Daniela Botus - Inlfuenta micotoxinelor asupra pasarilor si productiei avicole
Analiza Hplc a Micotoxinelor
-
Upload
tabaraalin777 -
Category
Documents
-
view
258 -
download
0
Transcript of Analiza Hplc a Micotoxinelor
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
1/57
ANALIZA HPLC A MICOTOXINELOR
Mucegaiurile de depozit sursa de contaminare cumicotoxine
Mucegaiurile sunt larg raspandite n natura, fiind mai numeroase nsa, n
mediile bogate n glucide de origine vegetala, intervenind ntotdeauna n
procesele de putrefactie a substantelor vegetale. Se raspndesc cu mare
usurinta n natura, n special prin spori, care spre deosebire de cei bacterieni
sunt o forma de nmultire si nu de rezistenta. Efectele favorabile ale unorcategorii de fungi se folosesc n industria alimentara pentru fermentarea unor
produse lactate proaspete, prepararea unor branzeturi (Rouefort, !ucegi,
"omorod# si produse de carne (salam tip $Sibiu$#. Efectele daunatoare se
manifesta prin producerea de toxine nocive pentru om si animale, genernd
diverse toxiinfectii alimentare. %in punct de vedere morfologic,
mucegaiurile sunt formate din mai multe cellule eucariote care formeaza
miceliul, avand la randul lui o portiune aeriana si una situata n mediul n
care se dezvolta. %in punct de vedere fiziologic, o parte din miceliu este
reprezentata de aparatul vegetativ (&ife tubular septate sau neseptate#, iar o
alta parte de aparatul reproducator (&ife pe care se dezvolta sporii#.
%in punct de vedere metabolic, mucegaiurile au cteva caracteristici si
anume' cele mai multe sunt saprofite, dezvoltnduse pe substraturi
organice) folosesc pentru &ranire surse de carbon) prefer atmosfera umeda sitemperatura de dezvoltare ntre *+++-) sunt n general aerobe si acidofile,
dezvoltnduse la un p" cuprins ntre .
/dentificarea mucegaiurilor se face cu a0utorul unor c&ei dicotomice, pe baza
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
2/57
caracterelor culturale si morfologice. Materia prima alimentara si produsele
finite pot fi contaminate cu sporiu sau fragmente de miceliu din mediul
ncon0urator, contaminarea putnd avea loc n diferite stadii de productie.
1rezenta unui numar mare de spori sau fragmente de miceliu n produse carenu sunt vizibil mucegaitepoate indica pe de o parte o contaminare generala a
mediului ncon0urator sau o prelucrare de materie prima mucegaita.
%ezvoltarea unei anumite specii de ciuperci pe un produs alimentar are si
aspecte necunoscute, dar cu siguranta, ea este corelata cu calitatea specie
micetice si cu proprietatile produsului alimentar. %e asemenea dominatia
unei specii se poate datora unei contaminari puternice din nise ecologiceunde sa dezvoltat mucegaiul.
Principalele specii de fungiide depozit si micotoxinele care le produc sunt'
1.Aspergillus flavus, A.parasiticus, A.nomius, Penicillium puberulum, P.
citrinum, Rizopusproduc 2flatoxine !3, !*, 43, 4*, M3, M*)
2. 1enicillium verucosum, 1. viridicatum, 1.commmune, 2spergillus
alutaceus, 2. oc&raceus, 2.melleus produc 5c&ratoxina 2
. 1enicillium expansum, !6ssoclam6s nivea, 2spergillus clavatus
1atulina MucegaiulAspergillus sp. infesteaza un numar mare de fura0e dar
mai ales pe cele de natura vegetala si animala. -reste foarte bine n sroturile
de ara&ide si nutreturile combinate. /nfesteaza n mare masura si asternutul
din adaposturi precum si plantele fura0ere smulse cu radacini. 2erul din
imediata apropiere a acestor focare este puternic ncarcat cu spori de
Aspergillus. %in numeroasele tulpini ale mucegaiului Aspergillus, maifrecvente si daunatoare animalelor sau dovedit a fi ' A. flavus, A.
fumigatum, A. nidulans,A.candidus, A. clavatus, A. niger, A. glaucus, A.
amstelodanii, A. parasiticus, A.giganteus si A. claviformeAspergillus sp.
contine mai multi principii toxici dintre care cei mai importanti sunt
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
3/57
aflatoxinele care deriva de la 7a-Aspergillus si 7fla- flavus, prima tulpina
din acest mucegai n care sau pus n evidenta astfel de micotoxine.
