1

Raport stiintific

privind implementarea proiectului Cod PN-II-ID-PCE-2012-4-0488 cu titlul:

ACTIVAREA REDOX A MOLECULELOR MICI DE CATRE CENTRI METALICI CU RELEVANȚĂ BIOLOGICA

Obiectivele proiectului au fost clarificarea mecanismelor unor enzime precum clorit dismutaza, sulfit

reductaza, enzime dependente de cobalamină, dar şi a mecanismelor de interacţiune în sisteme model, cu

oxianioni de sulf, clor şi, pentru comparaţie, carbon şi azot. Aceste urmau a fi ilustrate prin metode

spectroscopice (inclusiv de temperaturi joase), cinetice (inclusiv în domeniul milisecundelor), şi de

modelare moleculară, şi a se concretiza în cel puţin 6 publicaţii şi cel puţin 15 puncte de impact cf.

Thmoson-Reuters ISI. Obiectivele au fost atinse în intregime prin realizarea activităților propuse numărul

lucrărilor publicate se încadrează în previziuni (circa 30, cu o sumă a facorilor de impact apropiată de 70,

depășind numărul depășin de cca 5 ori ținta propusă inițial și având în plus încă în stadiu de manuscrise o

serie de contribuții antyicipate a fi și ele de impact). Lista publicațiilor este:

A. Attia, R. Silaghi-Dumitrescu. J. Phys. Chem. B, 2014, 118(42), 12140-5 . – descrie activarea hidroxilaminei

la centri heminici

A. Attia, R. Silaghi-Dumitrescu. Eur. J. Inorg. Chem., 2014, DOI: 10.1002/ejic.201402385. –descrie

reactivitatea centrilor supra-redusi de fier, cu oxizi de azot

M. Surducan, S.V. Makarov, R. Silaghi-Dumitrescu. Eur. J. Inorg. Chem., 2014, DOI: 10.1002/ejic.201402657

– descrie bariere de activare si izomerie de legatura in oxizi si oxianioni de sulf la centri heminici

R. Silaghi-Dumitrescu, D.A. Svistunenko, D. Cioloboc, C. Bischin, F. Scurtu, C:E: Cooper. Nitric Oxide – Biol.

Chem., 2014, 42C, 32-39 – descrie izomeria redox si reducerea azotitului la centri heminici

D. Hathazi, S. Mahuţ, F. Scurtu, C. Bischin, C. Stanciu, A. Attia, G. Damian, R. Silaghi-Dumitrescu. J. Biol.

Inorg. Chem., 2014, 19, (7), 1233-1239. DOI: 10.1007/s00775-014-1181-y – descrie un nou oxianion de azot

ca potential ligand la un centru heminic

S.V. Makarov, A.K. Horváth, R. Silaghi-Dumitrescu, Q. Gao. Chem. – Eur. J., 2014, 20(44), 14164–14176.

DOI: 10.1002/chem.201403453 – featured online by the journal – review asupra reactivitatii agentilor

disponibili pentru suprareducerea centrilor biologici metalici

A. Attia, S.V. Makarov, A.F. Vanin, R. Silaghi-Dumitrescu. Inorg. Chim. Acta, 2014, 418, 42-50 – descrie

asimetria în complecsi relevanti biologici ai fierului cu liganzi pe baza de sulf, azot si oxigen

M. Surducan, S.V. Makarov, R. Silaghi-Dumitrescu. Polyhedron, 2014, 78, 72-84 – descrie izomerie redox si

de legatura in derivati din clasa cobalaminelor

A. Attia, R. Silaghi-Dumitrescu. Int. J. Quant. Chem., 2014, 14(10), 652-665 descrie izomerie de legatura in

complecsi de fier cu peroxinitrit

2

D. Hathazi, A.C. Mot, A. Vaida, F. Scurtu, I. Lupan, E. Fischer-Fodor, G. Damian, D.M. Kurtz, Jr., R. Silaghi-

Dumitrescu. Biomacromolecules, 2014, 15(5), 1920-1927 – aplicatii practice ale reactiilor redox la

hemoproteine

A.A. Attia, A. Lupan, R.B. King, Polyhedron. 2015, 85, 933-940; doi:10.1016/j.poly.2014.10.005 – complecsi

de cobalt cu liganzi pe baza de fosfor, bor si hidrogen

A. Lupan, R.B. King, Inorg. Chem. Commun. 2015, 51, 40-41; doi: 10.1016/j.inoche.2014.11.003 – clusteri

de molibden implicati in cai sintetice ce implica anioni tricarbolidici

A.M.V. Branzanic, A. Lupan, R.B. King. Organometallics, 2014, 33, 6443-6451; doi: 10.1021/om500801e –

complecsi ai unei serii de metale tranzitionale cu liganzi pe baza de bor si hidrogen

A. Lupan, R.B. King. Polyhedron, 2014, 78, 130-134; doi: 10.1016/j.poly.2014.04.041– complecsi de cobalt

cu liganzi pe baza de sulf, bor si hidrogen

A. Lupan, R.B. King. J. Organomet. Chem., 2014, 754, 94-103; doi: 10.1016/j.jorganchem.2013.12.045 –

complecsi de Mo si W cu liganzi pe baza de bor si hidrogen

A. Lupan, R.B. King. Polyhedron, 2014, 71, 133-141; doi: 10.1016/j.poly.2014.01.010 – clusteri de metale

tranzitionale

Dereven’kov, Ilia A.; Salnikov, Denis S.; Silaghi-Dumitrescu, Radu Makarov, Sergei V.; Koiffman, Oscar I.

