1

MEMBRANE BIOLOGICE Organizarea materiei vii Elementele constitutive ale materiei vii sunt aceleaşi cu cele care alcătuiesc materia nevie. In sistemele materiale, diferitele specii de atomi formează compuşi chimici anorganici sau organici, mai mici sau mai mari, fără a avea însă neapărat proprietăŃi caracteristice viului. Gradul de structurare (ordine) a materiei este caracteristica esenŃială care deosebeşte sistemele materiale vii de cele nevii. Elementele primelor trei perioade din sistemul periodic, cu atomi mici, reprezintă aproximativ 98% din materia vie, dintre care H, C, O, N reprezintă 96%; acestea se clasifică în metale (Ca, K, Na, Mg etc) şi metaloizi (C, Cl, S etc). Unele elemente au rol plastic , intrând în compoziŃia anumitor structuri (H, C, N, O, P, Ca etc). Altele au rol catalitic , dinamic, contribuind la desfăşurarea în bune condiŃii a unor procese: conducerea excitaŃiei neuromusculare, diferite procese enzimatice, procesele de la nivelul membranelor biologice. Dintre acestea fac parte Ca, K, Na, Mg etc. Pe lângă elementele aflate în proporŃie mai mare, în sistemele biologice se găsesc şi elemente aflate în cantităŃi mai mici şi al căror rol nu este pe deplin elucidat: Cu, Cd, Cr, As, Se, Pd, Mo, numite oligoelemente . Biofizica molecular ă are ca obiect de studiu caracterizarea componenŃilor moleculari ai materiei vii, în încercarea de a demonstra rolul biologic sau mecanismul acestora de interacŃiune în cadrul proceselor celulare. Pentru aceasta, este necesară izolarea componenŃilor moleculari şi macromoleculari folosind o serie de tehnici preparative precum ultracentrifugarea, centrifugarea în gradient de concentraŃie, cromatografia sau electroforeza. Prin separare se pot obŃine populatii omogene de celule, organite celulare sau chiar componente macromoleculare distincte, care urmează a fi studiate separat. Prin izolare însă, se pierd aspectele funcŃionale legate de coexistenŃa în mediul biologic, cu toate consecinŃele ce decurg de aici. Astfel, de un deosebit interes în ultimul timp se bucură tehnicile biofizice de studiu in vivo. In legătură cu componenŃii moleculari ai materiei vii, trebuie să remarcăm faptul că există o diversitate foarte mare de biomolecule (se estimează, de exemplu, că sunt 1012 tipuri de molecule proteice şi 1010 tipuri de acizi nucleici) ce rezultă însă din asamblarea unui număr surprinzător de mic de unităŃi monomerice: 20 de aminoacizi (unităŃile monomerice ale proteinelor) şi 8 nucleotide (unităŃile monomerice ale acizilor nucleici). După natura moleculelor din care sunt compuse celulele oricărui organism, se deosebeşte o mare proporŃie de micromolecule anorganice (apă şi ioni anorganici) precum şi componen Ńii organici, specifici materiei vii ce se prezintă preponderent ca molecule uriaşe (macromolecule). Organismul uman cuprinde 70% apă şi 30% componenŃi de altă natură. Apa totală este repartizată într-un sistem compartimental format din:

• 5% în plasmă; • 15% în lichidul interstiŃial sau extracelular; • 5% apă legată (apa constituită din molecule orientate, ataşate

macromoleculelor sau ionilor); • 45% în lichidul intracelular.

Cunoaşterea volumului acestor compartimente şi a compoziŃiei lor este primordială din punct de vedere fiziologic, patologic şi terapeutic.

2

Apa total ă a organismului se reînnoieşte la fiecare 16 zile. Organismul prelucrează zilnic aproximativ 2,5 l de apă. Aportul zilnic de apă are la bază apa ingerată ca atare şi apa preluată prin intermediul alimentelor, iar eliminarea se realizează prin urină, plămâni, piele. Datorită proprietăŃilor sale fizice, discutate anterior, apa joacă un rol biologic important în fenomenele de transport (circulaŃie sanguină, secreŃie glandulară, difuzie, osmoză, filtrare) şi în stabilitatea structurală a membranelor celulare. ForŃe interatomice şi intermoleculare Pentru înŃelegerea formării structurilor biologice din componenŃii lor moleculari sau atomici este necesară cunoaşterea diferitelor tipuri de interacŃiuni elementare ce se manifestă între acestea. Rezultatul acestor interacŃiuni este, fie formarea unor legături chimice , deci a unor noi componenŃi moleculari, fie dispunerea spaŃială a acestora în conformitate cu rezultanta forŃelor intermoleculare care se manifestă între ei. Legăturile ionice sunt legături electrostatice foarte puternice. ForŃa de interacŃie dintre doi ioni având sarcinile electrice q1 şi q2, aflate la distanŃa r într-un mediu cu constantă dielectrică ε, este dată de legea lui Coulomb :

Fq q

r= ⋅ ⋅1

41 2

2πε ForŃele de respingere (dintre sarcinile de acelaşi semn) sunt pozitive, iar cele de atracŃie (dintre sarcinile de semn contrar) sunt negative.

