Microscopia de scanare Microscopia de scanare confocala cu laser aplicata confocala cu laser aplicata la nevertebratele marine la nevertebratele marine

(CLSM)(CLSM)

RezumatRezumat CLSM reprezinta un instrument ecotoxicologic puternic CLSM reprezinta un instrument ecotoxicologic puternic

pentru a evalua rapid efectele in vivo ale substantelor pentru a evalua rapid efectele in vivo ale substantelor toxice asupra calitatii si dezvoltarii embrionilor toxice asupra calitatii si dezvoltarii embrionilor nevertebratelor marine. Vom descrie aici o noua abordare nevertebratelor marine. Vom descrie aici o noua abordare CLSM pentru a evalua cantitatea relativa de galbenus CLSM pentru a evalua cantitatea relativa de galbenus (vitellus) din embrionii de (vitellus) din embrionii de Amphiascus tenuiremisAmphiascus tenuiremis (copepode) produsi de catre parintii crescuti de la ecloziune (copepode) produsi de catre parintii crescuti de la ecloziune pana la maturitate in PAH.pana la maturitate in PAH.

Metoda se bazeaza pe etichetarea fluorescenta a Metoda se bazeaza pe etichetarea fluorescenta a embrionilor si s-au detectat diferente statistic semnificative embrionilor si s-au detectat diferente statistic semnificative in concentratiile vitellus-ului oualor femelelor expuse la UV in concentratiile vitellus-ului oualor femelelor expuse la UV si sedimente contaminate. Intensitatile vitellus-ului au fost si sedimente contaminate. Intensitatile vitellus-ului au fost mult mai mari la cele neexpuse UV, tratate cu 2500ng mult mai mari la cele neexpuse UV, tratate cu 2500ng chrysene/g de sediment si la cele expuse UV tratate cu chrysene/g de sediment si la cele expuse UV tratate cu 500ng chrysene/g de sediment.500ng chrysene/g de sediment.

Cuvinte cheie:Cuvinte cheie:

• embrionembrion

• copepodcopepod

• vitellusvitellus

• hidrocarburi aromatice policiclicehidrocarburi aromatice policiclice

IntroducereIntroducere Microscopul confocal cu laser este folosit cel mai mult in cercetarile Microscopul confocal cu laser este folosit cel mai mult in cercetarile

biomedicale, insa a inceput sa aiba aplicatii si in ecotoxicologie, mai ales in biomedicale, insa a inceput sa aiba aplicatii si in ecotoxicologie, mai ales in cea marina. Cu ajutorul unor programe speciale, el permite evaluarea cea marina. Cu ajutorul unor programe speciale, el permite evaluarea raspunsurilor toxicologice ale organismelor la agentii de mediu, oferind o raspunsurilor toxicologice ale organismelor la agentii de mediu, oferind o altenativa in determinarea efectelor toxice si probabil este cel mai altenativa in determinarea efectelor toxice si probabil este cel mai perfectionat instrument disponibil in a masura fluorescenta.perfectionat instrument disponibil in a masura fluorescenta.

In experimentele de fata se descriu cateva masuratori cu ajutorul acestei In experimentele de fata se descriu cateva masuratori cu ajutorul acestei microscopii pentru a evalua cantitatea relativa de vitellus din embrionii microscopii pentru a evalua cantitatea relativa de vitellus din embrionii nevertebratelor marine (copepode), crescute fie in sedimente curate, fie in nevertebratelor marine (copepode), crescute fie in sedimente curate, fie in sedimente contaminate. Astfel, concentratia relativa masurata de galbenus sedimente contaminate. Astfel, concentratia relativa masurata de galbenus din embrioni prin intermediul CLSM poate servi ca indicatori ai efctelor din embrioni prin intermediul CLSM poate servi ca indicatori ai efctelor toxice asupra calitatii oualor si in cele din urma asupra succesului toxice asupra calitatii oualor si in cele din urma asupra succesului reproductiv.reproductiv.