Redox chemistry of cobalamin and its derivatives. Coordination Chemistry Reviews, DOI

10.1016/j.ccr.2015.11.001 – cu un accent semnificativ pe reactivitatea față de derivați de sulf (fie redox, fie

de formare de complecși)

Kakes, Melinda; Cioloboc, Daniela; Tomsa, Adrian-Raul; Silaghi-Dumitrescu, Radu; Damian Grigore. Redox

And Ligand Binding Reactivity In Iron And Chromium –Substituted Polyoxometalates. Revue Roumaine de

Chimie, 2015, 60(7-8), 707-720 – în căutarea unor procese biomimetice în polioxometalați, inclusiv a

detectării de potențiali complecși cu agenți redox, inclusiv pe bază de sulf

Silaghi-Dumitrescu, Radu; Scurtu, Florina; Mason, Maria; Svistunenko, Dimitri A.; Wilson, Michael T.;

Cooper, Chris E. The reaction of oxyhemoglobin with nitric oxide: EPR evidence for an iron(III)-nitrate

intermediate. Inorganică Chimică Acta, 2015, 436, 179–183 – lămurirea unui mecanism de activare a

oxianionilor în globine

Attia, Amr A. A.; Silaghi-Dumitrescu, Radu. Bacterial nitric oxide reductase: A mechanism revisited by an

ONIOM (DFT:MM) study. Journal of Molecular Modeling, 2015, 21, 130-142 – un studiu implicând activarea

oxianionilor la centri de fier în proteine membranare

Attia, Amr A. A.; Dereven’kov, Ilia A.; Silaghi-Dumitrescu, Radu. Ruthenium dinitrosyl complexes –

computational characterization of structure and reactivity. Journal of Coordination Chemistry, 2015,

68(14), 2409-2422. DOI:10.1080/00958972.2015.1041936 – complecși pe bază de sulf și oxizi/oxianioni de

azot

3

Lakk-Bogáth, Dóra; Speier, Gábor; Surducan, Mihai; Silaghi-Dumitrescu, Radu; Simaan, A. Jalila; Faure,

Bruno; Kaizer, József. Comparison of heme and nonheme iron-based 1-aminocyclopropane-1-carboxylic

acid oxidase mimics: kinetic, mechanistic and computational studies. RSC Advances, 2015, 5, 2075–2079 –

investigare computațională a căilor de activare implicând centri de valență înaltă

Silaghi-Dumitrescu, Radu; Carrascoza Mayen, Juan Francisco. A twist in the anomeric effect. Studia

Universitatis Babeș-Bolyai Seria Chemia 2014, LIX(3), 95-101 – considerații asupra structurii electronice în

combinațiile simple ale oxigenului și sulfului

A. M. V. Brânzanic, A.Lupan, R. B. King, Dalton Trans. 2015, 44, 7355-7363, doi : 10.1039/C5DT00143A -

izomerie de legatura si geometrica la centri bimetalici

A. M. V. Brânzanic, A.Lupan, R. B. King, J. Organomet. Chem. 2015, 792, 74-80, doi:

10.1016/j.jorganchem.2015.02.030 - izomerie de legatura si geometrica in complecsi ai nemetalelor cu

molibden, wolfram, ruteniu, reniu, osmiu și iridiu

A.Lupan, R. B. King, Inorg. Chem. Comm. 2015, 51, 40-41, doi: 10.1016/j.inoche.2014.11.003 - centri de

molibden și activarea unor liganzi de bor la aceștia, în scopul identificării de noi căi sintetice și în contextul

izomeriei de legătură

A.Lupan, R. B. King, J. Comp. Chem. 2015, acceptat, doi: 10.1002/jcc.23995, - complecsi de molibden cu

nemetale – aspect de izomerie de legatura si geometrica

A.A.A. Attia, A.Lupan, R. B. King, RCS Adv. 2015, 70, 56885-56890, doi: 10.1039/C5RA09849A - complecsi

ai cobaltului cu azot si alte nemetale, prezetand structuri electronice neobisnuite

A.A.A. Attia, A.Lupan, R. B. King, J. Organomet. Chem. 2015, acceptat, 10.1016/j.jorganchem.2015.04.010

– complecsi dimetalici de cobalt, cu nemetale – structure electronice neobisnuite si aspect de izomerie

geometrica si de legatura

A.Lupan, R. B. King, J. Comp. Chem. 2015, in press, doi: 10.1002/jcc.23995

A.A.A. Attia, A.Lupan, R. B. King, RCS Adv. 2015, 70 5, 56885-56890, doi: 10.1039/C5RA09849A

A.A.A. Attia, A.Lupan, R. B. King, J. Organomet. Chem. 2015, in press, 10.1016/j.jorganchem.2015.04.010

Ciprian Coşar, Amr A.A. Attia, Alexandru Lupan, R. Bruce King. Journal of Organometallic Chemistry2017,

827, 105–111 - izomerie de legătură

A.A.A. Attia; D. Cioloboc; A. Lupan, R. Silaghi-Dumitrescu. Journal of Inorganic Biochemistry, 165, 49-53,

2016 – izomerie redox și de legătură în sisteme metal-dioxigenice

Attia, Amr A. A.; Silaghi-Dumitrescu, Radu. Journal of Molecular Graphics and Modelling, 2016, 69, 103-110

Szávuly, Miklós István; Surducan, Mihai; Nagy, Emőke; Surányi, Mátyás; Speier, Gábor; Silaghi-Dumitrescu,

Radu; Kaizer, József. Dalton Transactions, 2016, 45, 14709-14718 – activare molecule mici la centru de fier

bioanorganici; izomerie de legătură și reactivitate spin-dependentă

4

La aceste articole se adaugă, neprevzut în planul de lucru, un capitol de carte într-o prestigioasă serie -

Sergei V. Makarov, Anna S. Makarova, Radu Silaghi-Dumitrescu, „Sulfoxylates”, in 'The Chemistry of

Peroxides' - Patai's Chemistry of Functional Groups, 2014. DOI: 10.1002/9780470682531.pat0829 și o

carte, Sergei V Makarov, Attila K Horvath, Radu Silaghi-Dumitrescu, Qingyu Gao. Sodium Dithionite,

Rongalite and Thiourea Oxides, World Scientific, London, 2016, ISBN: 978-1-78634-095-5.

