Metode indirecte

1. Metoda indirect in doua etape Deoarece metoda directa a avut unele neajunsuri si s-a putut executa numai pe tesuturi nefixate, s-au cautat posibilitati de imbunatatire a metodei. In acest mod s-au dezvoltat metodele in mai multe etape, care intensifica semnalul primit.Se foloseste un set primar specific pentru antigenul urmarit( anticorp nemarcat) si un ser secundar marcat care reactioneaza cu serul primar. Reactia a prezentat un progres in tehnicile imunohistochimice dar nu se mai foloseste in forma sa initiala.

2. Metoda indirecta in trei etapeIn acest caz se adauga un al treilea strat de anticorp marcat cu aceasi enzima. Cel de al treilea anticorp este specific pentru anticorpul secundar. Stratul tertiar serveste pentru amplificarea semnalului prin legarea mai multor antigene tertiare de antigenul secundar, crescand in acest mod cantitatea de enzima si intensificarea reactiei de culoare.

In anii 70 imunohistochimia a luat un nou avant prin introducerea unor noi tehnici ca: Metoda peroxidaza antiperoxidaza Sternberger si colaboratori Folosirea aurului colloidal de Faulk si Taylor Demonstrarea de catre Taylor si Burs a faptului ca se pot detecta antigenele si din piesele fixate in formaldehida si incluse in parafina. Prepararea anticorpilor monoclonali( tehnologia hibridomului) de catre Kohler si Milstein

3. Motoda peroxidaza-antiperoxidaza si metoda fosfataza alcalina antifosfataza alcalina Se mai numeste si metoda anticorpilor nemarcati si foloseste un complex imun solubil de enzima antienzima. Se bazeaza pe metoda indirect dar este completata cu amplificarea semnalului prin reactive enzimatica. Principii de baza Se foloseste anticorpul primar specific nemarcat Se adauga serul secundar care reactioneaza cu serul primar Se adauga serul tertiar- antiperoxidaza obtinuta din acelasi tip de animal ca si serul primar- care se va lega de locusurile libere ale serului secundar Se adauga peroxidaza care va fi legata de antiperoxidaza Se efectueaza o reactie histochimica pentru evidentierea peroxidazei cu apa oxigenata si cromogenPentru fosfataza alcalina principiile de baza sunt identice.

Perozidaza si antiperoxidaza amestecate in proportie optima de 3:2 formeaza urmatorul complex

Fosfataza alcalina si antifosfataza alcalina amestecate in proportie de 2:1 formeaza urmatorul complex

4. Metoda ABC (avidin biotin complex)In zilele noastre metoda cea mai utilizataeste metoda ABC, respective variantele cre deriva din aceasta.Avantaje: Sensibilitate > 10X PAP Reactivii sunt mai rezistenti in timp Posibilitate de efectuare in 6 ore cu streptavidina Se pot utiliza anticorpi secundari polivalentiPrincipia de bazaa. Se aplica serul primar specific: anticorpul primar este pordus in soarece sau iepure impotriva unui antigen umanb. Se adauga serul secundar marcat cu biotina: anticorpul secundar este produs impotriva fragmentului Fc al IgG al animalului in care a fost produs anticorpul primar, totodata este marcat si cu o molecula de biotina.c. Se adauga complexul avidina-biotina marcat cu peroxidaza: in complex se foloseste avidina conjugate cu 3 molecule de biotina care la randul lor sunt marcate cu peroxidaza. Initial s-a folosit o mixture proaspat obtinuta prin amestecarea cu 20-30 de minute inainte de reactive a avidinei cu biotina conjugata cu HRP, in proportie de 1/3 sau cele indicate de firmele producatoare. Mai nou se folosesc complexe gata preparate. In loc de avidina se poate utilize streptavidina, care este izolata din culturile de Streptomyces avidinii. De asemenea formeaza legaturi cu 4 molecule de biotina dar nu are lanturi oligozaharidice auxiliare care pot forma legaturi nespecifice cu lectinele tisulare.d. Evidentierea reactiei cu apa oxigenata si cromogen.

