuzionarea acestor limfocite de oarece cu celule din mielomul de oarece, cu inten ia reu it de a produce celule hibride (fig. 56) cu 2 caractere mo tenite importante: - capacitatea de a produce anticorpi monospecifici (achizi iona i de la limfocitele parentale) i - abilitatea de a cre te continuu n cultur, caracter de imortalitate mo tenit de la linia de celule mielomatoase. Animalele (de obicei oareci sau obolani) sunt imuniza i cu un antigen. Odat ce animalele dezvolt un rspuns imun eficient, sunt splenectomizate i se prepar o suspensie celular (se utilizeaz de asemenea ganglionii limfatici). Aceste celule sunt fuzionate cu linii celulare din mieloame, prin adi ia de PEG (Poliethylene glycol) are are rolul de a promova fuziunea membranelor celulare. Numai o mic parte a acestor celule vor fuziona (frecven a este de 1/105 sau 1/106). Mixtura fuzionat este transferat ntr-o cultur ce con ine HAT care este o mixtur de hipoxantin, aminopterin i timidin.. n aceste condi ii celulele splenice pot cre te n mediul cu HAT, n timp ce celulele mielomatoase mor n aceste condi ii, din cauza defectului metabolic ce nu le permite utilizarea acestor metaboli i. Mediul cu HAT n acest moment con ine: celule splenice, celule mielomatoase i celule fuzionate. Celulele splenice mor n acest mediu, n mod natural dup 1-2 sptmni iar celulele mielomatoase sunt distruse de prezen a HAT. Celulele fuzionate supravie uiesc oricum, din cauza imortalit ii bodndite de la celulele mielomatoase. Unele dintre aceste celule care supravie uiesc au capacitatea de a produce anticorpi la fel ca i celulele splenice. Prin tehnici imune, godeurile n care sunt culturile celulare, sunt testate n scopul identificrii anticorpilor dori i. i dac se reu e te identificarea, urmeaz clonarea celulei din godeul n care s-a identificat anticorpul dorit. Clona care rezult dintr-un singur progenitor, posed caracter de imortalitate i are capacitatea de a produce anticorpi monoclonali.

Fig. 56. Producerea de anticorpi monoclonali

B. Testele pentru evaluarea imunit ii mediate celular Evaluarea competen ei imune Diferite teste s-au dezvoltat pentru evaluarea func iei sistemului imun celular. Aceste teste include teste cutanate destinate identificrii Hipersensibilit ii ntrziate tip IV, evaluri ale func iei limfocitelor T i B, determinri ale func iilor limfocitelor i neutrofilelor. Multe din aceste proceduri sunt supuse variabilit ii biologice astfel standardizarea lor fiind dificil. Oricum evalurile furnizeaz date importante despre func ia celular n infec iile cu patogeni intracelulari, n imunologia tumorilor i rejetului de transplant. Evaluarea competen ei celulelor T i B, ca i func ia celulelor fagocitare au o importan primordial n determinarea statusului imun al unui individ cu infec ii cronice, sindroame de imunodeficien sau pacien i cu terapii imunosupresive (n patologia malign). 1. Teste cutanate DTH (delayed T hypersensitivy) Imunocompeten a i expunerea la anumi i agen i infec io i pot fi msurate prin testul cutanat. Aceste proceduri sunt simplu de efectuat i dac sunt interpretate corect, pot fi utilizate n practica medical. Exist 2 tehnici de testare cutanat: fie injectarea intradermic a antigenului, fie testul prin contact direct. Aceste teste pot fi interpretate la 24-72 de ore de la efectuare. a. injectarea intradermic a antigenului s-a utilizat n special pentru evaluarea statusului imunocompetent i a contactului cu agentul etiologic n diferite infec ii, cum sunt: tuberculoza, lepra, bruceloza, varicela, limfogranulomatoza venerian, psitacoza, bola hidatic, leishmanioza, afec iuni fungice. b. teste de contact sunt efectuate prin plasarea antigenului pe suprafa a tegumentar i acoperirea zonei cu un plasture; testul este util n determniarea hipersensibilit ii la diferite produse: cosmetice sau spunuri. Interpretarea corect a rezultatelor este punctul critic al testelor cutanate. Indurarea n jurul locului de injectare, este rezultatul infiltratului mononuclear i al edemului.

Aceast reac ie apare la 24-48 de ore dup ce se efectueaz testul. Diametrul zonei de indurare este un indicator al intensit ii rspunsului imun celular mpotriva antigenului testat. Eritemul (bine delimitat) de la locul inoculrii este un indicator al hipersensibilit ii imediate. Deobicei dispare la 12-18 ore dar poate persista perioade mai lungi de timp. Reac ia eritematoas nu ar trebui luat n considerare n interpretarea testului cutanat. n cazul copiilor testele au o valoare mai mic i nu sunt recomandate, mai ales n cursul primului an de via . Copiii probabil nu au fost ndeajuns de expu i la antigene ct s- i dezvolte un rspuns adecvat, astfel putnd fi sensibiliza i n momentul injectrii antigenului. Pacien ii imunosupresa i cum sunt indivizii crora li s-a efectuat un transplant, deobicei sunt anergici i lipse te rspunsul la acest test. Reac iile adverse la testele cutanate pot apare la indivizi hipersensibiliza i i imuniza i. Reac ii locale severe reprezentate de eritem, indura ie i necroz se pot de asemenea dezvolta. Simptomele sistemice cum sunt: febra i reac ia anafilactic sunt rare. 2. Evaluarea limfocitelor Identificarea i evaluarea func iei celulelor T i B la nivelul sngelui periferic este foarte important n diagnosticarea bolilor nso ite de imunodeficien e, boli autoimune i n reac ii imune n patologia tumoral. Metodele disponibile pentru separarea limfocitelor i a subpopula iilor specifice includ: separarea pe gradient de densitate, sortarea celulelor activate prin utilizarea fluorescen ei, panning-ul, rozetarea, separarea magnetic. Separarea n gradient de densitate se bazeaz pe faptul c limfocitele sunt mai pu in dense dect eritrocitele i granulocitele (fig. 57) i este utilizat pentru a izola majoritatea limfocitelor sanguine.

