1

“Interactii moleculare generatoare de chiralitate evidentiate

prin corelarea datelor de dicroism circular indus cu calcule cuantice”

-RAPORT STIINTIFIC AL ETAPELOR 2012-2014-

INTRODUCERE

Dicroismul circular indus (ICD) isi poate avea originea fie in modificarea geometriei moleculei achirale care devine,

astfel, chirala, fie in interactia intre momentele de tranzitie magnetic si electric ale celor doua molecule care interactioneaza si inducerea unei puteri rotatorii nenule pentru molecula chirala [1]. Spectrul de dicroism circular este sensibil la modificarile de mediu, de geometrie si de densitate electronica, avind drept caracteristica, pe linga pozitia si intensitatea benzii, semnul acesteia. In acest fel, moleculele achirale pot deveni un senzor al interactiilor necovalente. Rezultate preliminare [2,3] au aratat ca, prin corelarea datelor experimentale cu cele teoretice, se pot estima atit specia care interactioneaza, cit si modificarile conformationale care au loc. Totusi, este necesar un studiu mai aprofundat al modului in care cele doua mecanisme de generare a unui semnal ICD se combina si care este rezultatul asupra spectrului experimental.

Obiectivele acestui proiect au fost studiul interactiilor chirale in medii anizotrope (micele, ciclodextrine, proteine) prin spectroscopie de dicroism circular cuplata cu simularea spectrelor prin metode de chimie computationala. Aparitia unui semnal de dicroism circular (ECD) indus pentru aceste sisteme se datoreste modificarii geometriei ligandului care devine, in urma interactiei, chiral, si/sau interactiei dintre momentele de tranzitie electric si magnetic ale partenerilor [4, 5].

Corelarea datelor experimentale cu cele teoretice permite identificarea speciei/speciilor de ligand care participa la interactie si a modificarilor conformationale care au loc [6], precum si investigarea modului in care cele doua mecanisme generatoare de chiralitate se combina si care este rezultatul asupra spectrului experimental.

METODE EXPERIMENTALE SI TEORETICE

Spectrele de dicroism circular si absorbtie au fost inregistrate cu un spectropolarimetru J-815 Jasco. S-a lucrat pe banda

ligandului achiral, urmarindu-se aparitia semnalului dicroic indus al acestuia prin interactia cu un mediu chiral. Pentru fiecare pereche ligand achiral-mediu chiral studiata au fost selectate conditiile optime de lucru.

Spectrele de fluorescenta (in stare stationara, cu rezolutie in timp) si Raman au fost inregistrate cu un spectrofluorimetru FLS920 Edinburgh Instruments si un spectrometru Raman NRS-3100 Jasco. S-a urmarit modificarea caracteristicilor emisiei de fluorescenta a ligandului si a frecventelor sale de vibratie prin interactia cu macromolecula chirala.

Calculele cuantice in vid si in solvent au fost efectuate cu programul Gaussian09, folosind metoda DFT cu o functionala B3LYP si diferite baze de orbitali atomici (6-31G, TZVP, aug-cc-pVDZ, 6-311++G(d,p)). Solvatarea a fost tratata in cadrul modelului PCM. Modelarea moleculara a complecsilor ligand–ciclodextrina si ligand–proteina s-a efectuat in prima faza cu programul Autodock 4.0. Complecsii ligand-ciclodextrina au fost optimizati apoi cu metoda DFT (ONIOM), iar complecsii ligand-proteina prin dinamica moleculara. In toate cazurile, proprietatile spectroscopice au fost calculate prin metoda (TD)DFT.

Pentru simularea spectrelor ECD ale sistemelor formate din nanoparticule metalice pe suprafata carora sint adsorbiti tioli s-a folosit metoda (TD)DFT, cu o baza LANL2DZ. In prealabil, geometria moleculelor de tioli a fost optimizata (in stare izolata si ca adsorbat).

REZULTATE SI DISCUTII Obiectivele propuse au fost: O.1. Implementarea si optimizarea metodei pe sisteme model O.2. Studiul unor interactii necovalente in complecsi bimoleculari O.3. Studiul interactiilor chirale in medii anizotrope O.4. Studiul moleculelor chirale adsorbite la suprafata nanoparticulelor O.5. Alte aplicatii ale metodei O.6. Coroborarea rezultatelor si stabilirea unui algoritm de lucru In acest scop s-au studiat urmatoarele aspecte: • Studiul experimental (ECD si Raman) si teoretic, pentru sisteme simple (model) si complecsii lor bimoleculari

de tipul molecula chirala- molecula achirala in diferite rapoarte molare. Compusii chirali utilizati au fost: S-(+)-2-butilamina, D-luciferina, acidul S-(+)-4-izobutil-α-metil-fenilacetic, bromura

de (-)-N-dodecil-N-metilefedriniu, β-ciclodextrina (β-CD) si β-ciclodextrina modificata cu fragmente izopropil (2-HP- β-CD). Compusii achirali au fost derivati de cumarina, p-nitrozodimetilanilina, kaempferol. Un caz aparte il constituie moleculele achirale ce prezinta benzi electronice n-π*, interzise in spectrul de absorbtie, dar care pot fi permise in spectrul ICD. O a treia categorie de interes sint amestecurile racemice, anume bilirubina (BLB) si amestec racemic de R- si S-warfarina. Sistemele binare susceptibile de a forma complecsi prin interactii necovalente au fost monitorizate prin spectroscopie ECD si, ca o metoda de control, ce poate evidentia formarea de complecsi, spectroscopia Raman.

