1

UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE ŞTIINłE

Camelia Ciobanu

InfluenŃa unor extracte vegetale de

Chelidonium majus şi Berberis vulgaris

indicate pentru afecŃiuni hepatice

asupra şobolanilor intoxicaŃi experimental

Rezumatul tezei de doctorat

Conducător ştiinŃific,

Prof. Dr. Aurel Ardelean

ORADEA 2008

2

Cuprins

Introducere 8 Partea generală 11 1. ImportanŃa fitoterapeutică a speciilor Chelidonium majus şi Berberis

vulgaris

1.1. Chelidonium majus 1.1.1. Date botanice 1.1.2. Produsul medicinal Chelidonii herba 1.1.3. Date fitochimice 1.1.4. Efecte fitoterapeutice ale extractelor 1.1.5. Forme farmaceutice şi medicamente

1.2. Berberis vulgaris

1.2.1. Date botanice 1.2.2. Produsul medicinal Berberidis cortex

1.2.3. Date fitochimice 1.2.4. Efecte fitoterapeutice ale extractelor 1.2.5. Forme farmaceutice şi medicamente

2. Modele experimentale de inducere a afecŃiunilor hepatice 2.1. Cercetarea influenŃei extractelor vegetale asupra organismului 2.2. IntoxicaŃia hepatică acută experimentală 2.3. Modele de experimentare a acŃiunii hepatoprotectoare a extractelor vegetale

12 12 12 14 16 19 22 27 27 29 30 32 34 36 36 37

40

Partea experimentală 3. Premize şi obiective de cercetare

3.1. Precizări privind acŃiunea extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris 3.2. Obiectivele cercetării

4. Materiale şi metode 4.1. Extractele vegetale

4.1.1. DefiniŃie şi tipuri 4.1.2. Descrierea extractelor fluide 4.1.3. Prepararea extractelor fluide

4.2. Modele de organizare structurală şi ultrastructurală a ficatului la şobolan

4.2.1. Lobulii hepatici 4.2.2. PopulaŃiile celulare hepatice

4.3. Tetraclorura de carbon, un xenobiotic cu tropism hepatic 4.3.1. AcŃiunea CCl4 asupra organismului 4.3.2. Bioactivarea hepatică a CCl4 4.3.3. Mecanismul de acŃiune al CCl4 4.3.4. Modificările hepatotoxice induse de CCl4

44 45

45 47 49 49 49 50 50

52 52 56 61 61 62 63 65

3

4.3.5. Hepatectomia chimică 4.3.6. Sisteme celulare de protecŃie împotriva toxicităŃii CCl4 4.3.7. Utilizări experimentale ale CCl4

4.4. Metode şi tehnici experimentale 4.4.1. Metode histologice 4.4.2. Tehnici histochimice 4.4.3. Tehnici histoenzimatice 4.4.4. Metode biochimice 4.4.5. Metode electronomicroscopice

5. Organizarea experimentelor 5.1. Tipul experimentelor 5.2. Animalele de experienŃă 5.3. Loturile de experienŃă 5.4. SubstanŃele administrate 5.5. Dozele administrate 5.6. Calea de aministrare 5.7. Recoltarea probelor

6. Rezultate şi discuŃii 6.1. InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor senescenŃi intoxicaŃi cu CCl4

6.1.1. Analizele experimentale 6.1.2. Discutarea rezultatelor 6.1.3. Concluzii comentate

6.2. InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor tineri intoxicaŃi cu CCl4

6.2.1. Analizele experimentale 6.2.2. Discutarea rezultatelor 6.2.3. Concluzii comentate

6.3. InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis

vulgaris asupra ficatului şobolanilor tineri 6.3.1. Analizele experimentale 6.3.2. Discutarea rezultatelor 6.3.3. Concluzii

6.4. InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis

vulgaris asupra rinichilor şobolanilor tineri 6.4.1. Analizele experimentale 6.4.2. Discutarea rezultatelor 6.4.3. Concluzii

7. Concluzii finale

68 70 74 76 76 76 77 78 79 80 80 80 81 81 82 83 83 84

84 84

114 120

123 123 150 152

155 155 166 166

167 167 181 181 182

Bibliografie 185 Extras bibliografic al lucrărilor ştiinŃifice din teza de doctorat 202

4

ImportanŃa teoretică şi practică a studiului

Utilizarea plantelor în tratarea unor boli a devenit o tradiŃie, „farmacia

naturii” constituind o sursă importantă pentru terapie. În prezent, proprietăŃile plantelor medicinale sunt reevaluate datorită progreselor realizate în cercetarea chimică, farmacologică şi clinică a plantelor şi a formelor farmaceutice obŃinute din produse vegetale, dar mai ales datorită avantajelor pe care acestea le oferă.

Cu toate acestea, remediile fitoterapeutice sunt destul de greu acceptate, pe de o parte datorită faptului că mecanismele prin care ele acŃionează asupra organismului sunt de cele mai multe ori insuficient cunoscute. Pe de altă parte, cercetările care vizează efectele biologice ale plantelor medicinale sunt extrem de laborioase, deoarece necesită animale de laborator, aparatură performantă, precum şi extracte vegetale minuŃios pregătite, la care să se cunoască principiile active şi modul de acŃiune la nivelul structurii, ultrastructurii şi metabolismului celulelor.

Lucrarea de faŃă prezintă cercetările asupra extractelor fluide obŃinute din două plante medicinale care revendică efecte benefice în afecŃiunile hepatice: Chelidonium majus (rostopasca) şi Berberis vulgaris (dracila). Datele acumulate în literatura de specialitate arată că utilizarea fitoterapeutică a extractelor de Chelidonii herba, respectiv de Berberidis cortex are la bază doar efectul farmacologic major, mecanismul intim de acŃiune al celor două produse vegetale, la nivel celular şi subcelular, nefiind cunoscute.

Pornind de la aceste premize, am considerat utilă iniŃierea unui studiu comparativ privind influenŃa hepatoprotectoare a extractelor fluide de Chelidonium

majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor intoxicaŃi experimental cu tetraclorura de carbon, un xenobiotic cu tropism hepatic. Astfel, ne-am propus să investigăm prin metode şi tehnici histologice, biochimice şi electronomicroscopice modificările structurale şi funcŃionale apărute în ficatul şi rinichii animalelor de experienŃă tratate cu câte unul din cele două extracte vegetale, în scopul elucidării mecanismului de acŃiune al acestor produse fitoterapeutice la nivel celular şi subcelular.

Precizări privind acŃiunea extractelor vegetale

de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris Plantele şi preparatele obŃinute din plante sunt întrebuinŃate de multă vreme

în tratarea unor boli. Folosite la început în mod empiric, efectele benefice ale multor asemenea leacuri au atras atenŃia cercetătorilor care, prin studiile întreprinse de-a lungul timpului, au clădit un suport ştiinŃific fitoterapiei.

5

Extractele fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris se află în compoziŃia a numeroase preparate farmaceutice şi sunt indicate mai ales pentru acŃiunea lor coleretică-colagogă, antispastică şi hepatoprotectoare [FR X, 1993; Tămaş şi Oniga, 2001]. Utilizarea celor două extracte ca remedii fitoterapeutice se bazează pe o veche tradiŃie şi este susŃinută de progresele ştiinŃifice realizate în ultimul timp în descifrarea compoziŃiei chimice şi a efectelor farmacologice ale acestora [Stănescu şi col., 2002].