Fig. 57. Separarea pe baza gradientului de densitate a limfocitelor Sngele total este defibrinat prin agitare ntr-un recipient cu bile de sticl iar cheagul care rezult este ndeprtat. Apoi sngele este diluat ntr-un mediu de cultur tisular i stratificat ntr-o eprubet plin pe jumtate cu solu ie Ficoll. Ficoll are o densitate mai mare dect cea a limfocitelor dar mai mic dect a eritrocitelor i granulocitelor. Dup centrifugare eritrocitele i polimorfonuclearele neutrofile vor trece n parte inferioar a por iunii cu Ficoll formnd un depozit la fundul eprubetei, n timp ce limfocitele se a eaz la interfa a mediului cu Ficoll. Prepararea limfocitelor poate continua prin ndeprtarea macrofagelor i PMN reziduale prin adi ie de fier, care va fi ingerat de fagocite, care vor ptea fi ndeprtate prin ac iunea unui

magnet. Macrofagele pot fi ndeprtate prin lsarea suspensiei celulare s se a eze pe un platou de plastic. Macrofagele vor adera de plastic, n timp ce limfocitele vor putea fi ndeprtate prin splare. Sortarea celulelor activate prin fluorescen Disponibilitatea anticorpilor monoclonali fa de o multitudine de antigene i dezvoltarea flowcitometriei a dus la apari ia unei metode foarte eficiente de studiu a clasificrii celulare. n aceast tehnic, recunoscut ca i sortarea celulelor activate prin fluorescen , anticorpii marca i cu substan e fluorescente sunt incuba i mai nti cu o popula ie celular. Celulele con in antigene specifice pe suprafa a lor i se vor lega de anticorpii marca i; celulele sunt diluate excesiv nainte de a fi inoculate ntr-o singur pictur celular; citometrul scaneaz fiecare pictur cu o excita ie intens tip laser. Fluxul celular ce traverseaz laser-ul are o rat de peste 5000 celule per minut iar analiza se efectueaz electronic. Dac celula este marcat, va fi fluorescent i poate fi separat sau sortat prin deflec ie electrostatic. Lumina ce rezult n cursul scanrii d informa ii despre mrimea celulelor i densitatea antigenelor de suprafa . Citometrele cu fascicol dual, ofer informa ii n plus prin scanarea a 2 antigene diferite sitate pe aceea i celul. Instrumentele utilizate sunt foarte sofisticate i necesit o mentenan foarte atent pentru ob inerea de rezultate optime (fig. 58). Citometrul ofer informa ii asupra lungimii vie ii celulelor, n timp ce tehnicile microscopice necesit distrugerea i fixarea celulelor pe lame speciale care pot altera antigenele de suprafa . Oricum, antigene intracelulare trebuie s fie analizate cu metode microscopice. Se fac eforturi continue pentru a se mbunt i calitatea anticorpilor monoclonali pentru a furniza informa ii corecte despre histologia, structura celular i localizarea antigenelor. Flow citometria poate efectua o analiz diferen iat a celulelor albe sanguine furniznd informa ii despre numrul celulelor B (cu CD19, CD 20 i HLA-DR pe suprafa a lor) celulelor T (CD3), celulelor Th (CD4) i limfocitelor Tc i Ts (CD8). Aceast tehnic este de asemenea util pentru analiza unor antigene prezente pe celulele maligne n anumite patologii hemoproliferative (fenotiparea celulelor tumorale pentru diagnostic i clasificarea leucemiilor i limfoamelor, evaluarea i prognosticul unei boli maligne, determinarea aneuploidiei ADN-ului).

Fig. 58. Sortarea celulelor activate prin fluorescenta

Aceast metod mai ofer informa ii despre numrul celulelor T, al raportului CD4/CD8 care este foarte important n sindroamele imunodeficien elor, dar mai ales n SIDA. Rozetarea Se bazeaz pe faptul c unele popula ii limfocitare au receptori pentru eritrocite. Celulele T umane au receptori pentru eritrocitele de oaie (E) reprezentate de moleculele CD2. Cnd sunt amestecate celulele T cu aceste eritrocite, se formeaz rozete astfel se pot separa de limfocitele ce nu formeaz rozete, reprezentate de limfocitele B (fig. 59) pe gradient Ficoll.

Fig. 59.Izolarea subpopula iilor limfocitare prin rozetare O modificare adus acestei tehnici permite s se izoleze celulele cu al i receptori, de exemplu unele celule T (celulele T ) au receptori pentru fragmentul Fc al IgG (Fc ). Aceste celule pot fi identificate i izolate prin rozetare cu eritrocite de bou, sensibilizate cu anticorpi anti eritrocite de bou. Panning Popula iile celulare pot fi separate pe platforme sensibilizate cu anticorpi. Anticorpii se leag non-covalent la suprafa a de plastic (ca n cazul unei tehnici imune pe faz solid) i mixtura celular pe aplic pe platform. Celulele antigen (+) se leag de anticorpi iar celulele antigen (-) pot fi ndeprtate prin splare. Prin schimbarea condi iilor de cultur sau prin digestie enzimatic celular pe suprafa a platformei uneori este posibil s se recupereze celulele ce s-au fixat pe suprafa . Astfel, metoda este mult mai eficient pentru ndeprtarea unei subpopula ii celulare, mai degrab dect izolarea ei. De exemplu se poate utiliza pentru separarea CD4 de CD8 i separarea Th de Ts prin utilizarea

de anticorpi anti Ig care se leag la suprafa a anticorpului de pe celula B. Prin sensibilizarea platformei cu molecule de antigen, celulele ce se vor lega de acesta pot fi separate dintre celulele care nu s-au legat de antigen (fig. 60).

Fig. 60.Iizolarea subpopula iilor limfocitare prin metoda panning

Separarea magnetic Aceast metod utilizeaz bile magnetice mbrcate n anticorpi specifici (de exemplu anticorpi anti CD4); bilele sunt amestecate cu popula ia celular i se leag de acelea care recunosc anticorpul. Aceste celule pot fi apoi ndeprtate sau izolate prin aplicarea unui cmp magnetic. O alt metod util pentru ndeprtarea popula iilor celulare care nu reprezint interes, se bazeaz pe anticorpi i pe sistemul Complement. Cnd un anticorp specific (de exemplu CD8) este adugat la o mixtur celular, urmat de adugare de Complement, acea subpopula ie celular va fi lizat; n mod natural aceast metod se aplic doar anticorpilor care fixeaz Complementul i unde popula ia celular int are suficiente antigene pentru a fixa Complementul n doz litic.