Sensibilitatea spectrului ECD la conformatia adoptata in urma interactiei il recomanda ca o metoda de studiu al modificarilor conformationale [7]. Problema se complica in cazul sistemelor labile, care pot adopta mai multe conformatii, iar spectrul experimental este o medie a spectrelor acestora. Dezavantajul este necesitatea unor calcule laborioase pentru simularea

2

spectrului. Pentru exemplificare, am considerat un sistem foarte simplu acetona-S-(+)-2-butanol, in care acetona are tendinta de a accepta protoni in legaturi de H, iar butanolul de a ceda. Prin optimizarea geometriei de echilibru a complexului, am identificat doua conformatii la energii cvasiegale cu spectre foarte diferite (Figura 1 a), in care semnul benzilor nu este acelasi. Cautarea conformationala nu a fost exhaustiva. Dar de aici rezulta, pe de o parte, ca semnul benzii ICD nu este intotdeauna acelasi cu cel al componentului chiral care il induce, iar pe de alta parte ca o abordare riguroasa a simularii acestor spectre ar implica luarea in considerare a dinamicii sistemului studiat prin dinamica moleculara. Nu in ultimul rind, moleculele de solvent pot juca si ele un rol, astfel ca solvatarea ar trebui considerata explicit.

300 350 400 450 500

-1500

-1000

-500

0

500

1000

1500

R / 1

0-4

0 e

rg e

su c

m/G

auss

λ /nm

BLB M

BLB M-S-butilamina 1:1

BLB M-S-butilamina 1:2

BLB M-R-butilamina 1:2

a) b) Figura 1. Spectre ECD simulate ale complecsilor acetona-R-butanol (a), BLB-butilamina (b).

Interactia S-(+)-2-butilaminei cu derivati achirali ai 3-carboxicumarinei. In cazul interactiei S-(+)-2-butilaminei cu mai multi derivati achirali ai 3-carboxicumarinei, in functie de aciditatea

acestora, sunt in principiu posibile 3 cazuri: inexistenta unei interactii, formarea unui complex bimolecular cu legatura de hidrogen, formarea unei perechi de ioni liberi in solutie prin transfer de proton. Incadrarea intr-o categorie sau alta este guvernata de marimea energiei libere a procesului de transfer de proton. Considerind structurile celor doi parteneri, aparitia unui semnal dicroic indus in spectrul derivatului carboxicumarinic ar trebui sa aiba loc numai in cel de-al doilea caz (formare de complex). Derivatii studiati au urmatoarele valori ale pKa: acid 3 carboxi-5,6-benzocumarinic (1), 3.52, acid 3-carboxicumarinic (2), 3.14, acid 7-dimetilamino-3-carboxicumarinic (3), 3.06, acid 7-metoxi-3-carboxicumarinic (4), 2.98.

Dupa cum se observa din Figura 2, comportamentul compusilor studiati in prezenta moleculei chirale este diferit, in functie si de polaritatea solventului in care are loc interactia. Daca 1 prezinta un semnal indus in ACN, 2 si 3 in hexan si ACN, 4 il prezinta numai in hexan. Un caz special il constituie 3, ale carui spectre in ACN si hexan se prezinta ca imagine in oglinda, cu doua benzi de tip excitonic, desi compusul nu prezinta in molecula doi cromofori identici. Acest lucru nu a putut fi explicat deocamdata.

250 300 350 400 450-4

-3

-2

-1

0

1

2

θ (

md

eg

)

λ (nm)

a) 1 in ACN

250 300 350 400-4

-2

0

2

4

6

θ (

md

eg

)

λ (nm)

b) 2 in hexan

250 275 300 325 350 3750

10

20

30

40

θ (

md

eg

)

λ (nm)

c) 2 in ACN

250 300 350 400 450-2

-1

0

1

2

3

4

θ (

md

eg

)

λ (nm)

d) 3 in hexan

300 350 400 450

-3

-2

-1

0

1

2

3

λ (nm)

θ (

md

eg

)

e) 3 in ACN

250 300 350 400-5

0

5

10

15

θ (

md

eg

)

λ (nm)

f) 4 in hexan Figura 2. Spectre experimentale ICD. [amina]=5×10-2 M; gri: ligand; negru: ligand+amina

3

Energia libera a procesului de transfer de proton depinde de energia de protonare/deprotonare a celor doi componenti,

de taria legaturii de hidrogen care se formeaza si de polaritatea solventului. Cu cit aciditatea derivatilor de cumarina creste, energia libera devine mai negativa, favorizind procesul de transfer de proton. Pentru formare de complecsi, transferul de proton trebuie sa fie reversibil. Aceasta se poate asigura modificind polaritatea solventului.

Simularea spectrelor ECD ale complecsilor permite aprofundarea modului de interactie intre cei doi componenti si felul in care aceasta influenteaza tranzitiile electronice si puterea rotatorie, conducind uneori la concluzii surprinzatoare. Spectrul ECD simulat al complexului bimolecular format de compusul 2 cu butilamina coreleaza ca lungime de unda a benzilor si intensitate cu spectrul experimental (Figura 3 a). Geometria optimizata a complexului care corespunde acestui spectru indica formarea unei legaturi de H (1.53 A). In acest mod, pe baza corelarii dintre spectrul experimental si cel simulat pentru mai multe geometrii posibile ale complexului, se poate atribui geometria reala in solutie, in diferite medii, intr-un mod similar atribuirii configuratiei absolute. Spectrul simulat al compusului 4 in prezenta butilaminei in hexan (Figura 3 b) prezinta 3 benzi in domeniul 400-250 nm, 350 nm (+); 323 nm (-); 292 nm (+), care coreleaza ca pozitie si semn cu datele experimentale: 366 nm (+); 328 nm (-); 288 nm (+).

a) b) Figura 3. a) Spectrul simulat si experimental in ACN al complexului butilaminei cu 2 si geometria complexului; b) spectrul simulat al compusului 4 (gri) si al complexului lui cu amina (negru) in hexan.