Pentru a testa utilitatea microscopiei cu laser s-au folosit embrioni de Pentru a testa utilitatea microscopiei cu laser s-au folosit embrioni de Amphiascus tenuiremis Amphiascus tenuiremis (Copepoda) ce au fost supusi infectarii cu o (Copepoda) ce au fost supusi infectarii cu o hidrocarbura aromatica policiclica (chrysene-engl.), care poate avea hidrocarbura aromatica policiclica (chrysene-engl.), care poate avea potential activ asupra proprietatilor endocrine ale organismului. De aceea,in potential activ asupra proprietatilor endocrine ale organismului. De aceea,in acest studiu, s-a formulat ipoteza ca chrysena poate afecta formarea acest studiu, s-a formulat ipoteza ca chrysena poate afecta formarea vitellus-ului matern, si ca aceste efecte pot fi detectate in embrioni prin vitellus-ului matern, si ca aceste efecte pot fi detectate in embrioni prin etichetarea fluorescenta a galbenusului si prin masuratori cu ajutorul CLSM.etichetarea fluorescenta a galbenusului si prin masuratori cu ajutorul CLSM.

Materiale si metodeMateriale si metodeEtichetarea galbenusului: BODIPY 505/515Etichetarea galbenusului: BODIPY 505/515 BODIPY 505/515 nu este o substanta toxica, dar BODIPY 505/515 nu este o substanta toxica, dar

patrunde usor membranele celulare,lasand pete patrunde usor membranele celulare,lasand pete fluorescente in complexele citoplasmatice din galbenus si fluorescente in complexele citoplasmatice din galbenus si serveste la marcarea fluorescenta a vitellus-ului. Este serveste la marcarea fluorescenta a vitellus-ului. Este solubil in dimetilsulfoxid (DMSO), are o absorbtie maxima solubil in dimetilsulfoxid (DMSO), are o absorbtie maxima la 502 ± 3 nm si o emisie maxima la 510 ± 4 nm.la 502 ± 3 nm si o emisie maxima la 510 ± 4 nm.

Modelul crustacean: copepodul bentic marin Modelul crustacean: copepodul bentic marin Amphiascus Amphiascus tenuiremistenuiremis

Acest copepod isi are habitatul in sedimentele din zonele Acest copepod isi are habitatul in sedimentele din zonele de estuar de la Marea Nordului si Marea Baltica pana in de estuar de la Marea Nordului si Marea Baltica pana in zona de sud a Golfului Mexic. Isi realizeaza ciclul de viata zona de sud a Golfului Mexic. Isi realizeaza ciclul de viata in doar 15 zile la 25°C. Ouale au un corion clar si sunt in doar 15 zile la 25°C. Ouale au un corion clar si sunt extrudate in mase planare asociate, de cate 5-7 oua/masa. extrudate in mase planare asociate, de cate 5-7 oua/masa. Ouale si embrionii au aproximativ 30×20μm; de aceea se Ouale si embrionii au aproximativ 30×20μm; de aceea se pot obtine cu usurinta imagini CLSM de intensitate mare a pot obtine cu usurinta imagini CLSM de intensitate mare a fluorescentei si de inalta rezolutie. fluorescentei si de inalta rezolutie.

Femela de Femela de Amphiascus tenuiremisAmphiascus tenuiremis cu masele de cu masele de oua extrudate sub abdomenoua extrudate sub abdomen

In vederea demararii experimentului, s-au In vederea demararii experimentului, s-au colectat sedimente ce nu s-au contaminat cu colectat sedimente ce nu s-au contaminat cu chrysene pentru lotul control, iar loturile de chrysene pentru lotul control, iar loturile de tratament au fost infectate cu o solutie stoc tratament au fost infectate cu o solutie stoc formata prin dizolvarea chrysenei in diclormetan formata prin dizolvarea chrysenei in diclormetan (DCM)-operatorul de transport.(DCM)-operatorul de transport.

