7/31/2019 Lp Imuno 4

1/4

1

Lp Imuno 4

Reactii Ag-Ac cu molecule marcate (continuare)

4. IMUNOFLUORESCENTAPermite vizualizarea reactiei Ag-Ac folosind ca molecula marcata un Ac conjugat cu o substanta fluorescenta = are proprietatea

ca atunci cand e excitata cu o radiatie luminoasa cu o anumita lungime de unda sa emita o radiatie luminoase cu alta lungime de

unda.

Fluoresceina absoarbe lumina albastra emite lumina galben-verde

Rhodamina absoarbe lumina galben verde emite lumina rosie

Auramina absoarbe variate lungimi emite lumina galben dg microscopic al mycobacteriilor se leaga de

acidul micolic din peretele bacterian

a. IMUNOFLUORESCENTA DIRECTA - pentru determinarea Ag (evaluare calitativa/cantitativa - fluorometru)Se marcheaza cu un fluorocrom specific pentru de determinat. Complexele imune formate se detecteaz prin aplicarea

radiatiei luminoase excitante potrivite si citirea emisiei.

Ag determinate pot fi:

solubile - detectabile in ser/LCR/alte lichide biologice/extracte tisulare; corpusculate ( Ag celulare constitutive) de suprafata sau intracelulare (celule normale/patologice - maligne/bacterii)

vizualizate direct pe sectiuni tisulare prin microscopie cu fluorescenta;

b. IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA -pentru determinarea Ag sau Ac (calitativ, semicantitativ, cantitativ)Se marcheaza cu un fluorocrom secundar anti specific .

Putem determina fie (cand cunoastem ) evaluare calitativa /semicantitativa (titruri de Ac)/cantitativa

(cand cunoastem ) evaluare calitativa /cantitativ)

Avantaje: sensibilitate mai mare decat imunofluorescenta directa; se consuma mai putini specifici (in cursul procesului de

marcare o parte din Ac se distrug), foloseste doar un singur tip de Ac marcati (Ac anti Ig umana - IgG)

Aplicatii practice: determinarea Ac anti HIV (test de confirmare),

determinarea autoAc asociati cu BAI:ANA, Ac anti ADNdc, Sm, Ro, La, SCL70, centromer, U1 RNP, CCP.

5. FLOW-CITOMETRIA (CITOMETRIA DE FLUX)Flow-citometru = un instrument care ilumineaza celulele care curg (trec) individual prin fata sursei de lumina, si care apoi

detecteaza si coreleaza semnalele emise de celulele care au fost iluminate.

Pentru a putea fi masurate de flow-citometru celule trebuie sa fie intr-o suspensie (ideale sunt celulele sangvine dar exista

protocoale si pentru celule din culturi, bacterii) cu o concentratie de 10 10 celule/ml si cu diametrul intre 1 si 30m.

Citometrele pot masura si alte particule decat celulele: virusuri, nuclee, cromozomi, fragmente ADN s.a.

Avantaje: poate scana rapid un numar mare de celule (500-5000/s) si poate identifica diverse tipuri de celule - imunofenotipare

Lumina emisa de celule:

lumina imprastiata (forward scatter - celule mari, side scatter - celule complexe) fluorescenta - dupa prepararea cu fluorocromi folosind:

- fie marcati cu fluorocromi specifici unor celulare (membranare/intracitoplasmatice/nucleare)- fie marcarea directa a unor componente celulare cu o substanta fluorescenta - exista fluorocromi care se leaga

specific de ADN : se pot diferentia celule normale de celule maligne aflate intr-o mixtura; sau se pot evalua

proportiile de celule aflate in diverse stagii ale ciclului celular etc

- Iluminarea celulelor se face cu diverse tipuri de laser, adaptate tipului de fluorocromi folositi.Celulele sunt evaluate in functie de intensitatea luminii imprastiate (forward si scatter) si de culoarea emisa de fluorocromi.

Celulele pot fi numerate, caracterizate (diametru/volum), dar si sortate, in functie de cerinte.

Aplicatii: imunofenotiparea limfocitelor (nr.absolut si procentul relativ al populatiilor limfocitare -T, Th,Tc,B, NK), HLAB27

7/31/2019 Lp Imuno 4

2/4

2

Investigarea Complementului

Componenetele sistemului complementului sunt in mare parte sintetizate hepatic; exista si surse extrahepatice: celule

endoteliale, monocite/macrofage, astrocite, epiteliale(renale, intestinale) etc.

Productia de complement este crescuta in reactia de faza acuta; principalul inductor al transcriptiei genelor componentelor

complementului este IFN ; alti inductori: IL-1, IL-6;

A. Screening initial pentru evaluarea complementului: CH 50 si AH 50Exista mai multe tipuri de protocoale pentru CH 50, AH 50; se pot efectua in tuburi/(micro)placi.

Ca2+ e esential pentru interactiunea subcomponentelor C1, C9

Mg2+ e necesar pentru legarea C4b la C2b si interactiunea C3b cu factorul B

Se foloseste ser/plasma proaspata (in produsele invechite componentele pot fi inactivate/proteolizate sau activate/consumate).

