Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de

vin

Icircndrumator ProfunivdringBarla Florin

Masterand Moldovanu RamonaMIASP II grupa 2 C

PROIECT ECAST

VINULDefinitia data vinului de Oficiul

International al Viei si Vinului este urmatoarea bdquoBautura obtinuta pe calea fermentarii spirtoase integrale sau partiale a mustului de struguri

Principalele soiuri de vincultivate

Soiurile nobile pentru vinuri albe Feteasca regala Feteasca alba Riesling italian Aligoteacute Pinot gris Muscat Ottonel Tamaioasa romaneasca Grasa de Cotnari Chardonnay Sauvignon Traminerroz

Soiurile nobile pentru vinuri rosii Merlot Feteasca neagra Babeasca neagra Cabernet Sauvignon Pinot noir Cadarca Burgund mare Busuioaca de Bohotin si alte soiuri

Arealele viticole din Romania icircncadrate icircn zonele viticole B CI si CII si cuprind 8 regiuni viticole104872937 podgorii1048729171 centre viticole

Părţile componente ale strugurilor şi boabelor

faţă de greutatea strugurelui

faţă de greutatea boabelor

Ciorchini 3-7 -

Pieliţă 93-97 9 -11

Miez 93-97 85-90

Seminţe 93-97 2-6

Schema tehnologica

de prodecere avinurilor de

calitate superioara

Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor

roşii

Drojdii selecţionate

SO2 Struguri roşii

Recepţie

ZdrobireDezbrobonire

Mustuială

Fermentarea pe boştină

BoştinăVin Ravac

Presare

Vin de presă

Terminarea fermentaţiei

Vin nou

Formare

Maturare

Pritocire

Cleire

Filtrare

Vin roşu curentVin roşu superior Drojdie Tescovină Ciorchini

Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt

Apa este componenta principală din punct de vedere cantitativ a mustului ocupacircnd icircn medie 70-80 din masa sa

Glucidele sunt reprezentate de glucoză şi fructoză care se acumulează icircn bob fiind formate prin fotosintezăCacircnd strugurii sunt copţi icircn totalitate se acumulează o cantitate maximă de glucide icircn bob ce diferă de la un soi la altul Icircn unele soiuri se găsesc şi cantităţi mici de zaharoză şi pentozani

Acizii organici se găsesc liberi şi sub formă de săruri de Ca şi K Acidul tartric se găseşte in proporţii de 002 013 g şi sub forma de bitartrat de potasiu 04 08 precum şi tartrat de calciu Acidul tartric e specific mustului şi vinului şi e prezent mai mult icircn strugurii verzi avacircnd gust acru ierbos Pe măsură ce coacerea se realizează acidul tartric arde prin procesul de respiraţie

Substanţele azotoase se găsesc icircn must sub formă de albumoze peptone peptide aminoacizi amide săruri amoniacale şi azotaţi Aminoacizii amidele şi sărurile amoniacale sunt asimilate de drojdii la fermentarea mustului

Substanţele pectice se găsesc icircn cantităţi mari icircn pieliţă şi seminţe şi au proprietatea de a reţine substanţe coloidale

Pigmenţii sunt localizaţi icircn pieliţă astfelroşii antocianeverzi clorofilăgalbeni caroten şi xantofilăgalbeni-bruni flavone Substanţele tanante sunt prezente icircn seminţe şi ciorchini acestea icircn contact cu mustul icircn cazul icircn

care au fost zdrobite icircn timpul presării imprimă un gust astringent Substanţele de aromă sunt localizate icircn pieliţă şi icircn zona periferică a miezului şi pentru diferitele soiuri

de struguri predomină grupuri diferite de substanţe aromate Vitaminele se găsesc icircn must 2-4 mgl mărind valoarea dietetică şi alimentară a mustului şi vinului Enzimele se găsesc mai mult icircn must interesul fiind icircndreptat spre enoxidază cea care catalizează

procesele de oxidare icircn afară de aceasta se mai găsesc şi invertaza glucosidaza şi lipaze Substanţa radioactivă prezentă icircn must şi vin este potasiul icircnsă puterea radioactivă este mică

Bolile şi defectele vinurilorBoli ale vinurilor Floarea vinurilor Oţetire vinurilor Borşire vinurilor Băloşire vinurilor Boala icircntoarcerii vinurilor Amăreala vinurilor Fermentaţia malolactică

Amăreala vinului este provocată de Bacillus amaracrylus deterioracircnd proprietăţile organoleptice astfel că vinul devine amar prezintă un miros iritant de acizi volatili capătă o culoare icircnchisă brună Această boală intervine la vinuri roşii icircnvechite icircn sticle şi la vinuri nematurate şi nesulfitate la timp Se poate preveni prin pitrociri regulate prin sulfitare SO2 ndash 100mgl şi prin corijarea acidităţii Această boală se poate trata prin pasteurizare filtrare cleire cu gelatină prin corijarea taninului şi prin cupajare la consum

Defectele vinurilor Casarea brună Casarea ferică neagră Casarea cuproasă Gust şi miros de hidrogen sulfurat Gustul şi mirosul de mucegai