Legătura (interac Ńiunea)

Exemplu Energia interac Ńiunii (kJ/mol)

1. Covalentă legături care determină structura primară, legături bisulfidrice: -S–S-

146 - 680

2. Ionică -COO- -COO- Na+Cl- 40 - 400

3. Ion – dipol Na+(H2O)n 4 - 40 4. Dipol-dipol InteracŃiuni ale dipolilor

permanenŃi sau induşi 4 - 40

5. De hidrogen C=O----H-N- O-H----N O-H----O= N-H----N N-H----O2

8 – 25 25 25 15 10

6. Hidrofobe Formează bistratul lipidic şi grupările nepolare ale proteinelor

4 - 8,5

Moleculele formate din mai mulŃi atomi legaŃi covalent se vor angaja în interacŃii cu moleculele vecine în funcŃie de distribuŃia sarcinilor electrice în cadrul moleculei. DistribuŃia asimetrică a sarcinilor pozitive şi negative generează un dipol electric molecular. Între astfel de molecule cu caracter de dipol se dezvoltă legături de tip Van der Waals , care sunt mai slabe decât legăturile ionice, scăzând mult mai repede cu distanŃa: F ~ 1/r6. Există molecule cu caracter de dipol permanent la care

Ca2+

3

sarcinile pozitive sunt concentrate spaŃial diferit faŃă de cele negative, indiferent de influenŃele exterioare. Unele molecule au caracter neutru dar, în prezenŃa unor molecule polare, acestea îşi redistribuie sarcinile electrice devenind dipoli indu şi, ce pot să se angajeze astfel în interacŃii dipol-dipol. La alte molecule cu caracter neutru, mişcarea electronilor este cauza unei polarizări pe perioade foarte scurte de timp. Aceste molecule cu caracter de dipol instantaneu vor induce şi moleculelor vecine dipoli instantanei cu care vor putea astfel interacŃiona, dipolul indus şi cel inductor comportându-se ca o pereche de oscilatori cuplaŃi. Există două tipuri de legături care au un rol determinant în realizarea structurii spaŃiale a biopolimerilor şi în agregarea supramoleculară, care conduce la formarea organitelor şi a celulelor în general: 1. legătura de Hidrogen: într-o legătură covalentă cu caracter polar pronunŃat, nucleul de hidrogen (protonul) este numai parŃial ecranat de electroni şi prezintă un surplus de sarcină pozitivă, care-l face să interacŃioneze cu o pereche de electroni neparticipanŃi la legătura chimică a unui atom suficient de electronegativ dintr-o altă moleculă. O moleculă se comportă ca donoare de protoni (D-H), iar cealaltă ca donoare de electroni (:A), respectiv ca acceptoare de protoni, între ele stabilindu-se o legătură de hidrogen prin transferul parŃial al protonului: D-H ----- :A. Cei mai frecvenŃi donori de protoni sunt grupările -OH, =NH, ≡NH+, iar acceptori sunt în special atomii de oxigen şi de azot, când au surplus de sarcină negativă (electroni neparticipanŃi). Acest gen de interacŃie electrostatică între molecule este, din punct de vedere energetic, la limita dintre forŃele Van der Waals şi legăturile chimice covalente. Energia degajată la formarea unei legături de hidrogen este de 4 - 7 Kcal/mol, iar prin stabilirea legăturii între gruparea (D-H) şi gruparea (:A) se reduce libertatea de mişcare a moleculelor, sistemul devenind mai structurat. Agregările dintre moleculele de apă, ce îi determină proprietăŃile fizice deosebite, se realizează tot prin legături de H. Aceste legături joacă rolul major în stabilitatea structurii spaŃiale a biopolimerilor (macromoleculelor) şi în realizarea interacŃiunilor specifice între macromolecule sau între o macromoleculă şi un anumit loc reactiv situat pe o macromoleculă. 2. legătura hidrofob ă: dizolvarea în apă a oricărei molecule face ca moleculele de apă aflate în contact cu ea să nu mai poată stabili acelaşi număr de punŃi de H cu alte molecule de apă, dar se pot eventual forma astfel de punŃi între apă şi molecula respectivă. Dacă această moleculă are însă o porŃiune hidrofobă pe care nu se pot stabili legături de H, aşa cum sunt catenele hidrocarbonate din acizii graşi, toate moleculele de apă aflate în contact cu această porŃiune vor avea un număr redus de legături de H, deci, energia potenŃială a sistemului va fi mare. Deoarece orice sistem tinde să atingă starea cu energie potenŃială mai mică, grupările hidrofobe “evită” într-o cât mai mare măsură contactul cu apa, asociindu-se între ele. Această interacŃie este legătura hidrofobă, care face ca moleculele (sau grupările) hidrofobe dizolvate în apă să se alăture între ele numai pe baza respingerii mutuale cu solventul. Efectul hidrofob contribuie şi el la realizarea structurilor spaŃiale ale biopolimerilor, dar rolul său predominant este formarea membranelor biologice ca bistraturi lipidice. Structura membranelor biologice Membranele biologice sunt compuse din proteine, lipide, glucide, ioni, apă, în proporŃii variabile. Nu există date analitice asupra conŃinutului în ioni şi apă.