Primele cercetări efectuate în această direcŃie au identificat principiile

active, precizându-se componenta alcaloidică şi nealcaloidică pentru Chelidonium

majus, respectiv pentru Berberis vulgaris. De asemenea, au fost descrise proprietăŃile farmacognostice ale celor două plante şi au fost puse în evidenŃă acŃiunile biologice ale extractelor şi principiilor active izolate, stabilindu-se o corelaŃie între compoziŃia chimică a produsului vegetal medicinal şi efectul terapeutic. În paralel cu aceste studii, au putut fi perfecŃionate tehnicile extractive prin care se obŃin din cele două specii vegetale diferite preparate farmaceutice. Recent, principiile active au fost izolate din Ńesuturi şi celule provenite de la specii de Berberis cultivate in vitro.

Baza ştiinŃifică care permite utilizarea în fitoterapie a celor două produse vegetale a fost completată de studiile farmacologice realizate prin diferite experimente efectuate pe animale, precum şi prin testări clinice. Cercetările moderne au demonstrat că fitocomplexul de principii active extras din Chelidonium

majus are efecte antivirale, antitumorale, antimicrobiene, coleretice şi colecistokinetice, hipolipemiante şi hipocolesterolemiante. Pentru extractele de Berberis vulgaris au fost dovedite de asemenea, efecte coleretice şi colagoge, antimicrobiene şi antitumorale.

Obiective de cercetare Din literatura de specialitate publicată până în prezent despre extractele

bioactive de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris reiese că utilizarea acestora în fitoterapie se bazează pe efectul farmacologic major, mecanismele de acŃiune la nivelul Ńesutului şi celulelor hepatice nefiind la ora actuală elucidate. Se ştie însă că remediile naturale pot deveni medicamente moderne dacă există date suficiente şi aprofundate asupra impactului pe care îl au asupra organismului.

Acesta este motivul pentru care ne-am propus să cercetăm influenŃa hepatoprotectoare a extractelor fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris, prin investigarea, la nivel celular şi subcelular, a modificărilor structurale şi funcŃionale produse în urma administrării la animalele de laborator a unor substanŃe consacrate.

În acest scop am folosit ca model experimental intoxicaŃia hepatică acută indusă la şobolani de tetraclorura de carbon (CCl4), una dintre cele mai cunoscute substanŃe xenobiotice cu tropism hepatic, capabilă să producă leziuni grave ale

6

ficatului, similare celor apărute în hepatita şi ciroza descrise la om [Tanikawa, 1968; Mogoş şi Sitcai, 1988; Faroon şi col., 1994]. Inducerea toxicozei hepatice la animalele de experienŃă prin administrarea CCl4 permite realizarea unei hepatectomii chimice [Chanda şi Mehendale, 1996; Rusu, 1997; Rusu şi col., 2005], utile pentru studierea eventualei regenerări a ficatului sub acŃiunea remediilor fitoterapeutice. Extractele vegetale testate în experimentul nostru sunt hidroalcoolice şi au un conŃinut standardizat de alcaloizi [FR X, 1993; Tămaş şi Oniga, 2001], consideraŃi principiile active responsabile de efectele farmacologice ale celor două plante.

Din dorinŃa de a obŃine rezultate cât mai exacte şi complete asupra influenŃei hepatoprotectoare a celor două extracte vegetale la şobolanii intoxicaŃi, am decis organizarea unei serii de două experimente acute, care diferă între ele prin vârsta animalelor de experienŃă şi prin dozele de substanŃe administrate. Această shemă de lucru ne-a permis să apreciem în mod punctual:

1) efectul hepatoprotector al extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor senescenŃi şi tineri intoxicaŃi cu CCl4;

2) corelaŃia dintre doza şi acŃiunea biologică a CCl4 şi a extractelor vegetale; 3) impactul produs de cele două extracte vegetale asupra ficatului şi rinichilor

şobolanilor neintoxicaŃi, în vederea precizării eventualelor reacŃii adverse. Pentru realizarea obiectivelor propuse am efectuat o gamă complexă de

analize experimentale, bazate pe metode şi tehnici histologice, histochimice, histoenzimatice, biochimice şi electronomicroscopice [Reitmann şi Frankel, 1957; Mureşan şi col., 1976; Hayat, 2000].

Materiale şi metode Extractele vegetale

Conform FR X [1993], extractele vegetale sunt preparate farmaceutice

obŃinute prin extracŃia produselor vegetale cu diferiŃi solvenŃi, urmată de evaporarea parŃială sau totală a solventului.

Prepararea extractului fluid de Chelidonium majus s-a realizat din Chelidonii herba prin repercolare după tehnica Squibb, utilizând ca solvent alcoolul de 70°[Popovici şi Lupuleasa, 2001]. Extractul a fost standardizat la un conŃinut de 0,25% alcaloizi totali exprimaŃi în chelidonină. Analiza calitativă a alcaloizilor s-a efectuat prin cromatografie în strat subŃire, iar determinarea cantitativă după tehnica titrimetrică oficinală în FR X [1993]. Extractum Chelidonii

fluidum este produs în cadrul Laboratorului de MicroproducŃie al UMF Cluj-Napoca [Tămaş şi Oniga, 2001].

Prepararea extractului fluid de Berberis vulgaris s-a realizat din Berberidis cortex prin repercolare după tehnica Squibb, utilizând ca solvent alcoolul de 70°[Popovici şi Lupuleasa, 2001]. Extractul a fost standardizat la un

7

conŃinut de 1% alcaloizi totali exprimaŃi în berberină. Determinarea cantitativă a alcaloizilor s-a efectuat prin spectrofotometrie în UV. El a fost realizat între anii 1983-1997 în cadrul Laboratorului de MicroproducŃie al UMF Cluj-Napoca sub numele de Tonobil, iar ulterior de SC Plafar Cluj-Napoca [Tămaş şi Oniga, 2001].

Tetraclorura de carbon, un xenobiotic cu tropism hepatic

Tetraclorura de carbon (CCl4) este o moleculă relativ non-reactivă şi devine

toxică pentru organism numai după activare enzimatică. Aceasta se produce în ficat, la nivelul reticulului endoplasmic neted, prin sistemul de oxidaze cu funcŃie mixtă (SOFM) [Orlandi şi Yezequel, 1972]. O componentă majoră a acestui complex polienzimatic este o hemoproteină cu banda de absorbŃie spectro-fotometrică de 450 nm, cunoscută sub denumirea de citocrom P-450. Dintre multiplele forme ale acestui citocrom prezente în microzomii hepatici, citocromul P-450 2E1 a fost identificat ca fiind cel mai important catalizator al bioactivării hidrocarburilor la animale şi posibil la om [Ryan şi col., 1984].

În microzomi CCl4 este metabolizată pe cale reductivă la radicalul liber triclormetil (-CCl3). De asemenea, CCl4 poate fi oxidată şi la fosgen (COCl2), dar cantitatea foarte redusă care se formează face ca această substanŃă şi această cale de biotransformare să fie nesemnificative pentru ficat. În condiŃii anaerobe, CCl4 este metabolizată pe o cale alternativă de reducere, formându-se produşi de tip carbene care se leagă de proteine şi acizi nucleici [Nelson, 1995].

CCl3 atacă legăturile duble ale acizilor graşi polinesaturaŃi membranari pe care reticulul endoplasmic, ca şi alte formaŃiuni subcelulare, îi conŃin din belşug, provocând lipoperoxidarea acestora cu consecinŃe foarte grave pentru funcŃionalitatea celulelor. Radicalul liber CCl3 foarte reactiv atacă şi modifică proteinele hepatice, mai întâi la nivelul microzomilor, locul formării sale, apoi şi la nivelul mitocondriilor şi membranei plasmatice, inducând peroxidarea acestor structuri celulare. În acest fel rezultă hidroxialcani difuzibili care pot şi ei să reacŃioneze cu grupările tiol din proteine şi să cauzeze leziuni hepatice semnificative. CCl3 poate reacŃiona cu O2 formând triclormetil-peroxil (CCl3OO-), un radical liber la fel de reactiv care poate induce peroxidarea lipidelor membranare şi alchilarea unor macromolecule celulare. MetaboliŃii reactivi formaŃi prin bioactivarea CCl4 se leagă şi de ADN nuclear, ceea ce explică carcinogenitatea şi mutagenitatea provocate de acest xenobiotic [Brent şi Rumack, 1993; Raucy şi col., 1993; Rusu şi col., 2005].

