Influenta polifenolilor asupra actiunii amilazei

Influenta polifenolilor asupra actiunii amilazelorAbstractPrezenta lucrarea are drept obiectiv studiul efectului inhibitor al compuilor fenolici din ceaiul verde i negru asupra activitii enzimatice a amilazelor din fina de mal in vederea obtinerii unor extracte cu aplicabilitate in industria alimentara.

Ambele ceaiuri au prezentat aciune inhibitoare diferit asupra enzimei n funcie de tipul de ceai analizat i de concentraia probei supus analizei.

Cuvinte cheie : Polifenoli, amilaza, ceai verde

IntroducereDatorita actiunii lor antioxidant polifenolii ceaiului verde i negru au proprieti benefice asupra organismului, precum reducerea riscului de cancer, a bolilor cardiovasculare si chiar de prevenire a fenomenelor specifice imbatranirii. n literatur se menioneaz c polifenolii din ceaiul verde prezint aciune antiradical mai puternic dect vitamina C sau E. n acelai timp, polifenolii pot inhiba enzimele digestive, reducnd digestibilitatea alimentelor.

Unii cercettori (Zhang, J.; Kashket, S.) consider capacitatea ceaiurilor de a reduce coninutul de zahr din snge, ca fiind proprietatea care st la baza ntrzierii proceselor de mbtrnire. S-a demonstrat c att ceaiul verde, ct i ceaiul negru au aciune antidiabetic, ambele fiind benefice n prevenirea i tratarea diabetului, probabil datorit mecanismului de inhibare a activitii amilazei asupra amidonului ingerat. Ceaiul inhib att -amilaza salivar, ct i -amilaza din sucul pancreatic. Ca urmare, transformarea amidonului n zaharuri simple este ncetinit i creterea nivelului de glucoz n snge este minimalizat. Mai mult, potrivit unui studiu recent, ceaiul poate reduce absorbia intestinal a glucozei. Astfel, unii autori afirm c o singur ceac de ceai verde inhib activitatea enzimatic a amilazei cu 87% (Zhang, J.; Kashket, S.).Ceaiul verde furnizeaz mai ales fenoli simpli, pe cnd ceaiul negru conine n special polifenoli compleci. Ceaiul negru prezint o capacitate inhibitorie mai puternic dect ceaiul verde. nlturarea taninurilor din ceai cu gelatin determin pierderea activitii inhibitorii asupra amilazelor.

Compuii polifenolici din ceai care sunt eficieni n inhibarea activitii enzimatice a -amilazei sunt reprezentai de: epigalocatechin-galat, epicatechin-galat, epigalocatechina, epicatechina, (+) catechina i izomerul acesteia, teaflavina, teaflavinmonogalat A, teaflavinmonogalat B i teaflavindigalat. Amilazele sunt enzimele care catalizeaza reactii de hidroliza a legaturilor -1,4-glicozidice din amidon, glicogen si poliglucide derivate ale acestora, conducand la produsi cu greutate moleculare mica: dextrine, maltoza, glucoza. Cele mai active se gasesc in saliva si in sucul pancreatic al omului si al animalelor, in mucegaiuri, cereale incoltite. Se impart in trei grupe:1. -amilazele ( endoamilaze; dextrinogenamilaze) hidrolizeaza legaturile -1,4-glicozidice din interiorul moleculelor de amidon conducand la dextrine diferite ca marimi; sunt raspandite in majoritatea drojdiilor, microciuperci si bacterii, in semintele plantelor si in unele lichide biologice animale ca saliva, suc pancreatic, sange;

2. -amilaze ( exoamilaze; zaharogenamilaza) hidrolizeaza legaturile -1,4-glicozidice de la capetele nereducatoare ale lanturilor poliglucidice din amidon, conducand la eliberarea de maltoza si dextrine limita datorita neatacarii legaturilor -1,6-glicozidice. Sunt raspandite mai ales in semintele cerealelor;

3. (gluco)-amilaze ( -1,4-glucan-glucohidrolaze; -amiloglucozidaze) hidrolizeaza atat legaturile -1,4 cat si -1,6-glicozidice de la capetele nereducatoare ale lanturilor poliglucidice din amidon, conducand la eliberarea de glucoza. Sunt raspandite in microorganisme, mai ales in microciuperci; se gasesc in mucoasa intestinala a mamiferelelor, inclusive a omului.