Pastrarea pe termen scurt se poate face la 4C iar pe temen lung se face la -70C si cu adaos de inhibitori de proteaze.Manipularea produselor de sange in vederea purificarii, izolarii componentelor complementului se face la 4C.

1. CH 50 = testul hemolitic pentru complement calea clasica se folosesc hematii de oaie sensibilizate cu Ac de iepure anti-hematie de oaie = hematii de oaie opsonizate cu Ac de iepure.

Principiul metodei

Se prepara eritrocitele-tinta = eritrocite de oaie sensibilizate .

Se prepara dilutii seriate din serul pacientului peste care se adauga eritrocite de oaie sensibilizate si se incubeaza la 37C

Se foloseste o eprubeta de control cu hematii sensibilizate si fara ser de la pacient (pentru a evalua eventuala liza spontana).

Se recolteaza supernatantul din eprubete si se evalueaza spectrophotometric (ex. la 540nm).

In functie de absorbtia luminii se calculeaza gradul de hemoliza din fiecare eprubeta si ulterior CH50 al serului pacientului

CH 50 se exprima ca valoarea inversa a diluiei serului care produce hemoliza a 50% din hematiile test ;

Cresteri CH 50: tranzitor in majoritatea inflamatiilor.

Scaderi CH 50: Deficite congenitale: heterozigote CH 50 scade moderat; homozigote CH 50 scade sever (spre zero)

Deficite dobandite (consum) ale componentelor cailor clasice si comune ale complementului: LES, vasculite,

GNA poststreptococica, septicemii cu gram negativi

2. AH 50 = testul hemolitic pentru complement calea alterna se folosesc hematii de iepure, fara anticorpi (sunt un activator puternic al caii alterne a complementului; activarea caii clasice e blocata prin adaugare de chelator de Ca2+ (EDTA)

AH 50 se exprima ca valoarea inversa a diluiei serului care produce hemoliza a 50% din hematiile test;

Cresteri AH 50: tranzitor in majoritatea inflamatiilor.

Scaderi AH 50: in deficite congenitale sau dobandite ale componentelor caii alterne si comune ale complementului.

CH 50 scazut + AH 50 normal => deficit C1, C2, C4 CH 50 normal + AH 50 scazut => deficit cale alterna

CH 50 scazut + AH 50scazut => probabil deficit C3 sau C5-C9

7/31/2019 Lp Imuno 4

3/4

3

B. Evaluarea individuala a componentelor complementului.1. Evaluarea cantitativa:

a. Izolarea componentelor prin teste imnune reactie Ag-Ac: Affinity chromatography

Se folosesc coloane de afinitate (a caror componenta de baza e unmaterial sintetic = sefaroza si proteina A - un ligand pentru Ac)

Sunt tapetate cu Ac specifici componentei complementului care trebuie

purificata (C3, C4)

Se adauga serul pacientului, apoi se spala si apoi e adauga un buffer cu pH

acid care disloca component complementului de pe Ac specific

Imunodifuzie radiala Mancini Imunoelectroforeza rocket Nefelometrie frecvent utilizata pentru C3 si C4 (inclusiv C3b si C4b)

valori normale: C3 = 75 175 mg/dl, C4 = 14 40 mg/dl

ELISA sandwich - pentru evaluarea atat a componentelor cascadeicomplementului cat si a inhibitorilor acestuia.

b. Purificarea componentelor prin metode (bio-) chimice:Se utilizeaza PEG ( polietilen glicol) care separa proteinele in functie de greutatea lor moleculara: proteinele mai grele precipita

la concentratii mai mici de PEG; in plus lungimea lantului PEG selecteaza tipul de proteina care precipita; pentru proteine

diferite se folosesc PEG cu lanturi de diferite lungimi. Apoi se separa proteinele din amestec utilizand fast protein liquid

chromatography. In final se indeparteaza reziduurile contaminante prin filtrare in gel

2. Evaluarea functionala prin evaluarea actiunii litice a fiecarei componente Activitatea hemoliticaUn ser normal este depletat de o anumita componenta a complementului SNDx (ser normal depletat de componenta x).

precipitare cu un anume PEG pentru C1

adaugare de ammoniac pentru C3, C4 incalzire la 56 C pentru C2

SNDx se incubeaza cu serul pacientului de investigat si cu hematii de oaie sensibilizate ( pentru calea clasica) sau cu hematii de

iepure (pentru calea alterna). Se recolteaza supernatantul si se evalueaza spectrophotometric (ex. la 540nm). In functie de

absorbtia luminii se calculeaza gradul de hemoliza care este expresia activitatii hemolitice a componentei investigate.

Flow-citometrie - se evaluaza expresia celulara a receptorilor de complement (CR1 = CD35, CR2 = CD32, CR3 = CD18/CD11b,

CR4 = CD18/CD11c) si a proteinelor reglatoare C1-inh, DAF, factor I, H

Deficite de complement

1. Deficit de C3 Deficit de sinteza: congenital (cz. 6) sau dobandit: hepatopatii severe. Deficit prin consum:

deficit congenital de inhibitori ai C3b => activarea caii alterne => C3, factor B cu valori normale C1, C2, C4 infectii severe, GN acuta post-streptococica, GN membranoproliferativa, LES, vasculite;

In anumite afectiuni (LES, GN membranoproliferativa) pot apare auto Ac

C3 nefritic factor care recunosc si stabilizeaza C3 convertazei caii alterne (C3bBb) prelungindu-i excesiv activitateasi determinand nivele serice scazute de C3.