5. Metoda complexului de avidina (streptavidina) biotina marcata ( LSAB)a. Se aplica anticorpul primar specificb. Se adauga serul secundar marcat cu biotinac. Se adauga complexul de avidina (streptavidina) marcata cu peroxidazad. Evidentierea reactiei cu apa oxigenata si cromogen

6. Metoda EPOSAnticorpul primar este cuplat cu o molecula de dextran care tot odata este cuplat cu enzima. Este o metoda rapida, asemanatoare metodei directe, dar intr-o varianta moderna.

7. Metoda dextran ( DAKO en Vision)Este o metoda in doua etape care pare sa prezinte o sensibilitate asemanatoare sau superioara metodei streptavidin-biotina. Metoda se bazeaza pe folosirea unui sistem hidrosolubil marcat cu enzime, si conjugat cu anticorpul secundar. Principiile de baza ale reactieia. Se aplica serul primar specific : anticorpul primar este produs in soarece sau iepure impotriva unui antigen uman.b. Se adauga anticorpul secundar. De o molecula de dextran sunt cuplati un numar mare ( peste 100) de molecule de enzima( HRP sau fosfataza alcalina) si totodata sunt cuplate si molecule de anticorp secundar, care se pot lega de anticorpul specific. Metoda scade timpul de reactie, dar producatorul presupune folosirea unor seruri prediluate. c. Evidentierea reactiei cu apa oxigenata si cromogen.

8. Metoda TSA ( sau CSA) Du PontPrincipii de bazaMetoda este asemanatoare cu cea din metoda ABC , este mai lunga cu doua faze decat metodele S-ABS conventionale dar este mult mai sensibila. A dat reactii positive din sectiuni de parafina si in cazul unor anticorpi care nu au fost active la alte metode. a. Dupa aplicarea complexului streptavidin biotina / HRP se adauga tiramina biotinilata in prezenta perhidrolului( Bobrow si colaboratori). Peroxidaza va oxida tiramina care se va precipita in jurul complexului antigen anticorp, oferint multiple locusuri de amplificare a reactiei.b. Se adauga streptavidina conjugata cu enzima, care se leaga cu tiramina biotinilata. In prezenta perhidrolului si a DAB- ului are loc reactia de culoare. Dezavantajul metodei provine din modul de amplificare a semnalului, adica limitele de reactie nu sunt intotdeauna bine demarcate, ceea ce poate da pozitivitate falsa in cazul unor reactii membranare. Este aplicabila si in metodele imunofluorescente cu streavidina conjugate cu marcajul fluorescent, respective tiramina cuplata cu colorant fluorescent( Speel si colaboratori) respective cu aur coloidal.

Metoda CSA II: CSA II este o varianta noua a metodei originale CSA. Este la fel de senzitiv dar are avantajul ca nu foloseste biotina, dezavantajul este ca a fost conceput pentru anticorpii monoclonali. Metoda foloseste precipitarea tiramidei conjugate cu fluoresceina catalizata de peroxidaza, urmat de o reactive cu antifluoresceina conjugate cu peroxidaza. Rezultatul este o amplificare marcata a semnalului. Se poate folosi si prin procedee manual si prin procedee automatizate. Avantajele metodei constau in faptul ca este exclusa reactia nespecifica rezultata biotinei endogene, conta din mai putine etape, se poat folosi dilutii mai mari.