Modificările hepatotoxice induse de CCl4 se realizează in vivo şi in vitro în cursul unei cascade de modificări biochimice şi structurale care include, într-o ordine relativ cronologică, lipoperoxidarea, inhibarea sintezelor proteice şi scăderea numărului polizomilor hepatici, atât prin alterarea ARNm cât şi prin reducerea fixării ribozomilor pe acesta, inactivarea sau reducerea activităŃii unor enzime, dezechilibrarea homeostaziei Ca2+, creşterea permeabilităŃii membranelor celulare, hepatocitoliza prin necroze şi apoptoză [Brent şi Rumack, 1993], activarea unor factori implicaŃi în procesul de fibrozare [Poli, 2000].

8

Sub acŃiunea CCl4 se produc modificări hepatice infrastructurale mai întâi în reticulul endoplasmic, apoi la nivel mitocondrial, membranar şi difuz celular câteva ore mai târziu. Mitocondriile suferă rarefierea matricei şi lezări ale cristelor prin dezagregare şi umflare, ca o consecinŃă a jugulării resurselor energetice celulare. Membrana celulară şi sistemul de endomembrane sunt lezate în cursul lipoperoxidării prin distrugerea permeabilităŃii lor selective, cu consecinŃe grave pentru celule. La nivelul membranei lizozomale, aceste alterări permit vărsarea în citoplasmă a hidrolazelor, care sunt o cauză majoră a fenomenului de necrobioză. În ultimă instanŃă, celulele intoxicate cu CCl4 se umflă, formând aşa-numitele „celule balon”, concomitent cu distrugerea integrităŃii membranei celulare şi a pătrunderii în celulă a fosfolipazei A. Rezultă creşterea nivelului lizofosfatidelor care desăvârşesc distrugerea celulară [Rusu şi col., 2005].

Modificările lezionale care apar în ficatul intoxicat cu CCl4 au o gradaŃie a gravităŃii: de la distrofia clară la degenerescenŃa grasă, care sunt relativ reversibile, până la necroza hepatică punctuală sau difuză. Aceste leziuni apar în primul rând ca o consecinŃă directă a acŃiunii toxice a CCl4 şi a radicalilor săi liberi, dar pot fi cauzate şi indirect de fenomenele hipoxice care o însoŃesc. Elementele definitorii ale acestui proces lezional al parenchimului hepatic sunt, în ordinea importanŃei, balonizarea celulară, necrozele şi steatoza extinsă [Rusu şi col., 2005]. Ca răspuns la distrugerea celulelor parenchimale, celulele Ito pot fi stimulate să elibereze proteine ale matricei extracelulare, ceea ce contribuie la dezvoltarea fibrogenezei hepatice, mediată parŃial şi de celulele Kupffer care produc o cantitate mare de citokine [Poli, 2000].

Experimentele efectuate in vivo şi in vitro pe mamiferele de laborator au arătat că hepatotoxicitatea CCl4 este zonală, efectele sale nocive manifestându-se diferenŃiat în funcŃie de topografia acinului [Jungermann, 1992]. Hepatocitele cu cel mai avansat grad de afectare sunt cele din zonele acinare III, apoi cele din zonele II învecinate, fapt semnalat şi în cazul cirozei umane [Tanikawa, 1968], zone în care s-au constatat o producŃie crescută de citocrom P-450 şi un nivel scăzut de glutation redus. Pe de altă parte, în zonele acinare I, mai puŃin afectate de CCl4, există o concentraŃie mai mare de enzime de protecŃie celulară împotriva radicalilor liberi reactivi. Producerea leziunilor hepatice în zone preferenŃiale se datorează unei rezistenŃe minime a acestor zone, denumite din acest motiv de către Rusu şi col. [2005] „linii de fractură”. Această teorie originală a autorilor citaŃi se bazează pe rezultatele practice observate în numeroase experimente realizate de-a lungul mai multor ani de cercetări. Liniile de fractură se suprapun peste zonele III şi II din structura acinară a ficatului şi corespund zonelor clasice hepatice peri-centrolobulare, predestinate să fie aşa, datorită unui complex de factori.

Deşi xenobioticul sau radicalii săi liberi penetrează tot ficatul, de obicei determină leziuni specifice zonale, afectând cu predilecŃie şi anumite organite celulare. Hepatectomia chimică [Rusu, 1997] declanşează un proces de refacere hepatică, care nu diferă mult de cea apărută după hepatectomia chirurgicală. Un rol important în refacerea Ńesutului hepatic îl are zona acinară I, caracterizată printr-un proces foarte activ de diviziuni celulare. Hepatocitele nou formate vor înlocui

9

arhitectura aberantă a leziunilor cu una mai mult sau mai puŃin normală. Dacă se depăşesc însă anumite limite legate de doza sau de durata administrării xenobioticului, hepatectomia chimică se transformă într-un proces ireversibil spre exitus [Chanda şi Mehendale, 1996; Rusu şi col., 2005].

În condiŃiile unei toxicoze induse de xenobiotice, ficatul are două căi importante de a-şi reface homeostazia dezechilibrată: mecanismul hormetic, care răspunde la substanŃa hepatotoxică prin reacŃii biochimice complexe şi regenerarea

hepatică, care se bazează pe diviziunea celulară ca mecanism de compensare a distrugerii arhitecturii tisulare sub acŃiunea toxicului.

Metode şi tehnici experimentale

Prin metodele de histologie clasică celulele pot fi vizualizate la microscopul

optic pe baza proprietăŃilor tinctoriale. Fragmentele de ficat şi rinichi, cu o grosime de cel mult 5 mm, au fost prelucrate printr-o succesiune riguroasă de operaŃiuni în vederea examinării structurii tisulare. Cuburile de Ńesut au fost introduse timp de 24 de ore în soluŃia fixatoare Bouin şi apoi spălate cu alcool de 70° şi deshidratate cu alcool absolut. Piesele fixate au fost infiltrate cu parafină topită la 56°C, în etuvă. După solidificare, blocurile de parafină au fost modelate şi apoi secŃionate la microtomul de tip Reichert, obŃinându-se secŃiuni cu grosimea de 5 µm. SecŃiunile au fost etalate şi lipite pe lame de sticlă cu albumină Mayer. După deparafinare cu hidrocarburi benzenice şi hidratare cu alcool 70° şi apă distilată, secŃiunile au fost colorate cu hematoxilină-eozină şi apoi deshidratate cu alcool absolut şi clarificate cu xilen. SecŃiunile colorate au fost montate între lamă şi lamelă cu balsam de Canada, uscate şi etichetate. Preparatele obŃinute au fost examinate la microscopul optic şi memorizate la computer [Mureşan şi col., 1976].

Tehnicile de histochimie permit identificarea la microscop a diferiŃilor constituenŃi chimici ai celulelor, păstrând integritatea structurală tisulară. Fragmentele de ficat, de maxim 1 mm grosime, au fost prelucrate până la stadiul de secŃiuni adecvate identificării şi localizării lipidelor totale. Vizualizarea acestor substanŃe, în preparatul microscopic, s-a realizat printr-o reacŃie histochimică specifică. Probele de ficat, congelate la -196°C prin imersare în azot lichid, au fost secŃionate la criotomul Shandon AS, obŃinându-se secŃiuni cu o grosime de 7 µm. După etalare şi lipire pe lame de sticlă, secŃiunile au fost colorate cu o soluŃie saturată de Sudan negru, montate în mediu hidrosolubil, examinate imediat la microscopul optic şi fotografiate digital [Mureşan şi col., 1976].

