LUCRARE METODICO-TIINIFIC PENTRU OBINEREA GRADULUI DIDACTIC I

COORDONATOR TIINIFIC : conf. dr. Anioara Cmpean

CANDIDAT: prof. S.I Veronica Carmen Tudose(Stavarache)IMPLANTURILE DENTARE I IMPORTANA STUDIILOR DE BIOLOGIE N EVALUAREA BIOCOMPATIBILITII LORLUCRARE METODICO-TIINIFIC PENTRU OBINEREA GRADULUI DIDACTIC IStructura lucrrii metodico-tiinifice

INTRODUCEREMORFOLOGIA PARODONIULUINOIUNI DE ANATOMIE A DINILORBIOMATERIALE N IMPLANTALOGIA DENTAR I BIOCOMPATIBILITATEACERCETRI PERSONALEASPECTE METODICE PRIVIND PREDAREA LECIILOR DE IGIEN LA GIMNAZIU I LA LICEUargumentMaterialele dentare reprezinta de un timp indelungat componentele esentiale ale unui tratament eficient al starilor dentare patologice. Totusi, desi s-au realizat imbunatatiri semnificative ale calitatii materialelor de restaurare dentara cu trecerea anilor, majoritatea restaurarilor necesita sa fie inlocuite in timp si chiar sunt necesare biomateriale mai bune. Exista putina informatie despre efectele biologice adverse ale materialelor dentare. In ciuda folosirii de lunga durata a anumitor materiale de restaurare , exista inca intrebari in ceea ce priveste comportamentul lor in mediul biologic.Linii celulare folosite n studiile de biocompatibilitateFibroblaste gingivale umane

osteoblaste

PREMISELE CERCETARIIExist un numeroase studii care au demonstrat c o serie de implanturi elibereaz n mediu compui (n special ioni metalici) cu poteniale efecte citotoxice, situaie cu att mai grav cu ct avem de a face cu reacii care pot avea loc n cavitatea bucal.

ScOPUL CERCETARIIStandardizarea unor metode in vederea evaluarii citotoxicitatii materialelor dentare care au patruns pe piata romaneasca.OBIECTUL CERCETARIIn aceasta lucrare este prezentat comportamentul in vitro al fibroblastelor gingivale umane (linia celular HGF-1) i osteoblastelor fetale umane (hFOB 1.19) crescute in contact cu diferite suporturi cu poteniale implicaii n implantologia dentar: 1) discuri de titan comercial cu suprafee lefuite cu hrtie metalografic de SiC cu diferite grade de rugozitate; 2) discuri de titan (Ti/ TiO2) cu suprafee lefuite pe care s-a depus o pelicul de TiO2 de diferite grosimi si rugozitati; 3) discuri de material ceramic a cror component principal este oxidul de zirconiu, preparate conform normelor ISO 13356 (Biozyr).Rezultatele obinute cu aceste materiale au fost comparate cu culturile control ce au fost realizate pe suprafee de plastic.

MATERIALE STUDIATEMETODOLOGII I TEHNICI DE TESTARE IN VITRO A BIOCOMPATIBILITII IMPLANTURILOR DENTARE1. EVALUAREA VIABILITII I MORFOLOGIEI CELULAREA. Studiul potenialului citotoxic manifestat de biomateriale prin determinarea activitii extracelulare a lactat dehidrogenazeiB. Evaluarea viabilitii celulare prin determinarea metabolismului energetic celular testul MTT

2. METODE MICROSCOPICE DE EVALUARE A INTERACIILOR CELULE-MATERIAL DENTARMetode imunochimice de evaluare a interaciilor celul-suport

3.STUDIUL POTENIALULUI PROLIFERATIV

MORFOLOGIA CELULAR

Morfologia celularMorfologia celular poate fi evideniat prin microscopie n contrast de faz la intervale de 24 ore, cu scopul de a evidenia modificrile fenotipice ale celulelor de pe suportul de plastic crescute n prezena materialului de testat pn cnd ajung la confluen. Pentru a obine informaii despre morfologia celulelor crescute pe materialele studiate a fost realizat un studiu de detectare n fluorescen a actinei, principala protein a citoscheletului.STUDII PE FIBROBLASTE GINGIVALE

