Platelia™ EBV-VCA IgM 1 placă - 96 72936 METODĂ IMUNOENZIMATICĂ PENTRU DETERMINAREA CALITATIVĂ ÎN SER UMAN A ANTICORPILOR IgM SPECICI DE ANTIGENUL CAPSIDAR AL VIRUSULUI EPSTEIN-BARR

2015/04 1 - SCOPUL TESTĂRII Această trusă imunoenzimatică se foloseşte pentru determinarea calitativă a anticorpilor IgM dirijaţi împotriva antigenului capsidei virale (VCA) a virusului Epstein-Barr (EBV-VCA) în serul uman. Testarea PlateliaTM EBA-VCA IgM poate fi utilizată în conjuncţie cu altă serologie pentru Epstein-Barr (PlateliaTM EBV-VCA IgG, PlateliaTM

EBV-EA-D IgG şi PlateliaTM

EB-NA-1 IgG) ca element ajutător în diagnosticul mononucleozei infecţioase. 2 - IMPORTANŢA CLINICĂ Virusul Epstein-Barr (EBV) este un patogen uman obişnuit, afectând 80% dintre adulţi în SUA. Încă de la descoperirea lui în 1964, EBV a fost implicat etiologic într-un număr crescând de boli umane, cum este şi mononucleoza infecţioasă. EBV a mai fost asociat şi cu limfoamele cu celule B la persoanele imunodeprimate, incluzând atât pacienţii cu transplant cât şi pe cei cu SIDA. După caracteristicile morfologice, EBV face parte din familia Herpesviridae. Toate virusurile herpetice au capacitatea de a stabili infecţii latente la gazdele lor. Mononucleoza infecţioasă (MI) este o boală acută, limfoproliferativă autolimitantă, produsă de EBV. Deşi infecţia primară cu EBV apărută în copilărie este adesea asimptomatică, aproape jumătate până la două treimi dintre infecţiile primare cu acest virus la adolescenţi şi adulţi tineri determină apariţia unei boli clinc manifestă cum este MI, prezentând următoarele simptome: faringită în puseu febril, tonsilită, limfadenopatie, stare de rău general, cefalee, mialgie, spleno- şi hepatomegalie, erupţie tegumentară şi leucocitoză. Infecţia cu EBV are ca rezultat producerea de anticorpi împotriva a patru complexe distincte: antigenul nuclear indus [EBV induced Nuclear Antigen, EBNA], antigenul timpuriu [EBV induced Early Antigen, EA], antigenul capsidar [Viral Capsid Antigen, VCA] şi antigenul memebranar indus [EBV induced Membrane Antigen, MA]. Complexul EA este divizat în două componente care includ EA-D (componenta difuză) şi EA-R (componenta de restricţie). Anticorpii IgM anti-VCA sunt detectabili de timpuriu în cursul evoluţiei bolii. Nivelele de anticorpi cresc şi ating un maxim după 3-4 săptămâni, apoi scad până la nivele nedetectabile. 3 - PRINCIPIUL TESTĂRII Principiul truselor Bio-Rad ELISA se bazează pe capacitatea substanţelor biologice (ex. antigenele) de a fi adsorbite de suprafeţele din plastic cum sunt cele din polistiren (faza solidă). Trusa PlateliaTM EBV-VCA IgM se bazează pe tehnologia ELISA şi utilizează antigene VCA purificate fixate la faza solidă (în godeurile microplăcii). Când antigenele fixate la faza solidă intră în contact cu serul pacientului, anticorpii specifici de antigen, dacă sunt prezenţi, vor lega antigenul de pe faza solidă, formând complexele antigen-anticorp. O soluţie de tratare prealabilă a serului este utilizată pentru a îndepărta eventualele interferenţe cauzate de IgG şi IgM-FR. Excesul de anticorpi este înlăturat prin spălare. Aceasta este urmată de adăugarea conjugatului alcătuit din imunoglobuline de capră specifice de IgM umane şi marcate cu peroxidază din hrean, ce se ataşează la complexele antigen-anticorp. Excesul de conjugat este înlăturat prin spălare, apoi se adaugă substratul tetrametil benzidină (TMB). Dacă în serul pacientului se găsesc anticorpi IgM specifici de antigenul EBV-VCA, apare culoarea albastră. Când reacţia enzimatică este stopată cu H2SO4 1N, conţinutul godeurilor se colorează în galben. Culoarea, care este direct proporţională cu concentraţia de anticorpi din serul uman, poate fi citită cu un spectrofotometru adecvat sau cu cititorul de microplăci ELISA. Sensibilitatea, specificitatea şi reproductibilitatea dozărilor ELISA pot fi comparabile cu alte tehnici serologice pentru anticorpi, cum ar fi imunofluorescenţa, tehnica fixării complementului, hemaglutinarea şi testarea imunoradioizotopică.

