UNIVERISTATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE DIN CRAIOVA ȘCOALA DOCTORALĂ

TEZĂ DE DOCTORAT REZUMAT

ROLUL TRANZIȚIEI EPITELIO-MEZENCHIMALE ÎN CARCINOAMELE UROTELIALE DE

VEZICĂ URINARĂ

CONDUCĂTOR DE DOCTORAT, Prof. Univ. Dr. CRĂIȚOIU ȘTEFANIA

STUDENT DOCTORAND, DROCAȘ IOAN ANDREI

CRAIOVA – 2016

2

CUPRINS

INTRODUCERE 3

STADIUL CUNOAŞTERII 3

CAPITOLUL 1

Histologia şi histofiziologia sistemului urinar

3

CAPITOLUL 2

Patologia tumorală vezicală

4

CAPITOLUL 3

Rolul tranziţiei epitelio-mezenchimale în carcinogeneza de la nivelu vezicii urinare

4

CONTRIBUŢII PERSONALE

CAPITOLUL 4

Studiul clinico-epidemiologic al carcinoamelor uroteliale de vezică urinară

4

CAPITOLUL 5

Studiul morfologic al carcinoamelor uroteliale de vezică urinară

6

CAPITOLUL 6

Studiul imunohistochimic al carcinoamelor uroteliale de vezică urinară

8

CONCLUZII GENERALE 11

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 11

Cuvinte cheie: cancer vezical, tranziţie epitelio-mezenchimală, sistem urinar, studiu

imunohistochimic, markeri imunohistochimici

3

INTRODUCERE

Cancerul vezical este pe primul loc ca și frecvență la nivelul tractului urinar, după

cancerul prostatic (Boring CC, Squires TS, Tong T, 1995). Prezintă variații geografice

importante, cea mai mare rată a incidenței fiind la bărbații care trăiesc în țările dezvoltate. În

Europa există cea mai mare incidență a cancerului vezical de la nivel mondial. Este de cinci ori

mai frecvent la bărbaţi decât la femei. Cu toate că leziunile sunt mai frecvente la sexul masculin,

prognosticul acestor pacienți este mai bun decât pentru sexul feminin, iar rata de mortalitate este

mai mică, carcinoamele fiind mai frecvent diagnosticate în stadii inițiale (Shariat SF, 2010).

Procesul de carcinogeneză de la nivelul uroteliului, recurența, progresia și metastazarea

pot implica numeroase molecule care urmează a fi descoperite și înțelese. La acest moment nu

există biomarkeri moleculari de diagnostic, prognostic sau terapeutici pentru carcinomul urotelial

(Liang Cheng, Darrell D. Davison, Julia Adams et al, 2014).

Teza de doctorat este structurată în două părţi majore:

I Stadiul cunoaşterii în care, pe parcursul a trei capitole au fost tratate aspecte referitoare

la histologia şi histofiziologia sistemului urinar, patologia tumorală vezicală şi la rolul tranziției

epitelio-mezenchimale în carcinogeneza de la nivelul vezicii urinare.

II Partea personală are ca obiectiv major de cercetare, stabilirea unor corelaţii între

aspectele clinice, imagistice, histologice şi imunohistochimice şi se direcţionează pe linia

realizării unui studiu clinico-epidemiologic, morfologic şi a unui studiu imunohistochimic,

fiecare dintre acestea propunându-şi mai multe obiective.

STADIUL CUNOAȘTERII

CAPITOLUL 1 HISTOLOGIA ŞI HISTOFIZIOLOGIA

SISTEMULUI URINAR

Sistemul urinar îndeplineşte multiple funcţii: elaborarea şi eliminarea urinii, prin aceasta

epurându-se organismul de produşii de catabolism, unii foarte toxici, menţinerea echilibrului

acido-bazic şi hidro-electrolitic, prin excreţia apei şi resorbţia selectivă a unor substanţe şi ioni,

funcţie endocrină cu rol în reglarea tensiunii arteriale, prin producerea unor substanţe dotate cu

activitate hormonală (renină), rol în stimularea formării globulelor roşii prin sintetiza la nivel

renal a eritropoetinei. Toate aceste funcţii îndeplinite de sistemul urinar contribuie la

menţinerea homeostaziei organismului.