Evaluarea competen ei celulelor T Enumararea celulelor T 1. enumerarea numrului total al celulelor T poate fi efectuat prin utilizarea anticorpilor monoclonali la CD3 conjugat cu substan e cu fluorescen . Celulele sunt numrate prin microscopie cu fluorescen sau prin flow citometrie; subsetul celulelor T poate fi numrat prin utilizarea anticorpilor monoclonali fa a de CD4 sau CD8. 2. metoda rozetelor E poate fi utilizat pentru numrarea celulelor T: celulele T au receptori pentru eritrocitele de oaie; dac limfocitele din sngele periferic sunt amestecate cu o suspensie de eritrocite de oaie, celulele T se vor lega de eritrocitele de oaie i vor forma rozete ce pot fi num rate la microscopia optic. Evaluarea func iei celulelor T Transformarea limfoblastic

n mod normal, celulele T func ionale se transform n celule blastice mari, cu o intensificare a sintezei ADN-ului, cnd sunt expuse la fitohemaglutinin (o substan mitogenic) sau concavalina A (un extract de plante care stimuleaz n mod specific celulele T). Gradul mitozei este msurat prin gradul de ncorporare a timidinei triturate la mediul de reac ie, apoi se msoar prin scintila ie spectrometric. Evaluarea competen ei limfocitelor B Enumerarea limfocitelor B 1. prin tehnici imunofluorecente prin utilizarea anticorpilor policlonali marca i cu fluorescein sau prin flow citometrie 2. antiseruri monoclonale mpotriva lan urilor grele sau u oare, se pot utiliza pentru evaluarea subclaselor limfocitelor B 3. rozete EA sau EAC: celulele B au receptori pentru C3 i Fc a moleculei de anticorpi astfel pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbricate cu anticorpii lor (EA); de asemenea pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbrcate cu anticorpi i Complement (EAC) i pot fi num rate la microscop. Testele pentru evaluarea func iilor celulelor B 2. transformarea limfocitar; n mod normal celulele B func ionale pot fi stimulate s se transforme n celule blastice mari cu sintez crescut de ADN, cnd sunt expuse la LPS (lipopolizaharid). Acesta poate fi msurat prin gradul de ncorporare a timidinei triturate adugate la mediul de reac ie 3. determinarea nivelului imunoglobulinelor prin electroforeza poteinelor; o scdere sau o cre tere a gamma-globulinelor poate atrage aten ia asupra unei sinteze anormale de anticorpi 4. cuantificarea diferitelor tipuri de imunoglobuline, prin diferite metode: RIA, ELISA, IF etc 5. imunizarea activ poate fi utilizat in vivo, pentru a testa capacitatea de a produce anticorpi. De exemplu, persoana este imunizat cu trivaccinul DiTePer (anti diftero-tetano-pertusis) apoi este testat prin testul Schick pentru a se evalua dezoltarea imunit ii antidifterice. Evaluarea func iei fagocitare 1. evaluarea chemotaxiei este efectuat prin testarea capacittii celulelor fagocitare de a migra prin membrane spre substan a chemotactic 2. evaluarea digestiei sau fagocitozei este efectuat prin vizualizare direct a numrului de particule ingerate utiliznd microscopul 3. evaluarea ingestiei i/sau distrugerea intracelular prin utilizarea testului de reducere cu NBT (nitro blue tetrazolium). n mod normal celulele fagocitare cnd sunt stimulate (de exemplu de endotoxin) inger colorantul i l reduce (virarea culorii din galben n albastru). n condi ii anormale capacitatea de distrugene intracelular este asociat cu scderea testului de reducere.

Evaluarea sistemului Complement Cea mai simpl msur a activit ii Complementului este determinarea concentra iei serice, care induce liza a 50% din preparatul standardizat de eritrocite sensibilizate cu anticorpi (EA). Acest

test se poate efectua n godeuri sau n eprubete. Un sistem simplu care furnizeaz o msur a activit ii Complementului este hemoliza radial. Tehnica este similar cu cea a imunodifuziei radiale, cu excep ia faptului c godeurile con in un ser test i gelul con ine EA. O zon de hemoliz se dezvolt n jurul godeului i mrimea acestei zone este propor ional cu cantitatea de Complement din godeu. Aceast tehnic msoar activitatea total a cilor clasic i litic (C1-C9) dar dac serul prezint o deficien a Complementului, nu se poate identifica care dintre proteine lipse te. Componentele individuale pot fi msurate separat pentru a determina fie nivelul total fie nivelul func ional. Aceasta este o distinc ie foarte important att timp ct un component poate fi prezsent n cantit i normale dar nefunc ional. Nivelul total al proteinelor sistemului Complement este deobicei msurat cu RIA (Radio Immune Assay) sau prin tehnica ELISA, prin utilizarea unui anticorp specific pentru proteina care este investigat. Nivelele func ionale sunt msurate pentru a detecta fiecare component proteic a Complementului, prin furnizarea unui cocktail de celule ro ii sensibilizate plus toate componentele necesare pentru liz, cu excep ia celei care este investigat.

Stiinta este domeniul care realizeaza cele mai multe progrese zilnic, iar unul dintre cele mai importante este modificarea genetica, ce consta in modificarea structurii ADN-ului unor animale sau plante pentru ca acestea sa aiba o productivitate mai sporita si astfel omul sa castige mai multe de pe urma cresterii sau cultivarii acestora.

Prin intermediul unei noi stiinte aparute recent si la noi in tara, biotehnologia, ingineri din intreaga lume au reusit sa imbunatateasca sanatatea animalelor, sa creasca productivitatea produselor de provenienta animala, sa aduca beneficii mediului, sa conserve diferite specii de animale si nu in ultimul rand chiar sa obtina progrese in ceea ce priveste sanatatea umana prin intermediul cercetarilor efectuate pe animale.

Principalele tehnologii pe care se bazeaza ceretariile biotehnologice sunt: genomica, clonarea si modificarea genetica, aceasta din urma facand subiectul articolului de astazi.

Animalul modificat genetic reprezinta acel animal care a suferit in mod deliberat modificari ale genomului, genomul fiind responsabil pentru transmiterea ereditara a unor caracteristici specifice speciei. Genomul animalelor manipulate genetic contine gene ce provin de la alte animale din aceeasi specie sau specii diferite. Genele inmagazineaza informatia genetica necesara pentru formarea si functionarea normala a unui organism, insa ele pot fi manipulate artificial astfel incat caracteristicile de baza ale animalului care a suferit o astfel de operatie sa fie modificate. Spre exemplu, unui embrion i se poate implanta o gena care sa sisteze functionarea altor gene continute in mod natural de catre acesta.

Primul animal care a fost supus unor astfel de tratamente a fost soarecele, si mai apoi a fost urmat de catre iepuri, porci, oi si bovine.

Aceste animale sunt produse acum la scara larga deoarece sunt folosite in cercetarile biologice si medicale, in productia de medicamente, in medicina experimentala si in agricultura. Un exemplu concret ar fi vitele modificate din punct de vedere genetic pentru a produce lapte ce contine anumite proteine umane, folosite in tratamentul emfizemelor umane, astfel reducandu-se considerabil costul tratamentului sau alte animale care au suferit modificari la nivelul genomului astfel incat sa dezvolte simptomele anumite boli si astfel sa faca facila studierea tratamentelor pentru acestea.