Pentru a avea inca o dovada experimentala a formarii complexului, au fost efectuate masuratori de spectroscopie Raman

pentru compusii separati si pentru complex (Figura 4 pentru interactia 2- amina). Spectroscopia Raman evidentiaza efectul interactiei bimoleculare la nivel local, al gruparilor functionale. De asemeni, constituie o metoda de validare a geometriei de echilibru determinata prin calcule cuantice, pentru care se simuleaza si spectrul Raman. Analiza spectrelor a presupus identificarea benzilor compusului 2 care isi modifica pozitia/intensitatea in urma complexarii si care sunt situate in regiuni spectrale in care amina nu prezinta benzi. Aceste benzi sunt indicate in Figura 4, alaturi de atribuirea vibratiilor corespunzatoare, facuta pe baza unui calcul DFT. Modificarile observate arata in mod clar formarea complexului, remarcandu-se fapul ca fragmentele afectate de complexare sunt carboxilul si carbonilul.

Figura 4. Spectre Raman ale compusului 2, aminei si complexului bimolecular. Interactia unei molecule chirale cu o molecula ce prezinta doi enantiomeri aflati in solutie ca amestec racemic. Un alt aspect studiat a fost interactia unei molecule chirale cu o molecula ce prezinta doi enantiomeri aflati in solutie ca

amestec racemic. Un astfel de compus este bilirubina (BLB), ai carei enantiomeri sunt notati P si M. Spectrul lor ECD se prezinta ca obiect si imagine in oglinda, cu doua benzi excitonice, de intensitati aproximativ egale, dar semne diferite, pozitiv-negativ

Banda (cm-1)

Atribuire

1747 νC=Ocarbox 1680 νC=Ocetona 1216 νC-Ocarbox, δC-H 657 δC=Ocetona, δC=C 597 δO=C-O, δC=C 563 δC=C in afara planului

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

579609

650

563

597

1216

657

1231

1216

16801747

1733

1742

3C C A-B uN H 2

B uN H 2

ν (cm-1)

3C C A

4

300 350 400 450 500 550 600

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[BLB]=9.73*10-5M

[BLB]=3.72*10-5M

CD

(m

de

g)

[BLB] (M)

300 350 400 450 500 550

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3[BLB] = 4.74 *10

-5 M

[BLB]=0 M

CD

(m

de

g)

λ (nm)

pentru P. Ele au fost evidentiate in interactie cu albuminele serice [8]. In prezenta S-(+)-sec-butilaminei este indus un semnal dicroic de diferite forme, in functie de mediu. In DCM si DMSO

semnalul prezinta doua benzi excitonice negativ-pozitiv centrate la maximul de absorbtie (440 nm), caracteristice conformerului M, in DMSO, in prezenta de SDS, o singura banda pozitiva la 445 nm, ca in Figura 4 a, b. Un caz special il constituie interactia cu o micela chirala, care presupune probabil doua etape, in functie de concentratia de BLB (Figura 5, c), deoarece forma spectrului se modifica. In prezenta de SDS, la concentratii sub si peste CCM, in mediu apos, nu se observa benzi ICD ale BLB.

Simularea spectrului ECD al conformerilor P si M ai BLB in interactie cu S-(+)-sec-butilamina (1:1 si 1:2) arata doua benzi excitonice la 431 si 401 nm (in vacuo), care se regasesc si in spectrul simulat al conformerilor izolati (Figura 1 b). Chiar in interactie cu R-(-)-sec-butilamina, forma spectrului si semnul benzilor se pastreaza practic nemodificate. Acest fapt pare sa indice ca aparitia benzilor in spectrul BLB in prezenta unor molecule chirale se datoreaza inducerii unui exces enantiomeric.

400 450 500 550

-6

-4

-2

0

2

4

6

CD

(m

de

g)

λ (nm)

10 µM

40 µM

60 µM

80 µM

100 µM

a) b) c)

Figura 5. Spectre de dicroism circular ale BLB in DCM (a); DMSO in prezenta de SDS (b); micele chirale (c).

• Studiul experimental (ECD si Raman) si teoretic, pentru compusi achirali inclusi in cavitatea chirala a

ciclodextrinelor

Derivati cumarinici In prezenta 2-hidroxipropil-β-ciclodextrinei s-a inregistrat un semnal de dicroism circular indus pozitiv (figura 6). Din

variatia acestui semnal cu concentratia de ciclodextrina s-a determinat constanta de asociere si o stoechiometrie a complexului de 1:1. Avantajul acestei metode spectrale este acela ca poate valida geometria complexului. Astfel, prin simularea spectrelor de dicroism circular (TDDFT) pentru diferite geometrii optimizate de complecsi si compararea cu spectrul experimental s-a ales acea geometrie care reproduce cel mai bine spectrul in ceea ce priveste pozitia, semnul si intensitatea benzilor.

Derivati de fenoxatiina Includerea 10,10-dioxid-fenoxatinei si a 2-brommetil-10,10-dioxid-fenoxatinei in cavitatea α-, β-, γ- si 2-hidroxipropil-

β-ciclodextrinei a fost evidentiata prin masuratori de dicroism circular [9]. Desi cei doi derivati de fenoxatiina au elemente de chiralitate, si anume miscarea de flip-flap a ciclului si rotatia gruparii CH2Br, experimental acestia nu prezinta semnal dicroic. In schimb, in prezenta ciclodextrinei s-a observat apariatia unui semnal de dicroism circular indus (Figura 7). Din dependenta acestuia in functie de concentratia de ciclodextrina s-a gasit ca stoechiometria complecsilor formati este de 1:1, constantele de legare fiind cuprinse intre 80-350 M-1, in functie de tipul ciclodextrinei. Lipsa semnalului dicroic in absenta ciclodextrinelor a fost explicata prin calcule DFT-TDDFT, care au aratat ca desi o anumita conformatie poate avea semnal dicroic (Figura 7 c), bariera de rotatie, respectiv bariera miscarii de flip-flap fiind foarte mica (0.53 kcal/mol), semnalul dicroic se mediaza pentru toti conformerii existenti in solutie. Totodata, calculele TDDFT au permis calcularea directiilor momentelor de tranzitie care au fost corelate cu semnul benzilor de dicroism si au indicat, conform regulilor empirice Harata-Kodaka, ca includerea in cavitatea ciclodextrinelor s-a facut axial.