Gustul şi mirosul de mucegai se icircntacirclnesc la vinurile păstrate icircn vase mucegăite Pentru icircndepărtarea acestor defecte vinurile se tratează prin administrarea de bioxid de sulf icircn doze de 40-50 mgl de vin sau prin tratarea vinurilor cu făină de muştar alb nedegradat sau cu ulei de vaselină

Control tehnic de calitate al vinuluiControl tehnic de calitate al vinului

Aspectul limpAspectul limpezimeaezimea şi culoarea vinului şi culoarea vinului LimpLimpezimeaezimea este este o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante Aprecierea ei Aprecierea ei trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezimedefecte de limpezime Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu foarte limpede suficent de limpede puţin limpedefoarte limpede suficent de limpede puţin limpede MirosulMirosul vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului precum şi a prezenţei unor mirosuri străineprecum şi a prezenţei unor mirosuri străine Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară ca efect al fementaţiei alcoolice ca efect al fementaţiei alcoolice Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

VINULDefinitia data vinului de Oficiul

International al Viei si Vinului este urmatoarea bdquoBautura obtinuta pe calea fermentarii spirtoase integrale sau partiale a mustului de struguri

Principalele soiuri de vincultivate

Soiurile nobile pentru vinuri albe Feteasca regala Feteasca alba Riesling italian Aligoteacute Pinot gris Muscat Ottonel Tamaioasa romaneasca Grasa de Cotnari Chardonnay Sauvignon Traminerroz

Soiurile nobile pentru vinuri rosii Merlot Feteasca neagra Babeasca neagra Cabernet Sauvignon Pinot noir Cadarca Burgund mare Busuioaca de Bohotin si alte soiuri

Arealele viticole din Romania icircncadrate icircn zonele viticole B CI si CII si cuprind 8 regiuni viticole104872937 podgorii1048729171 centre viticole

Părţile componente ale strugurilor şi boabelor

faţă de greutatea strugurelui

faţă de greutatea boabelor

Ciorchini 3-7 -

Pieliţă 93-97 9 -11

Miez 93-97 85-90

Seminţe 93-97 2-6

Schema tehnologica

de prodecere avinurilor de

calitate superioara

Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor

roşii

Drojdii selecţionate

SO2 Struguri roşii

Recepţie

ZdrobireDezbrobonire

Mustuială

Fermentarea pe boştină

BoştinăVin Ravac

Presare

Vin de presă

Terminarea fermentaţiei

Vin nou

Formare

Maturare

Pritocire

Cleire

Filtrare

Vin roşu curentVin roşu superior Drojdie Tescovină Ciorchini

Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt

Apa este componenta principală din punct de vedere cantitativ a mustului ocupacircnd icircn medie 70-80 din masa sa

Glucidele sunt reprezentate de glucoză şi fructoză care se acumulează icircn bob fiind formate prin fotosintezăCacircnd strugurii sunt copţi icircn totalitate se acumulează o cantitate maximă de glucide icircn bob ce diferă de la un soi la altul Icircn unele soiuri se găsesc şi cantităţi mici de zaharoză şi pentozani

Acizii organici se găsesc liberi şi sub formă de săruri de Ca şi K Acidul tartric se găseşte in proporţii de 002 013 g şi sub forma de bitartrat de potasiu 04 08 precum şi tartrat de calciu Acidul tartric e specific mustului şi vinului şi e prezent mai mult icircn strugurii verzi avacircnd gust acru ierbos Pe măsură ce coacerea se realizează acidul tartric arde prin procesul de respiraţie

Substanţele azotoase se găsesc icircn must sub formă de albumoze peptone peptide aminoacizi amide săruri amoniacale şi azotaţi Aminoacizii amidele şi sărurile amoniacale sunt asimilate de drojdii la fermentarea mustului

Substanţele pectice se găsesc icircn cantităţi mari icircn pieliţă şi seminţe şi au proprietatea de a reţine substanţe coloidale

Pigmenţii sunt localizaţi icircn pieliţă astfelroşii antocianeverzi clorofilăgalbeni caroten şi xantofilăgalbeni-bruni flavone Substanţele tanante sunt prezente icircn seminţe şi ciorchini acestea icircn contact cu mustul icircn cazul icircn

care au fost zdrobite icircn timpul presării imprimă un gust astringent Substanţele de aromă sunt localizate icircn pieliţă şi icircn zona periferică a miezului şi pentru diferitele soiuri

de struguri predomină grupuri diferite de substanţe aromate Vitaminele se găsesc icircn must 2-4 mgl mărind valoarea dietetică şi alimentară a mustului şi vinului Enzimele se găsesc mai mult icircn must interesul fiind icircndreptat spre enoxidază cea care catalizează

procesele de oxidare icircn afară de aceasta se mai găsesc şi invertaza glucosidaza şi lipaze Substanţa radioactivă prezentă icircn must şi vin este potasiul icircnsă puterea radioactivă este mică

Bolile şi defectele vinurilorBoli ale vinurilor Floarea vinurilor Oţetire vinurilor Borşire vinurilor Băloşire vinurilor Boala icircntoarcerii vinurilor Amăreala vinurilor Fermentaţia malolactică