4

Deoarece resturile glucidice sunt întotdeauna ataşate proteinelor sau lipidelor din membrane, putem considera membranele ca fiind alcătuite din proteine şi lipide. Lipidele Deşi structurile lipidelor din membrane sunt aşa diferite, ele au o proprietate comună: sunt molecule amfifile . Aceasta înseamnă că ele au o parte hidrofil ă şi o parte hidrofob ă. Partea hidrofilă este gruparea polară. Partea hidrofobă constă din lanŃurile de acizi graşi. O conseinŃă a structurii amfifile este aranjamentul fosfolipidelor şi glicolipidelor în mediul apos. Grupările polare au afinitate pentru apă, în timp ce lanŃurile de hidrocarburi caută să nu vină în contact cu apa. Aceasta se poate realiza prin formarea de micele , în care grupările polare sunt la suprafaŃă şi lanŃurile de hidrocarburi spre interior. Un alt aranjament posibil, de fapt cel mai favorizat în mediul apos este dublul strat lipidic (figura). Formarea stratului dublu lipidic este un proces rapid şi spontan în apă, un proces de autoasamblare . ForŃa majoră care determină formarea straturilor duble lipidice o constituie interacŃiunea hidrofobă. AlŃi factori care stabilizează structurile duble lipidice sunt:

• forŃele de atracŃie Van der Waals dintre lanŃurile de acizi graşi şi • interacŃiunile electrostatice şi prin punŃi de H dintre grupările polare ale

fosfolipidelor şi moleculele de apă.

Fosfolipidele prezintă proprietăŃi de mezomorfism , adică la încălzire nu trec direct din starea cristalină în starea lichidă, ci prezintă stări intermediare, numite stări mezomorfe. Aceste stări sau faze prezintă proprietăŃi intermediare între lichide şi solide. SubstanŃele care prezintă un astfel de comportament se numesc cristale lichide . Procesul care are loc este o topire a lanŃurilor de acizi graşi din molecula fosfolipidelor, care capătă conformaŃii şi mobilităŃi similare cu cele din hidrocarburile lichide. In acelaşi timp, grupele polare ale moleculei menŃin grupate moleculele fosfolipidelor într-o singură structură. Lipidele suferă o tranziŃie endotermă de la starea de cristal la cea de cristal lichid, iar temperatura la care se produce tranziŃia se numeşte temperatur ă de tranzi Ńie. Lipidele au constituit multă vreme principala componentă a membranelor analizate biochimic, deoarece tehnicile lor de analiză erau bine stabilite. Pe 1 µm2 există 5·106 molecule lipidice, ceea ce înseamnă pentru întreaga membrană a unei celule animale aproximativ 109 molecule lipidice. Proteinele Studiul proteinelor din membrană implică:

- obŃinerea proteinelor prin “solubilizarea” (dezagregarea) membranei; - izolarea proteinelor purificate; - caracterizarea structurii acestor proteine.