Compusi din clasa flavonoidelor-kaempferolul Interactia kaempferolului cu β-CD conduce la aparitia unor benzi de dicroism circular, ca in Figura 7 b), a caror pozitie

si semn coreleaza cu spectrul simulat pentru o geometrie plana a formei neutre a acestei molecule (Figura 7 d). In acest caz se poate atribui, pe linga conformatia ligandului in complex, si specia care este inclusa in cavitate, anume specia neutra, desi s-a lucrat la pH=7.4, iar pKa pentru kaempferol este 7.05.

Molecula de kaempferol prezinta un grad de libertate de rotatie - torsiunea de-a lungul legaturii dintre fragmentele cromona si fenil. Prima valoare pKa este 7.05, astfel incat la pH neutru kaempferolul se gaseste atit sub forma neutra, cit si ca anion deprotonat la gruparea hidroxil din pozitia 7. La includerea in cavitatea ciclodextrinei se observa aparitia unui semnal ECD indus al kaempferolului, alcatuit din patru benzi situate la 227 (–), 260 (+), 312 (+) si 382 (+) nm (Figura 8a). Pe baza corelarii datelor experimentale cu cele teoretice obtinute din modelarea moleculara a complecsilor de incluziune (folosind metoda semiempirica PM3 urmata de simularea spectrelor ECD ale complecsilor cei mai stabili la nivel B3LYP/6-31G), s-au evidentiat urmatoarele: a) desi in solutie kaempferolul se gaseste atit ca molecula neutra, cit si ca anion, specia care este inclusa in cavitatea ciclodextrinelor este cea anionica; b) conformatia kaempferolului in complex prezinta un unghi de torsiune de -50 grade. Aceste rezultate se coreleaza cu datele de fluorescenta 3D, spectre de emisie cu rezolutie in timp si timpi de viata, ce arata modificarea ponderii celor trei specii excitate ale kaempferolului la complexare, si anume cresterea procentului de anion (A*) si tautomer (T*),

5

specii mult mai fluorescente decat specia normala, N* (Figura 8b). Rezultatele obtinute prin spectroscopie Raman indica modificarea la complexare a frecventelor de vibratie ale gruparilor carbonil, legaturii C(2)=C(3) si gruparilor OH din pozitiile 3 si 5 (Figura 8c).

INTERACTII CHIRALE CU PROTEINELE

a) chiralitate indusa prin modificari conformationale Interactia acidului 3-carboxibenzocumarinic cu HSA si BSA poate fi studiata pe banda ICD a derivatului cumarinic.

Rezultatele sint prezentate in figura 9, unde se observa diferente atit in forma spectrului, cit si in stoechiometrie: 1:1 in prezenta de BSA, amestec 1:1 si 1:2 in prezenta de HSA. Mai mult, rezultatele de docking molecular cuplate cu simulari de spectre au condus la determinarea geometriei complecsilor, atit 1:1, cit si 1:2.

250 300 350 400 4500.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

CD

(m

de

g)

λ (nm)

Figura 6. Spectrele de dicroism circular indus ale 3-carboxi-5,6-benzocumarinei in prezenta 2-hidroxipropil-β-ciclodextrinei.

a)

200 250 300 350 400 450

-2

0

2

4

[kaemp]=1x10-4 M etoh:pbs 1:3

[kaemp]=1x10-4 M etoh:pbs 1:3; [β-CD]=1.52x10

-2 M

θ (

md

eg

)

λ (nm)

b)

c)

d)

Figura 7. Spectre ICD ale10,10-dioxid-fenoxatiinei (a) si kaempferolului (b) in prezenta ciclodextrinei si spectre ECD simulate (c) si, respectiv (d).

6

200 250 300 350 400 450

-5

0

5

10

kaemp, exp.

kaemp:β-CD 1:1, exp.

kaemp:2-HP-β-CD 1:1, exp.

kaemp:β-CD 1:1, simulat

θ (

mg

rad

e)

λ (nm)

(a)

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

amestec

complex 1:1

fizic

β-CD

kaemp

kaemp/DFT

ν (cm-1)

Ram

an

In

ten

sit

y (

a.u

.)

(c)

kaemp

330

460

350

400

350 625400 500

Wav

ele

ng

th [

nm

]

Wavelength [nm]

500

0

kaemp:β-CD 1:1

330

460

350

400

350 625400 500

Wavele

ng

th [

nm

]

Wavelength [nm]

500

0

kaemp:2-HP-β-CD 1:1

330

460

350

400

350 625400 500

Wavele

ng

th [

nm

]

Wavelength [nm]

500

0

(b)

Figura 8. Spectre ECD experimentale si simulat (B3LYP/6-31G) (a), spectre de fluorescenta 3D si cu rezolutie in timp (b) si spectre Raman (c) ale complecsilor 1:1 kaempferol–ciclodextrina. Este prezentata si geometria complexului kaempferol–β-CD.