2flatoxinele sunt produse n cantitati variabile n directa concordanta cu
prezenta unor numerosi factori favorizanti. %intre aflatoxinele studiate pnan prezent cele mai daunatoare sunt aflatoxinele !3, !*, 43, 4*, care se
regasesc n laptele animalelor &ranite cu fura0e contaminate sub forma
M3,M*. 1e lnga aflatoxine n sursele fura0ere sau n asternutul
adaposturilor se mai pot gasi si alte micotoxine ntruct mucegaiul
Aspergillus creste de obicei mpreuna cu Mucor, Penicillium, Rhizopus,
Alternaria. 8otodata este bine stabilit ca nutretul infestat cu
Aspergillus
contine si alte toxine, ca acidul oxalic care tulbura absorbtia calciului din
tubul digestiv, ncetineste cresterea si scade calcemia. 2cidul oxalic rezulta
din degradarea de catre acest mucegai a &idratilor de carbon din substratul
infestat. 2cidul co0ic( * &6droximet6l9&6droxi:p6rone# este o toxina
neurotropa, cardiotoxica, leucocitotoxica, antibiotica. Se face responsabil de
miscarile necontrolate, exoftalmie si convulsii tetaniforme. 2lt derivat toxic
este acidul betanitopropionic, care produce vasodilatatie si ca urmare
insuficienta circulatiei cerebrale precum si transformarea &emoglobinei n
met&emoglobina, deci stare de anoxemie. 2cidul aspergilic si compusii
nruditi (acid &idroxiaspergilic, acid dezoxiaspergilic# au efect antibiotic.
2laturi de aflatoxine mai apare si substante tremorgene (generatoare de
frisoane# care se elaboreaza odata cu aflatoxinele, flavalcoolul sau
flavonolul, acidul galic, etc. 8otodata ciuperca contine si o endotoxina careeste puternic nefrotoxica, &emoaglutinanta, &emolitica, dermonecrotica) la
iepure aceasta produce &emoragii, necroze renale, degenerescenta grasa
&epatica. Se constata ca toate speciile de mamifere, pasari, pesti si albine pot
face aflatoxicoza. ;a doze mari de aflatoxina sau mucegai manifestarea
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
4/57
clinica va fi acuta sau subacuta, iar la doze mici, patrunse n organism ntro
perioada de timp ndelungata manifestarea clinica va avea o evolutie cronica.
Morbiditatea si mortalitatea cuprind adesea un numar mare de animale mai
cu seama cnd factorii care favorizeaza dezvoltarea mucegaiului persista.Micozootoxicoza apare n special n conditii de supraaglomerari, umiditate
ridicata, suprancalzire, etc., factorii principali fiind tot nutretul infestat si
aerul contaminat cu spori. Sporii deAspergillus pot patrunde si prin porii
co0ii n oua unde pot creste omornd embrionul sau producndui leziunile
caracteristice aspergilotoxicozei c&iar n faza embrionara.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
5/57
serioasa de siguranta alimentara, mai ales n anumite regiuni ale globului n
care conditiile climatice sau standardele din agricultura sunt precare.
5rganizatia pentru 2limente si 2gricultura (=25# estimeaza ca pe plan
mondial pna la *9> din culturile alimentare sunt semnificativ contaminatecu micotoxine. /n literatura sunt citate date conform carora n natura ar
exista un mare numar de micotoxine, din care au fost identificate peste *++
de specii. 1ractic, nu se cunosc zone pe glob indemne si se apreciaza ca *9
?+> din cerealele lumii sunt contaminate cu micotoxine cunoscute, produse
mai ales de fungi din genurile Aspergillus, Fusarium, Penicillium, amintite
anterior. Raspndirea diferitelor specii de fungi, precum si concentratia nmicotoxine a &ranei este influentata de conditiile pedoclimatice. 5 situatie
precisa a distributiei geografice a micotoxinelor a fost facuta ntrun studiu
prezentat n 3@, la prima conferinta despre micotoxine a 5rganizatiei
pentru 2limentatie si 2gricultura (=25#, 5rganizatiei pentru Sanatate
Mondiala (A"5# si 1rogramului Batiunilor Cnite pentru Mediu (CBE1#.
2ceasta a aratat ca n alimentele si nutreturile contaminate natural cu fungi
se gasesc n concentratii mari doar sapte micotoxine' aflatoxina, oc&ratoxina
2, patulina, zearalenona, tricotecenele, citrinina si acidul penicilic.
%istributia micotoxinelor n diferite zone ale globului se caracterizeaza prin
urmatoarele'
D n regiunile reci (-anada, nordul SC2 si ma0oritatea tarilor europene#
domina aflatoxinele (exceptie fac produsele de import provenite din tarile
calde# dar foarte importante sunt' vomitoxina, zearalenona, oc&ratoxina,%2S, toxina 8* si toxina "8*)
D n sudul si centrul Europei, unde se cultiva porumb (Suedia, 2ustria,
Cngaria#, domina fusariotoxinele (vomitoxina, zearelona, toxina 8 *#)
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
6/57
D n nordul Europei (%anemarca, 1olonia# pe primul loc se afla oc&ratoxina
2)n regiunile calde si umede din 2merica ;atina, 2sia, 2frica si anumite
zone din 2ustralia, mai raspndite sunt aflatoxinele.