4 - CONŢINUTUL TRUSEI Toţi reactivii sunt exclusiv destinaţi diagnosticului in vitro.

Etichetă Natura reactivilor Prezentare

R1 Microplate Microplaca: 12 barete (8 godeuri fiecare) sensibilizate cu antigen viral capsidar de EBV (gp 125) purificat prin afinitate şi inactivat, păstrate într-o pungă de aluminiu cu deshidratant-indicator de umiditate

1

R2 Concentrated

Washing Solution 20x)

Soluţie de spălare concentrată (20x) Tampon Tris (pH 7,2 ± 0,2) cu 1% Tween® 20. Conservant: ProClin™ 300 (0,1%)

1 x 50 ml

R3 Non

Reactive control

Control negativ (uman) pentru anticorpi IgM anti-EBV-VCA. Negativ pentru AgHBs şi HIV-1, HIV-2 şi anticorpi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi penicilină/streptomicină (0,01%)

1 x 0,4 ml

R4a Positive Control I

Control pozitiv I (uman) pentru anticorpii IgM anti-EBV-VCA. Negativ pentru AgHBs şi HIV-1, HIV-2 şi anticorpi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi penicilină/streptomicină (0,01%)

1 x 0,4 ml

R4b Positive Control II

Control pozitiv II (uman) pentru anticorpii IgM anti-EBV-VCA. Negativ pentru AgHBs şi HIV-1, HIV-2 şi anticorpi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi penicilină/streptomicină (0,01%)

1 x 0,4 ml

R5 Calibrator

Calibrator (uman) pentru anticorpii IgM anti-EBV-VCA, cu factorul de corecţie specific trusei imprimat pe eticheta flaconului. Negativ pentru AgHBs şi HIV-1, HIV-2 şi anticorpi anti-HCV. Conservanţi: azidă de sodiu (<0,1%) şi penicilină/streptomicină (0,01%)

1 x 0,4 ml

R6 Conjugate Conjugat (gata de lucru): anticorpi de capră anti-IgM umane, marcaţi cu peroxidază din hrean; Conservanţi: ProClin™ 300 (0,1%) şi gentamicină.

1 x 16 ml

R7 Diluent II

Diluant II: tampon gata de lucru (pH 7,5) cu stabilizatori proteici. Conţine imunoglobuline de capră/oaie anti-IgG umane pentru adsorbţia serului în vederea îndepărtării IgG competitive. Conservant: ProClin™ 300 (0,1%).

2 x 45 ml

R9 Chromogen TMB

Soluţie Cromogen/Substrat (gata de lucru): Tetrametil benzidină (TMB). Reactivul trebuie să rămână închis când nu este utilizat, în caz contrar se poate forma un precipitat în godeurile de reacţie.

1 x 15 ml

R10 Stopping Solution

Soluţie de stopare (gata de utilizat): acid sulfuric 1N 1 x 15 ml

5 - PRECAUŢII ŞI AVERTISMENTE PRECAUŢII Calitatea rezultatelor depinde de aplicarea corectă a următoarelor Bune Practici de Laborator: • Nu utilizaţi reactivi expiraţi • Nu amestecaţi reactivii din loturi diferite în aceeaşi serie de testare REMARCĂ: puteţi utiliza din alte loturi decât cele din trusă soluţia de spălare (R2), soluţia cromogen/substrat (R9) şi soluţia de

stopare (R10). Aceşti reactivi pot fi folosiţi cu trusele PlateliaTM EBV-VCA IgG, PlateliaTM EBV-EA-D IgG şi PlateliaTM EB-NA-1 IgG din catalogul nostru. Contactaţi serviciul nostru tehnic pentru a obţine informaţii detaliate.

• Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 minute pentru ca reactivii să ajungă la temperatura camerei • Reconstituiţi reactivii cu grijă, evitând contaminarea • Nu efectuaţi testul în prezenţa unor vapori reactivi (acizi, alcalini, aldehidici) sau a prafului, deoarece ar putea altera

activitatea enzimatică a conjugatului. • Utilizaţi sticlărie foarte bine spălată şi clătită cu apă distilată sau de preferat, utilizaţi materiale de unică folosinţă. • Nu lăsaţi microplaca să se usuce între sfârşitul operaţiunilor de spălare şi distribuirea reactivilor. • Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la ionii metalici. În consecinţă, nu permiteţi ca nici un element metalic să intre în

contact cu conjugatele sau soluţia substrat. • Soluţia cromogen/substrat trebuie să fie incoloră. Apariţia unei coloraţii indică faptul că acel reactiv nu mai poate fi utilizat şi

trebuie înlocuit. Păstraţi soluţia la întuneric. • Utilizaţi un vârf de pipetă nou pentru fiecare probă. • Spălarea microplăcii este o etapă esenţială în procedeul de lucru: respectaţi numărul recomandat de cicluri de spălare şi

asiguraţi-vă că toate godeurile sunt complet umplute şi apoi complet golite. Spălările incorecte pot duce la rezultate imprecise.