300 350 400 450

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

324 nm

357 nm

d/p=2.02

Ab

so

rban

ce

λ (nm)

a)

300 350 400 450

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 387 nm

330 nm

Ab

sorb

an

ce

λ (nm)

b)

300 330 360 390 420 450

-4

0

4

8

12

16

20

∆θ (

md

eg

)

λ (nm)

c)

300 330 360 390 420 450

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

∆θ (

mdeg)

λ (nm)

d) Figura 9. Spectre de absorbtie si dicroism circular ale amestecurilor de acid 3-carboxibenzocumarinic -BSA (a) si (c),

7

acid 3-carboxibenzocumarinic -HSA (b) si (d). Spre deosebire de spectrele ICD, prelucrarea datelor de absorbtie ale acelorasi amestecuri nu permite identificarea unor

diferente structurale si de stoechiometrie intre complecsii acidului 3-carboxibenzocumarinic -HSA si acidului 3-carboxibenzocumarinic -BSA. Se dovedeste astfel adecvarea si caracterul mai larg de aplicabilitate al metodei ICD in studiul unor interactii moleculare complexe.

Diferentele ce apar in interactia derivatului cumarinic cu albuminele pot fi explicate prin modelarea moleculara a complecsilor proteina-ligand. Rezultatele de docking molecular arata ca acidul 3-carboxibenzocumarinic se leaga la situsul Sudlow I al HSA, dar la situsul Sudlow II al BSA (figura 10).

Rezultate indica posibilitatea legarii unei a doua molecule de ligand la HSA, in situsul bilirubinei, cu formarea unui complex stabil. Se explica astfel formarea complexului 1:2 observata experimental. Pornind de la geometria liganzilor in acesti complecsi, prin simularea spectrului de dicroism circular pentru monomer si dimer am obtinut o buna corelatie cu datele experimentale ale complecsilor 1:1 si 1:2. Prin aceasta metoda se pot extrage maximum de informatii structurale din spectrele experimentale ICD.

Acidul 3-carboxibenzocumarinic, desi este o molecula cu structura simpla, poate prezenta forme foarte diferite ale spectrului ICD in diferite medii anizotrope, ceea ce o recomanda ca proba ICD.

a) b)

Figura 10. Geometria complecsilor acidului 3-carboxibenzocumarinic cu HSA (a) si cu BSA (b). Este figurata pozitia TRP214, respectiv 212 (aflat in situsul Sudlow I) si pozitia ligandului in complecsii cei mai stabili.

b) Chiralitate indusa prin cuplaj excitonic intra- sau intermolecular Asa cum s-a aratat mai sus pentru cazul kaempferolului, corelarea datelor experimentale de ICD cu rezultatele

calculelor DFT permite identificarea speciei si conformatiei unui ligand achiral ce dobandeste chiralitate prin interactia cu un mediu chiral. In cele ce urmeaza sint prezentate rezultatele obtinute extinzind aceasta metoda la sisteme ligand–proteina in care chiralitatea indusa a ligandului se datoreste unui mecanism de cuplaj excitonic [10]. Patru liganzi model au fost selectati in acest scop, pentru abilitatea lor de a forma excitoni intra- si/sau intermoleculari: curcumina, auramina O, tacrina si benzo[a]piren. Pentru a identifica natura si numarul speciilor legate la proteina, s-au simulat spectrele ECD (B3LYP/6-31G(d,p), B3LYP/TZVP) pentru diferite conformatii ale speciilor neutre si/sau cationice ale liganzilor, in forma de monomer sau dimer, in absenta si in prezenta L-triptofanului. Rezultatele teoretice au fost comparate cu date experimentale de ICD din literatura, obtinute pentru interactia acestor liganzi cu alfa-1 glicoproteina [11]. Astfel, in fiecare caz, s-a identificat mecanismul responsabil pentru inducerea chiralitatii ligandului. Auramina O si tacrina se leaga in forma cationica, ca dimeri, cuplajul excitonic avind loc intre momentele de tranzitie apartinind la doua molecule individuale de ligand legat (Figura 11a si b). In cazul benzo[a]pirenului, cuplajul excitonic se produce preponderent intre tranzitii electronice apartinind ligandului legat si resturilor de aminoacizi situate in apropierea sa (L-triptofan in alfa-1 glicoproteine) (Figura 11c). Astfel, s-a aratat ca prin coroborarea rezultatelor de ICD cu calculele teoretice putem reproduce si interpreta caracteristicile spectrale ale benzilor excitonice.

300 350 400 450 500

-400

-200

0

200

EC

D

λ (nm)

auramina O, dimer

auramina O + L-Trp

exp.

a)

175 200 225 250 275

-300

-150

0

150

300

EC

D

λ (nm)

tacrina, dimer

tacrina + L-Trp

exp.

b)

225 300 375 450

-150

-75

0

75

EC

D

λ (nm)

benzo[a]piren, dimer

benzo[a]piren + L-Trp

exp.

c)

Figura 11. Spectre ECD simulate ale unor excitoni intermoleculari homo- (a, b) si heterocvasidegenerati (c).