Manuscrisele în lucru includ:

C. Bischin, D. Hathazi, G. Damian, R. Silaghi-Dumitrescu - Chlorite reactivity with myoglobin: analogy with

peroxide and nitrite chemistry, Journal of Biological Inorganic Chemistry, submitted

C. Bischin, A. Mot, R. Silaghi-Dumitrescu, Sulfide reactivity towards globins: in quest of a putative Fe(IV)-

sulfide intermediate, Journal of Biological Inorganic Chemistry, submitted

R. Silaghi-Dumitrescu, A. Attia et al. Peroxo-Transition Metal Systems: Examples of Electromerism in

Palladium Structures

A. Attia, R. Silaghi-Dumitrescu. A quantum chemical study on the reaction mechanism of nickel cysteine

dioxygenase.

F. Scurtu, C. Bischin, R. Silaghi-Dumitrescu et al. The reaction of oxy hemoglobin with nitrite, Journal of

Biological Inorganic Chemistry, submitted

F. Carrascoza, M. Surducan, A. Kun, R. Silaghi-Dumitrescu – Bleomycin reaction mechanisms

C. Bischin, L. Gaina, R. Septelean, A.C. Mot, R. Silaghi-Dumitrescu et al – TBA

A.A. Attia, D. Cioloboc, R. Silaghi-Dumitrescu – Chlorite dismutase – a hemoprotein with a catalytic

mechanism focused on higher-spin states

A. Branzanic, U. Ryde, R. Silaghi-Dumitrescu - High-valent heme-sulfide adducts in sulfite reductase

A. Branzanic, U. Ryde, R. Silaghi-Dumitrescu – Iron-sulfur cluster effects on linkage and redox isomerism in

sulfite reductase reactive intermediates

A. Branzanic, U. Ryde, R. Silaghi-Dumitrescu – Accurate computational description of the resting state in

sulfite reductase: importance of the heme / iron-sulfur cluster coupling

A. Attia, R. Silaghi-Dumitrescu – Nitrogen activation at low-valent metal centers: what makes a good

nitrogenase

M. Surducan, R. Silaghi-Dumitrescu – Linkage and isomerism in heme-SO adducts

La acestea se adauga participari la conferinte internationale de speecialitate – conferinta eurpeana

de chimie bioanorganica EUROBIC (Zurich, Budapesta), ICBIC (Beijing), conferinta societatilor europene de

chimie EUCHEMS, conferinta internationala dedicata proteinelor transportoare de oxigen (O2BiP, Sheffield,

Hamburg), colocviul european de mecanisme de reactie anorgabice (DCIRM, Debrecen), conferintele

5

nationale anuale sau bienale cu participare internationala de specialitate (chimie, biochimie și respectiv

modelare moleculară), și altele. Din alte resurse, colectivul a fost reprezentat și la conferința internațională

de chimie teoretică, WATOC.

Toți membrii colectivului au participat la manuscrisele aflate în lucru sau publicate. Pe lîngă aceștia,

un număr de studenți masteranzi sau de nivel licență au fost angrenați în experimente, o parte regăsindu-

se pe listele de autori prezentate mai sus (ex., Hathazi, Vaida, Stanciu, Mahut). În total, publicațiile

susținute de către acest proiect de cercetare au însumat până acum circa 70 de puncte de factor de

impact, inclusiv un review în prestigioasa revistă Coordination Chemistry Reviews și un capitol de carte în

prestigioasa serie Patai's. Credem de aceea că se poate argumenta că fondurile folosite în proiect au dat

rezultate rezonabile, cu atât mai mult dacă luăm în considerare contextul impredictibil și disfuncțional al

cercetării din această parte a Europei. Nu în ultimul rând, un corp serios de date rămâne încă în lucru

pentru manuscrise viitoare. O parte din acest corp este sumarizat în cele de mai jos.

Caracterizarea complecșilor su sulfura.

La adăugarea sulfurii de o concentrație 16 µM într-o concentrație de 6 µM de metHb s-au observat

schimbări majore. În urma reacției urmărite timp de 20 min, maximul metHb de pe banda Soret se

deplasează de la 405 la 430 nm, iar cele din zona vizibilă, 500 respectiv 631 nm se deplasează la 542 și 574

nm, caracteristici ce nu corespund nici unui tip de compus dintre cei discutați până acum (Figura 1).

Figura 1. Spectrul UV-vis al reacției metHb (6 µM) cu sulfură (16 µM) timp de 20 min, soluție tampon fosfat pH 7.

În scopul unei analize mai detaliate și a detecției unor posibile specii intermediare, cât și pentru

determinarea parametrilor cinetici ai acestei reacții, s-a utilizat tehnica Stopped-Flow. Fiindcă această

tehnică este folosită pentru procese ce au loc într-un timp foarte scurt, studiul s-a putut realiza pe

concentrații de 10 ori mai mari ale sulfurii cât și a metHb față de concentrațiile folosite la analiza realizată

cu spectroscopia UV-vis.

6

Astfel, în Figura 2 se poate observa spectrul obținut în urma reacției dintre methemoglobină și

sulfură studiată prin tehnica Stopped-Flow. Pe baza acestei metode am putut determina tipul de reacție;

rezultatele experimentale s-au putut fita bine pentru prima parte a reacției după modelul simplu A B,

unde specia A este forma met a hemoglobinei care se consumă și se acumulează specia B, pe care o

presupunem a fi aductul Fe(III)-sulfură.

Figura 2. Stânga: Spectrele UV-vis obținute în primele 2,4 minute după amestecarea met hemoglobinei (50 uM) cu sulfură (160 uM). Dreapta: Cele două specii simulate pe baza modelului teoretic A>B, propus

pentru reacția dintre hemoglobină și sulfură.

În Figura 3este reprezentat spectrul RES pentru o probă control cu metHb (negru) și reacția metHb

cu sulfură (roșu). Așa cum se știe din literatură, met hemoglobina prezintă un semnal în zona caracteristică

fierului de spin înalt (1000-1400 G), cu un factor g de ~6, aceasta sugerând existența unei specii cu 5

electroni neîmperecheați. În urma reacției cu sulfura se observă dispariția semnalului pentru fierul de spin

înalt și apariția unuia în zona caracteristică pentru fier de spin jos (2500-4000 G) – aparent un semnal de tip

rombic ale cărei componente au valori g de 2.52, 2.28 și 1.87, similare cu cele raportate în literatura pentru

globinele din Lucina pectinata si pentru mioglobina. După știința noastră spectrul aductului

hemoglobinelor din vertebtrate cu sulfura nu a fost până acum descris în literatură.