Amilazele sunt inactivate la temperature inalte si cu ajutorul inhibitorilor chimici. Recent s-a demonstrate ce extractele de ceai verde si ceai negru au proprietati inhibitorii partiale asupra acestor enzime. Ceaiul verde si ceaiul negru reprezinta doua dintre cele cinci varietati de baza ale aceleiasi plante Camellia sinesis (ceai alb, ceai verde, oolong, ceai negru sip pu-erh). Ceaiul verde este supus unui tratament cu aburi, pentru a nu fermenta; inainte de uscare, frunzele sunt rulate aidoma celor de tutun, faza in care capata o culoare galben-verzuie. La ceauil negru oxidarea este mai profunda (dureaza ore intregi) si datorita acestui indelungat proces de fermentare, contine de trei ori mai multa cafeina decat celelalte tipuri de ceai. Att ceaiul negru ct i cel verde conin cantiti mari de flavonoide; cu toate acestea, ele difer n structura lor chimic. Ceaiul verde conine mai multe flavonoide simple numite catechine, n timp ce procesul de oxidare prin care trec frunzele pentru a se obine ceai negru face ca aceste flavonoide s se transforme n varieti mai complexe numite teaflavine i tearubigine. In frunzele proaspete de ceai sunt prezente substante din grupa catechinelor, care includ cativa esteri galici: gallocatechina (GC), epigal-locatechina (EGC), epicatechina (EC), epigallocatechin-gallat (EGCg) si epicatechin gallat (ECg). Componenta care domina este EGCg, care este si cea mai puternica. Tabelul de mai jos furnizeaz valori medii pentru diferite flavonoide prezente n ceaiul verde i negru, cu toate c ele difer n funcie de varietatea frunzelor, mediul de cretere, prelucrare, mrimea particulelor din frunzele subterane de ceai i de prepararea infuziei.

Tabelul 1.Flavonoide n ceaiul verde i negruFlavonoideCeaiul verde,(g medie/ 100g)Ceaiul negru (g medie/ 100g)

Catechine 14.24.0

Teaflavine -0.94

Flavonol glicozide 0.640.47

Flavon C glicozide 0.0860.051

Total polifenoli 16.015.6

Materiale si metode Pentru determinarile experimentale s-au ales doua variante de lucru:

A. Substratul: Solutia de amidon 2% preparat in extractul de ceai negru,respectiv verde n concentratie de: 1,5%, 3%, 4,5% .

Extractul enzimatic: soluie de malt 3%, in mediu apos.

B. Substratul: solutia de amidon 2% in mediu apos; Extractul enzimatic: solutie de malt 3% in ceai (negru, respectiv verde) n concentratie de: 1,5%, 3%, 4,5% In studiul de fata s-au utilizat ceaiul verde si ceaiul negru ca sursa de polifenoli.1. Dozarea polifenolilor din ceaiul verde si negru prin metoda spectofotometrica. Fenolii, in mediu alcalin, reduc complexul fosfomolibdenic (4MoO3MoO2)H3PO4. Reactivii folositi sunt: - reactiv Folin-Ciocaltau;

- Na2CO3 (101 g Na2CO310 H2O/500 ml apa);

- solutie etalon de fenol(quercetina).

Proba de analizat se obtine astfel: se trateaza 0,5 ml de extract de ceai (diluat 1:2) cu 0,5 ml reactiv Folin-Ciocaltau (diluat 1:3), apoi se adauga 1ml solutie saturata Na2CO3 si 16 ml de apa distilata. Amestecul se mentine la temperature camerei 25 de minute, apoi se citeste extinctia la 725 nm.

n paralel s-a dozat n acelai mod quercetina (drept etalon) dintr-o solutie etalon Activitatea amilazei s-a determinat prin dozarea glucidelor reducatoare formate ca urmare a actiunii amilazelor asupra amidonului folosind metoda cu acidul 3,5-dinitrosalicilic (acid 3,5-DNS).

2. Determinarea activitatii amilazei prin dozarea glucidelor reducatoare cu acid 3,5-DNS

Se supune actiunii enzimatice o solutie de amidon 2% in extractul de ceai verde, respectiv negru folosind drept sursa de amilaza un extract apos din malt 3%;

Se determina zaharul reducator format.

Reactivi : - solutie amidon 2% in extract de ceai;

- solutie DNS.