Dezvoltarea sistemului urinar are loc în strânsă legătură cu dezvoltarea sistemului

genital, având origine mezodermală. Mezodermul intermediar este segmentat în regiunea

cervicală, formând nefrotoamele (Sadler TW, 2010), din care, se formeză, trei structuri primare:

pronefrosul, mezonefrosul şi metanefrosul.

Sistemul urinar este format din rinichi, organ pereche, localizat retroperitoneal, în loja

renală, de o parte şi de alta a coloanei vertebrale, în dreptul vertebrelor T11-L3, cu rol secretor,

de elaborare a urinii şi din căile urinare intrarenale (calice mici, calice mari, pelvis renal) şi

extrarenale (uretere, vezica urinară, uretra, prin care urina este transportată, stocată şi eliminată

în afara organismului (Chesbrough RM, Burkhard TK, Martinez AJ, Burks DD, 1989; Crăiţoiu

Ş, 2003; Sinescu I, Gluck G, 2008).

4

CAPITOLUL 2 PATOLOGIA TUMORALĂ VEZICALĂ

Cancerul vezical ocupă locul secund între cancerele tractului uro-genital, fiind pe primul

loc ca și frecvență la nivelul tractului urinar, după cancerul prostatic (Boring CC, Squires TS,

Tong T, 1995). Are o incidență de aproximativ 5% dintre cazurile noi de cancer depistate anual,

ocupând locul 4 ca și frecvență la bărbați, după cancerul prostatic, pulmonar și cancerul de colon

(Tomescu P, Pănuş A, 2006). Incidența cancerului vezical pare că este în scădere, probabil

datorită diminuării expunerii pacienților la diferiți factori de risc precum fumatul sau diferiți

agenți chimici (Sievert KD, Amend B, Nagele U et al, 2009). Cancerul vezical apare aproximativ

de două ori mai frecvent la bărbații albi, comparativ cu bărbații negri, în timp ce la femeile albe,

rata de apariție este cu doar 44% mai mare față de femeile negre (Cutler SJ, Young JL, 1975).

Această afecțiune frecventă nu trebuie percepută ca o patologie cu agregare familială

(Kiemeney LA, Schoenberg M, 1996; McCullough DL, 1975). Studiile genetice au descoperit

un număr de aproximativ 7-10 alterări cromozomiale în cazul pacienților cu tumori vezicale

infiltrative (Richter J, Jiang F, Gorog JP et al, 1997; Richter J, Beffa L, Wagner U et al, 1998).

Expunerea profesională este implicată în aproximativ 20% dintre cazurile de cancer

vezical în Statele Unite ale Americii, având o perioadă de latență cuprinsă între 30 - 50 ani

(Silverman DT, Levin LI, Hoover RN, Hartge P, 1989; Silverman DT, Levin LI, Hoover RN,

1989; Maximilian B, James WFC, Guido D et al, 2013). Incidența cancerului vezical este direct

proporțională cu perioada de timp și cu numărul de țigarete fumate pe zi (Brennan P, Bogillot O,

Cordier S et al, 2000; Joseph JC, Evanguelos X, Luis AK et al, 2014). Dieta, alături de factorii

nutriționali acționează ca și factori pro- sau antitumorali la nivelul întregului proces de

tumorigeneză de la nivelul tractului urogenital (Cheng G, Xie L, 2011; Steineck G, Hagman

U, Gerhardsson M, Norell SE, 1990; Vena JE, Graham S, Freudenheim J et al, 1992; Xu C, Zeng

XT, Liu TZ et al, 2015).

CAPITOLUL 3 ROLUL TRANZIŢIEI EPITELIO-MEZENCHIMALE ÎN

CARCINOGENEZA DE LA NIVELU VEZICII URINARE

Procesul de tranziție epitelio-mezenchimală (TEM) a fost observat încă din timpul

dezvoltării embrionare fiind un proces important pentru dezvoltarea embrionară şi pentru

formarea diferitelor ţesuturi şi organe (Savagner P, Boyer B, Valles AM et al, 1994). Interesul

pentru acest proces este în principal legat de rolul său în progresia din cadrul neoplaziilor (Thiery

JP, Sleeman JP, 2006). În anul 1982 a fost propusă teoria TEM care arată că în culturile de celule

epiteliale, acestea se convertesc morfologic în celule mezenchimale cu mobilitate în gel