Copepodele au fost crescute prin incubatie Copepodele au fost crescute prin incubatie pana ce au ajuns la maturitatea reproductiva. Au pana ce au ajuns la maturitatea reproductiva. Au fost recoltate aproximativ 400 de femele ce au fost recoltate aproximativ 400 de femele ce au fost introduse in mediu steril -24 ore- timp in care fost introduse in mediu steril -24 ore- timp in care 200 dintre ele au eclozat. Embrionii au fost 200 dintre ele au eclozat. Embrionii au fost recoltati si introdusi, la intamplare, cate 30,in recoltati si introdusi, la intamplare, cate 30,in loturile de control si cele de tratament, in prezenta loturile de control si cele de tratament, in prezenta sau absenta razelor UV. Dupa 26 zile, fiecare lot a sau absenta razelor UV. Dupa 26 zile, fiecare lot a fost scos din camera de studiu,iar femele gravide fost scos din camera de studiu,iar femele gravide care au supravietuit au fost marcate cu ajutorul care au supravietuit au fost marcate cu ajutorul suspensiei de BODIPY 505/515 in 2% DMSO.suspensiei de BODIPY 505/515 in 2% DMSO.

RezultateRezultate

Metoda marcarii fluorescente a galbenusului Metoda marcarii fluorescente a galbenusului descrisa anterior, a fost folosita pentru a detecta descrisa anterior, a fost folosita pentru a detecta diferente statistic semnificative intre calitatea diferente statistic semnificative intre calitatea galbenusului de la ouale femelelor expuse la raze galbenusului de la ouale femelelor expuse la raze UV si sedimente contaminate cu chrysene. De UV si sedimente contaminate cu chrysene. De exemplu, fig.1 prezinta sectiuni optice de oua de exemplu, fig.1 prezinta sectiuni optice de oua de la 2 femele expuse la sedimente contaminate cu la 2 femele expuse la sedimente contaminate cu chrysene, una la lumina rece si alta la raze UV. chrysene, una la lumina rece si alta la raze UV. Femela expusa la UV, la 1500 ng/g sediment Femela expusa la UV, la 1500 ng/g sediment apare in imagine ca avand ouale mai mici, dar apare in imagine ca avand ouale mai mici, dar mai numeroase decat femela expusa la aceeasi mai numeroase decat femela expusa la aceeasi concentratie de chrysene,dar fara UV.concentratie de chrysene,dar fara UV.

Fig.1. Fig.1. Imagine CLSM Imagine CLSM ce prezinta ce prezinta complexele de complexele de galbenus din galbenus din ouale de ouale de Amphiascus Amphiascus tenuiremistenuiremis

In urmatoarea figura sunt prezentate intensitati In urmatoarea figura sunt prezentate intensitati diferite de unitati de fluorescernta la embrioni diferite de unitati de fluorescernta la embrioni colectati mai devreme de 24 ore, de la femele colectati mai devreme de 24 ore, de la femele crescute in diferite combinatii de tratament.crescute in diferite combinatii de tratament.

Exista 2 explicatii ce conduc la aceste rezultate:Exista 2 explicatii ce conduc la aceste rezultate: 1- expunerea la chrysene in timpul dezvoltarii a 1- expunerea la chrysene in timpul dezvoltarii a

imbunatatit in mod semnificativ depunerile imbunatatit in mod semnificativ depunerile ulterioare de galbenus in oua, efect puternic ulterioare de galbenus in oua, efect puternic consolidat prin iradiere cu UVconsolidat prin iradiere cu UV

2- femelele expuse la chrysene au produs oua ce s-2- femelele expuse la chrysene au produs oua ce s-au dezvoltat anormal.au dezvoltat anormal.

Nu demult s-a observat si la alti crustacei ca Nu demult s-a observat si la alti crustacei ca

toxicitatea endocrina, acuta sau cronica, a PAH toxicitatea endocrina, acuta sau cronica, a PAH poate fi influentata si de interactiunea acestora cu poate fi influentata si de interactiunea acestora cu iradiatiile UV.iradiatiile UV.