8

In prezenta de alfa-1 glicoproteina, tacrina prezinta un semnal ECD indus cu doua benzi la 253 nm (+) si 239 nm (-) atribuit formarii unui exciton intermolecular [11]. In cazul tacrinei, formarea excitonilor a fost studiata avind in vedere doua aspecte: a) in scopul estimarii capacitatii metodelor teoretice de a simula spectrul ECD experimental [6], si b) pentru stabilirea limitelor in utilizarea conceptului de “cuplaj excitonic”, asa cum este descris de modelul Kasha [12], pentru explicarea aparitiei de semnale +/- in spectrul ECD. S-a studiat mai intii monomerul izolat (optimizare de geometrie, simulare de spectre), caracterizindu-se spectrele ECD si de absorbtie (in ceea ce priveste pozitia si semnul benzilor, taria oscilatorului, localizarea momentelor de tranzitie electric si magnetic), precum si starile excitate corespunzatoare (energie, forma functiilor de unda, localizare de orbitali moleculari). S-au construit apoi mai multe structuri pentru dimer, studiindu-se influenta factorilor geometrici asupra formei spectrului ECD simulat. Factorii geometrici considerati au fost distanta intercromoforica dintre centrii celor doi monomeri, diedrul dintre momentele electrice de tranzitie ale monomerilor, unghiul dintre distanta intercromoforica si momentul electric de tranzitie al monomerului, alte unghiuri ce descriu inclinarea si descentrarea unui monomer fata de celalalt. In construirea structurilor pentru dimer s-a pornit de la doua structuri optimizate de monomer, considerindu-se ca cele doua grupari fenil se gasesc fie de aceeasi parte a nucleelor acridinice centrale, fie de parti opuse. Intensitatea benzilor ECD, i.e. puterea rotatorie, depinde de distanta intercromoforica (Figura 12A), in timp ce semnul +/- al benzilor ECD a fost regasit pentru valori ale unghiului diedru dintre momentele electrice de tranzitie intre 0 si 90 de grade, si -90 si -180 de grade (Figura 12B). S-a observat ca raportul dintre intensitatile benzilor pozitiva si negativa scade odata cu scaderea simetriei dimerului (la inclinarea si/sau descentrarea unei molecule de monomer, Figura 12C). Prin coroborarea acestor informatii cu date asupra localizarii orbitalilor moleculari si compozitiei functiilor de unda s-a putut stabili pentru ce valori ale parametrilor geometrici sunt respectate regulile Kasha ale cuplajului excitonic, respectiv care dintre semnalele +/- obtinute pot cu certitudine sa fie atribuite formarii de excitoni intramoleculari. Influenta functionalei/setului de baza asupra formei spectrului ECD simulat este prezentata in Figura 12D. Functionalele folosite au fost B3LYP, CAM-B3LYP si B2PLYPD, cu seturi de baza 6-31G, aug-cc-pVDZ, TZVP si 6-311++G**. S-a constatat ca baza de orbitali atomici nu influenteaza semnificativ geometria monomerului, insa are efect asupra pozitiei benzilor.

200 220 240 260-300

-200

-100

0

100

200

(A)

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

15A

20A

λ (nm)

5A

10A

180 200 220 240 260

-100

-50

0

50

100

(B)

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

λ (nm)

40

80

-120

-160

180 200 220 240 260 280-75

-50

-25

0

25

50

(C)

1 monomer

inclinat la 75o

monomeri

paraleli

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

I+/I

-=0.32

I+/I

-=0.92

λ (nm)175 200 225 250 275

-150

-100

-50

0

50

100

150

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

exp.

6-31G

TZVP

6-311++G**

λ (nm)

-20

-10

0

10

20

(D)

θ (m

deg

)

Figura 12. Influenta distantei intercromoforice (A), a diedrului dintre momentele electrice de tranzitie ale monomerilor

(B) si a simetriei dimerului (C) asupra formei spectrului ECD simulat. (D) Influenta bazei de orbitali atomici asupra alurii spectrului ECD.

Localizarea dimerului in alfa-1 glicoproteina a fost modelata cu ajutorul programul Autodock. S-a lucrat in doua moduri,

simulind formarea succesiva de complecsi 1:1 si 1:2 si respectiv docind la proteina un dimer deja construit. Complecsii 1:2 in care distanta intercromoforica in dimer este de 7-10 A sint mai favorizati energetic (Einter. = 9-10 kcal/mol) decit complecsii formati de dimeri cu distante intercromoforice mici (3-4 A, Einter. = 6-7 kcal/mol). In cei mai stabili complecsi, dimerul este localizat la intrarea in situsul de legare al glicoproteinei (Figura 13), la 11 A distanta de restul Trp25.

Un alt sistem studiat este curcumina in interactie cu HSA sau AGP. Am avut ca obiectiv rationalizarea si explicarea datelor experimentale prin corelarea cu calcule de chimie computationala. Spectrul experimental la pH=7.4 prezinta 3 benzi, la 485, 423 si 368 nm, de semn (+), (-) si, respectiv (-) si raport de intensitati 1.0:0.7:1.4 in prezenta de HSA si la 472, 415, 360 nm, de semn (-), (+), (+), dar raport de intensitati 1.0:0.3:0.1 in prezenta de AGP, astfel ca exista diferente conformationale intre

9

lingandul in stare legata la cele doua proteine. Corelarea cu spectrele simulate ale tuturor speciilor posibile ale moleculei neutre indica interactia in conformatii torsionate diferite a speciei neutre la cele doua proteine la pH=7.4. La pH=9.0, forma spectrului experimental se modifica, existind 2 benzi de tip excitonic la 497 nm (+) si 427 nm (-). Din corelarea spectrului ECD simulat al diferitelor specii ionice posibile cu spectrul ICD experimental, s-a identificat specia care interactioneaza cu proteina in mediu bazic.

Figura 13. Geometria diferitilor complecsi de interactie ai tacrinei cu AGP si spectrul ECD simulat. INTERACTIA MOLECULELOR CHIRALE CU NANOPARTICULE METALICE Dupa cum se stie, tiolii se adsorb cu usurinta pe suprafata nanoparticulelor metalice de Ag si Au, de aceea am ales tioli

chirali, ca cisteina, tiocolesterol, glutationa ca molecule model pentru evidentierea interactiilor cu nanoparticulele prin spectroscopie ICD. In afara de acestea, ne-am propus sa studiem posibilitatea inducerii unui semnal de dicroism indus al nanoparticulelor in prezenta micelelor chirale si a proteinelor.