7

Figura 3. Spectrul RES al Hb (negru) și al reacției Hb cu Na2S (roșu)

O dovadă suplimentară că într-adevr compusul observat este un aduct feric-sulfură poate veni pe

baza faptului că acesta în mediu de peroxid formează sulfhem, unde atomul de sulf este inserat în

componența porfirinei, într-un nucleu pirolic. Banda caracteristică acestuia este într-adevăr observabilă în

Figura 3, la adăugarea de peroxid și sulfură, în acestă ordine, la hemoglobină. Dacă peroxidul este însă

adăugat după sulfură, reacția nu mai are loc, ceea ce sugerează o legare foarte eficientă a sulfurii la hem

(datele de titrare indicând o afinitate sub 10 μM).

Figura 3. Spectrul UV-vis al reacției metHb (6 µM) cu H2O2 (160 µM) și Na2S (16 µM), soluție tampon fosfat pH 7.4

S-a studiat și reacția methemoglobinei în prezența lipozomilor, cu sulfit și respectiv sulfură, cu

scopul de a observa dacă aceștia produc modificări în oxidarea lipidică. În Figura 4 se observă, la

lungimea de undă caracteristică oxidării lipidelor (240 nm), cinetica probei control ce conține doar

metHb și lipozomi în comparație cu probele în care s-a adăugat sulfit și sulfură. Rezultatele indică faptul

8

că nu există un decalaj între timpii de inducere a oxidării lipidelor (o perioadă de lag diferită), dar apar

diferențe în ceea ce privește cantitatea de lipide oxidate. Astfel, sulfitul și sulfura se dovedesc a fi

inhibitori ai acestei reacții.

Figura 4. Oxidarea lipidelor de către metHb (6 µM) în prezența sulfitului (500 µM) și a sulfurii (16 µM) la 240 nm (la lungimea de undă specifică oxidării lipidelor), 500 min, soluție tampon fosfat pH 7.4

Figura 5 ilustrează și o parte din rezultatele legate de halogenuri. Astfel, reacția formei oxi a

globinelor cu cloritul pare să duc la un nou tip de ligand din clasa oxianionilor de clor. Procese similare au

fost observate de noi și în reacii ale hipocloritului, și urmează să fie detaliate.

9

Figura 5. Experimente stopped-flow ilustrând reacția oxi hemoglobinei cu cloritul. A) spectre UV-vis colectate în primele 2.4 s după amestecarea oxy-Mb (10 µM) cu clorit (533 mM); dreapta: oxy-Mb (50 µM) + clorit (880 mM), în fosfat (100 mM), pH 7. B) Stânga: spectre simulate pentru modelul AB: oxy-Mb-50 µM; clorit-880 mM; dreapta: curbele experimentașă și teoretică la 580 nm. În reprezentare schematic se

arată mecanismul propus pentru reacție.

Figura 6 prezintă un sumar al ciclului catalitic al clorit dismutazei, obținut din calcule DFT.

10

Figura 6. Evolutia ciclului catalitic al clorit dosmutazei, dedusa pân acum din calculele noastre M06-2x/6-31G**; axa vertical este în kcal/mol. Rezultate comparabile, în curs de finalizare, a furnizat și funcționala

M06L.

Figura 7 ilustrează o parte din eforturile în direcția explorării reactivității altor halogeni – mai exact, a

mecanismului catalitic al enzimei TPO, responsabilă, prin mecanisme încă aflate în dezbatere, de reacții de

halogenare (iodurare).

Figura 7. Date DFT (M06L/6-31G**) asupra activării legăturii O-I într-un model heminic al situsului catalitic al tiroid peroxidazei (Fe(III), cu imidazol coordinat trans față de OI-), ca prim pas în setul de reacții ce duce

la reacții de halogenare relevante fiziologic.

11

Reacția hemoproteinelor cu sulfitul (SO3-)

Posibila interacțiune dintre hemoglobină/mioglobină si sulfit a fost studiată la trei pH-uri (pH 5, 7 si 11),

pentru cele trei forme ale proteinelor: forma met, oxi sau deoxi. În nici unul din cazuri, nu s-a observat

vreo modificare a spectrului UV-vis în timp, aceasta sugerând faptul că accesul sulfitului la fierul heminic nu

este posibil în cazul acestor două proteine, sau ca eventualul aduct are semnatura spectroscopica imposibil

de distins fata de cel al apei.

Figura 8. Spectrele UV-vis ale met-hemoglobinei (A) și a deoxi-hemoglobinei (B) colectate după amestecarea acestora cu 200 mM sulfit de sodiu.

Accesibilitatea sulfitului la hemul heminic a fost studiat și în cazul altei proteine heminice-peroxidaza din

hrean. După cum se poate observa din Figura 9, nici în acest caz nu s-a evidențiat prezența vreunui

intermediar sau produs de reacție cu spectru clar individualizat. Datele din literatura sugereaza ca in

spectrele RES (rezonanta electronica de spin) o astfel de interactiune ar putea fi, in schimb, detectabilaș

aceasta pista urmeaza a fi investigata.

12

Figura 9. Spectrul UV-vis al peroxidazei din hrean după tratarea acesteia cu 500 mM sulfit, pH 5.

Reația hemoproteinelor cu fluorura

Spre deosebire de sulfit, anionul fluorură formează un aduct cu met-hemoglobina, fapt observabil în Figura

10. Însă, atât spectrele formei oxi, cât și cele ale formei deoxi, rămân neafectate în prezența excesului de

fluorură. Experimente redox asupra acestui sistem sunt in desfăsurare in prezent.

Figura 10. Spectrele UV-vis ale met-hemoglobinei colectate după amestecarea cu 100 mM fluorură.

Aductul format în cazul met-hemoglobinei a fost oxidat cu peroxid de hidrogen și peroxodisulfat de amoniu

și redus cu DOTU, pentru evidențierea apariției unor posibili intermediari. În Figura 11.A se poate observa

formarea ferilului prin tratarea aductului Fe(III)-Fl cu peroxid și B- formarea aductului Fe-CO prin reducerea

aductului Fe(III)-Fl cu DOTU.