UV+2500ng CHRY/g-sed=0 (seria 1)UV+2500ng CHRY/g-sed=0 (seria 1) 2500ng CHRY/g-sed=290 (seria 2) 2500ng CHRY/g-sed=290 (seria 2)UV+500ng CHRY/g-sed=308 (seria 3)UV+500ng CHRY/g-sed=308 (seria 3) 500ng CHRY/g-sed=254 (seria 4) 500ng CHRY/g-sed=254 (seria 4) UV Control=175 (seria 5) UV Control=175 (seria 5) Control=176 (seria 6) Control=176 (seria 6)

0

290

308

254

175

176

0 50 100 150 200 250 300 350

1

2

3

4

5

6

Unitati de fluorescenta

DiscutiiDiscutii

Se pare ca in acest studiu mecanismul cresterii Se pare ca in acest studiu mecanismul cresterii intensitatii galbenusului datorita prezentei chrysenei intensitatii galbenusului datorita prezentei chrysenei este necunoscut, dar chrysena poate avea diferite este necunoscut, dar chrysena poate avea diferite proprietati chimice care sa imita diferiti hormoni proprietati chimice care sa imita diferiti hormoni endogeni, sau poate interfera cu actiunea normala a endogeni, sau poate interfera cu actiunea normala a unor hormoni importanti in controlul genezei vitellus-unor hormoni importanti in controlul genezei vitellus-ului.ului.

In alte studii, cand femele de creveti au fost expuse In alte studii, cand femele de creveti au fost expuse la o PAH asemanatoare, s-a produs la fel o cantitate la o PAH asemanatoare, s-a produs la fel o cantitate mare de galbenus, insa cand femelele au fost mare de galbenus, insa cand femelele au fost incrucisate cu masculi neexpusi a existat o mortalitate incrucisate cu masculi neexpusi a existat o mortalitate ridicata a puilor, deci s-a considerat ca acea ridicata a puilor, deci s-a considerat ca acea hidrocarbura a reprezentat un factor de toxicitate.hidrocarbura a reprezentat un factor de toxicitate.

ConcluziiConcluzii

S-a demonstrat ca BODIPY 505/515 este un S-a demonstrat ca BODIPY 505/515 este un marker fluorescent excelent pentru embrionii marker fluorescent excelent pentru embrionii nevertebratelor marine, dar si o procedura rapida nevertebratelor marine, dar si o procedura rapida si fara costuri ridicate. Din moment ce si fara costuri ridicate. Din moment ce concentratia de galbenus este puternic corelata concentratia de galbenus este puternic corelata cu membrana de proteine, BODIPY 505/515 poate cu membrana de proteine, BODIPY 505/515 poate servi ca un indicator al calitatii oului/embrionului servi ca un indicator al calitatii oului/embrionului in bioteste ecotoxicologice.in bioteste ecotoxicologice.

In concluzie, cu ajutorul microscopiei confocale In concluzie, cu ajutorul microscopiei confocale cu laser se pot face evaluari ecotoxicologice de cu laser se pot face evaluari ecotoxicologice de risc din mediul inconjurator, reprezentand o risc din mediul inconjurator, reprezentand o tehnologie accesibila, inca in curs de dezvoltare.tehnologie accesibila, inca in curs de dezvoltare.

BibliografieBibliografie

Ankley, G.T., Collyard, S.A., Monson, P.D., and Kosian, P.A.(1994). Influence of ultraviolet light on the toxicity of sediments contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons. EnvironToxicol Chem 13:1791–1796.

ASTM (1989). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. West Conshohocken,Pa.:American

Society for Testing and Materials, E-729 88a.

Boese, B.L., Ozretich, R.J., Lamberson, J.O., Cole, F.A., Swartz, R.C., and Ferraro, S.P. (2000). Phototoxic evaluation of marine sediments collected from a PAH-contaminated site. Arch Environ Contam Toxicol 38:274–282.

Chandler, G.T., and Green, A.S. (1996). A 14-day harpacticoidcopepod reproduction bioassay for laboratory and field contaminated muddy sediments. In: Techniques in Aquatic Toxicology,Ostrander, G.K. (Ed.). Boca Raton, Fla.: CRC Press, Inc.