Tehnicile histoenzimatice pot identifica activitatea unei enzime în Ńesuturile supuse observaŃiei microscopice. În acest scop, fragmentele de ficat şi rinichi cu o grosime mai mică de 1 mm, au fost congelate în azot lichid la temperatura de -196°C şi secŃionate la criotomul de tip Shandon AS, la o grosime de 7 µm. SecŃiunile nefixate au fost aplicate pe lame şi acoperite cu medii de incubare specifice, în vederea vizualizării la microscop a produşilor cromofori sau cromogeni rezultaŃi prin activitatea enzimelor celulare. A fost determinată activitatea următoarelor enzime:

10

- lactatdehidrogenaza (LDH) conform metodei Hess, Scarpelli, Pearse (1971). S-a utilizat ca substrat lactat de sodiu în tampon fosfat pH 7,8 şi NAD+, iar pentru vizualizarea produsului o sare de tetrazoliu. Incubarea s-a făcut timp de 10 minute la 37°C. Locurile tisulare cu activitate enzimatică se evidenŃiază printr-o coloraŃie albastră-indigo.

- succinatdehidrogenaza (SDH) prin metoda Nachlas, Lison (1960), utilizând ca substrat succinat de sodiu în tampon fosfat pH 7,4 şi pentru vizualizare o sare de tetrazoliu. Timpul de incubare a fost de 60 de minute la 37°C. Locurile tisulare cu activitate enzimatică se evidenŃiază sub forma unei coloraŃii albastre-violacee.

- glutamatdehidrogenaza (GtDH) conform metodei Hess, Scarpelli, Pearse (1971), folosind ca substrat L-glutamat de sodiu şi NAD+, iar pentru vizualizare o sare de tetrazoliu. Incubarea a durat 30 de minute la 37°C. În locurile tisulare cu activitate enzimatică apare o coloraŃie violacee.

- citocromoxidaza (CyOx) conform metodei Burstone, pentru cuplarea oxidativă folosindu-se un amestec format din N-fenil-p-fenildiamină şi un derivat naftolic, iar pentru chelarea produsului de condensare o sare de cobalt. În locurile cu activitate enzimatică se obŃine o coloraŃie albastră-verzuie.

- adenozintrifosfataza (ATP-aza) prin metoda Wachstein-Meisel, utilizând ATP-ul ca substrat şi azotatul de plumb pentru obŃinerea unui precipitat colorat. Activitatea enzimatică este vizualizată în Ńesut datorită coloraŃiei brun-negre a sulfurii de plumb rezultate.

- glucozo-6-fosfataza (G6P-aza) prin metoda Wachstein-Meisel, utilizând glucozo-6-fosfatul ca substrat şi o sare de plumb pentru obŃinerea unui precipitat colorat. Activitatea enzimatică este evidenŃiată în Ńesut datorită coloraŃiei brun-aurii a produsului rezultat [Mureşan şi col., 1976]. Prin metodele de biochimie se pot izola şi determina substanŃe celulare pe

baza naturii lor chimice. Serul sangvin, obŃinut din sângele proaspăt de şobolan, a fost supus analizei biochimice în scopul determinării activităŃii transaminazelor. Activitatea glutamat-piruvat-transferazei (GPT) şi a glutamat-oxalacetat-

transferazei (GOT) a fost determinată prin dozarea acidului piruvic format într-o oră, într-un mililitru de ser sangvin, conform metodei Reitmann şi Frankel [1957]. Serul sangvin a fost incubat cu substratul specific, alanina pentru GPT şi acidul aspartic pentru GOT, la 37°C, timp de 30 de minute pentru GPT şi 60 de minute pentru GOT. Cetoacidul rezultat a reacŃionat cu 2,4-dinitrofenilhidrazina adăugată în mediul de reacŃie şi a format un compus roşu, care a fost determinat prin citirea extincŃiei la spectrofotocolorimetrul Spekol, la 635 nm. Pe baza curbei de etalonare s-a calculat apoi cantitatea de piruvat, exprimată în µg/ml ser sangvin/h.

Rezultatele au fost exprimate în medie ±ES şi prelucrate biostatistic, conform metodelor uzuale după Snedecor şi Cochran [1978]. Modificările parametrilor studiaŃi faŃă de valorile obŃinute la martorii corespunzători au fost evaluate pe baza testului „t” al lui Student, valorile aberante fiind eliminate după

11

criteriul Chauvenet. Pragul semnificaŃiei statistice a modificărilor a fost considerat la p=0,05 şi prin urmare diferenŃele la p<0,05 semnificative.

Analiza imaginilor electronomicroscopice ale Ńesuturilor dă informaŃii despre ultrastructura şi funcŃia intimă a celulelor. Pentru examinarea la microscopul electronic de transmisie, fragmentele de organe, recoltate sub formă de cuburi cu latura de 0,5 mm, au fost imediat prefixate în soluŃie de glutaraldehidă 2,7% în tampon fosfat 0,1M pH 7,2 timp de 1,5 ore la 4°C şi apoi spălate în tampon fosfat 0,15M pH 7,2. Postfixarea pieselor s-a făcut în soluŃie de acid osmic 2% în tampon fosfat 0,15M pH 7,4 timp de o oră la 4°C şi apoi au fost spălate în tampon fosfat 0,15M pH 7,2. Piesele deshidratate în acetonă, au fost incluse în răşina poliesterică Vestopal 310, polimerizarea făcându-se în etuvă la temperatura de 60°C, timp de 3 zile. Blocurile formate au fost modelate şi apoi secŃionate la un ultramicrotom tip Leica UC6, la grosimea de 70 nm. SecŃiunile de culoare aurie au fost preluate pe grile electrolitice şi dublu contrastate cu soluŃii de acetat de uranil şi citrat de plumb în scopul creşterii capacităŃii de împrăştiere diferenŃiată a electronilor de către materialul biologic. SecŃiunile ultrafine au fost examinate la un microscop electronic de tip Jeol JEM 1010. Imaginile mărite şi proiectate pe ecranul microscopului au fost alese şi înregistrate digital cu ajutorul unei camere video CCD Mega View III şi procesate ulterior pe calculator [Hayat, 2000; Pavelka şi Roth, 2005].

Organizarea

experimentelor Tipul experimentelor

Am realizat două experimente de tip acut, fiecare având o durată de 6 zile. Animalele de experienŃă Am folosit şobolani albi din rasa Wistar, masculi, adulŃi, având aproximativ

acceaşi greutate. În primul experiment am lucrat cu animale senescente, în vârstă de peste 12 luni şi cu o greutate medie de 224±20 g, în timp ce în al doilea experiment am folosit şobolani tineri, în vârstă de 2 luni şi cu o greutate medie de 150±15 g.

Pentru creşterea şi întreŃinerea şobolanilor au fost asigurate condiŃii zooigienice standardizate: interval de lumină/întuneric de 12 ore, umiditate relativă a aerului de 60%, temperatură constantă de 20±2°C, regim alimentar echilibrat în proteine, glucide, lipide şi vitamine, administrat sub formă de concentrate şi apă ad

libitum.