Metodele de preparare a nanoparticulelor pe care le-am utilizat sint prin reducere a azotatului de argint sau a acidului cloroauric cu citrat sau hidroborura de sodiu. Spectrele de absorbtie ale nanoparticulelor de Ag si Au astfel obtinute sunt prezentate in Figura 14. In fiecare caz s-a determinat concentratia optima a solutiei de nanoparticule si raportul molar intre acestea si compusul adsorbit pentru inregistrarea spectrelor ECD (absorbanta < 1), precum si conditiile experimentale ca pH, temperatura, taria ionica sau timpul de agitare. In unele conditii, NP devin instabile si isi modifica dimensiunile. In figura 14 este prezentat spre exemplificare spectrul ICD al NP de Ag in prezenta D-Cys, cu banda la 420 nm. Micelele chirale nu induc un semnal dicroic pe banda NP (probabil din cauza simetriei micelei, care mediaza semnalul ICD la zero). Pentru sistemele proteina-NP nu au fost gasite conditiile experimentale optime de inregistrare a spectrelor, problema necesitind citeva determinari suplimentare.

200 300 400 500 600 7000.0

0.5

1.0

1.5

A

λ (nm)

npAg (citrat)

npAg (NaBH4)

npAu

Figura 14. Spectre de absorbtie ale NP si dicroism circular indus in prezenta D-Cys.

200 220 240 260 280

-40

-20

0

20

cluster 1.1

cluster 2.1R

(10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

λ (nm)

200 300 400 500 600 700 8000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

A

λ (nm)

D-Cys(1x10-4

M):npAg-citrat(1x10-3

M), pH=10

1:1

1:2

1:4

300 400 500 600-10

-5

0

5

10

θ (

mg

rad

e)

λ (nm)

D-Cys

D-Cys+npAg

10

Pentru simularea spectrului ECD al acestui tip de sistem, am asimilat NP de Ag cu clusteri de atomi Ag55 si Ag56, cu un diametru de 1 Å (figura 15). Datele de literatura indica faptul ca de la aceasta marime, proprietati cum ar fi energia de legatura nu mai variaza semnificativ cu numarul de atomi. Considerarea unor clusteri mai mari este absolut prohibitiva dpdv al resurselor de calcul. Geometria moleculei adsorbite pe suprafata a fost optimizata, considerind mai multe moduri de adsorbtie. Densitatea starilor electronice a clusterului este extrem de mare pe unitatea de energie, ceea ce face ca numarul de tranzitii electronice posibile sa fie foarte mare. Aceasta constituie o dificultate in plus.

Ag55 Ag56

Figura 15. Geometria clusterilor de Ag care simuleaza NP. PROBE ICD

Metoda sondei moleculare de spin sau de fluorescenta este intens utilizata pentru studierea unor sisteme (macro)moleculare sau a unor procese, datorita versatilitatii ei. Probe ICD sunt mai putin studiate, dar metoda are un potential real, pentru ca semnalul ICD apare numai in urma interactiei chiral-achiral, iar forma acestuia este foarte sensibila la geometria si inconjurarea probei. Ca exemplificare din rezultatele obtinute, 3-carboxi-7-metoxicumarina este un ligand achiral cu doua grade de liberate chirale, care modifica foarte mult forma spectrului ECD, ceea ce il recomanda ca proba ICD. La adaugarea de BSA si HSA s-a putut observa un semnal dicroic indus, pozitionat la lungimile de unda de absorbtie ale ligandului si care prezinta caracteristici diferite in functie de natura proteinei. Astfel, in prezenta BSA s-au obtinut o banda negativa la 215 nm si 4 benzi pozitive in regiunea 230–380 nm (Fig. 16). Spectrul si-a pastrat caracteristicile pe un domeniu mare al raportului d/p. In prezenta HSA (Fig. 17), la un raport d/p pana la 1, s-au evidentiat urmatoarele benzi ICD: o banda negativa la 270 nm, 3 benzi pozitive in domeniul 280–380 nm. La rapoarte d/p 2-3 benzile de la lungime de unda mai mare s-au modificat forma ajungand sa aiba un aspect de banda tip exciton, atribuita unei interactii ligand:proteina 2:1. Conformatiile in care ligandul se leaga in situsurile proteinei au fost gasite prin docare moleculara cu ajutorul programului AutoDock Vina, urmata de o procedura de dinamica moleculara, iar pe baza lor au fost simulate TDDFT spectrele ECD ale moleculei izolate sau in prezenta resturilor de aminoacizi din situsul activ aflate la o distanta de 4 Å. Spectrele ECD simulate pentru toate aceste conformatii sunt in concordanta buna cu datele ICD experimentale in ceea ce priveste pozitia si semnul benzilor. Se observa forma diferita a spectrelor in functie de proteina sau raport molar.

200 240 280 320 360 400-40

-30

-20

-10

0

10

20

R (1

0-4

0 e

rg·e

su

·cm

/Ga

uss

)

λ (nm)

experimental × 9

structura din docking

(A) (B)

Fig. 16 (A) Comparatie intre spectrul ICD experimental si spectrul calculat al 3-carboxi-7-metoxicumarinei in BSA. (B) Structura obtinuta prin docare care a condus, in urma calculului TDDFT, la spectrul teoretic prezentat in (A).

11

280 300 320 340 360 380 400-3

-2

-1

0

1

2

3

4

CD

(m

deg

)

λ (nm)

[HSA]=0

d/p=1 d/p=2

d/p=3

260 280 300 320 340 360 380 400-4

-2

0

2

4

6

8

R (1

0-4

0 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss

)

λ (nm)

d/p =1 experimental

structura din docking

260 280 300 320 340 360 380 400-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

λ (nm)

d/p = 2 experimental×10

structura din docking

(A) (B)

(D)

(C)

(F) (E)

Fig 17. (A) Spectrele ICD experimentale ale 3-carboxi-7-metoxicumarinei in prezenta HSA la diferite valori d/p. (B) Structura obtinuta prin docare pentru un raport ligand:proteina 1:1 care a condus, in urma calculului TDDFT, la spectrul teoretic prezentat in (C). (D) geometria ligand+aminoacizi la distanta de 4 Å si variatia energiei in urma procedurii MD (E) Structura obtinuta prin docare pentru un raport ligand:proteina 2:1 care a condus, in urma calculului TDDFT, la spectrul teoretic prezentat in (F).