Pana acum am tot vorbit despre ce reprezinta aceste animale si pentru ce au fost ele create, insa trebuie sa stiti si faptul ca acest lucru a fost posibil datorita celor doi cercetatori de renume mondial, Watson si Crick, care in anul 1953 au descoperit structura ADN-ului, ceea ce a facut ca cercetariile din domeniul biologiei moleculare sa poata lua un avant considerabil. Tehnologiile folosite au combinat tehnici si expertize din domenii precum biochimie, genetica, biologie celulara, biologia dezvoltarii si microbiologie, iar prin intermediul acestora s-au produs progrese extraordinare in recombinarea ADN-ului, clonarea genetica, analiza expresiei genelor procesul prin care ia nastere o proteina, harta genomica. Principiul de baza al producerii de animale modificate genetic este introducerea uneia sau mai multor gene de provenienta straina in ADN-ul animalului care urmeaza sa fie modificat. Genele introduse trebuie sa fie transmise in linia germinala astfel incat fiecare celula germinativa a animalului sa contina acelasi material genetic modificat.

Exista 3 metode care sunt folosite pentru a modifica un animal din punct de vedere genetic:

y

Microinjectarea de AND ce consta in transferul de gene (care sunt recombinate, iar mai apoi clonate) care provin fie de la animale din aceeasi specie, fie de la animale apartinand unor specii diferite, in pronulceul unei celule reproductive (gametice). Celule manipulate sunt cultivate in vitro pana la un anumit stadiu de dezvoltare si introduse apoi in organismul femelei purtatoare.y

Transferul de gene mediat de retrovirusi ce implica retrovirusi folositi ca vectori pentru a transfera materialul genetic intr-o celula gazda, care mai apoi da nastere unui organism ce contine tesuturi sau parti de la alte specii. Organismele ce prezinta aceleasi modificari sunt imperecheate timp de circa 20 de generatii pentru a putea da nastere unor indivizi homozigoti care sa prezinte in mod caracteristic genele dorite.y

Transferul de gene mediat de celulele embrionare stem care consta in izolarea celulelor stem capabile de multiplicare si specializare, din embrion. Dupa care gena dorita este introdusa in aceste celule, care mai apoi sunt incorporate intr-un alt embrion din care ia nastere organismul cu caracteristici specifice genei manipulate. Dintre acestea, transferul de gene prin microinjectare este cea mai utilizata metoda pentru a produce animale de ferma. Pentru ca gena dorita sa se poata transmite in descendenta sunt imperecheate animale care prezinta aceeasi modificare genetica. Insa in ciuda tuturor acestor eforturi din aceasta metoda rezulta un numar foarte mic de animale care sa prezinte modificarea,

spre exemplu dintr-un esantion de 7000 de ovule de scroafa modificate genetic cu o gena specifica, doar 0,6% au manifestat la nastere caracteristicile dorite.

Spre deosebire de primele 2 metode care permit studiul prezentei genelor modificate doar pe indivizi vii, transferul de gene mediat de celulele embrionare stem permite acest studiu in toate stadiile de dezvoltare celulara. Am adus in discutie acest subiect deoarece are o importanta deosebita pentru agricultura si multe dintre statele care sunt renumite pentru productii mari de carne, lapte si alte produse de provenienta animala profita de pe urma acestor descoperiri biotehnologice pentru a-si spori productivitatea.

Impactul pe care il au aceste animale asupra ramurii zootehnice a agriculturii este unul de luat in seama pentru ca stim cu totii cat de greu este sa obtii animale care sa abia o productie cat mai mare de lapte, carne sau lana prin metoda traditionala de imperechere selectiva. Ai nevoie de timp pentru a obtine rezultatele dorite si cu toate acestea se poate ca rezultatul acestor imperecheri sa nu fie multumitor. Recurgand insa la metoda modificarii genetice timpul in care se pot obtine caracteristicile dorite pentru animalele de ferma este cu mult mai scurt, iar precizia manifestarii lor este mult mai mare. In felul acesta fermierul obtine o crestere considerabila a productivitatii.

Calitatea produselor este si ea foarte importanta pentru fermierul care doreste sa-si valorifice produsele obtinute de la animale. Cu ajutorul modificarilor genetice pe care le sufera animalele de ferma aceasta se poate imbunatatii de asemenea . Spre exemplu au fost create vaci care sa produca lapte in cantitati mai mari si de o calitate superioara, cu mai putina lactoza sau colesterol, porci si bovine care sa dezvolte masa musculara mai mare, deci mai multa carne sau oi care sa dea mai multa lana. Modificarea genetica e o alternativa mai sanatoasa la prostul obicei al fermierilor de a folosi hormoni de crestere in hrana animalelor, acestia ramanand stocati ca rezid in produsele animaliere duc la scaderea calitatii acestor.

In prezent, se fac cercetari pentru a produce animale care sa prezinte rezistenta la boli, insa acestea sunt ingreunate datorita faptului ca sunt extrem de putine gene cunoscute ca fiind raspunzatoare pentru imunitate,, la momentul actual.

Cam acestea sunt beneficiile pe care zootehnia le poate avea de pe urma cresterii acestor animale. Inainte de a incheia insa trebuie sa va mentionez insa una dintre cele mai interesante modificari genetice despre care am auzit de la profesorul meu de ecologie si pe care am regasit-o in top 10 cele mai interesante modificari genetice si anume capra paianjen care a fost produsa de catre profesorul Randy Lewis de la Universitatea din Woyming. Acesta recolteaza o proteina despre care se crede ca poate avea aplicatii foarte extinse de la crearea de veste antiglont pana la crearea de tendoane artificiale si chiar haine. Substanta cu pricina este matasea de paianjen, mai puternica chiar si decat otelul si foarte flexibila. Totul a pornit insa de la faptul ca paienjeni nu pot fii crescuti in ferme asa cum sunt viermii de matase si asta l-a facut pe profesor sa incerce sa dezvolte o alternativa pentru a putea recolta matase. Astfel a ajuns sa colaboreze cu Nexia Biotechnologies si sa dezvolte o metoda alternativa de recoltare a proteinei care produce matasea. Metoda implica extragerea proteinei din laptele unei capre careia i s-a inserat gena ce determina producerea de matase de paiajen in ADN-ul sau. Caprele care au suferit aceste modificari sunt perfect normale din punct de vedere fiziologic si comportamental, nedeosebinduse cu nimic de cele normale. Oare cat costa laptele acestei capre pe piata modiala?