Morfologia n contrast de faz a fibroblastelor gingivale la 48 ore de la nsmnare: A cultura control; B n vecintatea suportului de Ti; C n vecintatea suportului Biozyr A. B. C.MORFOLOGIA CELULARNu exist diferene semnificative de aspect citomorfologic i densitateCelule alungite cu aspect fusiform tipic14STUDII PE osteoblaste

Figura 25. Morfologia n contrast de faz a celulelor hFOB 1.19 la 48 ore de la nsmnare: a cultura control; b n vecintatea suportului de Ti; c n vecintatea suportului BiozyrA.B. C.MORFOLOGIA CELULAR Celule cu aspect poligonal, uor alungiteNu exist diferene semnificative de aspect citomorfologic i densitateViabilitatea celular

Viabilitatea celularExist un numr mare de studii care au demonstrat c o serie de implanturi elibereaz n mediu compui (n special ioni metalici) cu poteniale efecte citotoxice, situaie cu att mai grav n cazul implantelor dentare cu ct avem de a face cu reacii care pot avea loc n cavitatea bucal.17

Figura 21. Rata de supravieuire a celulelor HGF-1, expuse timp de 72 ore n condiii standard de cultivare (control) i la suporturile Biozyr (Zr) i de titan (Ti)Figura 22. Evaluarea eliberrii LDH n mediul de cultur de ctre fibroblastele gingivale n condiii standard i n prezena suporturilor Biozyr (Zr) i titan (Ti)VIABILITATEA CELULAR studii pe fibroblasteTestul MTT, demonstreaz o proliferare uor mai mare n vecintatea substratului Biozyr ceea ce-l recomand ca un material mai bun pentru implantologia oral.Testul LDH, ale crui rezultate sunt prezentate n figura 22 a indicat c viabilitatea celulelor nu este afectat de expunerea la cele dou tipuri de materiale, valorile activitii acestei enzime nenregistrnd creteri n raport cu controlul.

18Testul MTT, demonstreaz o proliferare uor mai mare n vecintatea substratului Biozyr ceea ce-l recomand ca un material mai bun pentru implantologia oral.

Testul LDH, ale crui rezultate sunt prezentate n figura 22 a indicat c viabilitatea celulelor nu este afectat de expunerea la cele dou tipuri de materiale, valorile activitii acestei enzime nenregistrnd creteri n raport cu controlul.VIABILITATEA CELULAR- studii pe osteoblaste

Figura 26 . Rata de supravieuire a celulelor hFOB 1.19 crescute pe suporturi de plastic, Ti i oxid de zirconiu (Zr)Figura 27 . Evaluarea eliberrii LDH n mediul de cultur de ctre hFOB 1.19 n condiii standard i n prezena suporturilor titan (Ti) i Biozyr (Zr)Testele de proliferare MTT (figura 26) i citotoxicitate LDH (figura 27) sugereaz c viabilitatea osteoblastelor nu este afectat semnificativ de prezena Ti i a materialului ceramic Biozyr. Prin urmare, aceste rezultate mpreun cu datele de microscopie n contrast de faz demonstreaz c cele 2 materiale studiate nu afecteaz semnificativ morfologia celular i nu induc efecte citotoxice att n culturile de fibroblaste gingivale ct i de osteoblaste fetale umane.