12

Loturile de experienŃă Şobolanii au fost împărŃiŃi în mai multe loturi, în funcŃie de obiectivele

urmărite în cadrul fiecărui experiment. Au fost organizate următoarele loturi: - lotul martor (M) alcătuit din 8 şobolani; - lotul intoxicat cu CCl4 (C) alcătuit din 8 şobolani; - lotul intoxicat cu CCl4 şi tratat cu extract de Chelidonium majus (CCh)

alcătuit din 10 şobolani; - lotul intoxicat cu CCl4 şi tratat cu extract de Berberis vulgaris (CB) alcătuit

din 10 şobolani; - lotul la care s-a administrat extract de Chelidonium majus (Ch) alcătuit din

8 şobolani; - lotul la care s-a administrat extract de Berberis vulgaris (B) alcătuit din 8 şobolani. MenŃionăm că loturile M, C, CCh şi CB sunt comune ambelor experimente,

în timp ce loturile Ch şi B au fost organizate doar în al doilea experiment. SubstanŃele administrate

Pe toată durata de 6 zile a fiecărui experiment au fost administrate

şobolanilor, în fiecare dimineaŃă, substanŃa placebo, substanŃa hepatotoxică şi cele două extracte vegetale supuse cercetării.

Uleiul de floarea soarelui a fost administrat şobolanilor din lotul martor (M) pentru obŃinerea efectului placebo. De asemenea, el a fost utilizat şi pentru diluarea corespunzătoare a CCl4 administrată şobolanilor din loturile intoxicate (C, CCh, CB).

Tetraclorura de carbon (CCl4) a fost administrată şobolanilor din loturile C, CCh, CB pentru inducerea intoxicaŃiei hepatice acute. Doza de CCl4 folosită în fiecare experiment a fost obŃinută prin diluare cu ulei de floarea soarelui.

Extractul fluid de Chelidonium majus, standardizat la un conŃinut de 0,25% alcaloizi totali exprimaŃi în chelidonină [Tămaş şi Oniga, 2001], a fost administrat şobolanilor intoxicaŃi experimental din lotul CCh pentru cercetarea potenŃialului său hepatoprotector, la un interval de 30 de minute după administrarea CCl4. De asemenea, el a fost administrat şi şobolanilor neintoxicaŃi din lotul Ch în vederea stabilirii inocuităŃii sale asupra ficatului şi rinichilor. Înainte de administrare, extractul de Chelidonium majus a fost încălzit pe baie de apă pentru evaporarea alcoolului şi reluat în ser fiziologic.

Extractul fluid de Berberis vulgaris, standardizat la un conŃinut de 1% alcaloizi totali exprimaŃi în berberină [Tămaş şi Oniga, 2001], a fost administrat şobolanilor intoxicaŃi experimental din lotul CB pentru cercetarea potenŃialului său hepatoprotector, la un interval de 30 de minute după administrarea CCl4. De asemenea, el a fost administrat şi şobolanilor neintoxicaŃi din lotul B în vederea stabilirii inocuităŃii sale asupra ficatului şi rinichilor. Înainte de administrare,

13

extractul de Berberis vulgaris a fost încălzit pe baie de apă pentru evaporarea alcoolului şi reluat în ser fiziologic.

Dozele administrate

SubstanŃe administrate Primul experiment Al doilea experiment ulei de floarea soarelui 0,2 ml 0,2 ml

CCl4 0,1 ml 0,05 ml extract de

Chelidonium majus 1,5 ml

soluŃie apoasă 4,2% 1,5 ml

soluŃie apoasă 20% extract de

Berberis vulgaris 1,5 ml

soluŃie apoasă 4,2% 1,5 ml

soluŃie apoasă 20% Înainte de administrare CCl4 a fost amestecată cu uleiul de floarea soarelui.

În primul experiment, s-a realizat o diluŃie de 1:2, fiecare şobolan din loturile C, CCh şi CB primind câte 0,3 ml amestec /100 g greutate corporală. În al doilea experiment, s-a realizat o diluŃie de 1:4, fiecare şobolan din loturile C, CCh şi CB primind câte 0,25 ml amestec /100 g greutate corporală.

MenŃionăm că soluŃia mumă de extracte vegetale standardizate a fost diluată cu apă distilată până la concentraŃia prevăzută în fiecare experiment. Doza de extract vegetal administrat şobolanilor s-a calculat prin extrapolarea dozei zilnice indicate la om [Tămaş şi Oniga, 2001], Ńinând cont şi de faptul că metabolismul şobolanilor este de 5-6 ori mai intens decât cel al omului. De asemenea, s-a luat în calcul şi diluŃia extractului vegetal.

Calea de administrare

Toate substanŃele folosite în experiment au fost administrate şobolanilor

prin gavaj intragastric, dimineaŃa pe nemâncate. În acest scop, şobolanului contenŃionat i s-a deschis gura cu ajutorul unui căluş perforat, prin a cărui orificiu s-a introdus sonda intragastrică. La capătul exterior al sondei s-a ataşat o seringă, al cărei conŃinut a fost pompat prin faringe şi esofag până în stomacul animalului.

Recoltarea probelor

Şobolanii au fost inaniŃiaŃi timp de 16 ore, anesteziaŃi cu eter etilic şi apoi

sacrificaŃi prin secŃionare cervicală, cu ajutorul unei ghilotine. Sângele şi fragmentele de ficat şi rinichi au fost prelevate în primele secunde de la sacrificarea animalelor, pentru a preîntâmpina alterările structurale şi biochimice postmortem.

Probele biologice au fost prelucrate apoi prin metode şi tehnici specifice analizelor experimentale histologice, histochimice, histoenzimatice, biochimice şi electronomicroscopice [Reitmann şi Frankel, 1957; Mureşan şi col., 1976; Snedecor şi Cochran, 1978; Ghergariu şi col., 2000; Hayat, 2000].

14

Rezultate şi discuŃii InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de Chelidonium

majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor senescenŃi intoxicaŃi cu

CCl4 (experimentul I)

Analizele experimentale arată încă de la nivel macroscopic că ficatul

şobolanilor din lotul intoxicat cu CCl4 a fost grav afectat. Această constatare este întregită de analiza histologică şi histochimică care demonstrează existenŃa leziunilor toxice hepatice. Se remarcă la lotul C mai ales balonizarea celulară şi necrozele centrolobulare, dar şi unele aspecte inflamatorii, precum şi creşterea masivă a cantităŃii de lipide în hepatocite, intoxicaŃia cu CCl4 determinând o adevărată steatoză hepatică, dispusă preferenŃial în zonele centrolobulare. Steatoza este foarte bine exprimată la nivelul „septelor disecante” [Rusu, 1997; Rusu şi col., 2005], realizate în parenchimul hepatic de celulele balonizate şi necrotice, participând la formarea acestora, dar este prezentă şi în celulele hepatice restante din jurul septelor.

Pe terenul biologic profund alterat de administarea CCl4 se constată diminuarea activităŃii enzimelor cercetate la nivelul ficatului prin tehnici histoenzimatice. Cauzele scăderii activităŃii acestor enzime la şobolanii din lotul intoxicat sunt cel puŃin două. Pe de o parte, distrugerea unor zone extinse de parenchim hepatic, ca urmare a steatozei, distrofiei, balonizării şi necrozării celulelor, reduce sau anulează capacitatea metabolică a ficatului. Pe de altă parte, radicalul liber CCl3, format în urma metabolizării hepatice a CCl4, are o acŃiune directă de inhibare totală sau parŃială a activităŃii enzimatice, inclusiv în Ńesutul hepatic restant şi funcŃional [Brent şi Rumack, 1993]. Unele enzime sunt mai sensibile la acŃiunea unor xenobiotice, devenind markeri pentru anumite tipuri de intoxicaŃii, aşa cum sunt considerate LDH, SDH şi G6P-aza în cazul hepatotoxicozei induse de CCl4 [Rusu şi col., 2005]. Remarcăm afectarea heterogenă a activităŃii enzimatice, în conformitate cu structura acinului hepatic, regiunile cele mai agresate fiind zonele acinare III şi II.