13

Figura 11. Spectrele UV-vis ale met-hemoglobinei, după amestecarea acesteia cu100 mM fluorură si: A) 1 mM peroxid și B) 30 mM DOTU.

Reacția hemoproteinelor cu hipocloritul (HOCl)

La fel ca în cazul fluorurii, tratarea formei met a hemoglobinei cu hipoclorit duce la formarea unui aduct,

presupus a fi, în cazul acesta Hb-Fe(III)-ClO.

Figura 12. Spectrele UV-vis ale hemoglobinei după amestecarea acesteia cu 50 µM HClO, pH 7.

Pentru evidențierea și caracterizarea intermediarilor formați în această reacție, s-a apelat la tehnica

stopped-flow. Spectrele obținute in primele 2 ms de la amestecarea reactanților se pot fita după o serie de

trei reacții consecutive în care specia A>B, B>C și C>D.

14

Figura 13. A) Spectrele UV-vis ale hemoglobinei tratate cu 466 µM HClO, pH 7, colectate în primele 2 ms

după amestecarea reactanților; B) Cele patru specii propuse de programul SPECFIT, pe baza fitării datelor experimentale după modelul A>B, B>C și C>D; C) Fitarea datelor experimentale după modelul A>B, B>C și

C>D.

In cele ce urmeaza, sunt descrise investigatii teoretice (DFT, insa pe alocuri ele au fost suplimentat cu

rezultate CASSCF si QM/MM, acolo unde structura electronica a fost un subiect complex, precum aductii

Fe-X-O, sau unde rolul matricii proteice s-a dorit a fi investigat mai in detaliu). Multe dintre aceste rezultate

sunt in conexiune cu experimente deja efectuate, sau cel putin planificate, in laboratoarele noastre.

Modele de superoxid reductază

Figurile 14 și 15 ilustrează suprafețe de potențial la situsul catalitic al superoxid reductazei pentru

disocierea moleculei de oxigen, care este studiată în paralel cu ali liganzi – NO fiind parte a unuia dintre

manuscrisele raportate mai sus.

15

Figura 14. Suprafața de energie potențială pentru ruperea legăturii Fe-O în SOR-dioxigen. Singura disociere

posibilă este pentru starea de spin înalt (S=2).

Figura 15. Suprafața de energie potențială pentru ruperea legăturii Fe-O în SOR-dioxigen. (cu imidazol axial). Din nou singurul proces posibil este în cazul modelului de spin înalt (S=2).

Modele de sulfit reductază/Interacțiunea ferilului cu sulfură (modele Fe-OS)

Modelele conțin Fe(III)porfirină legată axial de liganzii prezențati în continuare precum și de

metiltiolat (SMe) sau imidazol (Imi) o parte dintre rezultate sunt ilustrate în Figura 16.

16

Figura 16. Grafice ale energiei potențiale față de distanța O-S pentru diferite modele (stări de spin S=3/2 și

1/2). Punctul de 0 kcal/mol este luat arbitrar ca geometria de echilibru de pornire a stării de spin S=1/2 pentru modelul dat. Pentru modelul SMe-Fe-OSH2 ultimul punct alt graficului corespunde unei distanțe O-S

de 2.54. Nu sunt aratate alte puncte deoarece dupa acest moment hidrogenul de pe unitatea SH2 este transferat pe oxigen.

Calcule suplimentare au fost făcute pe modele similare de tip Fe-OOH studiind elongarea legăturii

O-O cu relevanță directă asupra ruperii legăturii oxigen-oxigen precum și asupra mecanismului hem

oxigenazei. Un alt set de calcule a fost făcut de-a lungul coordonatei de reacție a ruperii legaturii O-S din

modele Fe-OS (cu aceeași liganzi axiali de tip SMe si Imi).

Modele de clorit dismutază

Figurile 17 și 18 ilustrează câteva dintre curbele de potențial corespunzătoare unor etape din mecanismul

clorit dismutazei.

17

Figura 17. Suprafața de energie potențială pentru isomerul OClO de-a lungul ruperii legăturilor Fe-O și Cl-O. Rezultatele arată că numai ruperea legăturii Cl-O în modelul de spin înalt este accesibilă din punct de

vedere energetic.

Figura 18. Suprafața de energie potențială pentru isomerul OOCl. Rezultatele arată ca nici unul din procese

nu este posibil.

Modele Fe-peroxinitrat (interactiunea peroxonitratului cu Fe(II) și Fe(III) în molecule de interes biologic

Figurile 19 și 20 explorează câteva dintre suprafețele de potențial corespunzătoare ilustrând izomeria de

legătură a ligandului (NO4)-, peroxinitrato, la un centru biologic de tip SOR (superoxid reductază).

Figura 19. Suprafața de energie potențială pentru formarea/clivarea legăturii O-O(NO2) sau OO-NO2 în aductul peroxonitrat feric. Suprafețele arată ambele procese ca fiind posibile, cu preferință netă pentru

disocierea de-a lungul legăturii oxigen-oxigen.

18

Figura 20. Suprafața de energie potențială pentru formarea/clivarea legăturii O-O(NO2) în cazul aductului

feros (S=1). Rezultatele arată un proces exoterm ce decurge fără nici o barieră.

Oxizi și oxianioni de heteroelemente, XOn: caracterizare computațională

Figura 21 ilustrează un set de modele investigate la nivel DFT în privința structurii electronice și

geometrice, și a reactivității (izomerie de legătură, activare legătură heteroelement-oxigen).

Figura 21. Modele non-heminice pentru explorarea posibilităților de coordinare și activare a oxizilor și oxianionilor de sulf la fier. Pentru fiecare model au fost studiate cele mai probabile trei stări de spin (1/2,

3/2,5/2, respectiv 0, 1, 2). Pentru aducții SO și SO2 au fost examinate trei stări redox (sarcina totală a modelelor variind de la +1 la +3), în timp ce pentru restul au fost urmărite deocamdată doar stările formale

Fe(III). Optimizările de geometrie și explorările de curbe de potențial au fost realizate cu M06L/6-31G**.