Amăreala vinului este provocată de Bacillus amaracrylus deterioracircnd proprietăţile organoleptice astfel că vinul devine amar prezintă un miros iritant de acizi volatili capătă o culoare icircnchisă brună Această boală intervine la vinuri roşii icircnvechite icircn sticle şi la vinuri nematurate şi nesulfitate la timp Se poate preveni prin pitrociri regulate prin sulfitare SO2 ndash 100mgl şi prin corijarea acidităţii Această boală se poate trata prin pasteurizare filtrare cleire cu gelatină prin corijarea taninului şi prin cupajare la consum

Defectele vinurilor Casarea brună Casarea ferică neagră Casarea cuproasă Gust şi miros de hidrogen sulfurat Gustul şi mirosul de mucegai

Gustul şi mirosul de mucegai se icircntacirclnesc la vinurile păstrate icircn vase mucegăite Pentru icircndepărtarea acestor defecte vinurile se tratează prin administrarea de bioxid de sulf icircn doze de 40-50 mgl de vin sau prin tratarea vinurilor cu făină de muştar alb nedegradat sau cu ulei de vaselină

Control tehnic de calitate al vinuluiControl tehnic de calitate al vinului

Aspectul limpAspectul limpezimeaezimea şi culoarea vinului şi culoarea vinului LimpLimpezimeaezimea este este o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante Aprecierea ei Aprecierea ei trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezimedefecte de limpezime Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu foarte limpede suficent de limpede puţin limpedefoarte limpede suficent de limpede puţin limpede MirosulMirosul vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului precum şi a prezenţei unor mirosuri străineprecum şi a prezenţei unor mirosuri străine Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară ca efect al fementaţiei alcoolice ca efect al fementaţiei alcoolice Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Schema tehnologica

de prodecere avinurilor de

calitate superioara

Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor

roşii

Drojdii selecţionate

SO2 Struguri roşii

Recepţie

ZdrobireDezbrobonire

Mustuială

Fermentarea pe boştină

BoştinăVin Ravac

Presare

Vin de presă

Terminarea fermentaţiei

Vin nou

Formare

Maturare

Pritocire

Cleire

Filtrare

Vin roşu curentVin roşu superior Drojdie Tescovină Ciorchini

Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt

Apa este componenta principală din punct de vedere cantitativ a mustului ocupacircnd icircn medie 70-80 din masa sa

Glucidele sunt reprezentate de glucoză şi fructoză care se acumulează icircn bob fiind formate prin fotosintezăCacircnd strugurii sunt copţi icircn totalitate se acumulează o cantitate maximă de glucide icircn bob ce diferă de la un soi la altul Icircn unele soiuri se găsesc şi cantităţi mici de zaharoză şi pentozani

Acizii organici se găsesc liberi şi sub formă de săruri de Ca şi K Acidul tartric se găseşte in proporţii de 002 013 g şi sub forma de bitartrat de potasiu 04 08 precum şi tartrat de calciu Acidul tartric e specific mustului şi vinului şi e prezent mai mult icircn strugurii verzi avacircnd gust acru ierbos Pe măsură ce coacerea se realizează acidul tartric arde prin procesul de respiraţie

Substanţele azotoase se găsesc icircn must sub formă de albumoze peptone peptide aminoacizi amide săruri amoniacale şi azotaţi Aminoacizii amidele şi sărurile amoniacale sunt asimilate de drojdii la fermentarea mustului

Substanţele pectice se găsesc icircn cantităţi mari icircn pieliţă şi seminţe şi au proprietatea de a reţine substanţe coloidale

Pigmenţii sunt localizaţi icircn pieliţă astfelroşii antocianeverzi clorofilăgalbeni caroten şi xantofilăgalbeni-bruni flavone Substanţele tanante sunt prezente icircn seminţe şi ciorchini acestea icircn contact cu mustul icircn cazul icircn

care au fost zdrobite icircn timpul presării imprimă un gust astringent Substanţele de aromă sunt localizate icircn pieliţă şi icircn zona periferică a miezului şi pentru diferitele soiuri

de struguri predomină grupuri diferite de substanţe aromate Vitaminele se găsesc icircn must 2-4 mgl mărind valoarea dietetică şi alimentară a mustului şi vinului Enzimele se găsesc mai mult icircn must interesul fiind icircndreptat spre enoxidază cea care catalizează

procesele de oxidare icircn afară de aceasta se mai găsesc şi invertaza glucosidaza şi lipaze Substanţa radioactivă prezentă icircn must şi vin este potasiul icircnsă puterea radioactivă este mică

Bolile şi defectele vinurilorBoli ale vinurilor Floarea vinurilor Oţetire vinurilor Borşire vinurilor Băloşire vinurilor Boala icircntoarcerii vinurilor Amăreala vinurilor Fermentaţia malolactică