5

Proteinele sunt mult mai puŃin cunoscute decât lipidele membranare, aceasta atât din cauza unor obstacole metodologice, cât şi datorită complexităŃii structurale şi funcŃionale a fiecărei proteine. Proteinele membranare au un rol func Ńional preponderent şi, într-o mai mică măsură, un rol structural pur. Se deosebesc două clase de proteine membranare:

• Proteine extrinseci , proteine care pot fi deplasate din membrane prin metode “blânde” cu solvenŃi hipotoni, soluŃii saline concentrate sau cationi bivalenŃi. Există două tipuri de proteine extrinseci: • unele sunt prezente la nivelul suprafeŃei externe a membranei (receptorii

de la nivelul plasmalemei şi hormonii), • altele localizate la nivelul feŃei citoplasmatice (la nivelul membranei

eritrocitare). In cazul acestor proteine se întâlnesc interacŃiuni lipide-proteine de tipul legăturilor Van der Waals şi punŃi de H.

• Proteine intrinseci , proteine care nu pot fi extrase din membrană decât cu ajutorul detergenŃilor, care dezasamblează complet membrana celulară. Cea mai productivă tehnică este electroforeza în gel de poliacrilamidă, în prezenŃa detergentului dodecilsulfat de sodiu (SDS). Detergentul fiind puternic rupe toate interacŃiunile noncovalente dintre proteine sau dintre proteine şi lipide. Rolul SDS anionic constă în neutralizarea sarcinilor negative ale proteinelor. Ca urmare, proteinele vor migra în câmp electric exclusiv funcŃie de masa lor proprie. Proteine pot interacŃiona cu fosfolipidele membranare prin legături hidrofobe sau tip dipol-dipol. Majoritatea proteinelor care traversează membrana prezintă gruparea NH2 terminală la exterior, iar COOH terminal este situat în citoplasmă.

Proteinele sunt componentele active ale membranei, având rol de receptori, transportori, canale sau enzime. Ele asigură funcŃia de mediator al schimburilor de substanŃă, energie şi informaŃie dintre exterior şi mediul intracelular.

Organizarea membranelor biologice O serie de modelele teoretice s-au elaborat pentru definirea structurii membranelor, pe baza datelor furnizate de diferitele tehnici fizico-chimice precum microscopia electronică, difracŃia cu raze X, RES, RMN etc. Modelul mozaicului lipoproteic a fost elaborat începând din 1966, iar cea mai cunoscută şi acceptată variantă este cea dată de Singer şi Nicolson (1972). După aceştia, proteinele membranei ar fi implantate într-un strat dublu fosfolipidic la fel ca nişte iceberguri ce plutesc pe mare. Această “mare” lipidică este fluidă, deci cu lipidele în stare de cristal lichid, în care se pot mişca în voie proteinele. Astfel, în stratul dublu lipidic proteinele se pot deplasa fie lateral (difuziune laterală) fie se pot roti în jurul unei axe perpendiculare pe planul membranei (difuzie rotaŃională). Singer (1971) împarte proteinele membranei în integrale (proteine de membrană propriu-zise) şi periferice (proteine ataşate membranei). El consideră că proteinele integrale sunt cele care pătrund adânc în stratul dublu lipidic, putând chiar să străbată membrana dintr-o parte în alta. Pentru a fi posibilă această penetrare a proteinelor integrale în lipide, se sugerează că şi proteinele membranei sunt amfipatice (ca şi fosfolipidele), adică au o porŃiune hidrofilă şi o porŃiune hidrofobă în moleculă. Partea hidrofilă ar proemina în afara membranei, fiind în contact cu mediul apos şi cu grupările polare ale fosfolipidelor. Partea hidrofobă ar fi în interiorul membranei şi ar interacŃiona cu lanŃurile de acizi graşi din molecula fosfolipidelor (figura).

6

Modelul mozaicului lipoproteic îndeplineşte condiŃiile de stabilitate a structurii din punct de vedere termodinamic. Modelul este susŃinut de numeroase date experimentale ce confirmă structura globulară a proteinelor membranare (dicroism circular) precum şi plasamentul transmembranar al proteinelor (criofracturare). Există, de asemenea, dovezi experimentale în sprijinul mobilităŃii proteinelor şi a fluidităŃii lipidelor în membrană.

Dinamica componentelor membranelor biologice Baza fluidităŃii stratului dublu lipidic o constituie mobilitatea lipidelor. Se pot distinge mai multe categorii de mişcări: - mişcări de flexie ale moleculelor fosfolipidice ; stratul dublu lipidic este

caracterizat printr-un interior fluid şi o creştere progresivă a rigidităŃii pe măsură ce ne deplasăm de la centru membranei spre periferie. Această creştere progresivă a fluidităŃii spre interiorul membranei a fost evidenŃiată prin măsurători de RES şi RMN. Deci, grupările metilenice (-CH2-) din lanŃurile acizilor graşi sunt din ce în ce mai mobile spre interiorul membranei. O altă categorie de mişcări în molecula fosfolipidelor este mişcarea grupelor polare ale fosfolipidelor. Această mişcare este din ce în ce mai accentuată pe măsură ce ne îndepărtăm de periferie. Deci, în stratul dublu lipidic avem doi gradienŃi diferiŃi de flexibilitate, unul spre interiorul membranei şi celălalt spre exterior.