Autor: Paula Groza Surse: text: http://www.actionbioscience.org/biotech/margawati.html http://dsc.discovery.com/technology/tech-10/genetic-engineering/10-transgenic-animals.html poze: http://www.scq.ubc.ca/the-new-macdonald-pharm/ http://adumbrant.blogspot.com/2008_02_01_archive.html http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=transgenic http://www.accessexcellence.org/WN/SUA10/polly797.php

|| ro / multi language ||

|| misiune | politica editoriala | participa! | calendar | contact | link-uri ||

arhiva textelor subiecte :: actiune directa :: altermondializare vs globalizare :: anti-discriminare :: cenzura :: cultura :: ecologie si biotehnologie :: educatie :: gen si sexualitati :: granite :: media independenta vs media mainstream :: munca si productie :: nationalism :: noile tehnologii :: pace si razboi :: politica locala :: postcomunism? arhiva centru

Influenta organismelor modificate genetic :: Claudia Damian / 10.03.08 :: [email protected] Ne-am propus o prezentare sintetic a metodelor utilizate actualmente pentru transformarea celulei vegetale, relevarea importan ei genelor marker i raportoare, respectiv a progresului nregistrat n introgresia n genomul vegetal a unor gene cu importan economic , insistnd asupra datelor recente, spectaculoase, raportate n literatura acestui efervescent domeniu al geneticii actuale. Introducere Transformarea genetic a plantelor a cunoscut un progres spectaculos, de la ob inerea primelor gene himere, n anii aptezeci ai secolului trecut, la regenerarea primelor plante transformate genetic purtnd gene str ine (Gasser i Fraley, 1989). n ultimul deceniu, s-a ajuns la eliberarea n cmp i cultivarea pe scar larg a plantelor transgenice, de la 1,7 ha n anul 1996 la 39,9 milioane ha n anul 1999 ( http://www.agbioview.org). Metodele utilizate pentru transferul eficace al alogenelor n organisme vegetale receptoare au cunoscut, de asemenea, un progres nu mai pu in spectaculos, de la metode simple pn la adev rate metode r zboinice, de mpu care direct a ADN n esuturile int . Odat cu dezvoltarea metodologiei de izolare i clonare a genelor, respectiv a metodelor de transfer n celulele vegetale, un num r tot mai mare de plante au fost supuse transgenozei, incluznd grupele cu o mare importan economic : cerealele, leguminoasele, solanaceele, speciile pomicole sau forestiere. n literatura de specialitate, s-au publicat o serie de sinteze sau chiar c r i referitoare la transformarea genetic a plantelor (Davey i colab., 1989; Potrykus, 1991; Songstad i colab., 1995; Potrykus i Spangenberg, 1995). De aceea, n aceast lucrare ne-am propus o prezentare sintetic a metodelor utilizate actualmente pentru transformarea celulei vegetale, relevarea importan ei genelor marker i raportoare, respectiv a

reteaua IMC globala :: www.indymedia.org Projects :: print

:: radio :: satellite tv :: video Africa :: ambazonia :: canarias :: estrecho / madiaq :: kenya :: nigeria :: south africa Canada :: london, ontario :: maritimes :: montreal :: ontario :: ottawa :: quebec :: thunder bay :: vancouver :: victoria :: windsor East Asia :: burma :: jakarta :: japan :: korea :: manila :: qc :: saint-petersburg Europe :: abruzzo :: alacant :: andorra :: antwerpen :: armenia :: athens :: austria

progresului nregistrat n introgresia n genomul vegetal a unor gene cu importan economic , insistnd asupra datelor recente, spectaculoase, raportate n literatura acestui efervescent domeniu al geneticii actuale. Descoperirea structurii de dublu helix a ADN-ului uman de c tre Watson i Crick la nceputul anilor 1950 a dus la cunoa terea fundamentului biologic al speciei umane dar i a altor specii, iar dezvoltarea bio-tehnologiilor a f cut posibil interven ia n genom n cadrul tehnicilor de inginerie genetic . Aplicarea acestor tehnici la plante a f cut posibil ob inerea unor specimene modificate genetic. Odat cu nceputul anilor 1970, o serie de tehnici ale geniului genetic(adic manipularea direct a genelor de c tre om) permit extragerea unei gene din genomul unui organism i reimplantarea ei n genomul unui alt organism, apar innd unei alte specii sau chiar altui regn. Acest transfer de gene este numit trasgenez , pentru c el presupune traversarea barierelor care, pn nu demult, mpiedicau schimburile de gene ntre specii diferite, mai ales ntre cele apar innd unor regnuri diferite. Gena care codific un caracter pe care dorim s -l transfer m unui alt organism se nume te gen de interes, devenit n momentul transferului efectiv transgen , iar organismul receptor va fi numit prgenism transgenic. Mai mult geniul genetic permite ast zi chiar crearea unor gene artificiale sau modificarea patrimoniului genetic al unei aceleia i specii, prin inactivarea, modifivarea sau prin ad ugarea(adi ia) uneia din propriile sale gene. Sigla OMG desemneaz , a adar, orice organism al c rui patrimoniu genetic a fost modificat prin mecanismele specifice geniului genetic. Practic, ob inerea unui OMG implic urm toarele etape principale: Identificarea i preg tirea(multiplicarea) genei de interes; Introducerea ei(prin diver i vectori) n celula gazd ; Selectarea celulelor gazd care au integrat transgena n genomul lor; Ob inerea, n cazul organismelor pluricelulare, a unui nou organism pornind de la o singur celul transgenizat ; Verificarea transmiterii ereditare a caracterului codat de transgen , la descenden ii organismului transgenic. Organismele modificate genetic create i cultivate pe scar larg n Statele Unite ale Americii sunt acceptate de guvernele unor ri ale lumii (care merg pn la a le prezenta drept o rezolvare a problemei foametei), dar sunt privite, n schimb, cu nencredere de nenum rate alte ri i respinse cu vehemen de organiza iile ecologiste, devenind astfel un subiect foarte controversat. Unii speciali ti chiar au ajuns s defineasc , mai n glum , mai n serios, organismele modificate genetic ca o solu ie periculoas la o problem inexistent . Progresele realizate n ultimii ani n tiin i n tehnologie au avut un impact puternic asupra sectorului agricol i asupra celui alimentar din ntreaga lume. Metode novatoare de produc ie au revolu ionat i chiar au eliminat numeroase sisteme tradi ionale, afectnd capacitatea