În privința izomerului Fe-SO, rezultatele DFT relevă (conform Figurii 22) o tendință de izomerie de

legătură, și o variabilitate a stării de spin preferate. În starea de oxidare mai înaltă (cel mai probabil din

cauza schimbării durității centrului metalic din punct de vedere HSAB), are loc izomerizarea la Fe-OS la

19

simpla optimizare de geometrie, sugerând că la această stare de oxidare (corespunzând formal unui centrul

de Fe(III) coordinat la un SO izoelectronic cu molecula de oxigen, în concordanță cu cei ~2 electroni

neîmperecheați regăsiți la finalul calculului ca localizată pe SO) nu ar fi observabil experimental decât cel

mult izomerul Fe-OS.

Tendința generală spre stări de spin jos favorizează o interacțiune Fe-S mai eficientă (sau Fe-O, în

ultimul caz), ceea ce slăbește legătura S-O. Complexul [FeSO]+ este, conform datelor de densitate de spin,

descriptibil ca un radical anion SO (izoelectronic cu superoxidul) coordinat la un Fe(II) de spin jos, în bună

concordanță cu observații asupra complecșilor izoelectronici de tip Fe(III)-peroxo în hemoproteine, pe care

grupul nostru a argumentat că trebuie să îi descriem mai degrabă ca Fe(II)-superoxo. Complexul [FeSO]2+ în

schimb, prezintă un ligand neutru SO, izoelectronici cu molecula de oxigen în stare singlet.

În privința izomerului Fe-OS, se poate remarca elongarea mai mare a legăturii oxigen-sulf, sugerând

că aceasta ar putea fi mai expusă activării decât în Fe-SO. Structura electronică a complexului monocationic

este din nou izoelectronică sistemelor de tip Fe(II)-superoxo, în timp ce cea a celui dicationic este de tip

Fe(II)-oxigen, cu observația că spre deosebire de izomerul anterior aici ligandul apare ca triplet, în starea de

spin optimă cf. datelor DFT.

Izomerul Fe-OS este mai stabil energetic decât Fe-SO în toate stările de oxidare, respectiv cu 13,3

kcal/mol în cation și cu 14,5 kcal/mol în dication – preferințe destul de mari pentru a fi luate în considerare

ca semnificative indiferent de marja de eroare intrinsecă metodelor DFT.

Figura 22. Rezultate DFT asupra izomerilor Fe-OS și Fe-SO.

20

Figura 23 prezintă rezultate asupra ligandului SO2, în două variante de izomerizare și în mai multe

variante de stare redox sau de spin. Ca și în cazul ligandului SO, starea de oxidare cea mai înaltă dintre cele

examinate aici, formal echivalată cu un centru feric coordinat de un dioxid de sulf neutru electric, permite

doar izomerul legat prin oxigen la fier. Pentru celelalte două stări de oxidare, preferința energetică față de

izomerul Fe-OSO este marcantă – de 21,9 kcal/mol în cation și de 26,5 kcal/mol în dication.

Ca și în cazul azotitului geometria Fe-O-X-O (X=N sau S) conduce la elongarea semnificativă a

legăturii FeO-XO față de izomerul Fe-XO2 sau față de legătura FeOX-O.

Figura 23. Rezultate DFT asupra izomerilor Fe-OSO și Fe-SO2.

Complecșii Fe(III)-sulfit, indiferent de starea de oxidare sau de modelul de protonare (HSO3- vs.

HOSO2-) au fost calculați a fi stabili numai sub formă de izomeri coordinați la fier prin atom(i) de oxigen.

Figura 24 ilustrează aceste rezultate. În forma dianionică a sulfitului, legătura FeO-SO2 este puternic

activată (cu cca 0,3 Å mai mult decât celelalte două legături), sugerând o cale foarte eficientă de acțiune

sulfit reductazică. Tendința se menține, în versiune ceva mai redusă, și în versiunile protonate. Rezultatele

pot sugera readucerea în discuție a paradigmei curente din sulfit reductaze, unde substratul este propus (și

demonstrat experimental) a se lega la situsul catalitic feric prin atomul de sulf.

Figura2 5 ilustrează evoluția legăturilor S-O la elongare, într-o serie de complecși dintre cei descriși

în Figura 21. Din astfel de elongări se generează, la limită, un atom de oxigen activ – simulând până la un

21

punct procesul de activare a unui substrat prin mecanism oxigenazic. De departe, cel mai facil proces de

activare este cel din ligandul HSO3-. Complecșii de tip Fe(II)-superoxo, [FeSO]+, ca și [FeSO2]+, sunt apropiați

din acest punct de vedere. Calculele mai explicite asupra inserării explicite de oxigen în substraturi organice

(inserare în legături C-H, sau adiție la grupări funcționale potrivite) sunt în lucru.

Figura 24. Rezultate DFT asupra izomerilor Fe(III)-sulfit.

22

Figura 25. Curbe de potențial pentru eliberarea de oxigen activ din oxizi și oxianioni de sulf prezenți în

Figura 21.

Modele sirohemice

Situl activ al enzimei sulfit reductaza a fost investigat la nivelul teoriei RI-DFT folosind funcționala

TPSS, setul de baza def2-SV(P) și incluzând corecții de dispersie. Acest sit constă dintr-un ansamblu de doi

cofactori legati printr-un sulf cisteinic, primul fiind un sirohem, iar al doilea un cluster cubanic de fier și sulf

(Fe4S42+.) . Acest ansamblu de cofactori este prezent în mai multe enzime iar modul lui de funcționare

difera de la enzimă la enzimă, această diferențiere fiind în principal datorată mediului proteic diferit ce

apare în fiecare enzimă. Astfel, acest ansamblu poate funcționa la potențiale redox mici, caz în care are

rolul de a reduce substratul, dar și la potențiale redox înalte, caz în care are rolul de a oxida substratul.