(Greenburg G, Hay ED 1982). TEM reprezintă transformarea dinamică a celulelor epiteliale în

celule care prezintă fenotip mezenchimal (van der Horst G, Bos L, van der Pluijm G, 2012). TEM nu

este un proces specific neoplaziilor, jucând un rol important în diferențierea tisulară, dezvoltarea

organelor și vindecarea rănilor (Peinado H, Olmeda D, Cano A, 2007). TEM este un proces

reversibil, celulele implicate fiind capabile să redobândească fenotipul epitelial (Chen J, Han Q,

Pei D, 2012). Procesul de TEM cuprinde trei subtipuri diferite, care sunt separate prin căile de

producere și funcțiile îndeplinite, unul fiind asociat neoplaziilor (Chaw SY, Majeed AA, Dalley

AJ, 2012; Kalluri R, Weinberg RA, 2009).

5

CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL 4 STUDIUL CLINICO-EPIDEMIOLOGIC AL CARCINOAMELOR

UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ

Studiul realizat a fost analitic prospectiv și a inclus un număr de 784 de pacienti internați

pentru investigații și tratament in perioda 2013-2015, în Clinica de Urologie a Spitalului

Județean de Urgență Craiova, cu diagnosticul clinic de tumoră de vezică urinară. Pentru analiza

clinică am urmărit distribuţia pe ani calendaristici a cazurilor, precum și vârsta, sexul și mediul

de proveniență al pacienților, factorii de risc și simptomatologia asociată, la care s-a asociat

investigaţia imagistică (Fig. 4.1 - Fig. 4.5). Prelucrarea statistică a utilizat valorile medii, deviaţiile

standard şi testele de comparaţie (t Student, Chi pătrat, Pearson), realizate cu aplicații din cadrul

softului SPSS10 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Tabelul 4.1 prezintă cazuistica investigată, pe

ani de studiu.

Tabelul 4.1 Repartiţia cazurilor pe ani calendaristici

An 2013 2014 2015

Nr. Cazuri 205 262 317

% 26,1 33,4 40,5

592; 76%192; 24%

Bărbaţi

Femei

Fig. 4.1 Repartiţia cazurilor pe grupe de vârstă. Fig. 4.2 Repartiţia cazurilor pe sexe

Fig. 4.3 Repartiţia cazurilor în raport cu factorii de risc. Fig. 4.4 Repartiţia cazurilor în raport cu simptomele

de prezentare.

6

Parametr

u

Variabila Nr.cazuri %

Număr

tumori

unică

multiple

766

18 97,7

2,3

Dimensiuni

<2cm

2-10cm

>10cm

686

82

16

87,5

10,5

2

Localizare

trigon

dom

anterior

posterior

lateral

160

102

152

137

215

20,4

13,1

19,4

17,5

27,4

Fig. 4.5 Repartiţia cazurilor în raport cu numărul, dimensiunea și localizarea tumorilor.

CAPITOLUL 5 STUDIUL MORFOLOGIC AL CARCINOAMELOR UROTELIALE

DE VEZICĂ URINARĂ

Studiul morfologic a inclus un număr de 760 de carcinoame uroteliale de vezică urinară

invazive, diagnosticate în cadrul Laboratorului de Anatomie Patologică a Spitalului Jedețean de

Urgență Craiova. Analiza histopatologică a cazurilor a inclus stabilirea gradului de diferențiere

tumorală (Fig. 5.1), a profunzimii invaziei (Fig. 5.2, Fig. 5.3, Fig. 5.4) și a stadializării pTNM

tumorale. De asemenea au fost urmărite diferențierile histologice prezente la nivel tumoral (Fig.

5.5, Fig. 5.6), invazia vasculară (Fig. 5.7) și perineurală (Fig. 5.8), precum și aspectul histologic

al frontului tumoral, definit ca cea mai profundă arie de invazie a carcinomului urotelial la

nivelul peretelui vezical sau la nivelul fragmentelor de rezecție tumorală vezicală transuretrală.

Parametrii histopatologici ai carcinoamelor uroteliale vezicale sunt importanți atât pentru

aprecierea atitudinii terapeutice, cât și pentru stabilirea riscului de recurență și a speranței de

supraviețuire. Analiza integrată a parametrilor clinico-imagistici și histopatologici poate

optimiza managementul terapeutic în vederea ameliorării prognosticului.