:: barcelona :: belarus :: belgium :: belgrade :: bristol :: brussels :: bulgaria :: calabria :: croatia :: cyprus :: emilia-romagna :: estrecho / madiaq :: euskal herria :: galiza :: germany :: grenoble :: hungary :: ireland :: istanbul :: italy :: la plana :: liege :: liguria :: lille :: linksunten :: lombardia :: london :: madrid :: malta :: marseille :: nantes :: napoli :: netherlands :: nice :: northern england :: norway :: nottingham imc :: oost-vlaanderen :: paris/le-de-france :: patras :: piemonte :: poland

de producere a hranei pentru o popula ie aflat n expansiune continu . Aceste evenimente au generat numeroase schimb ri n economie i n organizarea social , dar i n gestiunea resurselor planetei. Mediul natural a fost bulversat de progresele tehnologice, care au permis nu doar ob inerea amelior rilor genetice prin selec ie, ci i crearea de noi combina ii genetice pentru a ob ine vegetale, animale i pe ti cu rezisten i productivitate teoretic mult mai mare. Biotehnologia modern ofer noi posibilit i de dezvoltare n sectoare foarte diverse, de la agricultur la produc ia farmaceutic , iar dezbaterile la nivel mondial asupra organismelor modificate genetic snt f r precedent n ultima perioad i au polarizat att aten ia oamenilor de tiin , ct i pe cea a produc torilor de bunuri alimentare, a consumatorilor, a grupurilor de ap rare a interesului public, a institu iilor publice i a factorilor de decizie. Punerea la punct a organismelor modificate genetic este ast zi, f r ndoial , un subiect care ridic numeroase probleme de etic referitoare la domeniul agriculturii i al alimenta iei. Plantele modificate genetic snt create prin utilizarea tehnicilor ingineriei genetice. n ultimii ani, al turi de metodele clasice de ncruci are a soiurilor sau de utilizare a ngr mintelor, au ap rut metode noi, care presupun folosirea unor tehnici specifice ingineriei genetice. Toate aceste plante nou create de c tre om nu exist n natur , iar impactul lor asupra mediului i asupra fiin ei umane nu este pe deplin cunoscut i scap cu totul sferei de control a speciali tilor. Defini ii ale organismelor modificate genetic: n legisla ia din Romnia privind regimul de ob inere, testare, utilizare i comercializare a organismelor modificate genetic, acestea snt definite ca reprezentnd orice organism, cu excep ia celui uman, al c rui material genetic a fost modificat altfel dect prin ncruci are i/sau recombinare natural sau orice entitate biologic capabil de reproducere sau de transferare de material genetic( definitie conform Legii nr. 214/2002). n Germania, organismele modificate genetic snt considerate acele organisme al c ror material genetic a fost modificat ntr-un mod care nu se reg se te n natur , n condi ii naturale sau de recombinare natural . Organismul modificat genetic trebuie s fie o unitate capabil de autoreplicare sau transmitere a materialului genetic. n Statele Unite, termenul de organism modificat genetic se refer la plante i la animale care con in gene transferate de la alte specii, pentru a ob ine anumite caractere, precum rezisten a la anumite pesticide i ierbicide. Transferul de gene apare i n agricultura conven ional , dar, spre deosebire de ingineria genetic , acesta are loc ntre indivizi apar innd aceleia i specii sau ntre specii nrudite. Marea diversitate a speciilor de plante i de animale existente ast zi atest faptul c ntotdeauna s-au

:: portugal :: roma :: romania :: russia :: sardegna :: scotland :: sverige :: switzerland :: torun :: toscana :: toulouse :: ukraine :: united kingdom :: valencia Latin America :: argentina :: bolivia :: chiapas :: chile :: chile sur :: cmi brasil :: cmi sucre :: colombia :: ecuador :: mexico :: peru :: puerto rico :: qollasuyu :: rosario :: santiago :: tijuana :: uruguay :: valparaiso :: venezuela Oceania :: aotearoa :: brisbane :: burma :: darwin :: jakarta

produs modific ri n zestrea genetic a acestora. ns , de notat, toate modific rile s-au produs treptat, n mod firesc, de-a lungul unor perioade foarte mari de timp i, un fapt care iar i trebuie re inut, de la sine, f r interven ia omului. Ingineria genetic este, deci, o nou tehnologie care implic manipularea genelor. Datorit limbajului universal al genelor (codul genetic), oamenii de tiin pot transfera gene ntre diferite specii care nu snt nrudite (animale, plante, microorganisme). De exemplu, genele unui pe te pot fi transferate la o plant de tomate sau la c p un pentru a le conferi rezisten sporit la temperaturi foarte sc zute. Plantele ob inute prin astfel de tehnici de inginerie snt for ate s produc substan ele chimice ale pe telui, tocmai datorit acestui limbaj universal, ele ajungnd s elaboreze, de pild , o substan pe care pe tii o produc, n mod normal, pentru a supravie ui n ap rece. Prin aceste noi tehnologii, au fost create numeroase plante modificate genetic, prezentate ca avnd o importan major n alimenta ie, cum snt porumbul i cartofii rezisten i la insecte, fasolea i soia tolerante la glifosat (pesticid foarte toxic), ro iile cu coacere ntrziat i cu con inut ridicat de substan solid . Ct de s n toase snt pentru consum este o alt problem . n ultima perioad , au fost create i organisme modificate genetic n scop nutri ional. Dac plantele transgenice realizate n scop tehnologic constituie prima genera ie de alimente modificate genetic, modific rile genetice care vizeaz mbun t irea calit ii nutritive a alimentelor se constituie n a doua genera ie de astfel de produse. n cadrul acestei noi genera ii de OMG se includ uleiurile a c ror compozi ie a fost modificat n vederea mbun t irii raportului ntre acizii gra i satura i i cei nesatura i, orezul auriu, cu un con inut mult mai ridicat de provitamina A, amidonul cu propor ia dintre amiloz i amilopectin modificat n vederea cre terii capacit ii de gelificare etc. Speciali tii apreciaz c , prin utlizarea tehnicilor de inginerie genetic , se altereaz grav hotarele pe care speciile le-au stabilit n mod firesc ntre ele de-a lungul evolu iei. n opinia unora, combinarea genelor speciilor care nu se nrudesc, prin modificarea permanent a codului genetic, este foarte posibil ca noile organisme create s transmit urma ilor, prin ereditate, schimb rile genetice induse. Mul i exper i se tem, nu f r argumente, c ingineria genetic va genera pierderea biodiversit ii, nl turnd barierele care au protejat integritatea speciilor de-a lungul timpului. Studii efectuate de ace tia demonstreaz c introducerea masiv i iresponsabil n circuitul agricol a plantelor modificate genetic sau transgenice, rezistente la ierbicide, va conduce, treptat, la dispari ia unor vie uitoare care se hr nesc cu semin ele provenite de la ierburi i buruieni. n ultimele decenii, nr ut irea condi iilor pedoclimatice, diminuarea progresiv a resurselor naturale i explozia demografic au justificat