Studiul exprimrii actinei din citoschelet

22

Figura 24. Evidenierea prin microscopie de fluorescen a morfologiei i distribuiei celulelor HGF-1 (marcate faloidina-FITC pentru evidenierea exprimrii actinei F) pe: a Suport control;b Suport de Ti cu suprafaa de rugozitate medie;c i d Suporturi de Ti cu film de TiO2 cu grosime, morfologie i rugozitate, diferite. ABCDScade densitatea contact guidancecontact guidanceDistribuie aleatorieAcest marcaj ofer indicii asupra morfologiei i orientrii celulelor cultivate pe aceste suporturi. Astfel, pe suprafaa neted a suportului de plastic (a), fibroblastele sunt orientate aleatoriu, i prezint o morfologie caracteristic unor celule bine etalate. Pe de alt parte, celulele cultivate pe Ti neacoperit i pe film de TiO2 cu diferite grade de rugozitate, sunt alungite, cu filopodii de diferite dimensiuni i aliniate aproximativ paralel unele fa de altele (b), (c) i (d). Acest lucru se datoreaz fenomenului denumit contact guidance conform cruia celulele sunt orientate n sensul gridurilor de pe suprafaa unui substrat. n plus, densitatea celular scade pe masur ce rugozitatea suportului crete fapt ce sugereaz c fibroblastele gingivale prefer suprafeele netede.

Figura 28 . Evidenierea prin microscopie de fluorescen a exprimrii actinei F n citoscheletul celulelor hFOB 1.19 crescute pe: a Suport control; b Suport de Ti cu suprafa neted; c Suport de Ti cu film compact de TiO2 cu suprafa rugoas; Suport de Ti cu film de TiO2 cu morfologie colonar i suprafa neted. Nucleii sunt marcai cu DAPI.ABDC

Se constatprezint o morfologie ca pe suprafeele netede celulele hFOB 1.19 poligonal tipic, cu prelungiri citoplasmatice scurte i o distribuie aleatorie, iar pe suprafaa rugoas, celulele au un contur poligonal alungit, cu prelungiri citoplasmatice mai lungi, ceea ce sugereaz o aderen puternic la substrat, i tind s formeze aliniamente paralele ca rezultat al fenomenului de contact guidance.O constatare important este faptul c densitatea celular cea mai mare se nregistreaz pe suportul (c) caracterizat prin cea mai mare rugozitate, fapt ce demonstreaz c, spre deosebire de FB, OB prefer suprafeele rugoase.

ADEZIUNEA CELULAR

Studiul expresiei FN sintetizate de FB gingivale pe suporturile testate

Figura 30 . Detectarea FN sintetizate de celulele HGF-1 pe: a Suportul control; b Suport de Ti comercial; c Suport de Ti acoperite cu film de TiO2 fin; d Suport de Ti acoperit cu un strat de TiO2 cu rugozitate crescut.

ABCDMarcaj absentDistibuie aleatorieImaginile din figura 30 demonstreaz un nivel diferit de expresie a FN i a adeziunii celulare pe suprafeele studiate. Dac se compar controlul (a) cu suprafaa de Ti comercial (b), se observ o distribuie aleatorie a reelei de FN. Pe celelalte suporturi (cu suprafata rugoasa), filamentele FN sunt orientate aproape paralel ntr-o direcie comun, dictat probabil de topografia iniial a substratului. Suportul de Ti care are cel mai fin strat de TiO2 (c) i o suprafa mai puin rugoas, prezint un nivel de expresie a FN similar cu cel evideniat n experimentul control. Pe suportul care prezint cea mai mare rugozitate a stratului de TiO2 (d), marcajul este aproape inexistent fapt ce demonstreaz c fibroblastele gingivale ader mai bine pe suprafee mai puin rugoase. Studiul exprimrii FN sintetizate de osteoblaste pe suporturile testate

Figura 31. Exprimarea FN de ctre osteoblastele fetale umane crescute pe suporturi: a Suporturi de plastic (control); b Suport de Ti cu film de TiO2 cu morfologie compact i compoziie rugozitate medie; c Ti anodizat;d Suporturi de Ti cu film de TiO2 cu morfologie colonar i rugozitate foarte mare.A BC DNivel redus de expresie a FN i o reea fibrilar intreruptDistribuie uniformDupa cum reiese din figura 31, nu se observ diferene semnificative n organizarea reelei de FN de ctre osteoblastele cultivate pe suporturile analizate. Excepie face suportul de Ti/TiO2 cu structur colonar i cel mai mare nivel de rugozitate, alctuit aproape exclusiv din rutil (d), care conduce la cel mai redus nivel de expresie a FN i o reea fibrilar ntrerupt.Se observ o expresie puternic i o distribuie uniform a FN n experimentul control. O organizare fibrilar similar i un nivel de expresie uor crescut se constat pe suprafeele de Ti cu film de TiO2 cu morfologie compact i rugozitate medie (b) i Ti anodizat (c). Inclusiv aceste studii au relevat c osteoblastele prefer suprafeele moderat rugoase spre deosebire de fibroblastele gingivale care manifest o adeziune mai puternic pe suprafeele netede.