Se iau intr-un Erlenmeyer 25 ml solutie amidon 2% in ceai,respectiv 25 ml solutie apoasa de amidon 2% . Pentru proba martor se folosesc 25 ml extract de ceai,respectiv 25 ml apa. Se aduga 5 ml de extract apos de malt 3% si 5 ml extracte malt 3% in ceai. Dupa ce au fost bine omogenizate se termostateaza la temperature de 40 C timp de 30 de minute. Dupa expirarea timpului de termostatare, activitatea enzimatica este oprita prin fierberea probelor. Dupa racire, probele se trec cantitativ in baloane cotate de 50 ml, se aduc la semn si se omogenizeaza. Din fiecare proba se determina glucidele reducatoare prin DNS.

Se iau 1 ml proba de analizat din fiecare balon cotat diluata 1:1 cu apa distilata peste care se aduga 2 ml reactiv DNS. Pentru proba martor se folosesc 2 ml apa distilata.Se agita si se astupa cu dop de vata dupa care se introduc timp de 10 minute in baie de apa la fierbere. Dupa racire se completeaza cu 16 ml de apa distilata, se omogenizeaza si si citeste extinctia la 535 nm, folosind cuva de 1 cm si apa distilata ca fond. In paralel se face o proba martor la care se foloseste numai apa distilata.

Trasarea curbei etalon pentru stabilirea curbei etalon se foloseste o solutie de glucoza in concentratie de 0,5 mg/ml.

Din aceasta solutie se pipeteaza intr-o serie de eprubete in care se gasesc cate 2 ml reactiv DNS, urmatoarele cantitati: 0,0; 0,5; 1; 1,5; 2. Volumul eprubetelor se aduce cu apa distilata la 4 ml, iar tratamentele ulterioare si adaugarea reactivilor se fac in modul descris la determinarea glucidului reducator in proba de cercetat.

Se traseaza curba etalon trecand pe abscisa cantitatile de zahar reducator, iar pe ordonata extinctiile corespunzatoare. 3) Dinamica reactiei enzimatice in extractele de ceai negru i verde Dinamica reactiei enzimatice s-a realizat pentru ambele variante A i B pentru urmtoarele durate de defurare a reaciei enzimatice 15, 30, 45 de minute.

Rezultate si discutii 1) Cantitatea de polifenoli totali coninut de ceaiurile analizate s-a exprimat n echivaleni de quecetin/g ceai. Valorile obinute sunt redate n tabelul 2. Tabelul 2. Polifenoli totali din ceaiul negru i verdeConcentratia ceai (%)Echiv. Quercetina/100 ml infuzie

NegruVerde

1,54,24,9

315,15,13

4,515,35,17

[echiv. quercetina/ml infuzie]

unde:

0,6 cantitatea de quercetina/ml proba;

1,426 - extinctia solutiei etalon de polifenoli 2. Activitatea enzimatica s-a exprimat in UE,adica in micromoli de glucoza pusi in libertate de amilazele dintr-un gram malt intr-un minut in conditiile de lucru date, dupa relatia:

unde:

c cantitea de glucoza transformata in grame;

d dilutia;

C volumul de extract enzimatic luat in analiza, in ml, sau cantitatea de material prima care se gaseste in C ml de extract, in grame;

1 micromol glucoza;

t timpul de termostatare, in minute;

Varianta A Tabelul 3.Influenta concentratiei ceaiului asupra activitatii enzimatice Concentratia ceaiului, %Activitatea enzimatica UE/g malt

negruVerde

1,5545,9670,7

3158,8273,5

4,552,9139,9

Din datele obtinute, se constata ca atat ceaiul negru cat si cel verde au actiune inhibitoare asupra amilazei din malt. Pentru experimentele cu substrat preparat in extractele de ceai, de concentratii diferite, se observa scaderea cantitatii de produsi de reactie, implicit scaderea activitatii enzimatice a amilazei din extractul apos 3% de malt. Actiunea de inhibare a enzimei este mai mare in cazul ceaiului negru comparativ cu cel verde, explicatia fiind prezenta compusilor de condensare a polifenolilor formati in timpul procesul de oxidare a frunzelor de Camellia sinesis cat si in urma desfasurarii reactiei Maillard, la obtinerea ceaiului negru. Se observa ca odata cu cresterea concentratiei ceaiului, implicit a cantitatii de polifenoli extrasi, scade activitatea amilazei direct proportional cu concentratia.