Fig. 5.1 Carcinom urotelial de grad înalt, col. HE, x200 Fig. 5.2 Reacţie desmoplazică peritumorală, col. HE, x200

7

Fig. 5.3 Carcinom urotelial, invazie în lmina propria

(pT1), col. HE, x100

Fig. 5.4 Carcinom urotelial, invazie în întreg peretele

(pT3), col. HE, x100

Fig. 5.5 Carcinom urotelial, diferențieri scuamoase,

col. HE, x100

Fig. 5.6 Carcinom urotelial, diferențieri cu celule clare,

col. HE, x100

Fig. 5.7 Carcinom urotelial, invazie vasculară,

col. HE, x200

Fig. 5.8 Carcinom urotelial, invazie perineurală,

col. HE, x200

8

CAPITOLUL 6

STUDIUL IMUNOHISTOCHIMIC AL CARCINOAMELOR

UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ Analiza imunohistochimică s-a realizat pe un lot selectat de 65 de cazuri, care a inclus 35

de cazuri în care s-a practicat cistectomia totală și 30 de cazuri în care s-a practicat rezecție

tumorală transuretrală (TURV). Cazurile au provenit din lotul analizat clinic și morfologic, fiind

supuse aceleiași prelucrări primare în cadrul secției de Urologie și a laboratorului de Anatomie

Patologică a Spitalului Județean de Urgență Craiova.

Panelul de markeri investigați în acest studiu s-a adresat investigării principalelor

mecanisme biomoleculare din cadrul tranziției epitelio- mezenchimale tumorale de la nivel

vezical, respectiv alterarea fenotipului epitelial, achiziționarea fenotipului mezenchimal, switch-

ul caderinic, acțiunea factorilor de transcripție (Tabel 6.1):

Tabel 6.1 Anticorpii utilizaţi pentru investigarea tranziției epitelio-mezenchimale

tumorale de la nivelul vezicii urinare

Anticorpul Clona/

Producător

Diluţia Recuperarea

antigenică

Control extern

pozitiv

CK7 OV-TL 12/30

Dako

1:100 EDTA, pH 8 uroteliu

CK20 Ks 20.8/Dako 1:75 EDTA, pH 9 colon

Vimentina SP20

Thermo Scientific

1:150

Citrat, pH 6 Colon

E-caderina NCH 38

Dako

1:100 Citrat, pH 6 glanada mamara

N-caderina 6G11/Dako 1:50

Citrat, pH 6 Amigdala

Twist Twist 1/LSbio 1:1000 Citrat, pH 6 Colon

Snail 1 policlonal

Abcam

1:75 Citrat, pH 6 Placenta

Imunoexpresia citokeratinei 7 a fost identificată în toate cazurile analizate la nivelul

celulelor tumorale. Marcajul a fost variabil ca intensitate și localizat la nivel citoplasmatic (Fig.

6.1). Imunoexpresia citokeratinei 20 a fost identificată la nivelul citoplasmei celulelor tumorale

în 62,9% din cazuri, intensitatea reacției fiind variabilă (Fig. 6.2). Imunoexpresia Vimentinei a

fost identificată la nivelul citoplasmei celulelor tumorale în 12 cazuri și la nivelul elementelor

mezenchimale. Marcajele au fost identificate doar în cazul carcinoamelor de grad înalt, cu

invazie în musculara propria/ întreg peretele sau organe adiacente (pT2-T4) și aflate în stadiile

II-IV (Fig. 6.3, Fig. 6.4). Imunoexpresia E-caderinei a fost observată la nivelul membranei

celulelor tumorale. Intensitatea reacțiilor atât la nivel intratumoral cât și a frontului de invazie a

fost variabilă și au fost observate diferențe ale numărului de celule marcate (Fig. 6.5, Fig. 6.6).

Imunoexpresia a fost prezentă la nivelul membranei și citoplasmei celulelor tumorale, precum și

a unor elemente stromale (Fig. 6.7, Fig. 6.8). Imunoreacția Twist a fost identificată la nivelul

nucleului celulelor tumorale și la nivelul unor elemente stromale precum fibroblaşti, macrofage,

celule endoteliale, limfocite (Fig. 6.9, Fig. 6.10). Imunoreacțiile Snail 1 au fost identificate la

nivelul citoplasmei și nucleului celulelor tumorale. Reacția a fost prezentă și la nivelul

limfocitelor și fibroblaștilor stromali (Fig. 6.11, Fig. 6.12).