- mişcarea de transla Ńie a moleculelor de fosfolipide ; reprezintă mişcarea întregii molecule de fosfolipid în stratul dublu lipidic. Se pot distinge două categorii de astfel de mişcări:

• difuzia lateral ă a moleculei în planul membranei, care se face în aşa fel încât molecula rămâne în acelaşi monostrat lipidic, deci, în aceeaşi jumătate a membranei. Această mişcare este foarte rapidă. S-a calculat prin RES că o moleculă de fosfolipid difuzează într-o secundă pe o distanŃă medie de 2 µm. Aceasta este o mobilitate foarte mare, dat fiind dimensiunea obişnuită a unei molecule fosfolipidice (de ordinul nanometrilor). Valoarea coeficientului de difuziune laterală corespunde unei vâscozităŃi de circa 100 ori mai mare ca a apei (1·10-3 N.s/m2, la 6°C) comparabil ă cu a uleiului de măsline.

7

• difuziunea transversal ă sau mişcarea de “flip-flop”, adică trecerea

moleculei dintr-un monostrat lipidic în celălalt (sau din jumătatea internă în cea externă a membranei). Asemenea mişcări sunt mult mai puŃin probabile decât difuziunea laterală. Timpul în care se petrece acest proces este mult mai lung decât cel în care se produce difuziunea laterală a fosfolipidelor în membrană.

• transla Ńia şi rota Ńia proteinelor în membrane ; miscările translaŃie şi rotaŃie sunt mai reduse ca intensitate comparativ cu fosfolipidele. Aceaste mişcări s-au putut evidenŃia prin măsurători de fluorescenŃă.

FuncŃiile membranelor biologice Principalele funcŃii ale membranelor biologice sunt următoarele:

• compartimentează materia vie (bariere selective); • intervin în desfăşurarea proceselor metabolice (interacŃiunile lipoproteice sunt

esenŃiale pentru funcŃia enzimelor din membrană), două din procesele majore de conversie a energiei în natură se petrec în membrană: fotosinteza şi fosforilarea oxidativă;

• controlează fluxul de informaŃie dintre celule şi mediul înconjurător, conŃin receptori specifici pentru stimuli exteriori şi legarea hormonilor de membrană. Generează semnale chimice şi electrice;

• suferă modificări funcŃionale adaptative (inducŃia enzimelor din reticulul endoplasmic sub acŃiunea medicamentelor);

• au rol în procesele imunitare, în reacŃiile de apărare ale celulelor şi organismului.

Fenomene de transport membranar Prezentarea globală a proceselor de transport se poate face urmărind trei criterii principale:

• mecanismele biofizice generale ale diferitelor tipuri de transport • categoriile de substanŃe (molecule, ioni) transportate • limitarea analizei transportului la nivelul membranei plasmatice a unor tipuri de

celule, Ńesuturi sau bariere fiziologice (cazuri particulare). Corespunzător cerinŃelor de a delimita structurile vii cu grad mare de ordine, de mediu exterior (grad de ordine minim), sistemele biologice superioare (organismele pluricelulare) au dezvoltat mai multe nivele de separare existând trei clase mari de membrane biologice:

• membrane bazale epiteliale – asigură prima bariera dintre mediul extern şi mediul intern (interstiŃial) al organismului,

flip-flop (rar)

difuzie laterală (frecvent)

flexie

rotaŃie

8

• membrane plasmatice – bariera de ordin II, separă spaŃiul interstiŃial de cel intracelular,

• membrane intracitoplasmatice (endomembranele) şi ale organitelor celulare – bariera de ordinul III, asigură segregarea funcŃională metabolică în cadrul celulei. Membrana nucleară este ultima barieră care izolează materialul genetic (cel mai înalt grad de structurare) de mediul extern.