3) Tabelul 8. Dinamica reactiei enzimatice in functie de concentratia ceaiuluiTimpul de termostatare

MinActivitatea enzimatica UE/g malt

Extract 1,5%Extract 3,0%

Extract 4,5%

negruverdenegruverdenegruverde

15239,52907,212,61099,32,5920,0

30545,9670,7158,8273,552,8139,9

45387,51262,4217,7540,4236,2270,6

Daca se variaza timpul de reactie se inregistreaza aceeasi tendinta de scadere a activitatii enzimatice a amilazei odata cu cresterea concentratiei la ambele tipuri de ceai.

In cazul ceaiului negru actiunea inhibitoare este mai puternica intr-un timp scurt de reactie (15 minute) pentru ca mai apoi reactia sa se echilibreze in sensul cresterii activitatii enzimatice a amilazei pe masura cresterii timpului de reactie. Aceasta se explica prin desfacerea legaturilor complexului polifenoli enzima, cu eliberarea enzimei.

In cazul ceaiului verde procesul de amiloliza debuteaza cu viteza mare pentru ca dupa un timp de reactie de 30 de minute sa se inregistreze cele mai mici valori ale activitatii enzimatice. Apoi procesul de hidroliza este reluat dar cu o viteza de reactia mai mica prin eliberarea centrilor activi ai enzimei si reluarea activitatii enzimei.Varianta B Tabelul 5 Influenta concentratiei ceaiului asupra activitatii enzimatice

. Concentratia ceai

%Activitatea enzimatica UE/g malt

NegruVerde

1,5531,8501,7

3158,7152,5

4,552,8109,6

In cazul variantei B, in care s-a utilizat extract de malt 3% in ceai se constata o scadere a activitatii enzimatice a amilazelor odata cu cresterea concentratiei ceaiului, atat cel negru cat si cel verde, astfel la dublarea concentratiei initiele (1,5) activitatea enzimei scade in medie de 3 ori, iar la triplarea concentratiei initiale activitatea enzimatica scade in medie de 6 ori. Se observa de asemenea ca extractul de ceai verde are o actiune inhibitoare mai mare decat extractul de ceai negru pentru primele doua concentratii.

3)Tabelul 10. Dinamica reactiei enzimatice in functie de concentratia ceaiuluiTimpul de termostatare

minActivitatea enzimatica UE/g malt

Extract 1,5%Extract 3,0%

Extract 4,5%

negruverdenegruverdenegruVerde

15143,74311,622,72228,6453,82783,2

30531,8501,7158,8152,552,8109,6

45749,61349,8228,2644,643,6511,8

La variatia timpului de reactie, scaderea activitatii enzimatice a amilazelor ramane proportionala cu concentratia ceaiului numai pentru 30 de minute,respectiv 45 de minute.Cea mai puternica inhibare pentru ceaiul negru este la 30 de minute la fel si pentru ceaiul verde.

Concluzii finaleStudiul de fata a demonstrat ca polifenolii prezenti in mediul de reactie enzimatica influenteaza activitatea amilazei in functie de concentratia lor.

Ca urmare, prezenta polifenolilor in sistemele alimentare poate fi o cauza a perturbarii proceselor enzimatice.

Bibliografie

1. Qiang, He.; Yuanping Lv.;Kai Yao, Effect of polyphenols on the activities of -amilase, pepsin, trypsin and lipaze,2006,

2. Yukihiko Hara; Miwa Honda,1994, Method of inhibiting the activity of -amylase,United States Patent, patent number 5,318,986;3. Sundarajan, Raja; Haja, Nazeer Ahamed; Venkatesan, Kumar; Mukherjee, Kakali; Saha, Bishnu Pada; Bandyopadhyay, Arun; Mukherjee, Pulok Kumar, Cytisus scoparius link A natural antioxidant, 2006, BMC Complementary and Alternative medicine, 6:8 doi 10.1186/1472-6882-6-8; 4. Tagliazucchi, D.; Verzelloni, E.; Conte, A, Effect of some phenolic compounds and beverages on pepsin activity during simulated gastric digestion, Departament of Agricultural Science, University of Morena and Reggio Emilia;5. Zhang, J.; Kashket, S.;1998, Inhibition of salivary amylase by black and green tea and their effects, Caries Researsh, 32:233-238(DOI: 10.1159/000016458)

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

EMBED MSGraph.Chart.8 \s

PAGE 1

_1238409426.unknown

_1238410298.unknown

_1238399468.

_1238409326.unknown

_1238399075.

_1238399467.

_1238398945.