• Niciodată nu utilizaţi acelaşi recipient pentru a distribui conjugatul şi soluţia de developare. • Verificaţi pipetele şi restul echipamentului pentru precizie şi bună funcţionare. • Nu modificaţi procedeul de lucru. INSTRUCŢIUNI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII Toţi reactivii sunt destinaţi diagnosticului in vitro. • Utilizaţi mănuşi de unică folosinţă când manipulaţi reactivii • Nu pipetaţi cu gura • Materialul de provenienţă umană utilizat la prepararea reactivilor a fost testat şi a fost găsit nereactiv pentru antigenul de

suprafaţă al virusului hepatitic B (AgHBs), anticorpii anti-virus hepatitic C (anti-HCV) şi anti-virusul imunodeficienţei umane (anti-HIV1 şi anti-HIV2). Pentru că nici o metodă nu poate garanta absenţa absolută a agenţilor infecţioşi, mânuiţi reactivii de origine umană şi prelevatele clinice ca şi cum ar putea transmite boli infecţioase.

• Orice material, inclusiv soluţia de spălare, ce vine în contact direct cu prelevatele şi cu reactivii de origine umană, trebuie considerat potenţial infecţios.

• Evitaţi stropirea cu probe biologice sau soluţii conţinând probe biologice • Suprafeţele stropite se vor curăţa cu clor menajer diluat la 10%. În eventualitatea stropirii cu acid, acesta trebuie mai întâi

neutralizat cu bicarbonat de sodiu, apoi curăţat cu clor menajer şi uscat cu hârtie absorbantă. Materialul utilizat la curăţenie trebuie aruncat într-un container de reziduuri contaminate.

• Probele biologice, reactivii de origine umană ca şi materialele produsele contaminate, trebuie aruncate după decontaminare: - fie prin introducerea în clor la concentraţie finală de 5% hipoclorit de sodiu, timp de 30 minute - fie prin autoclavare la 121ºC timp de minim 2 ore.

Autoclavarea pentru cel puţin o oră la 121ºC este metoda cea mai bună pentru inactivarea virusurilor HIV şi a virusului hepatitei B. ATENŢIE: NU INTRODUCEŢI ÎN AUTOCLAVĂ SOLUŢII CU HIPOCLORIT DE SODIU ! • Mânuirea şi eliminarea chimicalelor trebuie efectuată conform Bunelor Practici de Laborator. • Evitaţi orice contact al tegumentelor sau mucoaselor cu tamponul substrat, cromogenul şi soluţia de stopare (risc de

toxicitate, iritaţii sau arsuri). • Unii reactivi conţin azidă de sodiu pentru conservare. Azida de sodiu poate reacţiona cu plumbul sau cuprul din conductele

canalizării determinând producerea de azide metalice explozive. Pentru a preveni formarea azidelor, spălaţi din abundenţă cu apă dacă soluţiile conţinând azide au fost eliminate la canalizare după ce au fost inactivate.

• Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente chimice din acest kit de test, vă rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la www.bio-rad.com.

6 - MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ • Agitator tip vortex • Cititor de microplăci echipat cu filtre de 450 nm (*). • Container pentru deşeurile contaminate • Hipoclorit de sodiu (clor menajer) şi bicarbonat de sodiu. • Apă distilată sau deionizată. • Cilindri gradaţi. • Mănuşi din latex de unică folosinţă • Ochelari sau mască de protecţie • Hârtie absorbantă • Pipete sau pipete multi-canal, automate sau semiautomate, reglabile sau fixe, pentru a măsura şi pipeta 10, 100 şi 1000 μl. • Spălător de microplăci manual, semiautomat sau automat (*). • Eprubete de unică folosinţă. (*) Consultaţi departamentul tehnic pentru informaţii detaliate despre echipamentul recomandat. 7 - RECONSTITUIREA ŞI STOCAREA REACTIVILOR Trusa trebuie păstrată la temperatura de +2-8ºC până la data expirării inscripţionată pe cutie (în afara indicaţiilor speciale). Înainte de utilizare, lăsaţi reactivii să ajungă la temperatura camerei (+21-25ºC). Introduceţi imediat toţi reactivii în frigider după utilizare. 1) Reactivi gata de lucru • Reactivul 1 (R1): microplaca Fiecare cadru-suport conţinând 12 barete, se găseşte într-o pungă cu nervură, sigilată. Tăiaţi punga cu foarfecele sau bisturiul la 0,5-1 cm deasupra nervurii. Deschideţi punga şi scoateţi cadrul. Reintroduceţi baretele neutilizate imediat în pungă. Închideţi cu grijă punga şi introduceţi-o la +2-8ºC. Astfel păstrate, baretele sunt stabile timp de o lună.