Amăreala vinului este provocată de Bacillus amaracrylus deterioracircnd proprietăţile organoleptice astfel că vinul devine amar prezintă un miros iritant de acizi volatili capătă o culoare icircnchisă brună Această boală intervine la vinuri roşii icircnvechite icircn sticle şi la vinuri nematurate şi nesulfitate la timp Se poate preveni prin pitrociri regulate prin sulfitare SO2 ndash 100mgl şi prin corijarea acidităţii Această boală se poate trata prin pasteurizare filtrare cleire cu gelatină prin corijarea taninului şi prin cupajare la consum

Defectele vinurilor Casarea brună Casarea ferică neagră Casarea cuproasă Gust şi miros de hidrogen sulfurat Gustul şi mirosul de mucegai

Gustul şi mirosul de mucegai se icircntacirclnesc la vinurile păstrate icircn vase mucegăite Pentru icircndepărtarea acestor defecte vinurile se tratează prin administrarea de bioxid de sulf icircn doze de 40-50 mgl de vin sau prin tratarea vinurilor cu făină de muştar alb nedegradat sau cu ulei de vaselină

Control tehnic de calitate al vinuluiControl tehnic de calitate al vinului

Aspectul limpAspectul limpezimeaezimea şi culoarea vinului şi culoarea vinului LimpLimpezimeaezimea este este o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante Aprecierea ei Aprecierea ei trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezimedefecte de limpezime Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu foarte limpede suficent de limpede puţin limpedefoarte limpede suficent de limpede puţin limpede MirosulMirosul vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului precum şi a prezenţei unor mirosuri străineprecum şi a prezenţei unor mirosuri străine Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară ca efect al fementaţiei alcoolice ca efect al fementaţiei alcoolice Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor

roşii

Drojdii selecţionate

SO2 Struguri roşii

Recepţie

ZdrobireDezbrobonire

Mustuială

Fermentarea pe boştină

BoştinăVin Ravac

Presare

Vin de presă

Terminarea fermentaţiei

Vin nou

Formare

Maturare

Pritocire

Cleire

Filtrare

Vin roşu curentVin roşu superior Drojdie Tescovină Ciorchini

Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt

Apa este componenta principală din punct de vedere cantitativ a mustului ocupacircnd icircn medie 70-80 din masa sa

Glucidele sunt reprezentate de glucoză şi fructoză care se acumulează icircn bob fiind formate prin fotosintezăCacircnd strugurii sunt copţi icircn totalitate se acumulează o cantitate maximă de glucide icircn bob ce diferă de la un soi la altul Icircn unele soiuri se găsesc şi cantităţi mici de zaharoză şi pentozani

Acizii organici se găsesc liberi şi sub formă de săruri de Ca şi K Acidul tartric se găseşte in proporţii de 002 013 g şi sub forma de bitartrat de potasiu 04 08 precum şi tartrat de calciu Acidul tartric e specific mustului şi vinului şi e prezent mai mult icircn strugurii verzi avacircnd gust acru ierbos Pe măsură ce coacerea se realizează acidul tartric arde prin procesul de respiraţie

Substanţele azotoase se găsesc icircn must sub formă de albumoze peptone peptide aminoacizi amide săruri amoniacale şi azotaţi Aminoacizii amidele şi sărurile amoniacale sunt asimilate de drojdii la fermentarea mustului

Substanţele pectice se găsesc icircn cantităţi mari icircn pieliţă şi seminţe şi au proprietatea de a reţine substanţe coloidale

Pigmenţii sunt localizaţi icircn pieliţă astfelroşii antocianeverzi clorofilăgalbeni caroten şi xantofilăgalbeni-bruni flavone Substanţele tanante sunt prezente icircn seminţe şi ciorchini acestea icircn contact cu mustul icircn cazul icircn

care au fost zdrobite icircn timpul presării imprimă un gust astringent Substanţele de aromă sunt localizate icircn pieliţă şi icircn zona periferică a miezului şi pentru diferitele soiuri

de struguri predomină grupuri diferite de substanţe aromate Vitaminele se găsesc icircn must 2-4 mgl mărind valoarea dietetică şi alimentară a mustului şi vinului Enzimele se găsesc mai mult icircn must interesul fiind icircndreptat spre enoxidază cea care catalizează

procesele de oxidare icircn afară de aceasta se mai găsesc şi invertaza glucosidaza şi lipaze Substanţa radioactivă prezentă icircn must şi vin este potasiul icircnsă puterea radioactivă este mică

Bolile şi defectele vinurilorBoli ale vinurilor Floarea vinurilor Oţetire vinurilor Borşire vinurilor Băloşire vinurilor Boala icircntoarcerii vinurilor Amăreala vinurilor Fermentaţia malolactică

Amăreala vinului este provocată de Bacillus amaracrylus deterioracircnd proprietăţile organoleptice astfel că vinul devine amar prezintă un miros iritant de acizi volatili capătă o culoare icircnchisă brună Această boală intervine la vinuri roşii icircnvechite icircn sticle şi la vinuri nematurate şi nesulfitate la timp Se poate preveni prin pitrociri regulate prin sulfitare SO2 ndash 100mgl şi prin corijarea acidităţii Această boală se poate trata prin pasteurizare filtrare cleire cu gelatină prin corijarea taninului şi prin cupajare la consum