Transaminazele serice, în special GPT, au o semnificaŃie aparte pentru efectele unor toxice hepatice. De obicei, creşterea nivelului acestor enzime în sânge este consecinŃa unor modificări ale permeabilităŃii membranelor celulare [Cucuianu şi col., 1998]. De asemenea, eliberarea de transaminaze în sânge se poate datora şi unor procese de hepatocitoliză indusă experimental. Prin urmare, GOT şi GPT pot fi considerate enzime marker ale necrozelor hepatice care se produc sub acŃiunea unor substanŃe toxice, cum este de exemplu CCl4 [Teschke şi col., 1993; Rusu şi col., 2005]. Creşterea masivă, semnificativă din punct de vedere statistic (p<0,001), a concentraŃiei GPT şi GOT în sângele şobolanilor intoxicaŃi cu CCl4 este o dovadă a existenŃei unui fenomen de distrucŃie celulară şi poate fi corelată cu necrozele observate în preparatele microscopice. Nivelul crescut al GPT, enzimă prezentă numai în citosol, sugerează lezarea plasmalemei celulelor hepatice, în timp ce

15

creşterea înregistrată de GOT, enzimă prezentă în citosol dar şi în matricea mitocondriilor, indică alterarea profundă, la nivel subcelular, a hepatocitelor [Teschke şi col., 1993; Cucuianu şi col., 1998].

Modificările structurale şi metabolice observate în Ńesutul hepatic prelevat de la şobolanii intoxicaŃi cu CCl4, precum şi de la cei trataŃi cu extractele vegetale cercetate sunt confirmate de analiza electronomicroscopică a secŃiunilor ultrafine obŃinute din ficatul animalelor de experienŃă. Gravitatea leziunilor ultrastructurale depinde de poziŃia celulelor în lobulul hepatic, cele mai afectate de acŃiunea CCl4 fiind hepatocitele din zonele centrolobulare, care suferă modificări ireversibile. Acest fapt a fost semnalat şi în cazul cirozei umane [Tanikawa, 1968], precum şi în intoxicaŃia hepatică indusă la şobolan sau la puiul de găină [Rusu şi col., 2005] în urma administrării de nitrozamine. Producerea leziunilor în aceste zone cu rezistenŃă minimă la acŃiunea toxică a CCl4 se datorează irigării insuficiente cu oxigen şi nutrienŃi, prezenŃei aparatului enzimatic specializat pentru metabolizarea xenobioticelor [Orlandi şi Yezequel, 1972], precum şi ratei reduse a diviziunilor celulare [Lee şi col., 1998; Rusu şi col., 2005].

Rezultatele experimentului nostru arată de asemenea că, administrarea extractelor fluide de Chelidonium majus, respectiv de Berberis vulgaris are efecte pozitive asupra şobolanilor intoxicaŃi cu CCl4 : mortalitatea animalelor mai scăzută, aspectul macroscopic şi microscopic al ficatului mai puŃin lezat, steatoza mai redusă, activitatea enzimatică ameliorată. Nu au fost observate totuşi efecte benefice ale acŃiunii acestor extracte vegetale în privinŃa nivelului transaminazelor serice, ceea ce arată că, în condiŃiile experimentului nostru, administrarea extractului vegetal de Chelidonium majus, respectiv a celui de Berberis vulgaris nu interferează cu aspectele precizate mai sus. De altfel, fenomenul de necroză reprezintă doar un aspect al tabloului polimorf ce caracterizează instalarea leziunilor la nivel hepatic, consecutiv toxicozei cu CCl4. Alte aspecte ale acestui tablou sunt influenŃate pozitiv de extractele vegetale studiate, ceea ce justifică utilizarea lor în afecŃiunile hepatice.

Considerăm că influenŃa benefică a celor două extracte vegetale, susŃinută de observaŃiile histologice, histochimice, histoenzimatice şi electronomicroscopice din cadrul experimentului nostru, se bazează pe sistemele de protecŃie endogenă şi depinde de capacitatea de regenerare a Ńesutului hepatic. Deficitul de celule hepatice dobândit sub acŃiunea toxică a CCl4 poate fi compensat printr-un mecanism care implică diviziunea celulară [Rusu şi col., 2005]. Activitatea proliferativă a ficatului durează până la finele perioadei de creştere, respectiv 60 de zile la şobolan [Lee şi col., 1998], însă, consecutiv unor agresiuni xenobiotice însoŃite de distrugeri hepatice însemnate, poate să înceapă un proces activ de diviziune celulară [Chanda şi Mehendale, 1996], care constituie premizele refacerii tisulare. Odată cu înaintarea în vârstă a organismului scade atât numărul hepatocitelor care intră în diviziune, cât şi capacitatea acestora de a neutraliza şi înlătura efectele radicalilor liberi, consecinŃa fiind o sensibilitate crescută la hepatotoxine [Rusu şi col., 2005].

16

În consecinŃă, rata crescută a mortalităŃii animalelor intoxicate cu CCl4 (50% în cazul lotului C şi 30% în cazul loturilor CCh şi CB) este cauzată în primul rând de vârsta înaintată a şobolanilor folosiŃi în experiment şi secundar de doza hepatotoxicului şi a extractelor vegetale administrate. Datorită capacităŃii reduse de regenerare a ficatului la animalele senescente, o parte din şobolanii intoxicaŃi cu CCl4 au murit în decursul experimentului, iar cei care au supravieŃuit au prezentat alterări structural-funcŃionale hepatice şi după tratamentul cu extractele vegetale testate.

InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de Chelidonium

majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor tineri intoxicaŃi cu CCl4

(experimentul II)

Pentru a avea o imagine cât mai exactă asupra influenŃei hepatoprotectoare

a extractelor fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris la şobolani, s-a impus organizarea unui al doilea experiment, în care am folosit animale postpubere, în vârstă de 60 de zile. De asemenea, am considerat deosebit de utilă în acest sens modificarea dozelor substanŃelor administrate animalelor de experienŃă, în vederea stabilirii corelaŃiei doză - acŃiune biologică, atât în cazul CCl4, cât mai ales în cazul celor două remedii vegetale cercetate. Astfel, doza de CCl4 a fost redusă la jumătate faŃă de cea utilizată în primul experiment, iar doza de extracte vegetale a fost mărită de aproape cinci ori faŃă de cea utilizată în primul experiment, prin concentrarea soluŃiei administrate.

Rezultatele analizelor efectuate arată că în condiŃiile unei intoxicaŃii hepatice mai puŃin dure cu CCl4 apar leziuni tipice, însă moderat exprimate, cauzele fiind două. În primul rând, am folosit şobolani tineri, cu o capacitate crescută de regenerare a ficatului şi în consecinŃă, cu o rezistenŃă mai mare la acŃiunea hepatotoxică a CCl4 [Rusu şi col., 2005], iar în al doilea rând, am administrat o doză înjumătăŃită de CCl4. Pe fondul acestei hepatectomii chimice atenuate, extractele fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris au avut un puternic efect de protecŃie hepatică, dovedit atât de supravieŃuirea totală a şobolanilor, cât şi de analizele microscopice pe care le-am efectuat. De altfel, aceste rezultate sunt în concordanŃă şi cu doza mult mai mare de extracte vegetale utilizată în acest experiment.