Într-un studiu anterior mecanismul prin care sulfit reductaza transforma ionul sulfit în sulfură a fost

studiat iar ciclul catalitic propus este redat în Figura 26. In acel studiu sistemele investigate fac abstracție

de al doilea cofactor, presupunându-se că rolul cubanului este doar de a transfera electroni înspre fierul

aflat în sirohem. În eforturile noastre curente s-au reluat aceste calcule la un nivel de teorie diferit,

extinzând numărul sistemelor luate în considerare prin investigarea primelor 3 stări de spin posibile. De

asemenea cofactorul cubanic a fost introdus în sistemele studiate. Multitudinea stărilor de spin posibile

aduse de clusterul de fier și sulf îngreunează găsirea minimului global, fapt pentru care s-au construit și

sisteme în care cubanul este înlocuit cu Zn2+. In aceste sisteme ionul de zinc reproduce sarcina totala a

cubanului și descrie o singura stare de spin (S=0), fapt ce înlătură problema multitudinilor cuplajelor

magnetice posibile dintre cei 5 atomi de Fe din sistemele cubanice. Aceste sisteme (fără substratul atașat)

sunt redate in Figura 27.

Calculele au fost efectuate cu ajutorul software-ului TURBOMOL, program ce permite calcularea

structurilor electronice moleculare pornind de la metode ab initio. In cadrul avantajelor menționăm

stabilitatea superioara a calculelor de convergență, și implementarea aproximației Resolution of Identity

(RI) pentru calcule DFT, Hartree-Fock, MP2. Această metodă constă în implementarea unor seturi de funcții

de bază suplimentare (auxiliary basis sets) pentru estimarea integralelor coulombiene din hamiltonianul

electronic molecular și atenuează creșterea efortului computațional odată cu creșterea numărului de atomi

din sistemul studiat.

Rezultatele confirmă și depășesc așteptările noastre în privința potențialului de izomerie de legătură în

această clasă de liganzi, și permit delinearea contribuțiilor electrostatice, geometrice, electronice și de

cuplaj magnetic ale centrului cubanic la activarea și transformarea sulfitului în sulfit reductază. Manuscrisul

23

aferent este în curs de redactare.

Figura 26. Intermediari anterior propuși pentru ciclul catalitic al sulfit reductazelor.

Figura 27. Modele de coordinare axială, trans față de substrat sau față de intermediarii de reacție, folosite în studiile noastre.

24

Tabelul 1. Rezultate asupra modelelor de sulfit reductază cu sirohem.

Intermediar

Spin Sistem

Sirohem-SCH3 Sirohem-Zn(SCH3)4 Sirohem-Fe4S4(SCH3)4

h/2π Energia ∆E Energia ∆E Energia ∆E

a.u kcal/mol a.u kcal/mol a.u kcal/mol

2

1/2 -3316.7924 0.00 -6410.0774 0.00 -11278.2182 0.00

3/2 -3316.7596 20.64 -6410.0633 8.82 -11278.2066 7.29

5/2 -3316.7572 22.13 -6410.0569 12.87 -11278.0883 81.56

3

1/2 -3240.4287 0.00 -6333.7241 0.00 -11201.8623 0.00

3/2 -3240.4157 8.21 -6333.7108 8.34 -11201.8492 8.20

5/2 -3240.4017 16.99 -6333.5778 91.80

4

0 -3240.5085 0.00 -6333.7194 0.00 -11202.5624 0.00

1 -3240.5008 4.85

2 -3240.4774 19.56 -6333.6963 14.52

5

0 -3241.0125 2.56 -6334.3093 0.00

1 -3241.0165 0.00 -6334.3071 1.42 -11202.4539 562.99

2 -3240.9870 18.57 -6334.2897 12.32 -11203.3511 0.00

6

0 -3241.3941 0.00 -6334.7964 1.86 -11202.8981 25.68

1 -3241.3506 27.31 -6334.7993 0.00 -11202.9390 0.00

2 -3241.3737 12.82 -6334.7823 10.65

7

0 -3165.0191 3.93 -6258.4223 15.24 -11126.5371 17.21

1 -3165.0254 0.00 -6258.4466 0.00 -11126.5646 0.00

2 -3164.9770 30.37 -6258.4389 4.81 -11126.5567 4.94

8

1/2 -3165.2455 0.00 -6258.5488 0.00 -11126.6916 0.00

3/2 -3165.2132 20.22 -6258.4883 37.97 -11126.6766 9.36

5/2 -3165.2101 22.19 -6258.5133 22.27 -11126.6579 21.13

9

0 -3165.3282 0.00 -6258.5398 0.00 -11126.5343 0.00

1 -3165.3264 1.09 -6258.5126 17.06 -11126.6900 0.96

2 -3165.2955 20.48 -6258.5110 18.08 -11126.6753 10.23

10

1/2 -3165.3409 0.00 -6258.4063 0.00 -11126.5867 0.00

3/2 -3165.3103 19.18 -6258.3761 18.90 -11126.5729 8.63

5/2 -3165.2437 60.97 -6258.3645 26.17

11

1/2 -3165.9361 0.00 -6259.1496 0.00 -11127.2944 4.08

3/2 -3165.9042 20.01 -6259.0697 50.09 -11127.2867 8.93

5/2 -3165.8892 29.40 -6259.1074 26.44 -11127.3009 0.00

12

1/2 -3090.0781 0.00 -6183.3849 0.31 -11051.5242 0.15

3/2 -3090.0757 1.50 -6183.3854 0.00 -11051.5244 0.00

5/2 -3090.0446 21.06 -6183.3639 13.48 -11051.5152 5.77

25

13

0 -3090.1398 16.07 -6183.3499 0.00 -11051.4520 58.08

1 -3090.1654 0.00 -6183.3774 4.67 -11051.5446 0.00

2 -3090.1387 16.77 -6183.3551 18.68 -11051.5103 21.53

14

0 -3090.6968 6.25 -6183.9961 0.00 -11052.0858 35.67

1 -3090.7067 0.00 -6183.9375 36.79 -11052.1426 0.00

2 -3090.6713 22.23 -6183.9716 15.42 -11052.1388 2.43

15

1/2 -3090.7001 33.79 -6183.8983 0.00 -11052.1418 0.00

3/2 -3090.7540 0.00 -6183.8682 18.84 -11052.1408 0.62

5/2 -3090.7430 6.86 -6183.8612 23.26 -11052.1277 8.87

16

1/2 -3091.3102 0.00 -6184.5941 0.00 -11052.7279 0.00

3/2 -3091.2875 14.22 -6184.5812 8.05 -11052.7135 9.01

5/2 -3091.2792 19.41 -6184.5751 11.93 -11052.7119 10.05

Oxizi și oxianioni de clor și sulf: caracterizare experimentală

Figura 28 prezintă spectre de rezonanță electronică de spin colectate asupra mioglobinei tratate cu