Metode speciale1. Metoda imunoaur-argint( IGSS)Argintul metalic la microscopie optica apare ca si un precipitat negru, care se poate diferentia bine de culoarea reactiilor obtinute cu alti cromogeni. Este o metoda utila pentru marcajele duble sau multiple. Totodata se poate utiliza si la exprimarile electronooptice, deoarece particulele de argint nu sunt permeabile pentru raza de electroni. Principia de bazaParticulele de aur colloidal legate de antigen prin anticorp ( streptavidina, protein- A) in prezenta substantei reducatoare( hidrochinona) vor cataliza formarea unor depozite de argint dintr-o solutie argentica. Argintul metallic va cataliza reactia in continuare, ceea ce determina aparitia unor depozite de argint proportionale cu timpul de prelevare( Holgate). Sensibilitatea metodei este inver proportional cu marimea particulelor de aur. Reactivii uzuali ce folosesc particule de 1nm, penetreaza tesuturile si se pot folosi si in metoda pre=embedding.2. Microscopia confocalaLaserul de asemenea produce fluorescenta in colorantii specifici. Cu ajutorul luminii punctiforme focalizate sectiunea se poate imparti in multiple planuri optice. Prin suprapunerea planurilor si din sectiuni groase se pot obtine imagini clare, care prin metode digitalizate se pot mari in continuare. Informatia digitala stocata se poate folosi pentru reconstructia tridimensionala a relatiilor structura/reactie. Astfel la limita dintre microscopia optica si electronoptica se poate analiza localizarea unei cantitati mici de antigen, la nivelul unor structuri fine cum ar fi jonctiunile celulare, receptori membranari. 3. Metoda cu reactii multipleDeoarece este laborioasa si necesita diferite tipuri de seruri primare, secundare si diferite marcaje este folosit in primul rand in cercetare. Are ca scop principal :a. Determinarea topografica a relatiilor dintre unele structure tisulare b. Fenotipiarea unor cellulec. Determinarea comportamentului prognostic, fuctional al celulelorSe poate combina si cu metodele de hibridizare in situ. Pentru detectarea paralela a doua antigene se pot utilize doua metode de baza:a. Combina doua metode imunoenzimatice , de exemplu: imuno-fosfataza- alcalina si imunoperoxidazab. Si metoda IGSS.Avantajul este ca produsul reactiilor si structura tisulara sunt bine analizabile, mai ales daca se face si o colaborare pentru nuclei. Este necesar ca antigenele vizate sa fie prezente in cellule diferite, sau in compartimentele diferite ale aceleiasi celule. A doua metoda combina metodele imunofluorescente. Avantajul este ca se poate demonstra si coexpresia unor antigene localizate in compartimente celulare indentice. Dezavantajul consta I faptul ca necesita microscop fluorescent, coloranti speciali si sisteme de filter competente. 4. Metodele combinate cu microscopie electronicaImunohitochimia a fost si este utilizata si in cercetarea fundamentala. Aceasta insa ofera mai multe posibilitati decat munca de rutina din cadrul laboratoarelor de patologie. Au fost elaborate doua metode :a. Cea a reactiilor imunohistochimice dinaintea includerii materialului in rasina sintetica( pre-embedding)b. Cea a reactiilor de dupa includere( Post- embedding).

a. Metoda pre- embedding.Este metoda folosita in special in cercetare. Utilizeaza tesuturi de animale de experienta in special SNC fixat prin perfuzare cu solutie de paraformaldehida/glutaraldehida. Tesutul este sectionat la viratom in sectiuni de 10-30 , dupa care se efectueaza o reactive imuna. Anticorpii sunt conjugate de obicei cu aur si reactia este amplificata cu argint. Sectiunile sunt analizate sub microscop si zonele ce prezinta interes sunt incluse pentru microscopie electronica.

b. Metoda post-embedding Reactii immune din sectiuni fine( 1) din material osmificat se pot utilize in imunohistochimia diagnostic sip e material inclus in araldita sau durcupan, reactia post-embedding. Este mai dificila dar utila in cazul in care nu avem tesut inclus in parafina sau din diferite motive inluderea nu poate fi facuta in parafina. De asemenea poate fi utila in examinarea biosiilor medulare.

Principia de bazaSe efectueaza sectiuni de 2 cu un cutit de sticla. Se monteaza pe lame silanizate. Dupa sectionare araldita este indepartata din piesa prin deplastifiere cu et(-met) oxid de sodium, dupa care se procedeaza identic ca si cu sectiunile din parafina.

5. Metoda de amplificare cu cerc rotativ.Este o metoda relativ noua, deocamdata putin utilizata in imunohistochimie. Ea prezinta cuplarea metodelor imunohistochimice cu cele de biologie molecular.

PrincipiiAntigenul primar este cuplat cu o secventa specifica de primer ADN. La aceasta se adauga prin hibridizare un cerc amplificator care se leaga de primer si il prelungeste in masura dorita. Se adauga decoratori: secventa ADN cuplata cu fluoresceina, biotina sau HRP. Evaluarea rezultatului se face la microscopul de fluorescenta, sau dupa reactia de culoare cu diamino benzidina.