• Reactivul 3 (R3): controlul negativ • Reactivul 4a (R4a): controlul pozitiv I • Reactivul 4b (R4b): controlul pozitiv II • Reactivul 5 (R5): calibratorul • Reactivul 6 (R6): conjugatul • Reactivul 7 (R7): diluantul II • Reactivul 9 (R9): soluţie cromogen/substrat • Reactivul 10 (R10): soluţia de stopare 2) Reactivi de reconstituit • Reactivul 2 (R2): soluţia de spălare concentrată 20x Diluaţi 50 ml din soluţia de spălare 20x la volum final de 1,0 l cu apă distilată şi/sau deionizată pentru a obţine soluţia de lucru. Omogenizaţi bine. După diluare, păstraţi soluţia la +2-8ºC timp de 5 zile. 8 - PROBELE BIOLOGICE Recoltaţi probele de sânge conform practicilor curente. Testul se va efectua cu probe nediluate. Separaţi serul de cheag sau de hematii cât mai repede posibil pentru a evita hemoliza. Hemoliza intensă poate afecta performanţa testului. Probele care prezintă agregate trebuie clarificate prin centrifugare înainte de testare. Particulele de fibrină sau agregatele în suspensie pot duce la rezultate fals pozitive. Probele pot fi păstrate la +2-8ºC dacă testul se efectuează în 5 zile sau pot fi congelate la -20ºC timp de mai multe luni. Evitaţi congelările/decongelările repetate. Dacă prelevatele trebuie expediate, acestea trebuie ambalate conform reglementărilor în vigoare referitoare la transportul agenţilor etiologici. NU UTILIZAŢI SERURI CONTAMINATE, HIPERLIPEMICE, ICTERICE, INTENS HEMOLIZATE SAU INACTIVATE TERMIC. 9 - PROTOCOLUL DE LUCRU Urmaţi cu stricteţe protocolul de lucru. Utilizaţi calibratorul şi controalele în fiecare serie de determinări pentru a valida rezultatele testului. Respectaţi următoarele Bune Practici de Laborator: 1. Stabiliţi cu grijă planul de distribuţie şi identificare a probelor în placă. 2. Preparaţi soluţia de spălare diluată (R2) (consultaţi capitolul 7). 3. Scoateţi cadrul-suport şi numărul necesar de barete (R1) din ambalajul protector. Montaţi baretele în cadru. Lăsaţi un godeu

pentru blancul de reactivi, 3 godeuri pentru calibrator şi câte 1 godeu pentru fiecare control: negativ, pozitiv I şi pozitiv II.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B1 S2 B R3 S3 C R4a S4 D R4b S5 E R5 S6 F R5 S7 G R5 S8 H S1 S9

4. Toate probele, controalele şi calibratorul trebuie agitate la vortex înainte de utilizare. Diluaţi probele de testat, calibratorul,

controalele negativ şi pozitive la 1:81 (de ex. 10 μl + 800 μl) cu diluantul II (R7) în eprubete de diluţie sau în placă de diluţie. 5. Pipetaţi 100 μl din fiecare soluţie diluată (calibrator, controale, sau proba biologică) în fiecare godeu. Pipetaţi 100 μl din

diluantul II (R7) în primul godeu pentru blancul de reactivi. 6. Incubaţi microplaca timp de 30 de minute ± 2 minute la temperatura camerei (21-25ºC). 7. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container pentru deşeuri contaminate (care conţine hipoclorit de sodiu) şi

adăugaţi imediat în fiecare godeu minim 300 μl de soluţie de spălare. Aspiraţi din nou. Repetaţi această operaţie de cel puţin 4 ori (în total un minim 5 spălări). Dacă este necesar, uscaţi placa întorcând-o cu faţa în jos pe o hârtie absorbantă. Dacă utilizaţi un spălător automat de plăci, urmaţi aceeaşi procedură.

8. Distribuiţi în toate godeurile 100 μl de conjugat (R6). 9. Incubaţi microplaca timp de 30 de minute ± 2 minute la temperatura camerei (21-25ºC). 10. Goliţi toate godeurile prin aspirare şi spălaţi de 5 ori aşa cum s-a descris mai sus. 11. Distribuiţi repede în fiecare godeu 100 μl de soluţie cromogen/ substrat (R9) 12. Lăsaţi reacţia să se dezvolte la întuneric timp de 10 ± 2 minute la temperatura camerei (21-25ºC). Nu utilizaţi folie adezivă în

timpul acestei incubări. Soluţia cromogen/substrat îşi va schimba culoarea în albastru în godeurile care conţin nivele detectabile de anticorpi IgM.