Defectele vinurilor Casarea brună Casarea ferică neagră Casarea cuproasă Gust şi miros de hidrogen sulfurat Gustul şi mirosul de mucegai

Gustul şi mirosul de mucegai se icircntacirclnesc la vinurile păstrate icircn vase mucegăite Pentru icircndepărtarea acestor defecte vinurile se tratează prin administrarea de bioxid de sulf icircn doze de 40-50 mgl de vin sau prin tratarea vinurilor cu făină de muştar alb nedegradat sau cu ulei de vaselină

Control tehnic de calitate al vinuluiControl tehnic de calitate al vinului

Aspectul limpAspectul limpezimeaezimea şi culoarea vinului şi culoarea vinului LimpLimpezimeaezimea este este o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante Aprecierea ei Aprecierea ei trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezimedefecte de limpezime Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu foarte limpede suficent de limpede puţin limpedefoarte limpede suficent de limpede puţin limpede MirosulMirosul vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului precum şi a prezenţei unor mirosuri străineprecum şi a prezenţei unor mirosuri străine Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară ca efect al fementaţiei alcoolice ca efect al fementaţiei alcoolice Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt

Apa este componenta principală din punct de vedere cantitativ a mustului ocupacircnd icircn medie 70-80 din masa sa

Glucidele sunt reprezentate de glucoză şi fructoză care se acumulează icircn bob fiind formate prin fotosintezăCacircnd strugurii sunt copţi icircn totalitate se acumulează o cantitate maximă de glucide icircn bob ce diferă de la un soi la altul Icircn unele soiuri se găsesc şi cantităţi mici de zaharoză şi pentozani

Acizii organici se găsesc liberi şi sub formă de săruri de Ca şi K Acidul tartric se găseşte in proporţii de 002 013 g şi sub forma de bitartrat de potasiu 04 08 precum şi tartrat de calciu Acidul tartric e specific mustului şi vinului şi e prezent mai mult icircn strugurii verzi avacircnd gust acru ierbos Pe măsură ce coacerea se realizează acidul tartric arde prin procesul de respiraţie

Substanţele azotoase se găsesc icircn must sub formă de albumoze peptone peptide aminoacizi amide săruri amoniacale şi azotaţi Aminoacizii amidele şi sărurile amoniacale sunt asimilate de drojdii la fermentarea mustului

Substanţele pectice se găsesc icircn cantităţi mari icircn pieliţă şi seminţe şi au proprietatea de a reţine substanţe coloidale

Pigmenţii sunt localizaţi icircn pieliţă astfelroşii antocianeverzi clorofilăgalbeni caroten şi xantofilăgalbeni-bruni flavone Substanţele tanante sunt prezente icircn seminţe şi ciorchini acestea icircn contact cu mustul icircn cazul icircn

care au fost zdrobite icircn timpul presării imprimă un gust astringent Substanţele de aromă sunt localizate icircn pieliţă şi icircn zona periferică a miezului şi pentru diferitele soiuri

de struguri predomină grupuri diferite de substanţe aromate Vitaminele se găsesc icircn must 2-4 mgl mărind valoarea dietetică şi alimentară a mustului şi vinului Enzimele se găsesc mai mult icircn must interesul fiind icircndreptat spre enoxidază cea care catalizează

procesele de oxidare icircn afară de aceasta se mai găsesc şi invertaza glucosidaza şi lipaze Substanţa radioactivă prezentă icircn must şi vin este potasiul icircnsă puterea radioactivă este mică

Bolile şi defectele vinurilorBoli ale vinurilor Floarea vinurilor Oţetire vinurilor Borşire vinurilor Băloşire vinurilor Boala icircntoarcerii vinurilor Amăreala vinurilor Fermentaţia malolactică

Amăreala vinului este provocată de Bacillus amaracrylus deterioracircnd proprietăţile organoleptice astfel că vinul devine amar prezintă un miros iritant de acizi volatili capătă o culoare icircnchisă brună Această boală intervine la vinuri roşii icircnvechite icircn sticle şi la vinuri nematurate şi nesulfitate la timp Se poate preveni prin pitrociri regulate prin sulfitare SO2 ndash 100mgl şi prin corijarea acidităţii Această boală se poate trata prin pasteurizare filtrare cleire cu gelatină prin corijarea taninului şi prin cupajare la consum

Defectele vinurilor Casarea brună Casarea ferică neagră Casarea cuproasă Gust şi miros de hidrogen sulfurat Gustul şi mirosul de mucegai

Gustul şi mirosul de mucegai se icircntacirclnesc la vinurile păstrate icircn vase mucegăite Pentru icircndepărtarea acestor defecte vinurile se tratează prin administrarea de bioxid de sulf icircn doze de 40-50 mgl de vin sau prin tratarea vinurilor cu făină de muştar alb nedegradat sau cu ulei de vaselină