9

Fig. 6.1 Carcinom urotelial de grad scăzut, front de

invazie, marcaj CK7, x100 Fig. 6.2 Carcinom urotelial de grad înalt, front de

invazie, marcaj CK20, x100

Fig. 6.3 Carcinom urotelial, front de invazie, marcaj

Vimentina, x200

Fig. 6.4 Carcinom urotelial, front de invazie,

marcaj dublu Vimentina (brun)/ CK7 (roșu), x200

Fig. 6.5 Carcinom urotelial de grad scăzut, front de

invazie, marcaj Ecaderină, x100

Fig. 6.6 Carcinom urotelial de grad înalt, intratumoral,

marcaj E-caderina, x100

10

Fig. 6.7 Carcinom urotelial de grad scăzut, front de

invazie, marcaj N-caderină, x100

Fig. 6.8 Carcinom urotelial de grad înalt, front de invazie,

marcaj N-caderina, x100

Fig. 6.9 Carcinom urotelial de grad scăzut, intratumoral,

marcaj Twist, x100

Fig. 6.10 Carcinom urotelial de grad înalt, intratumoral,

marcaj Twist, x100

Fig. 6.11 Carcinom urotelial de grad scăzut, front de

invazie, marcaj Snail 1, x100

Fig. 6.12Carcinom urotelial de grad înalt, intratumoral,

marcaj Snail 1, x100

11

CONCLUZII GENERALE

Carcinoamele uroteliale vezicale sunt leziuni cu incidență în creștere, profilul pacientului

incluzând vârsta de peste 60 de ani, sexul masculin, fumător, cu hematurie la prezentare.

Hematuria a fost cel mai frecvent simptom la prezentarea pacienților (56,2%), iar

investigațiile imagistice au indicat predominența tumorilor unice (97,7%), cu dimensiuni sub

2cm (87,5%) și localizare la nivelul trigonului și peretelui lateral vezical.

Carcinoamele uroteliale de grad înalt și stadiu avansat prezintă la nivelul frontului de

invazie capacitatea de a achiziționare a unui fenotip mezenchimal, în condițiile conservării unui

fenotip epitelial specific.

Switch-ul caderinic este prezent în TEM urotelială tumorală și oferă informați în raport cu

agresivitatea leziunilor.

Studiul markerilor implicați în TEM urotelială tumorală indică imunofenotipuri specifice

în raport cu parametrii histopatologici de prognostic, aspect care poate sta la baza selectării

acestora ca ținte terapeutice.

Analiza profilului caderinic și a factorilor de transcripție în raport cu parametrii

histopatologici ai carcinoamelor uroteliale vezicale, poate îmbunătăți criteriile de selecție ale

pacienților incluși în viitoare trialuri clinice.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Boring CC, Squires TS, Tong T. Cancer statistics 1995. Cancer J Clin, 1995;45:2.

2. Brennan P, Bogillot O, Cordier S, Greiser E, Schill W, Vineis P, Lopez-Abente G,

Tzonou A, Chang-Claude J, Bolm-Audorff U, Jockel KH, Donato F, Serra C,

Wahrendorf J, Hours M, T'Mannetje A, Kogevinas M, Boffetta P. Cigarette smoking and

bladder cancer in men: a pooled analysis of 11 case-control studies. Int J Cancer 2000,

86(2):289-94.

3. Chaw SY, Majeed AA, Dalley AJ, Chan A, Stein S, Farah CS. Epithelial to mesenchymal

transition (EMT) biomarkers--E-cadherin, beta-catenin, APC and Vimentin--in oral

squamous cell carcinogenesis and transformation. Oral Oncol. 2012;48(10):997-1006.

4. Chen J, Han Q, Pei D. EMT and MET as paradigms for cell fate switching. J Mol Cell

Biol 2012;4:66-9.

5. Cheng G, Xie L. Alcohol intake and risk of renal cell carcinoma: a meta-analysis of

published case-control studies. Arch Med Sci. 2011;7:648–57

6. Chesbrough RM, Burkhard TK, Martinez AJ, Burks DD. Gerota versus Zuckerkandl: The

renal fascia revisited. Radiology 1989;173:845-6).