13. Adăugaţi 100 μl din soluţia de stopare în fiecare godeu. Omogenizaţi tapotând uşor microplaca. Prin adăugarea soluţiei de stopare, culoarea albastră se va schimba în galben.

14. Aşteptaţi minim 5 minute apoi citiţi. Ştergeţi cu grijă fundul plăcii. Cu lungimea de undă fixată la 450 nm, faceţi mai întâi blancul cititorului şi apoi citiţi densitatea optică în godeuri, în 30 de minute de la stoparea reacţiei (baretele trebuie întotdeauna să fie ferite de lumină înaintea citirii).

15. Verificaţi toate rezultatele înainte de transcriere pentru concordanţa între citiri şi planul de distribuţie şi de identificare a probelor în placă.

10 - CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR 1) Calculul absorbţiilor medii 1. Media DO (densitatea optică sau absorbţia) a calibratorului R5: calculaţi valoarea medie a DO utilizând cele 3 determinări

individuale de DO obţinute pentru calibratorul R5. Dacă una dintre valori este aberantă, deviind cu mai mult de 15% de la DO medie, eliminaţi valoarea aberantă şi refaceţi calculul cu cele două valori rămase.

2. Factorul de corecţie – pentru a lua în considerare fluctuaţiile zilnice (de temperatură şi timpi de lucru) din timpul testării, pentru fiecare lot de truse se determină un factor de corecţie pe care îl veţi vedea imprimat pe eticheta flaconului calibratorului R5.

3. Valoarea prag a calibratorului: se determină multiplicând factorul de corecţie cu DO medie a calibratorului R5 (obţinută în etapa 1).

4. Valoarea RSI – calculaţi Raportul se Statut Imunitar (RSI) pentru fiecare probă biologică împărţind valoarea DO obţinută pentru acea probă la valoarea prag a calibratorului determinată în etapa 3.

Exemplu: DO obţinute pentru calibratorul R5 = 0,380, 0,400, 0,420 DO medie pentru calibratorul R5 = 0,400 Factorul de corecţie = 0,5 Valoarea prag a calibratorului = 0,5 x 0,400 = 0,200 DO obţinută pentru un ser de pacient = 0,600 Valoarea RSI = 0,600/0,200 = 3,00 2) Validarea testării 1. Blancul de reactivi (când se citeşte faţă de aer) trebuie să fie <0,150 la 450 nm: DO BR < 0,150 2. Controlul negativ R3 trebuie să fie ≤ 0,250 la 450 nm (când se citeşte faţă de blanc): DO R3 ≤ 0,250 3. Fiecare calibrator R5 trebuie să fie ≥ 0,250 la 450 nm (când se citeşte faţă de blanc): DO R5 ≥ 0,250 4. Controlul pozitiv R4b trebuie să fie ≥ 0,500 la 450 nm (când se citeşte faţă de blanc): DO R4b ≥ 0,500 5. Valorile RSI (Raportul de Satut Imunitar) pentru controalele negativ, pozitiv I şi pozitiv II (R3, R4a, R4b) trebuie să se

încadreze între valorile indicate pe fiecare flacon Dacă aceste criterii nu se încadrează în intervalele respective, testul trebuie considerat invalid şi trebuie repetat. 3) Interpretarea rezultatelor Valorile RSI (Raportul de Satut Imunitar), calculat pentru fiecare eşantion prin împărţirea DO probă la valoarea prag, se interpretează după cum urmează:

Valoarea RSI Rezultat Interpretare ≤0,90 Negativ IgM anti-EBV-VCA nedetectabili

0,91-1,09 Dubios Proba trebuie retestată ≥1,10 Pozitiv Nivel semnificativ de anticorpi IgM anti-EBV-VCA. Indicativ pentru infecţie actuală

sau recentă

1. Acest mod de exprimare a rezultatelor şi valorile obţinute sunt specifice testului PlateliaTM EBV-VCA IgM. Valorile obţinute

prin alte metode nu sunt interşanjabile cu aceste rezultate. Mărimea nivelului de IgM raportat nu se poate corela cu titrarea la punct final.

2. Rezultatele celor 4 teste serologice, EBV-VCA IgM, EBV-VCA IgG EBV-EA-D IgG şi EB-NA-1 IgG, sunt necesare pentru tabloul cuprinzător al unei infecţii cu EBV, mai ales în cazul mononucleozei infecţioase. Interpretarea rezultatului unui test izolat EBV-VCA IgM, EBV-VCA IgG EBV-EA-D IgG sau EB-NA-1 IgG nu permite nici un fel de concluzie definitivă.

