O INTRODUCERE ÎN PCR

Reacția în lanț a polimerazei, sau PCR, a fost descoperit în 1983 de către Kary Mullis. Este o metodă pentru amplificarea a mici mostre de ADN sau ARN, crearea de milioane de exemplare în doar câteva ore, și a fost descris ca "fotocopiere moleculara". Acest lucru face posibilă o analiză ADN când sunt disponibile doar cantități foarte mici. Înainte PCR a fost disponibil pe scară largă, bucățile de ADN au trebuit să fie clonat într-un vector și transferat la bacterii, iar acest lucru ar putea dura săptămâni - PCR acum durează până la câteva ore pentru același rezultat.

PCR este de obicei folosit pentru a amplifica intinderile de ADN de până la 10 kb (perechi de baze kilogram), deși unele tehnici pot lucra cu ADN-ul de până la 40 kb. Există trei etape cheie ale PCR, fiecare la o temperatură diferită, iar aceste se repetă în cicluri într-o mașină de PCR cunoscut ca un termociclu. Procesul de încălzire și răcire se numește ciclurilor termice.

Etapa 1: denaturare

În etapa de denaturare (94-98 grade C, timp de 20-30 de secunde), legăturile de hidrogen din între bazele complementare și dublu helix de ADN "se topește" și se separă în două direcții distincte. In multe Amplificatoare PCR, soluțiile sunt deținute în tuburi mici de plastic în blocuri metalice, și sunt încălzite și răcite prin inversarea curenții electrici prin blocul, cunoscut ca efectul Peltier. Cu toate acestea, acest lucru poate fi lent pentru a schimba temperatura și încălzire și răcire nu poate fi uniformă prin blocul. Alte sisteme utilizează tehnologii diferite - de exemplu, termociclerul XXpress folosește un rezistență scăzută strat din material plastic probă tablelor ca un element rezistiv cadrul unui circuit electric pentru incalzire, împreună cu răcire cu aer forțat, pentru a îmbunătăți viteza, precizia și uniformitatea.

Etapa 2: Recoacerea

La 54-65 grade C (20-40 secunde), primeri (fire scurte de ADN, de asemenea, cunoscut sub numele de oligonucleotide) alătura la începutul și sfârșitul secțiunii de ADN monocatenar să fie copiat. Cei doi primeri sunt complementare "(trei Prime) 3 capete de sens și antisens componente ale ADN-ului.

O enzimă polimerază ADN, de obicei ADN polimeraza Taq (de bacteria Thermus aquaticus) sau ADN polimeraza Pfu (din archaeon Pyrococcus furiosus), se alătură la ADN. Ambele dintre acestea sunt enzime termic stabil, capabil să facă față cu schimbările de temperatură, iar acest lucru înseamnă că cercetătorii nu au nevoie pentru a adăuga noi enzime, la începutul fiecărui ciclu.

Etapa 3: Extinderea / alungire

La 72 de grade C, polimeraza Taq citește două componente imagine în oglindă ale ADN-ului și le folosește ca șabloane pentru a construi două noi directii de actiune ale ADN-ului dintr-o soluție tampon conținând nucleotide, elementele constitutive ale ADN-ului. Primerul se potrivește o intindere a ADN-ului pe sectiunea de copiat, și este necesar pentru enzima a putea adăuga noi nucleotide, dar, de asemenea marchează afară începutul și sfârșitul piesei de ADN pentru a fi copiate.

Se intinde duplicate ale ADN-ului au fiecare un vechi și unul nou fir de ADN-ului, și poate fi folosit din nou în următorul ciclu de a crea mai multe copii. Aceste cicluri se repeta la 20 la 40 de ori, care se încheie cu peste un miliard de copii ale piesei originale a ADN-ului, cunoscut sub numele de ampliconi.

Ultimul pas de alungire , la 70-74 grade C, timp de 5-15 minute, se asigură că toate moleculele monocatenare de ADN sunt complet extinse.