Control tehnic de calitate al vinuluiControl tehnic de calitate al vinului

Aspectul limpAspectul limpezimeaezimea şi culoarea vinului şi culoarea vinului LimpLimpezimeaezimea este este o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante Aprecierea ei Aprecierea ei trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezimedefecte de limpezime Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu foarte limpede suficent de limpede puţin limpedefoarte limpede suficent de limpede puţin limpede MirosulMirosul vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului precum şi a prezenţei unor mirosuri străineprecum şi a prezenţei unor mirosuri străine Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară ca efect al fementaţiei alcoolice ca efect al fementaţiei alcoolice Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Bolile şi defectele vinurilorBoli ale vinurilor Floarea vinurilor Oţetire vinurilor Borşire vinurilor Băloşire vinurilor Boala icircntoarcerii vinurilor Amăreala vinurilor Fermentaţia malolactică

Amăreala vinului este provocată de Bacillus amaracrylus deterioracircnd proprietăţile organoleptice astfel că vinul devine amar prezintă un miros iritant de acizi volatili capătă o culoare icircnchisă brună Această boală intervine la vinuri roşii icircnvechite icircn sticle şi la vinuri nematurate şi nesulfitate la timp Se poate preveni prin pitrociri regulate prin sulfitare SO2 ndash 100mgl şi prin corijarea acidităţii Această boală se poate trata prin pasteurizare filtrare cleire cu gelatină prin corijarea taninului şi prin cupajare la consum

Defectele vinurilor Casarea brună Casarea ferică neagră Casarea cuproasă Gust şi miros de hidrogen sulfurat Gustul şi mirosul de mucegai

Gustul şi mirosul de mucegai se icircntacirclnesc la vinurile păstrate icircn vase mucegăite Pentru icircndepărtarea acestor defecte vinurile se tratează prin administrarea de bioxid de sulf icircn doze de 40-50 mgl de vin sau prin tratarea vinurilor cu făină de muştar alb nedegradat sau cu ulei de vaselină

Control tehnic de calitate al vinuluiControl tehnic de calitate al vinului

Aspectul limpAspectul limpezimeaezimea şi culoarea vinului şi culoarea vinului LimpLimpezimeaezimea este este o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante Aprecierea ei Aprecierea ei trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezimedefecte de limpezime Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu foarte limpede suficent de limpede puţin limpedefoarte limpede suficent de limpede puţin limpede MirosulMirosul vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului precum şi a prezenţei unor mirosuri străineprecum şi a prezenţei unor mirosuri străine Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară ca efect al fementaţiei alcoolice ca efect al fementaţiei alcoolice Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Control tehnic de calitate al vinuluiControl tehnic de calitate al vinului

Aspectul limpAspectul limpezimeaezimea şi culoarea vinului şi culoarea vinului LimpLimpezimeaezimea este este o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante o condiţie de bază a vinurilor finite evoluante Aprecierea ei Aprecierea ei trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd trebuie să se facă atacirct la lumină transparentă cacirct şi icircn lumină reflectată aşezacircnd paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de paharul cu vin icircntre ochii privitorului şi sursa de lumină Icircn cazurile deosebit de importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn importante limpezimea se apreciază icircn locuri icircntunecoase aşezacircnd proba de vin icircn dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici dreptul unei lămpi electrice Pe un fond icircntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezimedefecte de limpezime Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizează o scară de termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu termeniConform acestei scări un vin poate fi limpede cristalin limpede cu luciu foarte limpede suficent de limpede puţin limpedefoarte limpede suficent de limpede puţin limpede MirosulMirosul vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului vinului se examinează icircn scopul aprecierii aromei sau buchetului precum şi a prezenţei unor mirosuri străineprecum şi a prezenţei unor mirosuri străine Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele Prin aroma unui vin se icircnţelege un complex de diferite mirosuri din care unele provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de provin din struguri şi altele se formează icircn timpul fermentaţiei Se disting tipuri de aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este aromă aromă primară cu miros specific de fruct ce provine din struguri şi este caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară caracteristica soiului aromă secundară aroma ce se suprapune peste cea primară ca efect al fementaţiei alcoolice ca efect al fementaţiei alcoolice Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de Aşadar aroma indică mirosul unui vin tacircnăr Buchetul este un amestec de arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă arome complexe caracteristice vinului maturizat icircn butoaie şi icircnvechit icircn sticlă

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Resveratrolul antioxidantul din vinul rosubull Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un

medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special Cercetatorii au incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu

bull Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange inima sau ficat

bull Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor care au diete relativ bogate in grasimi dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin

bull Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent antioxidant anticancerigen si un fitoestrogen

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes bull oenologic ndash este un nou compus fenolic provenit din struguri care participa

la culoare la caracterul gustativ la invechirea vinului intervine in reactiile de oxidare interactioneaza cu proteinele etc

bull fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii naturale a plantei

bull farmacologic ndash face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi in organism protector impotriva bolilor cardiovasculare proprietati chimiopreventive impotriva cancerului previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul creste cantitatea de colesterol bdquobunrdquo(HDL) si scade pe cel bdquo raurdquo(LDL)

bull Resveratrolul (trans354rsquo-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R-1998) Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

bull Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta in stare latenta o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Fig 2 Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Fenomenul de latenta timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa nu a fost explicata Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi umiditatea temperatura tesuturile moarte leziunile plantelor lumina etc

Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici ndash resveratrol resveratrol trans- de- hidrodimer şi ε - viniferina ndash in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea a fost pusa pe seama latentei acesteia

Biosinteza stilbenilor flavonoizilor şi taninurilor decurge din metabolismul secundar al aminoacizilor ndash metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric

Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina un aminoacidaflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintazasufera o deviere cu formare de resveratrol (fig3)

Fig3 Ciclul de sinteză al resveratrolului

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Sursele de resveratrol

bull Resveratrolul se gaseste in struguri vin must de struguri fructe afine din specia (Vaccinum) mure si merisorul (cranberrie)

bull Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea la infectii de fungi Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare

bull Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol bull Vinul rosu contine mai mult resveratrol Desi este prezent si in plante precum eucaliptul molid sau

alimente ca dudele si alunele cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii in special soiurile destinate obtinerii vinului Substanta se gaseste in radacini ramuri seminte dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 ndash 100 micrograme la gram

bull Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice componente a sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli in special a unor infectii fungice Pentru ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci strugurii din aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

bull Puncte de topire 265-266 grade Celsius bull Solubilitate in apa mai mare de 100μgml la 25 grade Celsius bull Formula chimica C14H12O3 bull Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis bull Solubilitate in etanol 50gl bull Masa molara 22825 bull Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc bull Scade nivelul colesterolului total din sange bull Combate osteoporoza bullAdministrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce

prelungeste viata cu 70-80 Resveratrol face parte din clasa de Polifenolibull Subclasa Stilbene (trans-354-trihydroxystilbene)bull Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoAbullRecunoscut ca antioxidant care raspunde la Stres infectii de fungi si radiatii

ultraviolete (UV)bull Resveratrol este solubil in grasimi compusii apar in configuratia trans si cis

Resveratrolbull Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Resveratrol este o fitoalexina O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectieibull De examplu Raspunde la invadarea fungiilor Infectiile cu fungi apar mai mult in zona

cu climat rece strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de Resveratrol S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in Franta deosebit la un nivel-relativ inalt datorita fumatului si consumului de acizi grasi saturati

bull Aceasta a adus idea consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovascularebull Acesti polifenoli contin antioxidanti anti-inflamatori si alti potentiali cu efect anti-

aterogenicbull Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 20-

30 polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte incidente promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimerefect la osteoartritainhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A

Reversia fenotipului malign cu flavonoizi Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu Acid Elagic EGCG - Galatul de epigalocatechina Quercitina Extract din Samburi de StruguriIsoflavone din Pueraria I-P6 ndash Inozitol Hexafosfat

bull Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor N-Acetilcisteina Vitamina C Vitamina D3Graviola Indol-3-Carbinol DiindolylmethaneEchilibru Hormonal Anticancer-Oncoxin

bull Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului malign prin inhibarea celulelor de cancer

bull Remisia completa de celule de cancer cu Germaniu Organic (Ge 132)

Proprietati

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Efectele cardiovasculareNumeroase studii au demonstrat ca vinul in special vinul rosu poate reduce incidenta

bolii coronariene Fiind un puternic antioxidant resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu densitate joasa (LDL) previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele

Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile Pe de alta parte resveratrolul este mai putin efiecient decat quercitina sau epicatechina ce se gasesc de asemenea in vinul rosu Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular

Efectele anticancerigeneResveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor

canceroase Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce denatureaza proteinele celulare In plus oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti mutagene ale resveratrolului

Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostaticabull Resveratrol cu eficacitate citostatica Mecanismul molecularbull Ca agent citostatic la cancerul de plaminbull Inhiba tumorogeneza intestinalabull In cresterea celulara de cancer bucalbull Reduce inflamatia indusa de colitabull In studiu pe animale s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar esofag sicancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrolbull La predispozitia genetica de cancer de colon efectul prin administrarea orala s-amixat

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor

Concentraţiile de resveratrol(pătrate linia punctată) şi DMU212(rombi linia dreapta) icircn plasmă şi ţesuturi de şoarecii care au primit o singură doză de droguri (240 mgkg-1) Valorile diferă semnificativ (p lt005)

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI

Cateva sute de compusi chimici diferiti alcooli superiori aldehide etili esteri ai acizilor grasi cetone monoterpene fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri Acesti compusi au diferite proprietăti fizice si chimice cum sunt polaritatea si volatilitatea si au domenii de concentratii de la cateva mgl pana la mai mult de 100 mgl

Consideratii generale

Componentii din vin provin pe mai multe cai - componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric acid malic acid citric substante minerale anioni si cationi sub forma de acizi minerali saruri) - componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative (alcooli acid lactic si acid succinic) - componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor existente (esteri acetali polifenoli

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

HPLC HPLC ndash metoda analitica utilizata in scopul separarii identificarii si dozarii substantelor organice si anorganice aflate in solutie

Calitativ separarea

determinarea componentilor pe

baza timpului de retentie

Cantitativ curba de etalonare -

pe domeniul de valabilitate al legii

Lambert Beer (variatie liniara a

raspunsului DAD cu concentratia)

ANALIZEbull farmaceuticebull clinicebull toxicologicebull de mediubull industrialebull alimentare