3. Probele dubioase trebuie retestate fie din acelaşi ser dar printr-o altă metodă (de exemplu prin imunofluorescenţă), fie prelevând o nouă probă de sânge.

4) Valori anticipate În faza acută Anticorpii IgM anti-EBV-VCA cresc rapid în faza acută fiind detectabili înaintea sau în paralel cu anticorpii IgG anti-EBV-VCA, IgM anti-EB-NA-1 şi anticorpii heterofili. IgM anti-EBV-VCA scad în faza târzie, odată cu IgM anti-EB-NA-1, însă IgG anti-EBV-VCA persistă. În faza de tranziţie Anticorpii IgM anti-EBV-VCA scad la nivele joase şi aproximativ similare cu anticorpii IgG anti-EB-NA-1 care tocmai încep să crească. IgG anti-EBV-VCA persistă. În faza de convalescenţă Anticorpii IgM anti-EBV-VCA au dispărut (aproape întotdeauna), în timp ce IgG anti-EB-NA-1 ating nivele înalte. 5) Prevalenţa Un număr de 158 de seruri recoltate în SUA de la populaţia sănătoasă având diverse categorii de vârstă, sex şi din zone geografice diferite au fost testate cu PlateliaTM EBV-VCA IgM. În urma testării 4 probe au fost găsite pozitive, adică o prevalenţă de 2,5% în această populaţie. Procentul de rezultate dubioase a fost de 1,9% (3 probe). Distribuţia valorilor RSI în acest studiu este prezentată în graficul de mai jos.

Histograma repartiţiei celor 158 de probe

Următorul tabel prezintă în rezumat repartiţia pe grupe de vârstă în populaţia sănătoasă:

Vârst Negative Dubioase Pozitive Total ≤ 20

21 - 30 31 - 40 41 - 50 51 - 60 Total

8 47 48 29 19

151

3 0 0 0 0 3

0 1 3 0 0 4

11 48 51 29 19

158 6) Limitele metodei 1. Procedee de lucru sau practici altele decât cele incluse în această trusă pot duce la rezultate neinterpretabile. Reacţiile nereproductibile sunt frecvent determinate de:

- spălarea inadecvată a microplăcilor - durată incorectă de incubare a microplăcilor - contaminarea probelor negative cu ser sau plasmă cu titruri înalte de anticorpi - contaminarea punctuală a soluţiei de developare cu agenţi chimici oxidanţi (apă de Javel, ioni metalici…) - contaminarea punctuală a soluţiei de stopare

Serurile contaminate, hiperlipemice, icterice, hemolizate sau inactivate termic ce pot da rezultate aberante, nu trebuie utilizate.

Performanţele testului au fost stabilite pe seruri şi nu pe plasmă. 2. Medicul trebuie să interpreteze rezultatele acestui test numai în contextul clinic şi coroborând cu alte teste de laborator. • Această trusă este destinată determinării răspunsului imun ce indică infecţia primară sau o reactivare virală. Performanţele

testului nu sunt stabilite pentru pacienţi cu carcinom nazofaringian, limfom Burkitt sau alte limfadenopatii asociate EBV, altele decât mononucleoza infecţioasă. Rezultatele testării cu PlateliaTM EBV-VCA IgM a serurilor de la pacienţii imunodeprimaţi trebuie interpretate cu precauţie. Performanţele testului nu au fost stabilite pentru prelevate clinice recoltate în secţiile de pediatrie.

• Absenţa anticorpilor IgM anti-EBV-VCA detectabili nu înlătură posibilitatea unei infecţii primare recentă cu EBV. Este posibil ca proba să fi fost recoltată fie prea devreme în evoluţia bolii, fie prea târziu. Dacă încă se suspectează infecţia cu EBV, se recomandă recoltarea unei a doua probe de sânge la 5-7 zile mai târziu şi repetarea testării.

• Anticorpii IgG anti-EBV-VCA pot intra în competiţie cu IgM anti-EBV-VCA pentru aceleaşi situsuri de legare, antrenând rezultate fals negative. Pe de altă parte, factorul reumatoid în prezenţa IgG specifice poate determina un rezultat fals pozitiv. Diluantul II ce conţine IgG de oaie/capră specifice de IgG umane permite diminuarea acestor interferenţe.

• O altă cauză de reacţii fals pozitive este prezenţa anticorpilor antinucleari.

11- PERFORMANŢELE 1) Sensibilitatea şi specificitatea Au fost testate cu trusa PlateliaTM EBV-VCA IgM 166 de probe caracterizate fie ca seronegative, fie de “fază acută” (IgM anti-EBV-VCA şi anticorpi heterofili prezenţi, IgG anti-EB-NA absenţi), sau seropozitive (prezenţa anticorpilor IgG Anti-EBV-VCA şi IgG anti-EB-NA, nici o evidenţă pentru IgM anti-EBV-VCA şi anticorpi heterofili). Testele utilizate pentru caracterizarea probelor au fost teste ELISA disponibile pe piaţă, EBV-VCA IgG ELISA, EBV-VCA IgM ELISA, EBV-EBNA IgG ELISA. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos.