MenŃinerea gradienŃilor termodinamici între diferitele compartimente, de-o parte şi de alta a barierelor membranare se face cu consum energetic din partea sistemului biologic. Consumul de energie se face atât direct, la nivelul barierei pentru a menŃine gradientele, cât şi indirect prin procesele de sinteză/reînoire a componentelor care alcătuiesc barierele. Fluxuri pasive şi active prin biomembrane În procesele izoterm-izobare din sistemele biologice izolate membranar, existenŃa unui gradient de potenŃial electrochimic al unei anumite substanŃe, generează un flux de substanŃă sau un transport după o anumită direcŃie (influx sau eflux). Fluxul moleculelor încărcate electric este determinat atât de gradientul de concentraŃie cât şi de câmpul electric (gradientul de potenŃial electric). In cazul unei difuzii pure, fără influenŃa câmpului electric, difuzia se face conform cu legea lui Fick, definită anterior. Fluxurile pasive se deosebesc de cele active prin mecanismul biofizic de funcŃionare al structurilor membranare ce intermediază transportul. Astfel putem diferenŃia: 1. disipatorii de energie liberă electrochimică, reprezentaŃi de canalele ionice şi

transportori. Aceştia utilizează secundar energie, aceasta fiind înmagazinată în gradienŃii electrochimici transmembranari, şi

2. generatori de gradient electrochimic, reprezentaŃi de pompele ionice, ce utilizează direct energia obŃinută prin hidroliza legăturilor macroergice din ATP.

DistincŃia dintre cele două modalităŃi de transport este numai în funcŃie de modul în care se face cuplajul cu reacŃiile chimice generatoare de energie: cuplaj direct în cazul transportului activ şi cuplaj indirect, prin intermediul gradienŃilor electrochimici în cazul transportul pasiv .

Fenomenologic, transportul micromoleculelor poate fi de tip uniport , atunci când are loc trecerea prin membrană a unei singure specii moleculare şi multiport , atunci când două sau mai multe fluxuri diferite sunt cuplate, având loc prin aceaşi structură specializată a membranei. Dacă cuplajul se face în acelaşi sens se numeşte simport (cotransport) , iar dacă se face în sensuri opuse se numeşte antiport (contratransport).

9

CLASIFICARE Fenomene de microtransfer (moleculă cu moleculă):

I. Transport pasiv – conform gradientului de concentraŃie � Difuziune simplă � Difuziune facilitată

- prin transportori - prin proteine-canal

II. Transport activ cu consum energetic � Transport activ primar – prin pompe ionice � Transport activ secundar:

- cotransport (simport) - contratransport (antiport)

Fenomene de macrotransfer (număr mare de molecule simultan):

I. Fagocitoz ă – transport de material solid II. Pinocitoz ă – transport de material lichid

� Endocitoză � Exocitoză � Transcitoza

Transportul pasiv Transportul pasiv micromoleculelor prin membrane se face în sensul gradientului de concentraŃie sau de potenŃial electrochimic. Pentru unele substanŃe fluxul creşte aproximativ proporŃional cu gradientul, conform legii lui Fick, saturaŃia căii de transport făcându-se numai la valori foarte mari ale acestuia (difuzie simplă), în timp ce pentru altele, fluxul ajunge mult mai repede la o valoare maximă, ce nu poate fi depăşită oricât ar creşte gradientul (difuzia mediată). Difuzia simpl ă În acest caz, difuzia se face direct, în sensul gradientului electrochimic dintre compartimentele separate de membrană, conform legii lui Fick. Transportul are loc prin dizolvarea în stratul lipidic funcŃie de coeficientul de permeabilitate (sau coeficientul de partiŃie), astfel trecând moleculele hidrofobe şi cele amfifile (hormonii steroizi, alcoolii şi acizii graşi). La trecerea micromoleculelor polare sau ioni anorganici, bistratul lipidic reprezintă o barieră energetică considerabilă, difuzia simplă a acestora fiind limitată. Difuzia prin canale Canalele ionice sunt proteine integrale care traversează bistratul lipidic şi au în centrul lor un canal trecere de diametru de ordinul angstromilor. Din punct de vedere termodinamic, canalele ionice sunt disipatori de energie liberă, pe care metabolismul celular o stochează sub formă de gradient de concentraŃie şi de potenŃial electric. Canalele ionice sunt de obicei bidirecŃionale şi se caracerizează prin conductan Ńa ionic ă şi permeabilitatea specific ă pentru fiecare tip de ioni (ele se găsesc în membranele majorităŃii celulelor, contribuind la apariŃia potenŃialului de repaus celular). FuncŃie de aceste caracteristici canalele ionice pot fi:

1. neselective cu conductanŃă fixă – au permeabilitate diferită funcŃie de diametrul particulei

10

2. selective cu conductanŃă variabilă – aceste canale prezintă două conformaŃii posibile caracterizate prin două stări diferite de conductanŃă: conformaŃia de “repaus” (închisă), sau într-o conformaŃie de “activitate” (deschisă).