PROLIFERAREA CELULAR

Detectarea ncorporrii 5`-brom deoxiuridinei de ctre fibroblastele gingivale umane

Figura 32. Detectarea imunofluorescent a BrdU ncorporat n timpul sintezei ADN de ctre celulele HGF-1 crescute pe: a Suportul de plastic (control); b Suport acoperit cu film de TiO2 cu rugozitate foarte mic; c Suport de Ti comercial cu suprafaa neteda; d Suport de Ti acoperit cu film de TiO2 cu rugozitate foarte mare.A BC DFrecventa cea mai mareFrecventa cea mai micaNivele similareStudiul potenialului proliferativ manifestat de ctre fibroblastele gingivale a demonstrat existena unui numr crescut de nuclei fluoresceni pe suprafeele cele mai netede [Fig.32 a, b i c]. n ceea ce privete suporturile acoperite cu dioxid de Ti (b si d), imaginile indic faptul c niciunul din aceste suporturi nu determin un grad de proliferare celular mai mare dect experimentul control.Totui, comparnd suporturile acoperite cu filme de TiO2 ntre ele, s-a constatat c frecvena cea mai mare a nucleilor marcai fluorescent se constat n cazul suportului acoperit cu o pelicul fin de TiO2 (b), care manifest i un grad mic de rugozitate. n cazul suportului cu rugozitate mare se observ un numr mic de nuclei marcai. n concluzie, se poate afirma c valori crescute ale rugozitii suprafeei de TiO2 pot influena negativ proliferarea. Aceste rezultate sunt n concordan cu rezultatele testelor prezentate anterior care demonstreaz c FB gingivale prezint un grad mai mare de biocompatibilitate fa de suprafeele netede.Detectarea ncorporrii 5` - brom deoxiuridinei de ctre osteoblastele umane

Figura 33. Detectarea imunofluorescent a BrdU ncorporate n timpul sintezei ADN de ctre osteoblastele fetale umane cultivate pe: a Suport de plastic (control); b Suport de Ti acoperit cu TiO2, de rugozitate crescut si cu morfologie colonara; c Suport de Ti acoperit cu TiO2, de rugozitate foarte mic si morfologie compact; d Suport de Ti anodizat de rugozitate mic si morfologie compactaA BC DFrecventa scazutaNivele crescute de exprimaren figura 33 sunt prezentate rezultatele deteciei BrdU ncorporate n AND-ul osteoblastelor cultivate pe urmtoarele suporturi: de plastic (a), Ti acoperit cu film de TiO2 de rugozitate crescut; c) suport de Ti acoperit cu film de rugozitate foarte mic; d) suport de Ti anodizat cu suprafa de rugozitate mic.Se constat c pe suportul cu suprafaa cea mai rugoas (b) se nregistreaz cea mai sczut frecven a celulelor cu semnale pozitive la nivelul nucleului (celule care se gsesc n faza S a ciclului celular). Suprafeele cele mai netede (a, c i d) manifest nivele ridicate de ncorporare a BrdU. concluziiRezultatele obinute au demonstrat c att materialele ceramice (pe baza de dioxid de zirconiu) ct i cele metalice (Ti i Ti acoperit cu filme de TiO2) prezint un nivel ridicat de biocompatibilitate.Totui se remarc un rspuns diferit al FB gingivale i al OB la materialele testate determinat n primul rnd de rugozitatea suprafeelor i mai puin de compoziia chimic a materialului. Astfel, este evident c FB prefer suprafeele netede n timp ce OB manifest preferin n special fa de suprafeele rugoase. Aceste date sunt n concordan cu rezultatele raportate n literatura de specialitate.