Faza acută EBV-VCA IgM +

EB-NA IgG - Ac heterofili +

Seropozitiv EBV-VCA IgG + EB-NA

IgG + EBV-VCA IgM - Ac heterofili -

Seronegativ EBV-VCA IgG –

EB-NA IgG - EBV-VCA IgM - Ac heterofili -

PlateliaTM EBV-VCA IgM

Pozitiv Dubios

Negativ Total

37 1 1

39

1 0

98 99

1 0

27 28

Sensibilitatea şi specificitatea testului au fost determinate după cum urmează: testul PlateliaTM EBV-VCA IgM a dat fie un rezultat negativ cu probele seronegative sau din perioada de convalescenţă, fie un rezultat pozitiv la probele recoltate în faza acută (*). Status Rezultate**

Specificitate Seronegativ 27 / 28 96,4 %

Seropozitiv 98 / 99 99,0 %

Sensibilitate Faza acută 37 / 38 97,4 %

Concordanţa 162 / 165 98,2 %

* Rezultate dubioase nu sunt incluse ** Rezultatele dubioase nu au fost retestate, fiind raportate ca dubioase Intervalele de confidenţă de 95 % au fost calculate folosind metoda obişnuită. Rezultatele testării au fost comparate cu rezultatele reieşite cu teste similare, ele nefiind corelate cu prezenţa sau absenţa bolii. Nu este posibilă nici un fel de judecată de predicţie a bolii doar pe compararea acurateţei testării. 2) Repetabilitatea (precizia intra-testare) Testul PlateliaTM EBV-VCA IgM a fost evaluat pentru precizie prin testarea a trei seruri (unul negativ, unul slab pozitiv şi unul pozitiv) de zece ori fiecare în aceeaşi placă. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos: n medie DS CV %

Negativ 10 0,06 0,03 54 Pozitiv slab 10 1,71 0,16 9,2

Pozitiv 10 4,15 0,21 5,1 Coeficienţii de variaţie (CV) pentru pozitivi sunt sub 15%. 3) Reproductibilitatea (precizia inter-testări) Testul PlateliaTM EBV-VCA IgM a fost evaluat pentru precizie prin testarea aceloraşi trei seruri de zece ori pe zi fiecare, în trei zile diferite. Rezultatele medii, deviaţiile standard şi coeficienţii de variaţie calculate pentru fiecare ser sunt prezentate în tabelul de mai jos: n medie DS CV %

Negativ 10 0,05 0,03 65,6 Pozitiv slab 10 1,61 0,20 12,1

Pozitiv 10 4,47 0,42 10,6

4) Reactivitatea încrucişată Au fost testate 22 de seruri găsite pozitive pentru anticorpi IgM anti-HSV 1 şi 2, anti-virus citomegalic, anti-virus varicelo-zosterian şi factori reumatoizi (în tabelul de mai jos). Datele prezentate în tabelul de mai jos arată că nici o probă nu a prezentat interferenţe cu testul PlateliaTM EBV-VCA IgM.

Specificitate PlateliaTM EBV-VCA IgM Alt kit RF+ 0,04 - 1,87 + RF+ 0,03 - 1,82 + RF+ 0,01 - 1,73 + RF+ 0,01 - 1,80 + RF+ 0,02 - 1,85 +

VZV IgM+ 0,33 - 3,28 + VZV IgM+ 0,10 - 5,46 + VZV IgM+ 0,04 - 4,98 + VZV IgM+ 0,08 - 2,34 + VZV IgM+ 0,03 - 2,18 +

HSV 1 IgM+ 0,02 - 2,53 + HSV 1 IgM+ 0,02 - 1,65 + HSV 1 IgM+ 0,01 - 1,34 + HSV 1 IgM+ 0,01 - 1,32 + HSV 2 IgM+ 0,06 - 1,76 + HSV 2 IgM+ 0,05 - 1,60 + HSV 2 IgM+ 0,03 - 2,09 + HSV 2 IgM+ 0,04 - 1,96 + CMV IgM+ 0,07 - 1,23 + CMV IgM+ 0,04 - 1,92 + CMV IgM+ 0,04 - 3,83 + CMV IgM+ 0,06 - 1,32 +

12 – BIBLIOGRAFIE 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr. 1964. Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt’s Lymphoma.