:: manila :: melbourne :: perth :: qc :: sydney South Asia :: india :: mumbai United States :: arizona :: arkansas :: asheville :: atlanta :: austin :: austin indymedia :: baltimore :: big muddy :: binghamton :: boston :: buffalo :: charlottesville :: chicago :: cleveland :: colorado :: columbus :: dc :: hawaii :: houston :: hudson mohawk :: kansas city :: la :: madison :: maine :: miami :: michigan :: milwaukee :: minneapolis/st. paul :: new hampshire :: new jersey :: new mexico

c utarea unor solu ii de diversificare a raselor de animale i a soiurilor de plante, de sporire a productivit ii culturilor prin cre terea rezisten ei la d un tori i la condi ii de mediu neprielnice (frig, secet , soluri s race etc.), de modificare n sens favorabil a compozi iei chimice. Solu iile s-au concretizat n aplicarea unor procedee pe ct de necontrolate, pe att de tiin ifice de modificare a zestrei genetice. Prin tehnicile de inginerie genetic , materialul genetic de interes este transferat de la organismul donor la cel acceptor, n scopul ob inerii de organisme cu caracteristici noi, utile. Aceste tehnici sunt: tehnici de recombinare a acizilor nucleici, care implic formarea de noi combina ii ale materialului genetic, prin inser ia moleculelor de acizi nucleici (ob inute prin diferite tehnici n afara unui organism) ntr-un virus, o bacterie sau alt sistem vector i ncorporarea acestora ntr-un organism gazd , n care nu exist n mod normal, dar care este capabil s continue propagarea; tehnici care implic introducerea direct ntr-un microorganism a materialului ereditar preparat n afara microorganismului; tehnici de fuziune celular sau tehnici de hibridizare, n care celulele vii cu noi combina ii de material genetic ereditar sunt formate prin fuziunea a dou sau mai multe celule, prin metode care nu au loc n mod natural. Sus in torii tehnicilor de modificare genetic afirm c utilizarea acestora aduce numeroase avantaje, ns aceasta se petrece mai ales pentru produc torii i comercian ii de plante transgenice: reducerea costurilor, deoarece nu mai este necesar tratarea culturilor cu ngr minte chimice; consumatorii pot fi ns p gubi i prin efectele pe termen lung ale aliment rii cu produse ob inute din aceste culturi. cre terea rezisten ei la ac iunea d un torilor; nimeni nu a putut ns documenta pe termen lung fenomenul, mpreun cu implica iile sale asupra lan ului trofic. ob inerea unor sporuri importante ale recoltelor; ntrebarea este, ns , dac nu cumva lipsurile cantitative snt de preferat prejudiciilor cauzate de impunerea plantelor modificate genetic. mbun t irea caracteristicilor organoleptice ale produselor (gust, culoare, form ); aceast muta ie for at aduce un c tig aparent, n raport cu ni te pierderi sigure. prelungirea termenului de valabilitate a produselor, prin cre terea rezisten ei la p strare; profitul este, n realitate, al produc torilor. Astfel, n teorie totul sun minunat: plantele transgenice nu mai trebuie tratate cu substan e chimice, ele fiind rezistente la ac iunea d un torilor; n acest fel, se ob in sporuri importante ale recoltelor, dar i produse care nu snt toxice, ele nefiind tratate chimic. Pe de alt parte, n ameliorarea clasic , prin diverse ncruci ri i hibrid ri, transferul genelor are loc n cadrul unui proces natural, ce dureaz ani mul i, n timp ce prin tehnicile de inginerie genetic , transferul genelor se face artificial, direct, rezultatul fiind doar aparent acela i.

:: new orleans :: north carolina :: north texas :: nyc :: oklahoma :: philadelphia :: pittsburgh :: portland :: richmond :: rochester :: rogue valley :: saint louis :: san diego :: san francisco :: san francisco bay area :: santa barbara :: santa cruz, ca :: sarasota :: seattle :: tampa bay :: tennessee :: united states :: urbana-champaign :: vermont :: western mass :: worcester West Asia :: armenia :: beirut :: israel :: palestine Topics :: biotech Process :: fbi/legal updates :: mailing lists :: process & imc docs :: tech

Exist o serie de ntreb ri pe care fiecare dintre noi ar trebui s i le pun : A mnca produse ce con in sau provin din Organisme Modificate Genetic (OMG)? Dar, astfel de medicamente, a utiliza? Ce a face dac ar fi mult mai ieftine dect produsele tratate chimic, pe care le accept, sau dect cele naturale? Am ncredere n opinia celor care fac cercetare tiintific i care evalueaz - cu metodele lor - beneficiile sau riscurile mele atunci cnd eu consum produse ce con in OMG? mi este suficient s cunosc opinia cercet rii pentru a consuma? Este bine s fie aloca i bani publici pentru cercetare n domeniul OMG i al biotehnologiilor? Dar bani priva i? Este necesar ca produc torii s solicite aprobare, de la o autoritate public , nainte de a introduce pe pia produse ce con in OMG? Etichetele produselor m informeaz suficient? Produc torii care nu pun etichete, mi iau ei, astfel, dreptul meu de a alege produse numai n cuno tin a de cauza? Exist sprijin public suficient pentru ca produc torii romni, ntreprinderile romne ti - n special, cele mici i mijlocii - s transfere, rapid, n productie, rezultatele activit ii de cercetare tiin ific din domeniul tiin elor vie ii, al biotehnologiilor, astfel nct s creasc competitivitatea acestor firme pe pie e globale, asa cum se ntmpl n rile dezvoltate? Sunt interesele mele de consumator suficient de bine ap rate prin legile i institu iile existente? Sunt dispus s -mi ap r mai bine interesele prin implicarea mea ntr-o asocia ie a consumatorilor? Sunt de acord s nasc un copil pe care, mai nti, l-am supus unei modific ri genetice? Vreau s fiu proprietarul mo tenirii mele genetice? Sunt de acord s fiu clonat f r a fi ntrebat? Credin ele mele mi permit s fiu de acord s fac omul modific ri n structura genetic a organismelor vii?