CONCLUZII Am demonstrat ca, prin corelarea spectrului experimental de dicroism circular indus al unor molecule achirale cu spectrul

simulat prin metode de calcul cuantic a diferitelor conformatii si specii posibile, se pot extrage informatii structurale asupra interactiei acestor molecule cu diferite medii anizotrope.

O.1. (A.1.1., A.1.2., A.1.3.) S-au studiat interactii chirale ale unor molecule relativ simple si s-a confirmat faptul ca dicroismul circular si

spectroscopia Raman aduc informatii complementare in ceea ce priveste acest tip de interactii. Corelarea datelor experimentale de dicroism circular indus cu cele teoretice permite determinarea geometriei complexului

si a modului de interactie, pe linga constantele de legare si stoechiometrie. Spectroscopia Raman completeaza imaginea prin informatii asupra modificarilor la nivelul gruparilor functionale.

O.2. (A.2.1., A.2.2., A.2.3., A.2.4.) S-au evidentiat interactii chirale in sisteme bimoleculare molecula chirala-molecula achirala, micela chirala-molecula

achirala, molecula chirala-amestec racemic. Derivatii de cumarina interactioneaza cu S-sec-butilamina prin formare de legaturi de H. S-sec-butilamina si micelele chirale determina aparitia unui exces enantiomeric pentru BLB.

O.3. (A.3.1., A.3.2., A.3.3., A.3.4., A.3.5., A.3.6.) In cazul complecsilor de incluziune cu ciclodextrinele, pe linga determinarea constantelor de legare si a stoechiometriei,

aspectul cel mai important este estimarea, prin corelare spectru ICD experimental-simulat, a speciei incluse si a conformatiei ligandului. S-au studiat mai multe tipuri de complecsi cu albuminele, care au inclus excitoni de tip intra- sau intermoleculari si s-au rationalizat rezultatele experimentale si teoretice.

O.4. (A.4.1., A.4.2., A.4.3., A.4.4., A.4.5.) A fost pusa in evidenta inducerea unui semnal dicroic al unor nanoparticule metalice de catre tioli chirali in anumite

conditii experimentale. Aceasta directie poate fi dezvoltata in cadrul unui proiect viitor. O.5. (A.5.1., A.5.2., A.5.3., A.5.4.) Metodologia utilizata de corelare a datelor experimentale cu cele teoretice pentru molecule flexibile a pus in evidenta

posibilitatea dezvoltarii unor probe ICD. Metoda de caracterizare a situsului activ al proteinelor prin probe ICD poate fi extinsa la alte sisteme supramoleculare.

O.6. (A.6.1., A.6.2.) Corelarea unor metode spectroscopice concertate cu date complexe de chimie computationala permite caracterizarea

liganzilor dpdv spectroscopic si a interactiilor acestora cu macromoleculele. Sint necesare determinari de spectroscopie de dicroism circular, Raman, simularea prin metode cuantice (TDDFT) a spectrelor ECD si Raman ale moleculelor izolate, solvatate sau in prezenta unor modele ( uneori simplificate) ale macromoleculelor respective. Metodologia de lucru a fost dezvoltata si va fi utilizata in alte proiecte in laboratorul de Structura moleculara al facultatii.

Din rezultatele proiectului, s-au publicat pina in prezent 4 articole: ref. 6, 7,postere la conferinte internationale. O parte arentltatelor se afla in curs de redactare si

9 si 13. Au fost prezentate un numar de 8vor fi ulterior publicate in jurnale ISI.

BIBLIOGRAF'IE

t . Nina Berova, Prasad L. Polavarapu, Koji Nakanishi, Robert W. Woody, Eds. "Comprehensive ChiropticalSpectroscopy", JOHN WILEY & SONS, [NC., New Jersey,2ll2.

2 . I. Matei, S. Ionescu, M. Hillebrand, J. Mol. Model. 18 (2012) 43814387.' , I. Matei, S. Ionescu, M. Hillebrand, Spectrochim. Acta A. 96 (2012) 709-:715.o . S. Allenmark, Chirality 15 (2003) 409422.t . Nina Berova, Prasad L. Polavarapu, Koji Nakanishi, Robert W. Woody, Eds. "Comprehensive Chiroptical

Spectroscopy", JOHN WILEY & SONS, INC., New Jersey,2012.u . S. Ionescu, I. Matei, C. Tablet, M. Hillebrand, Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (2013) 11604--111614.t . S. Ionescu, I. Matei, C. Tabtet, M. Hillebrando Curr. Drug Metab. 14 (2013) 474490.t . Marco Pistolozzi, Carlo Bertucci, Chirality 20,552-558 (2008).n . R. Sandu, C. Tablet, M. Hillebrand, J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem. 77 (2013) 183-193.to. N. Berova, L. Di Bari and G. Pescitelli, Chem. Soc. Rev. 36 (2007)914-931.tt. F. Zsila, H. Matsunaga, Z. Bikadi and J. Haginaka, Biochim. Biophys. Acta 1760 (2006) 1248-1273.t'. M. Kasha, H.R. Rawls, M. Ashraf El-Bayoumi, Pure Appl. Chem. 11 (1965) 371192.t'. G. Petrareanu, M. Balasu, A. Vacaru, C. Munteanu, A. Ionescu, I. Matei, S. Szedlacsek, Appl. Microbiol.

Biotechnol. 98 (2014') 7855-7867.

12