Ele sunt prezente mai ales în celulele excitabile, deschiderea lor fiind comandată de variaŃii ale potenŃialului electric transmembranar sau de legarea unor molecule cu rol de mesageri chimici. Canalele ionice comandate electric sunt implicate în propagarea potenŃialului de acŃiune în celulele excitabile (axoni, fibre musculare), iar canalele comandate chimic sunt implicate în transmiterea intercelulară a excitaŃiei precum şi în funcŃionarea unor celule receptoare specializate. Eficacitatea transportului prin canale ionice este foarte mare, printr-un singur canal putând trece 106-108 ioni pe secundă. Difuzia mediat ă (facilitat ă) Acest tip de difuzie se realizează prin legarea reversibilă de un component al membranei (transportor) care, prin modificare de conformaŃie tip “flip-flop” permite trecerea particulei prin stratul hidrofob. Si în acest caz, forŃa care determină transportul este tot gradientul de concentraŃie, fără să fie necesar un aport direct de energie metabolică dar, saturarea mai rapidă a transportorilor faŃă de aceea a canalelor, face ca cinetica transportului mediat să difere de aceea a difuziei simple sau prin canale. Difuzia facilitată se desfăşoară cu viteze mult mai mici comparativ cu difuzia prin canale ionice, de ex. transportorul de glucoză din membrana eritrocitară permite trecerea a circa 300 molecule pe secundă. EsenŃial în funcŃionarea transportorilor este însă specificitatea lor foarte mare, asigurată de structura site-ului de legare a substratului transportat la nivelul feŃei membranare a transportorului. Specificitatea este atât de mare încât se pot deosebi izomerii dextrogiri de cei levogiri. Unele substanŃe chimice se pot incorpora în structura membranei permiŃând astfel trecerea ionilor prin membrană. Aceste substanŃe sunt numite ionofori. De exemplu, valincomicina permite un transport uniport electrogenetic de K+, nigericina un transport antiport electroneutru (transportul în sensuri contrare al K+ şi H+) în timp ce gramicidina A poate forma canale prin care pot trece într-o anumită ordine de selectivitate diferiŃi ioni (H+, Na+, K+). Transportul activ Fluxurile de ioni în sens contrar gradienŃilor de concentraŃie sunt foarte evidente mai ales la celulele acelor organe implicate în secreŃia de fluide cu compoziŃie ionică (osmolaritate) diferită de cea a plasmei sanguine (rinichii, celulele producătoare de acid clorhidric din mucoasa gastrică, din epiteliul urechii interne care secretă endolimfa etc). Transportul activ de ioni este prezent însă în membranele oricărei celule vii, exemplul cel mai general fiind scoaterea Na+ şi reintroducerea K+ în citoplasmă de către “pompa” membranară de sodiu şi potasiu, mecanism care asigură menŃinerea gradientului electrochimic dintre exterior şi interior, generator de potenŃial membranar de repaus, necesar pentru derularea celorlaltor procese de schimb. Acesta reprezintă un mecanism de transport activ primar, deoarece, producerea de energie necesară transportului împotriva gradientului se face chiar la locul transportului, pompa ionică fiind o enzimă ATP-azică. Se admite că pe faŃa externă a membranei, un compus X se transformă în alt compus Y pierzând cu această ocazie afinitatea faŃă de Na+, dar căpătând afinitate

11

pentru K+. Dar, compusul Y nu există în acest moment pe faŃa internă a membranei, astfel încât apare un gradient de concentraŃie al compusului Y de-a lungul grosimii membranei, ceea ce face ca Y împreună cu eventualii ioni de K+ preluaŃi din mediul extracelular să se dplaseze către faŃa internă a membranei. Aici însă, are loc o reacŃie inversă de transformare a compusului Y în X. Se pierde astfel afinitatea pentru K+ şi acesta este eliberat în interiorul celulei. Produsul său de transformare, X, îşi va relua drumul către exterior transportând Na+. Transformarea Y în X se face ca o reacŃie endergonică, prin alimentarea cu energie metabolică stocată în compuşi macroergici de tipul ATP-ului. Stoechiometria pompei de sodiu-potasiu poate fi exprimată prin relaŃia:

iii PADPATP +++→++ + +ie

+e

+i K2Na3K23Na

La nivelul molecular, pompa de sodiu-potasiu este un ansamblu de macromolecule proteice capabil să hidrolizeze ATP-ul şi să utilizeze energia eliberată pentru transportul antientropic al ionilor, este o ATP-ază de transport, (Na-K)-ATP-aza. Activitatea acestei enzime este blocată de ouabain ă şi digital ă (ele interferează în legarea K+ la exterior).