Lancet. 1:702-703. 2. Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G Achong. 1965. Studies wilth Burkitt’s Lymphoma. Wister Inst. Sympos. Monogr. 4:69-82. 3. Schooley, R.T. and R. Dolin. 1985. Epstein-Barr Virus (Infectious Mono- nucleosis), 2nd edition. In: Principles and Practices

of Infectious Diseases. Mandell, G.L., R.G.Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York. Pp.97-982. 4. Henle, W. and Henle G. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. Human Herpesvirus Infections. Glaser and

Gottlieb-Stematsky, eds. Marcel Dekker, Inc. NR. Basel. 1982. 5. Tobi, M. and S.E. Straus. 1985. Chronic Epstein-Barr Virus Diseas: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and

Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 103 (6(pt. 1)):951-953. 6. Birx, D. L., R.R. Redfield, and G. Tosarto. 1986. Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Aquired

Immunodefiency Syndrome (AIDS) or AIDS-Related Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14):874-879. 7. Gottlieb-Sematsky, T. and Glaser, R. 1982. Assocation of Epstein-Barr Virus with Neurological Diseases. Human

Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Sematsky, eds. Marcel Dekker, Inc., NR. Basel. 8. Henle, G., W. Henle and V. Diehl. 1968. Relation of Burkitt’s Tumor- Associated Herpes-Type Virus to Infectious

Mononucleosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59:94-101. 9. Henle G., and W. Henle. 1978. The Virus as the Etiologic Agent of Infectious Mononucleosis. In: The Epstein-Barr Virus.

Berlin Sprihger- Verlag. Pp297-320. 10. Sumaya, C.V. 1986. Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab. Mgmt. Oct., pp37-46. 11. Lenelle, E.T. and W. Henle. 1987. Epstein-Barr Virus Infections: Clinical and Serological Features. Laboratory Mgmt. Oct.,

pp37-46. 12. Nikoskelainen, J. and P. Hanninen. 1975. Antibody Response to Epstein- Barr Virus in Infectious Mononucleosis. Infect.

Immun. 11:42-51. 13. Sumaya, C.V. 1987. Infectious Mononucleosis and other EBV Infections: Diagnostic Factors. Laboratory Management.

pp37-45. 14. Henle, W. and G. Henle. 1973. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. New Eng. J. Med. 228:263-264. 15. Engvall, E. and P. Perlman. 1972. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by

Enzyme-Labeled Anti- Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 109:129-135. 16. Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs. 1971. Immunoassay Using Antigen-Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 15:232-

235. 17. Engvall, E., and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of

Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:871-874. 18. Engvall, E. and P. Perlman. 1971. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. In: Proteins of the Biological Fluids, H.

Peeters, ed., Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge Oxford. Pergamon Press. p. 553-556. 19. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 1971. Enzyme- Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein

Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme-Labelled Antigen and Antibody- Coated Tubes. Biochem. Biophys. Acta., 251:427-434.

20. CDC/NIH Interagency Working Group. 1993. BioSafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 3rd edition. U.S.

Dept. of Health and Human Services, Public Health Service. pp18-24. 21. Drew, W.L. 1983. Diag. Med. 6:61-66. 22. Lennete, E.T. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. Chapter 78. 23. Okano, M. 1988. Clinical Microbiology Reviews. Epstein-Barr Virus and Human Diseases. Recent Advances in Diagnosis.

Vol.1, p300-312. 24. Baltz, M. 1992. Identifying Stages of EBV Infection. In: American Clinical Lab. pp. 20-22. 25. Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Hayward, G.S., and Hayward, S.D. 1991. Functional Domains of Epstein-

Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1. Journal of Virology, ASM. Vol. 65, No.3, pp. 1466-1478. 26. Davidsohn, I. 1937. Serologic Testing of Infectious Mononucleosis. Journal of American Medical Association. 183: 289-295. 27. Evans, A.S. 1974. History of Infectious Mononucleosis. In: American Journal of Medical Science. 267: 189-195. 28. Lennette, E.T. 1988. Herpesviridae: Epstein-Barr Virus. In: Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases, Principles and

Practice. Vol. II. Lennette, E.H., Halonen, P., Murphy, F.A., eds. Springer-Verlag, NY. pp. 230-246. 29. Bakerman, S. 1980. Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp 21-29. 30. Voller, A. and D. E. Bidwell, 1972. Brit. J. Exp. Pathology 56 :338-339. 31. R. Sohier, R.J. Freund, G. de-Thι, N.E. Day, A. Geser and G. Denhaut. 1973. Seroepidemiology of Herpesvirus Type

Epstein-Barr in Blood Donors from Communities around Lyon. American Journal of Epidemiology. Vol. 99, No.6, pp 414-424

TRINITY BIOTECH USA, 2823 Grits Road, Jamestown, NY, 14701

TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow – Ireland

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax. : +33 (0) 1 47 41 91 33 www.bio-rad.com

2015/04