7. Crăiţoiu Ş. Histologie specială. Ed. Medicală Universitară, Craiova, 2003.

8. Cutler SJ, Young JL Jr. Third National Cancer Survey: Incidence Data. Eds. Nat Cancer

Instit Monogr 1975; 41:20-25.

9. Greenburg G, Hay ED. Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express

characteristics of migrating mesen¬chymal cells. J Cell Biol 1982; 95: 333 339.

10. Joseph JC, Evanguelos X, Luis AK, Malte R, Michael R, Shahrokh FS. Effect of

Smoking on Outcomes of Urothelial Carcinoma: A Systematic Review of the Literature,

EUROPEAN UROLOGY 2014;65:742 – 54

12

11. Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest.

2009;119:1420–8.

12. Kiemeney LA, Schoenberg M, Familial transitional cell carcinoma. J Urol. 1996, 156:

867-872.

13. Liang Cheng, Darrell D. Davison, Julia Adams, Antonio Lopez-Beltran, Lisha Wang,

Rodolfo Montironi, Shaobo Zhang. Biomarkers in bladder cancer: Translational and

clinical implications, Critical Reviews in Oncology/Hematology 2014;89:73–111.

14. Maximilian B, James WFC, Guido D, Barton G, Harry H, Pierre K, Wassim K,

Lambertus AK, Carlo La V, Shahrokh S, Yair L. Epidemiology and Risk Factors of

Urothelial Bladder Cancer. European Urology, 2013; 63: 234 – 241.

15. McCullough DL, Lamma DL, McLaughlin AP3rd, Gittes RF, Familial transitional cell

carcinoma of the bladder. J Urol.1975, 113: 629-635.

16. Peinado H, Olmeda D, Cano A. Snail, Zeb, and bHLH factors in tumor progression: An

alliance against the epithelial phenotype? Nat Rev Cancer 2007;7:415–28.

17. Sadler T.W., Langman’s Medical Embriology, 11th edition, Lippincott, Williams and

Wilkins, Baltimore, 2010.

18. Savagner P, Boyer B, Valles AM, Jouanneau J, Thiery JP. Modulations of the epithelial

phenotype during embryogenesis and cancer progression. Cancer Treat Res 1994;71:229-

49.

19. Shariat SF, Pahlavan S, Baseman AG, Brown RM, Green AE, Wheeler TM, Lerner SP.

E-cadherin expression predicts clinical outcome in carcinoma in situ of the urinary

bladder. Urology 2001;57(1):60–5.

20. Sievert KD, Amend B, Nagele U, Schilling D, Bedke J, Horstmann M, Hennenlotter

J, Kruck S, Stenzl A. Economic aspects of bladder cancer: what are the benefits and

costs? World J Urol 2009;27(3): 295–300.

21. Silverman DT, Levin LI, Hoover RN, Hartge P. Occupational risks of bladder cancer in

the United States: I. White men. J Natl Cancer Inst 1989;81(19):1472–80.

22. Silverman DT, Levin LI, Hoover RN. Occupational risks of bladder cancer in the United

States: II Nonwhite men. J Natl Cancer Inst 1989;81(19):1480–3.

23. Sinescu I, Gluck G. Tratat de Urologie. Editura Medicală, 2008; 3:1947- 2142.

24. Steineck G, Hagman U, Gerhardsson M, Norell SE. Vitamin A supplements, fried foods,

fat and urothelial cancer. A case-referent study in Stockholm in 1985-87. Int J

Cancer. 1990 Jun 15;45(6):1006-11.

25. Thiery JP, Sleeman JP. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal

transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Feb;7(2):131-42.

26. Van der Horst G, Bos L, van der Pluijm G. Epithelial plasticity, cancer stem cells, and the

tumor-supportive stroma in bladder carcinoma. Mol Cancer Res 2012;10:995-1009.

27. Vena JE, Graham S, Freudenheim J, Marshall J, Zielezny M, Swanson M, Sufrin G. Diet

in the epidemiology of bladder cancer in western New York. Nutr

Cancer. 1992;18(3):255-64.

28. Xu C, Zeng XT, Liu TZ, Zhang C, Yang ZH, Li S, Chen XY. Fruits and vegetables

intake and risk of bladder cancer: A PRISMA-compliant systemic review and dose-

response meta-analysis of prospective cohort studies. Med (Baltimore), 2015;

94(17):e759.