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie

- faza stationara - adsorbant de tip silicagel alte umpluturi pe baza de silice

- principiul separarii etape repetate de adsorbtie-desorbtie

- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa

- Interactiuni polare (dipol-dipol) ndash faza normala

Cromatografia de schimb ionic

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic de semn contrar ionilor analitului

- specifica analitilor ioniciionizabili

- Interactiuni ionice

SEC (GPC)

- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate

- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Interactiuni dipol-dipol

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Cromatografie cu faza normala - faza stationara ndash puternic polara (silicagel)-faza mobila ndash nepolara Cromatografie cu faza inversa- faza stationara ndash nepolara lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

80Octadecilsilice (ODS C18)10 Octil (C8)5 Butil (C4)3 Fenil

2 Ciano (CN)

- faza mobila ndash polara (faza organica - CH3OH CH3CN THF sisau apa cufara sol tampon)

Elutie

izocratica in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana dimensiuni (Ld) T

Faza stationara natura diametrul particulelor

Faza mobila tipul de elutie debitul solventii

Analitul polaritate masa moleculara concentratie

Dimensiunea

particulelor

(μm)

Timpul de retentie (min)

Presiunea

(bar)

5 30 19

3 18 87

15 9 700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm 60 MeOH in ApaBenzamida alcool benzilic acetofenona benzoat de metil fenetol naftalina benzofenona bifenilFaza mobila

compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) ndash rezultatul UV si probleme de compresibilitate

Elutie in gradient Elutie izocratica

(1)-Benzen(2)-Monoclorbenzen(3) Ortodiclorobenzen (4)-123ndash triclorobenzen(5)-135ndashtriclorobenzen (6)-1234 ndash tetraclorobenzen (7)-Pentaclorobenzen (8)-Hexaclorobenzen

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

IR UVVIS Fluorescenta SM

Raspuns Universal Selectiv Selectiv Selectiv

Sensibilitate 4 micrograme 5 nanograme 3 picograme 1 picogram

Sensibilitate la debit DA NU NU NU

Sensibilitate la temperatura DA NU NU NU

Detectorul cromatografic idealRaspuns independent de compoziţia fazei mobile debit temperaturaSensibilitate ndash panta curbei de calibrare mare rarr sensibilitate mare

Selectivitatea Raspuns rapidZgomot de fond scazutNon-destructiv pentru probaDomeniu dinamic liniar mareStabilitate icircntr-un timp icircndelungat de operare

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

bull Cel mai folosit tip de detector ndash cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL Un astfel de detector capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm potrivit pentru majoritatea compusilor

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

MATERIAL ŞI METODĂ

Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

bullMetoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi

bull Metode de determinare

Cromatografie pe strat subtire si HPLC

Extracţia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol evaporarea sub vid a fazei lichide reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Extracţia din vin

Vinul este evaporat la frac12 din cantitate in evaporator sub vid pentru indepartaea alcoolului Din vinul dezalcoolizat compusii fenolici se extrag cu acetat de etil dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus urmator

Metoda de separare prin HPLC Extractele obţinute din prelucrarea probelor de struguri şi vin au fost injectate icircn

coloană de trei ori

Conditii de lucru Coloana - C18 250 mm x 46 mm debit 1 mlminut Elutie Sistem gradient = 2 solventi A ndash apa B - apa acetonitril H2O CH3 CN 28 (vv) Volumul injectat 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje - este o metodă rapidă pentru separarea identificarea şi determinarea

cantitativă a compuşilor aflaţi icircn amestecuri complexe - dă posibilitatea separării substanţelor aflate icircn concentraţii foarte mici icircn

amestecurile de analizat - este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Concluzii

bull Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor şi posibilitatea de diferentiere a acestora

bull Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa şi cantitativa a resveratrolului din struguri must şi vin dar şi din alte produse alimentare

bull HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice fenoli polifenolihellip

bull Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului şi in general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie şi reproductibilitate inalta

bull Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantităti mari de alcooli superiori etili esteri acetati acizi grasi si compusi carbonilici

Continutul de resveratrol in vin (mgl) Alb 005-180 Rose 043-352 Rosu 192-1259 Must de struguri 114-869

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29

Exemplu

CROMATOGRAMA

Resveratrolului

de vin

la timpul de retentie

respectiv

• Metoda rapida HPLC pentru determinarea resveratrolului de vin
• Slide 2
• Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara
• Fig1Schema tehnologică de obţinere a vinurilor roşii
• Componenţii chimici principali ai strugurilor sunt
• Bolile şi defectele vinurilor
• Control tehnic de calitate al vinului
• Resveratrolul antioxidantul din vinul rosu
• Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes
• Slide 10
• Slide 11
• Sursele de resveratrol
• Slide 13
• Slide 14
• Slide 15
• Slide 16
• Slide 17
• EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
• Slide 19
• Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare
• Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze
• Factorii care influenteaza separarea cromatografica
• Slide 23
• Slide 24
• MATERIAL ŞI METODĂ Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
• Slide 26
• Extracţia din vin
• Concluzii
• Slide 29