CAP. I. Organisme modificate genetic 1.1. Mic istoric al cercet rilor OMG-urilor

:: volunteer

De cnd practic agricultura i cre terea animalelor, omul a fost mereu interesat s adapteze, tot mai bine, plantele cultivate i animalele domestice la nevoile sale. Pn la apari ia geniului genetic, aceste amelior ri s-au realizat prin selec ia indivizilor care prezentau caracteristici morfologice sau fiziologice interesante(ap rute prin muta ii spontane) i prin sistemul ncruci are- selec ie a hibrizilor dintre soiurile sau rasele aceleia i specii. La animale, ncruci rile ntre specii diferite s-au dovedit a fi dificile i nu au reu it dect ntre speciile foarte apropiate, dnd na tere la hibrizi incapabili de a se reproduce; catrca, pb inut din ncruci area m garului cu iapa, fiind foarte rar fertil , iar cat rul este ntotdeauna steril. La plante, hibrizii ap ru i prin ncruci ri naturale4 sau artificiale ntre spewcii apropiate sunt, n general sterile, dar fertilitatea lor poate fi, n anumite cazuri, restaurat prin poliploidizare natural sau artificial . Ca exemplu cazul de la Triticale, hibrid artificial ntre grul tare(Triticum durum) i secar (Secale ereale).la plantele care se nmul esc n principal pe cale vegetativ , simpla selec ie a mutantelor spontane a contribuit, de asemenea, la sporirea biodiversit ii plantelor cultivate. Prin suprimarea barierelor naturale, care, pn n prezent, mpiedicau schimburile de gene ntre specii i regnuri diferite, geniul genetic permite crearea de organisme transgenice, dotate cu propriet i noi, total necunoscute nainte i ntr-un timp scurt(un deceniu), f r nici o rela ie cu ritmul multimilenar al evolu iei fiin elor vii. Tehnicile transgenezei confer astfel omului puterea cvasinelimitat (cel pu in teoretic) de a modifica patrimoniul ereditar al tuturor fiin elor care-l nconjoar , inclusiv al propriei sale specii. Este vorba, a adar, de o veritabil revolu ie biologic . ncepnd cu sfrsitul anilor 1970, interesul industriilor s-a ndeptat mai cu seam spre microorganismele utilizate n sectoarele alimentare i farmaceutice: i Transferarea genei interferonului(localizat pe perechea a cincea de cromozomi) n plasmide de Escherichia coli care, in vitro, producea interferon uman, de corca 200 ori mai ieftin dect cel ob inut prin extragerea lui din sngele omului; i Ob inerea unei bacterii care produce un ndulcitor, thaumatina, mult mai puternic dect zah rul i al c rei transgen provine de la un arbore din Africa Occidental (Thaumatococcus danielii, fam. Scitaminaceae). n 1978 are loc ob inerea unei bacterii transgenice (Escherichia coli) care sintetizeaz insulin uman , ca urmare a transferului de gene umane care codific aceasta protein . Din 1979 ncepe comercializarea bacteriei de Escherichia coli i producearea industrial a insulinei n bioreactoare. De asemenea, pornind tot de la aceast bacterie s-a ajuns la ob inerea hormonului de cre tere, a interleuchinei cu rol anticancerigen. Primele experien e n vederea ob inerii de animale transgenice au fost realizate de R. Palmiter i R. Brinster (1982), cercet tori americani (de

la Universit ile din Seattle, Philadelphia i San Diego) care au reu it transferul genei hormonului de cre tere (somatotropina) de la obolan la oarece. Gena respectiv a fost prima oar clonat n bacterii pentru ob inerea ei n cantit i mari. 1983 este anul n care se ob ine prima plant transgenic , un tutun rezistent la un antibiotic, datorit transferului unui fragment de plasmic bacterian care codific aceast proprietate. De i lipsit de valoare agricol , acest tutun a conferit realizatorului s u(prof. Van Montagu, Universitatea din Gand, Belgia) calitatea de pionier al transgenezei vegetale n Europa. O alt bacterie transgenetic ce merit de asemenea a fi men ionat este Pseudomonas syringae, ntruct a fost primul OMG diseminat n mod voluntar n mediul nconjur tor(n SUA, n anii 1983-1984), f r a se lua n considerare eventualele riscuri ecologice. Ob inerea unor produse farmaceutice, prin utilizarea unor microorganisme, a nceput odat cu izolarea gramicidinei(1939, de c tre R. Dubos) dintr-o bacterie edafic (din sol), Bacillus brevis, care ,,hr nit cu pneumococi, stafilococi i streptococi s-a dovedit a avea capacitatea de a ,, a digera ace ti agen i patogeni. Perioada 1980-1990 reprezint etapa primelor tentative, mai nti n SUA, apoi i n Europa, pentru aplicarea transgenezei n terapiile umane, fie pentru a lupta mpotriva unor maladii genetice (muscoviscidoz , miopatia Duchenne), fie mpotriva diverselor tipuri de cancer. 1986- reprezint premiera mondiala pentru cultura experimental , n cmp, a unei plante transgenice(n Belgia). ncepnd cu acest moment se constat extinderea parcelelor experimentale i cre terea num rului speciilor de plante transgenice aproape peste tot n lume. Comercializarea primelor plante modificate genetic ncepe n SUA n anul 1994. n 1996 ncep transporturile de containere cu soia i porumb transgenic din SUA c tre diferite porturi ale Europei; explozia de culturi comerciale cu plante transgenice n SUA, Canada i Argentina. 1.2. Plantele transgenice i noile lor propriet i Sunt relativ pu ine lucr ri care abordeaz , n mod critic, problema metodelor utilizate pentru transformarea genetic a plantelor (Potrykus, 1991), respectiv a mecanismelor biologice care permit transferul i integrarea unui fragment de ADN str in ntr-o celul vegetal int . In numeroase laboratoare s-a reu it transformarea genetic a diferitelor specii de plante, fie ele plante model cum ar fi tutunul (Nicotiana tabacum) sau petunia (Petunia hybrida), sau dimpotriv plante considerate recalcitrante dar de un mare interes economic, cum ar fi soia sau unele cereale. Pentru o anumit specie de plante poate fi aplicat eficient o metod de transformare genetic , sau mai multe.

Pentru o specie cum ar fi Arabidopsis thaliana, specie model pentru cercet rile de genetic molecular , al c rui genom a fost deja cartat n ntregime, se pot aplica cu succes, n func ie de scopul urm rit, mai multe metode de transformare genetic : transformarea semin elor, a explantelor radiculare sau chiar a inflorescen elor in planta, cu ajutorul vectorului Agrobacterium tumefaciens, transformarea direct a protoplastelor, metoda biolistic sau microinjectarea. Din p cate, ns , nu se pot aplica cu aceea i eficien diferite metode la specii considerate recalcitrante, iar celulele int pentru transformare nu sunt ntotdeauna cele care posed totipoten ialitate i deci pot regenera plante ntregi. Mai mult, eficien a transform rii este dependent nu numai de specie, dar chiar i de genotip. De aceea, g sirea unei metode general aplicabile care s permit transformarea eficient i de rutin a tuturor genotipurilor i speciilor de plante dorite de experimentatori, r mne un obiectiv al cercet rii din acest domeniu. Metodele de transformare pot fi clasificate n metode indirecte, bazate pe utilizarea unor vectori de ADN, i metode directe.

1.2.1. Principalele metode utilizate pentru transformarea celulelor vegetale: i METODE INDIRECTE TRANSFORMAREA MEDIATA 1. Transformarea mediat de bacterii: Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes 2. Transformarea mediat de virusuri i METODE DIRECTE o Transformarea protoplastelor o Metoda biolistics mpu carea direct a ADN n celule o Electroporarea o Electroforeza i Metode indirecte de transformare a plantelor. Z Transformarea mediat de Agrobacterium (fig. 1) Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes realizez ceea ce adeseori s-a numit inginerie genetic natural . Aceaste bacterii sunt capabile s transfere n esutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (tumor inducing) n cazul speciei A. tumefaciens sau R