clorit, și înghețate în azot lichid la 30 de secunde de la declanșarea reacției. Aceste spectre

complementează pe cele UV-vis înregistrate în regim stopped-flow dar și staționar (neprezentate aici din

cauza limitărilor de spațiu), prezentând dovezi în sprijinul unui mecanism implicând complexarea cloritului

la fier, urmată de trecerea într-o stare de oxidare invizibilă RES dar capabilă să oxideze aminoacizii din jur –

cel mai probabil starea feril. Este vorba de dispariția semnalelor ferice de la g~6, și apariția celor de radical

liber la g~2, ca și a unora de spin jos în regiunea g~2,4-2,5. Intensitatea relativ redusă a semnalelor de

radical liber la concentrații mai mici, sugerează un posibil mecanism clorit dismutazic – adică unul în care

ferilul generat la hem prin reducerea unei prime molecule de clorit va ajunge sa oxideze o a doua moleculă

de clorit.

26

Figura 28. Spectre RES colectate pentru mioglobină la 30 de secunde de la amestecarea cu clorit, la pH 7

(A) și respectiv 10 (B).

Figura 29 ilustrează spectre ce pot fi interpretate a corespunde uni aduct Fe(IV)-sulfido într-o

hemoproteină – una dintre țintele reprezentative proiectului de față. Figura 30 confirmă statultul de specie

oxidată al acestui produs.

27

Figura 29. A. SulfoferrylHbFe(IV)=S - formare din metHbFe(III)-SH (7 µM, pre-format cu un exces de sulfură

la pH 7) în reacție cu un exces de 100 de ori de hexacloroiridat la pH 9,5. În doar câteva secunde, reacția

produce un spectru similar oxoferilHbFe(IV)=O (experiment control in panelul B, cu aceleași condiții

experimentale dar fără a folosi sulfura). Specia finală a fost tratată cu un exces dublu de sulfură, formându-

se sulfhemoglobina (linia verde) – ca dovadă a existenței unei specii de valență înaltă. C. Progresul reacției

de disociere a metHbFe(III)-SH la pH 5-9 interval, sugerând că disocierea sulfurii de la metHbFe(III)-SH este

mult mai lentă decât oxidarea de către hexacloroiridat = și deci că sulfura este oxidată direct.

Figura 30. Spectre RES urmărind oxidare metHbFe(III)-SH cu hexacloroiridat, și demonstrând oxidarea la o

formă inactivă RES – cel mai probabil Fe(IV)-sulfido. Sunt, notabil, absente trăsăturile specifice degradării

28

oxidfative a hemului (mai exact, nu crește intensitatea semnalului de la g~4,3, și nu se dezvoltă semnale

puternic izotropice în zona de spin jos).

Figurile 31 și 32 ilustrează spectre UV-vis și RES reprezentative pentru experimentele în care s-a

urmărit reactivitatea unor macrocicluri de sinteză față de reactivii de interes pentru proiectul curent.

Cloritul și sulfitul indic semnale distincte în RES – foarte puternice în cazul cloritului – care nu sunt datorate

unui proces nonspecific de tip redox sau coordinativ – de vreme ce oxidanții clasici precum peroxidul sau

iridatul nu indic semnale similare. În schimb, în cazul cobaltului spectreșe RES oferă mult mai puțină

informație. Astfel, peroxidul și iridatul induc un semnal – probabil un radical localizat pe cobalamină,

generat pe cale oxidativă – în timp ce cloritul și sulfitul nu generează semnale bine definite – iar punctul de

plecare este oricum diamagnetic. În schimb, spectrele UV-vis ale complecșilor de cobalt sunt clar distincte

unele de celelalte; în condițiile în care datele RES nu sugerează schmbări majore de stare de oxidare, cele

UV-vis sunt atunci interpretabile ca dovadă a modificărilor de sferă de coordinare, în linie cu ipoteza de

lucru și cel mai probabil ducând la aducții-țintă.

Figura 31. Spectre UV-vis (panoul superior) și RES (panoul inferior) pentru reacția tetrasulfoftalocianinei

ferice cu liganzi și parteneri redox: clorit, peroxid (px), sulfit, iridat, hipoclorit.

29

Figura 32. Spectre UV-vis (panoul superior) și RES (panoul inferior) pentru reacția tetrasulfoftalocianinei de

Co(III) cu liganzi și parteneri redox: clorit, peroxid (px), sulfit, iridat, hipoclorit.

Dovezi cinetice și spectroscopice pentru complecși ai unor oxianioni de sulf cu cobalamina au fost

colectate în experimente UV-vis și RES, care se raportează în manuscrise aflate deja în lucru. Printre aceste

ținte s-a aflat și un aduct cobalamină-ditionit, ale cărui trăsături principale sunt ilustrate în Figura 33

conform unor calcule DFT. Astfel, se remarcă legătura sulf-sulf încă intactă, și localizarea densității de spin

în două maniere complet diferite: la cobalt în varianta „base-off”, și pe corină în varianta „base-on”.

Figura 33. Geometrii prezise la nivel M11/6-31g(d,p) pentru aducți cobalamină-ditionit (S=1/2, anioni).

30

Observații similare au fost realizate pe o serie de alte proteine sau sisteme model; țintele astfel studiate au

inclus mioglobina, hemoglobine din vertebrate, hemoglobine din plante, catalaza, porfirine de sinteză

complexate cu diverse metale (Fe, Cu, Cp, Zn), cobalamina, cobinamida, ftalocianine, și altele.

Director proiect,

Radu Silaghi-Dumitrescu