În stadiul actual al cercetărilor noastre este dificil să susŃinem care sunt mecanismele prin care cele două extracte vegetale acŃionează. Totuşi, pe baza unor date bibliografice considerăm că sunt implicate principiile active nealcaloidice, care protejează împotriva acŃiunii radicalilor liberi şi astfel pot preveni efectele nocive ale CCl4. Aceşti compuşi aparŃin la numeroase specii chimice (vitamine, carotene, fenoli, polifenoli, flavonoide, saponine etc.) şi sunt denumiŃi cu un termen cuprinzător, chemopreventori [Stavric, 1993]. Cu toate că mecanismele de acŃiune ale chemopreventorilor sunt complexe şi heterogene, capacitatea lor antioxidantă are un rol semnificativ în efectele hepatoprotectoare, fiind din acest motiv incluşi în prima linie de apărare celulară împotriva xenobioticelor [Cadenas,

17

1995]. La nivel intracelular, aceste substanŃe active reprezintă adevărate capcane pentru grupările electrofile ale radicalilor liberi pe care astfel îi neutralizează. De asemenea, sunt capabile să reducă activitatea enzimelor implicate în formarea radicalilor liberi, precum şi să crească activitatea enzimelor responsabile de detoxifierea radicalilor liberi [Stavric, 1993].

Date recente au arătat implicarea unor vitamine antioxidante în neutralizarea radicalilor liberi [Ahmad, 1995]. β-carotenul, cel mai puternic antioxidant dintre provitaminele A, este prezent în cantitate mare în toate organele plantei Chelidonium majus [Stănescu şi col., 2002]. Studiile experimentale efectuate in vivo [Rusu şi col., 2005] şi in vitro [Garcia-Gasca şi col., 1998] au arătat că acest principiu activ de origine vegetală are efect hepatoprotector, reuşind să neutralizeze radicalii liberi produşi în urma bioactivării diferitelor xenobiotice. Acidul ascorbic, aflat în frunzele de Chelidonium majus în concentraŃie maximă în perioada înfloririi [Stănescu şi col., 2002], este destul de reactiv pentru a intercepta oxidanŃii în fază apoasă, înainte ca aceştia să poată ataca lipidele [Ahmad, 1995].

O altă categorie de principii active vegetale capabile să reducă stress-ul oxidativ indus experimental este reprezentată de fenoli [Skottova şi col., 2004]. Se presupune că fenolii şi polifenolii, identificaŃi în cantitate crescută în Berberis

vulgaris [Hegnauer, 1964], cresc capacitatea de detoxificare a celulelor deoarece activează glutation-S-transferaza care catalizează conjugarea radicalilor liberi cu forma redusă a glutationului [Hayes şi col., 2005]. Flavonoizii prezenŃi în cele două plante [Hegnauer, 1964; Stănescu şi col., 2002] au de asemenea proprietăŃi antioxidante. Ei pot proteja celulele prin neutralizarea radicalilor liberi, creşterea concentraŃiei intracelulare a glutationului redus, blocarea canalelor de calciu şi inhibarea pătrunderii acestui ion în celule. Se pare că stimulează sinteza de ARNr şi astfel facilitează regenerarea hepatocitelor. La nivelul membranelor celulare, protejează unele enzime importante, blochează receptorii pentru xenobiotice şi favorizează refacerea porŃiunilor membranare lezate [Rusu şi col., 2005]. DerivaŃii flavonici reduc hepatotoxicitatea indusă de CCl4 întrucât pot forma în celule sisteme de oxido-reducere care echilibrează mecanismele endogene de protecŃie împotriva radicalilor reactivi [Stănescu şi col., 2002].

InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris

asupra ficatului şobolanilor tineri (experimentul II)

Se ştie că substanŃele medicamentoase pătrunse în organism sunt supuse

unor procese metabolice de degradare enzimatică, principalul organ implicat în detoxificarea acestora fiind ficatul. În acelaşi timp, datorită funcŃiei sale, ficatul este puternic afectat de prezenŃa substanŃelor active şi toxice în organism [Rusu şi col., 2005]. Pe baza acestor considerente, precum şi pentru aprofundarea datelor ştiinŃifice legate de impactul pe care cele două produse fitoterapeutice îl au asupra ficatului, am decis organizarea, în cadrul celui de al doilea experiment, a unui lot de şobolani la care să se administreze numai extractul de Chelidonium majus şi a altui lot la care să se administreze numai extractul de Berberis vulgaris.

18

Analizele experimentale arată că, în condiŃiile administrării unor doze mari de extracte vegetale, ficatul şobolanilor prezintă un aspect foarte asemănător din punct de vedere structural, ultrastructural şi metabolic cu cel descris la şobolanii lotului martor. MenŃionăm că în cazul animalelor cărora li s-a administrat doar extractul vegetal nu s-au efectuat analize biochimice, deoarece cercetările anterioare au arătat că extractele de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris nu influenŃează nivelul transaminazelor serice.

InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris

asupra rinichilor şobolanilor tineri (experimentul II)

SubstanŃele active sunt supuse în organism unui proces de epurare, fiind

mai întâi metabolizate la nivelul ficatului şi apoi eliminate, mai ales prin excreŃie renală. Frecvent, substanŃele exogene produc diferite reacŃii adverse la nivelul organului de eliminare. Datorită acestui fapt, în cadrul celui de al doilea experiment, o altă direcŃie de cercetare a urmărit prin mijloace histologice, histoenzimatice şi electronomicroscopice impactul produs de cele două extracte vegetale la nivelul rinichilor animalelor de experienŃă.

Partea cea mai vulnerabilă a nefronului este considerată tubul contort proximal, care poate fi lezat de metaboliŃii eliminaŃi din organism [Pavelka şi Roth, 2005; Rusu şi col., 2005]. Rezultatele noastre experimentale arată că structura, ultrastructura şi metabolismul nefrocitelor tubilor proximali sunt normale la şobolanii la care au fost administrate doze crescute din extractele vegetale cercetate.

Concluzii finale

1. Rezultatele noastre descriu un tablou complex structural, ultrastructural şi metabolic al acŃiunii CCl4 la nivelul ficatului de şobolan, dovedind reuşita toxicozei indusă experimental.

2. IntoxicaŃia hepatică acută determinată de CCl4 a fost folosită ca model experimental pentru studierea efectelor extractelor vegetale de Chelidonium

majus şi Berberis vulgaris asupra ficatului de şobolan. S-a utilizat în acest scop o gamă complexă de analize experimentale bazate pe metode şi tehnici histologice, histochimice, histoenzimatice, biochimice şi electrono-microscopice.

3. Analizele experimentale efectuate de noi demonstrează influenŃa hepatoprotectoare a extractelor fluide standardizate de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris. Administrarea acestor produse vegetale la şobolanii intoxicaŃi cu CCl4 a determinat următoarele rezultate pozitive: mortalitatea animalelor mai scăzută în primul experiment şi supravieŃuirea totală în cel de al

19

doilea, aspectul macroscopic şi microscopic al ficatului mai puŃin lezat, steatoza redusă, activitatea enzimatică ameliorată.

4. Efectele benefice ale celor două remedii fitoterapeutice se realizează prin capacitatea acestora de a neutraliza radicalul liber CCl3 rezultat în urma biotransformării hepatice a CCl4 şi de a exercita astfel o protecŃie la nivelul metabolismului, ultrastructurii şi structurii ficatului.

5. Considerăm că în acest mecanism de protecŃie hepatică un rol decisiv îl are componenta nealcaloidică a fitocomplexului extras din produsele vegetale Chelidonii herba şi Berberidis cortex. AcŃiunea constatată la nivelul structurilor şi funcŃiilor celulare şi subcelulare hepatice este determinată de caroten şi acidul cafeic, în cazul extractului de Chelidonium majus şi de compuşii fenolici şi polifenolici, în cazul extractului de Berberis vulgaris.