C4 nefritic factor care recunosc si stabilizeaza C3 convertazei caii clasice (C4bC2b) prelungindu-i excesiv activitateasi determinand nivele serice scazute de C3

Deficitul de C3 creste riscul infectiilor piogene cu germeni incapsulati, care pot fi foarte severe; la cei cu deficit congenitalmanifestarile apar precoce in copilarie.

In inflamatii valoarea C3 este de obicei crescuta IL1, Il 6, IFN, TNF stimuleaza sinteza de C3 si factor B

7/31/2019 Lp Imuno 4

4/4

4

2. Deficit de C4 Deficit de sinteza: congenital (cz. 6) sau dobandit: hepatopatii severe. Deficit prin consum:

Angioedem ereditar (deficit de C1 INH) infectii severe, GN acuta post-streptococica, GN membranoproliferativa, LES, vasculite, crioglobulinemie

In unele cancere nivelele C4 cresc. Deficitele de C1, C2, C3, C4 predispun la infectii recurente; predispun de asemenea la aparitia LES, glomerulonefrite. Defectele in calea clasica (de o cauza sau alta) pot duce la o scadere a clearance-lui complexelor imune (CI) care se depun la

nivelul MB ( glomerul, derm) determinand in continuare activarea complemetului si astfel generarea componentelor

proinflamatorii a complementului poate persista mai mult timp.

Deficitele de C5 - C9 predispun la infectii mai frecvente cu Neisserii.3. Deficit C1-INH = inhibitorul C1 (Angioedemul ereditar)

Deficite congenitale: cantitativ sau calitativ Valoare foarte scazuta diagnosticul prin teste cantitative Valoare cvasi-normala dar afunctional diagnostic prin teste functionale

Mecanism activarea spontana, necontrolata a caii clasice a complementului via C1 care cliveaza C4 care la randul lui cliveaza

C2 cu eliberare de C2a - posibil factor determinant; in plus se activeaza bradikinina (sistemul factorilor de contact este si elcontrolat partial de C1-INH) care face vasodilatatie si cresterea permeabilitatii vasculare (angioedemul nu e IgE-mediat).

Clinic: tumefieri spontane: fata, gat, organe genitale, extremitati. Poate fi amenintator de viata in cazul angioedemului laringian.

Paraclinic: valori scazute C1-INH

valori scazute C2, C4 (activarea C1 determina consum crescut de C2 si C4

valori normale C3, C5-9 (datorita celorlalti factori inhibitori ai complementului)

Proteine ce intervin in reglarea cascadei complementului (Inhibitori)

a. C1 Inh cliveaza C1 (separa Cq de CrCs)b. DAF =decay-accelerating factor = CD 55 care accelereaz descompunerea C3-convertazei caii clasice si alterne si inhiba

depunerea C4bC2b si C3bBb pe membranele celulelor gazdei,c. Factorul I cliveaza: C4b (dupa ce a fost legat de CR1 sau C4b-BP) si C3b generat pe calea alterna (dupa ce a fost legat de

factorul H)

- C4b binding protein blocheaza formarea C3 convertazei prin legarea de C4b, cofactor pentru Factorul I- Complement Receptor 1 - blocheaza formarea C3 convertazei prin legarea de C4b sau C3b, cofactor pentru

Factorul I

- Factorul H - blocheaza formarea C3 convertazei prin legarea de C3b, cofactor pentru Factorul Id. CD 59 - inhiba legarea lui C9 la C5bC6C7C8

Deficite dobandite asociate cu unele malignitati prin autoAc anti C1-INH (edem angioneurotic dobandit).

4. Deficit de DAF si CD59 ( hemoglobinuria paroxistica nocturna - HPN)Defect dobandit (mutatie spontana) al unei clone de celule stem hematopoietice si al progenitorilor acestora = defect al

sistemului de ancorare (prin fosfatidil-inozitol) al unor proteine de suprafata intre care si DAF, CD 59, Fc-R III.

DAF accelereaz descompunerea C3-convertazei caii clasice si inhiba depunerea C4bC2b si C3bBb pe membranele celulare.

CD59 inhiba legarea lui C9 la C8.

Deficitul de DAF si CD 59 pe membranele hematiilor => activarea complementului => liza hematiilor anemie hemolitica cu hemoliza intravasculara si hemoglobinurie (accentuata noaptea, pH scazut ?)

Deficitul de DAF si Fc-R III pe membrana plachetara => cresterea agregabilitatii plachetare induse de complement complicatii tromboembolice

Deficitul de Fc-R III pe membrana fagocitelor => scaderea functiei fagocitare Fc-R III mediata infectii bacteriene si persistenta de CI in circulatie