2.Dozarea activităţii peroxidazelor

Activitatea peroxidazei s-a determinat în rădăciniţele şi frunzele plantulelor de grâu, atât de la lotul martor, cât şi în cele tratate cu NaCl, AS, sau cu ambele soluţii. Extractul enzimatic a fost realizat din material vegetal proaspăt (1g) recoltat, după 21 de zile de la montarea experimentului. Mojararea s-a realizat cu nisip de cuarţ bine spălat şi sterilizat în etuvă la 120ºC adăugând 4 ml tampon fosfat în concentraţie de 6,7x 10 ³ M, pH=7, diluat 1:9 cu apă distilată răcită la 4ºCˉ şi 40 mg polivinil-pirolidonǎ (pentru înlǎturarea eventualilor inhibitori ai activitǎţii peroxidazice). Extractul s-a centrifugat la 15000xg, timp de 20 de minute la 4˚C. Supernatantul separat a fost păstrat 2 ore la frigder pentru exprimarea şi stabilizarea activităţii enzimatice. Au fost efectuate câte 3 repetiţii, atât pentru martor, cât şi pentru variantele experimentale luate în studiu.

Activitatea peroxidazică s-a determinat folosind un spectrofotometru Shimadzu UV-mini–1240, la o temperatură de 30ºC, urmărind formarea tetraguaiacolului, la o lungime de undă de 470 nm, ε=26.6mM-1cm-1, în 3 ml amestec de reacţie conţinând 1 ml tampon fosfat 0,1M pH=6,0; 1 ml guaiacol 15mM, 1 ml H2O2 3mM, şi 50μl extract enzimatic. O unitate peroxidazică (U) reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează oxidarea a 1μmol de guaiacol intr-un minut, conform metodei citate de Kim şi Yoo, 1996.

Se citeste absorbanta imediat la momentul t=0 (A0) si dupa 1 minut (A1)

(ΔA/min x Vt) / (ε x Vs)

Unde :

ΔA/min = A1 – A0

Vt = vol final de reactie = 3,05 ml

Vs = vol probei = 0,05

3.Determinarea conţinutului de prolină

Prolina, aminoacid cu rol protector, sintetizat în cazul în care plantele sunt supuse unui factor de stres se va determina cu ajutorul metodei Bates şi colab (1973).

0,5g de material vegetal s-a omogenizat cu 10 ml soluţie apoasă 3% de acid sulfosalicilic s-a filtrat, iar filtratul a fost tratat cu 2 ml ninhidrină acidă şi 2 ml acid acetic glacial într-o eprubetă la 100ºC, timp de o oră, după care s-a răcit în baie de gheaţă. Amestecul de reacţie a fost extras cu 4 ml de toluen prin agitare energică timp de 15-20 de secunde. A fost separat supernatantul cromoforic conţinând toluen şi s-a citit absorbanţa la o lungime de undă de 520 nm, folosind toluen ca martor.

Concentraţia prolinei a fost stabilită folosind o curbă etalon iar rezultatul s-a raportat la substanţa proaspătă, conform următoarei relaţii.

[μg prolina/ml x ml toluen / 115.5 μg/ μmol]/ [g proba/5] = μmoli prolina/g mat.vegetal proaspăt.