6. Comparând efectele celor două extracte vegetale administrate şobolanilor intoxicaŃi cu CCl4, rezultatele ambelor noastre experimente arată că influenŃa hepatoprotectoare este mai evidentă în cazul extractului fluid de Chelidonium

majus. 7. În primul experiment, efectele benefice ale celor două extracte vegetale au fost

mai estompate, ca o consecinŃă mai ales a reactivităŃii mai mici a şobolanilor senescenŃi. În cel de al doilea experiment, efectele benefice ale extractelor vegetale au fost mai evidente sub aspect macroscopic şi microscopic, fiind favorizate în primul rând de capacitatea regenerativă crescută a şobolanilor tineri, precum şi de hepatectomia atenuată, indusă de doza mai mică de toxic administrată.

8. Cele două remedii fitoterapeutice, administrate şobolanilor neintoxicaŃi, sunt metabolizate cu uşurinŃă la nivelul hepatocitelor, fără să inducă modificări negative în ficatul şi rinichii animalelor de experienŃă.

9. Rezultatele obŃinute de noi reprezintă o contribuŃie originală în ceea ce priveşte influenŃa hepatoprotectoare şi mecanismul de acŃiune la nivel celular şi subcelular a extractelor bioactive de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris.

10. Concluziile acestor experimente lărgesc sfera utilizării fitoterapeutice a celor două extracte fluide şi pot fi utile pentru practica medicală, care la ora actuală se orientează tot mai mult spre remediile naturale.

Bibliografie selectivă Din cele 212 titluri citate în teză:

1. Ahmad, S., 1995, Oxidative stress and antioxidant defenses în biology, Ed. Chapman & Hall, New York

2. Brent, J.A., Rumack, B.H., 1993, Role of free radicals in toxic hepatic

injury, Clin. Toxic., 31, (1), 139-171

20

3. Cadenas, E., 1995, Mechanisms of oxygen activation and reactive oxygen

species detoxification, Oxidative stress and antioxidant defenses in biology, Ed. by Ahmad S., Chapman & Hall, New York, 1-46

4. Chanda, S., Mehendale, H.M., 1996, Hepatic cell division and tissue

repair: a key to survival after liver injury, Mol. Med. Today, Feb., 82-89 5. Cucuianu, M., Crîsnic, I., Pleşca-Manea, L., 1998, Biochimie clinică –

Fundamentare fiziopatologică, Ed. Dacia, Cluj-Napoca 6. Faroon, O., De Rosa, C.T., Smith, L. et al., 1994, Carbon tetrachloride:

Health effects toxicokinetics, human exposure and environmental fate, Toxicol. Indust. Health, 10 (1), 4-20

7. Garcia-Gasca, T., Fatell, S., Villa-Trevino, S., Gonzales de Mejia, E., 1998, Effect of carotenoids against genotoxicity of diethylnitrosamine on rat

hepatocytes, Toxicology in vitro, 12, 691-698 8. Ghergariu, S., Pop, A., Kadar, L., Spînu, M., 2000, Manual de laborator

clinic veterinar, Ed. All Educational, Bucureşti, 261-266 9. Hayat, M.A., 2000, Principles and techniques of electron microscopy,

Biological applications, 4th Ed., Cambridge University Press, Cambridge 10. Hayes, J.D., Flanagan, J.U., Jowsey, I.R., 2005, Glutathione transferases,

Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 45, 51-88 11. Hegnauer, R., 1964, Chemataxonomie der Pflanzen buch III, Brickhäuser

Verlag, Basel, Stuttgart, 240-253 12. Jungerman, K., 1992, Zonal liver cell heterogenicity, Enzyme, 46, 5-7 13. Lee, V.M., Cameron, R.G., Archer, M.C., 1998, Zonal location of

compensatory hepatocyte profileration following chemically induced

hepatotoxicity in rats and humans, Toxic. Path., 26, 621-627 14. Mogoş, G., Sitcai, E., 1998, Toxicologie clinică, 1, Ed. Medic., Bucureşti 15. Mureşan, E., Bogdan, A.T., Gaboreanu, M., Baba, A.I., 1976, Tehnici de

histochimie normală şi patologică, Ed. Ceres, Bucureşti 16. Nelson, S.D., 1995, Mechanism of the formation and disposition of reactive

metabolites that can cause acute liver injury, Drug Metab. Rev., 27 (1-2), 147-177

17. Orlandi, F., Yezequel, A.M., 1972, Liver and drugs, Acad. Press, London, New York, 145-192

18. Pavelka, M., Roth, J., 2005, Functional ultrastructure. An atlas of tissue

biology and pathology, Ed. Springer, Wien, New York 19. Poli, G., 2000, Pathogenesis of liver fibrosis: role of oxidative stress, Mol.

Asp. Med., 21, 49-98 20. Popovici, I., Lupuleasa, D., 2001, Tehnologie farmaceutică, 1, Ed. a 2-a,

Ed. Polirom, Iaşi 21. Rappaport, A.M., 1958, The structural and functional unit of the human

liver (liver acinus), Anat. Rec., 130, 637-686 22. Raucy, J.L., Kraner, J.C., Lasker, J., 1993, Bioactivation of halogenated

hydrocarbons by cythocrome P450 2E1, Crit. Rev. Toxicol., 23 (1), 1-20

21

23. Reitmann, S., Frankel, S., 1957, A colorimetric method for the

determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic

transaminases, Amerc. J. Clin. Pathol., 28, 56-63 24. Rusu, M.A., 1997, Hepatectomia chimică model alternativ pentru studierea

regenerării hepatice, Bul. Soc. Nat. Cel., 25, 28 25. Rusu, M.A., Crăciun, C., Rusu, M.L., Puică, C., 2005, Xenobiotice şi

radicali liberi cu tropism hepatic: hepatectomia chimică: studii

experimentale, Eikon, Cluj-Napoca, 252 26. Ryan, D.E., Iida, S., Wood, A.W., 1984, Characterization of three highly

purified cytochromes P450 from hepatic microsomes of adult male rats, J. Biol. Chem., 259, 1239-1250

27. Skottova, N., Kazdova, L., Oliyarnyk, O., Vecera, R., Sobolova, L., Ulrichova, J., 2004, Phenolics-rich extracts from Silybum marianum and

Prunella vulgaris reduce a high-sucrose diet induced oxidative stress in

hereditary hypertriglyceridemic rats, Pharmacol. Res., 50, 123-130 28. Snedecor, G., Cochran, W., 1978, Statistical methods, 6

th Ed., The Iowa

State Univ. Press, Ames, Iowa 29. Stavric, B., 1993, Antimutagens and anticarcinogens in foods, Fd. Chem.

Toxic., 32 (1), 79-90 30. Stănescu, U., Miron, A., Hăncianu, M., Aprotosoaie, C., 2002, Bazele

farmaceutice, farmacologice şi chimice ale fitoterapiei, I-II, Ed. UMF Gr. T. Popa, Iaşi

31. Tanikawa, K., 1968, Ultrastructural aspects of the liver and its disorders, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, Igaku Shoin Ltd., Tokyo

32. Tămaş, M., Oniga, I., 2001, Produse fitoterapeutice româneşti, ediŃia a 2-a, UMF Iuliu HaŃieganu, Cluj-Napoca

33. Teschke R., Vierke, R., Goldermann, L., 1993, Carbon tetrachloride levels

and serum activities of liver enzymes fallowing acute CCl4 intoxication, Toxicol. Lett., 17, 175-180

34. ***1993, Farmacopeea Română EdiŃia a X-a, Ed. Med., Bucureşti