LP VI Bacteriologie Determinarea sensibilitatii bacteriilor fa de antibiotice II 1.Metoda diluiilor 2.Testarea sensibilitatii la antibiotice cu Etest. 1. Metoda dilutiilor se realizeaza preparand in prealabil solutii stoc de antibiotice (cu 1000 mcg/ml) din substantele ce se gasesc sub forma de pulberi. care vor fi dizolvate in diversi solventi (solutii tampon, apa) si vor fi conservate la 20 C pana la 6 luni. In practica veterinara, metoda dilutiilor se realizeaza pe mediul Mueller-Hinton sau BHI (bulion cord-creier) Tehnica de lucru : Se fac dilutii seriate din solutia stoc de antibiotic incepand cu al doilea tub si exceptnd ultimul tub care ramne ca martor. In fiecare tub se repartizeaz cte 0.1 ml din cultura de 20 ore (0.5 Mc Farland) Sensibilitatea bacteriei fa de antibioticul testat se exprima prin CMI (concentartie minima inhibitorie), adica prin concentartia minima de antibiotic in micrograme care inhiba dezvoltarea bacteriei, ceea ce corespunde cu ultimul tub in care bacteria nu s-a dezvoltat (mediul ramane limpede). 2.Etest este o metoda relativ noua pentru testarea in vitro a sensibilitaii, se aseamana metodei dilutiei combinand principiile metodei difuzimetrice cu cele ale dilutiei. Principiu : Asemanator procedeului difuzimetric, Etest necesita un inocul bacterian ajustat ca turbiditate, ce urmeaza a fi depus pe suprafata unei placi cu agar. Benzile de Etest contin un gradient de agent antimicrobian ce se aplica pe placa. Dupa incubare se formeaza o zona eliptica de inhibitie, iar valoarea CMI se citeste acolo unde cresterea bacteriana intersecteaza banda Etest.1

Materiale necesare : Placi Petri ;Bulion Mueller-Hinton ;Agar M-H ;Benzi Etest. Etape : Se realizeaza inocul alegand 3-4 colonii cu morfologie asemanatoare si suspendarea lor in solutie salina sau bulion (0.5 Mc Farland) Se utilizaeaza tampoane sterile ce vor fi introduse in tubul cu inocul, eliminandu-se excesul de lichid prin presarea tamponului pe peretii interiori ai tubului. Se depune inoculul la suprafata placii de agar, acoperind toata suprafata ; se lasa sa se usuce 10 min. Se aplica benzile Etest.(cu pensa sterila sau cu aplicatorul adeziv )- banda se aplica pe suprafata agarului cu capatul ce contine concentratia cea mai mare aproape de marginea placii.. Marginea capatului benzii notate cu E trebuie sa atinga marginea plcii. Citirea placilor : Valoarea CMI se citeste in punctul in care cresterea bacteriana intersecteaza banda Etest. *Daca nu apare nici o zona de inhibitie valoarea CMI se raporteza ca mai mare decat cea mai mare concentratie a agentului microbian al benzii Etest. *Daca zona de inhibitie nu intersecteaza banda (zona de inhibitie se afla sub banda Etest) valoarea CMI se raporteza ca mai mica decat concentartia cea mai scazuta ca a agentului antimicrobian al benzii Etest. *Pentru valoarea CMI ce se afla intre doua marcaje ale gradientului benzii, rezultatul se citeste ca valoarea cea mai mare. Aceste valori sunt specifice categorizarii unei tulpini bacteriene ca fiind rezistenta, sensibila sau intermediara. Exp La E.coli : Ampicilina (CMI g/ml) =32 tulpina este R

2