Prin extracŃie şi purificare s-a putut descrie structura (Na-K)-ATP-azei: ansamblu tetrameric constând din câte două subunităŃi mai mari, tip α (cu masa moleculară de 112.000 D) şi două subunităŃi mai mici, tip β (cu masa moleculară de 35.000 D), care sunt glicoproteine. Pe una din subunităŃile α se găseşte locul catalitic pentru hidroliza ATP-ului, iar între cele două subunităŃi mari este zona hidrofilă prin care sunt transportaŃi ionii. Rolul deosebit al pompei de sodiu şi potasiu din membrana plasmatică a tuturor celulelor constă şi în faptul că peste o treime din toată cantitatea de ATP sintetizat într-un organism animal în repaus este hidrolizată de (Na+,K+)-ATP-ază. Aceasta înseamnă că peste o treime din intensitatea metabolismului bazal serveşte nemijlocit la asigurarea gradientului electrochimic dintre spaŃiul intra şi extra celular. In afara transportului activ primar (prin pompe) se cunoaşte şi un mecanism de transport activ secundar (cuplat). Astfel, transportul aminoacizilor în celule este cuplat cu efluxul activ de Na+ (Na+ este transportat activ în timp ce pătrunderea aminoacizilor în celulă este un proces de difuzie facilitată). Analog, se produce transportul glucozei la nivelul celulelor intestinale. Un alt exemplu este transportul cuplat al apei cu Na+ în Ńesuturile epiteliale (i.e. nefron, vezica biliară, intestin), Transportul Na+ în exterior este activ, iar apa intră in celulă cuplat cu Na+ care difuzează pasiv spre interior. Acest mecanism are rolul de a menŃine izotonia mediului. Un exemplu de transport activ secundar este antiportul de Ca2+ la nivelul sarcolemei fibrei musculare. Ca2+ este scos din celulă prin cuplaj cu intrarea pasivă a Na+ prin transportori specifici.

EX

12

Fenomene de macrotransport Mecanismele care permit celulelor să absoarbă sau să elimine macromolecule sau particule de dimensiuni mari la nivelul membranei plasmatice sunt complet diferite de cele ale transportului ionilor sau moleculelor mici. Transportul prin vezicule se face prin:

• endocitoz ă, când transportul are loc spre interiorul celulei, • exocitoz ă, din citoplasmă spre exterior, • transcitoz ă, atunci când veziculele străbat integral celula dintr-o parte în

cealaltă. Endocitoza se împarte în două tipuri, funcŃie de natura substanŃelor ca pătrund în celulă: pinocitoza şi fagocitoza . • Pinocitoza poate fi independentă de receptori sau mediată de receptori.

Pinocitoza independentă de receptori este numită şi endocitoză în fază lichidă sau constitutivă.

• Pinocitoza dependentă de receptori, denumită şi clatrinic ă, se produce prin intermediul receptorilor de la nivelul membranei plasmatice, care recunosc macromoleculele din lichidul extracelular. Exemple de pinocitoză clatrinică sunt transportul insulinei şi colesterolului în celule.

Fagocitoza joacă la om şi mamifere un rol important în procesele de apărare antimicrobiană a organismului. Celula specializată, macrofagul, emite prelungiri citoplasmatice numite pseudopode care înconjoară particulele de substanŃă solidă. Prelungirile fuzionează iar materialul inglobat este transformat în veziculă de digestie, lizozom, unde, sub influenŃa enzimelor hidrolitice materialul fagocitat este distrus. Exocitoza reprezintă un proces prezent la toate celulele eucariote. In afara transferului la exterior a produşilor secretaŃi de celulă, fenomene de exocitoză se produc şi la nivelul sinapselor neuronale. Veziculele intracitoplasmatice fuzionează cu membrana plasmatică şi, sub influenŃa forŃelor de tensiune superficială, membrana veziculei confluează cu cea plasmatică, iar conŃinutul este eliberat în afara celulei. Transcitoza este o formă particulară a transportului prin vezicule ce realizează transportul macromoleculelor prin celulele endoteliului capilar, ce facilitează transportul proteinelor plasmatice către spaŃiul interstiŃial. Transportul prin transcitoză se poate produce în două moduri:

• prin vezicule independente ce se deplasează dinspre faŃa luminală a celulei endoteliale, prin citoplasma acesteia, spre faŃa antiluminală sau interstiŃială;

• veziculele pot forma un canal membranar transcitoplasmatic între polul luminal şi cel bazal. In acest mod viteza transportului creşte considerabil.