Micotoxinele contamineaza produsele agricole nainte sau dupa recoltare. # si p"ul acestuia (peste F#,
temperatura (9+ si ?++-, idela n medie *9+-#, luminozitatea si compozitia
atmosferei (areobioza# n care acestia se dezvolta.
1rodusele de origine vegatala reprezinta substraturi convenabile dezvoltarii
micetilor si elaborarii micotoxinelor. , si o
temperatura de peste *++-. Bumeroase dintre produsele alimentare sau
fura0ere de origine vegetala, cum sunt faina de gru, secara sau porumb,
sroturile de ara&ide, diferite fructe s.a. pe care sau dezvoltat fungi toxigeni,
n urma prelucrarilor suferite nu mai contin dect micotoxine care au rezistatacestor procese, n timp ce fungii care leau produs au fost omorati.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
7/57
asemenea fura0e, la nivelul tubului digestive se absorb n organismul care le
a consumat numai micotoxinele, iar fungii nu trec bariera intestinala si se
elimina cu fecalele.
2ceste micotoxine a0ung pe calea circulatiei sanguine n tesuturile
organismului sau n unele produse de secretie si excretie cum este laptele si
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
8/57
urina.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
9/57
ouale si alte produse ale organismului animal, existnd un important
potential de actiune asupra sanatatii umane. -onsecintele consumului de
alimente contaminate cu micotoxine asupra sanatatii omului sunt estimate
indirect pe baza efectului observat la animale. /ngestia n timp scurt a uneicantitati mari de aflatoxine duce la aparitia intoxicatiei acute. 5rganul tinta
care sufera leziuni grave n astfel de cazuri este ficatul. 2flatoxicoza acuta se
poate manifesta prin &emoragii, insuficienta &epatica acuta si c&iar moarte.
%oza mortala difera de la animal la animal si depinde de multi factori cum ar
fi cantitatea de aflatoxina ingerata, vrsta animalului, starea de sanatate si
starea de nutritie. -onsumul unei cantitati mai mici, dar timp mai ndelungatduce la aparitia intoxicatiei cronice. Efectele si simptomele sunt n general
greu de pus n evidenta att din cauza intensitatii reduse dar mai ales din
cauza caracterului lor nespecific. 2flatoxicoza cronica trebuie suspectata
cnd n lipsa altor cauze evidente, animalele au tulburari digestive
persistente nsotite de crestere anevoioasa n greutate. -onsumul de alimente
contaminate cu micotoxine poate avea urmari severe, cum ar fi ciroza si
carcinomul &epatic o forma particulara de boala canceroasa a ficatului.
Studiile epidemiologice efectuate n /ndia si n unele tari din 2frica au aratat
o asociere ntre consumul de alimente contaminate cu aflatoxine si cresterea
incidentei cancerului de ficat. Susceptibilitatea omului la aflatoxina nu este
foarte bine cunoscuta datorita raritatii cazurilor. %ate estimative cu privire la
doza de risc pentru oameni au fost obtinute cu ocazia unor intoxicatii
colective izbucnite, una n /ndia n 3@F n cursul careia au fost afectateaproape F++ de persoane din care o treime au murit, si alta n Genia n 3@:*,
unde au fost spitalizate *+ de persoane dintre care au decedat 3*.
/nvestigatiile din aceste focare de aflatoxicoza au dus la concluzia ca ele s
au datorat ingestiei repetate a unei cantitati de :99 micrograme de
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
10/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
11/57
evaluare a laboratoarelor pentru testarea alimentelor, respectiv pentru
acreditarea acestora. Clterior, metodele de analiza au fost aliniate la
recomandarile -odex 2limentarius -ommission privind metodele de analiza
si prelevare a probelor,2;/B5RM @H* si (=25, 3@@# si /S5H/E- 3+*9 din 3@@@.
Regle!en"#ri eur$pene referi"$are la ni%elul !a&i! ad!is de
!ic$"$&ine din cereale 'i pr$duse cerealiere
RE(LEMENT)RI E*ROPENE+ Nr. 1,,1-2/ 'i Nr. 112/-20
5c&ratoxina 2
-ereale neprocesate 9 JgHIg
-ereale neprocesate, destinate direct consumului uman JgHIg
-ereale procesate pentru copii +,9 JgHIg
%eoxinivalenol
-ereale neprocesate, altele dect gru dur, ovKz Li porumb 3*9+ JgHIg
4ru dur, porumb Li ovKz neprocesate 39+ JgHIg
-ereale Li produse de mKciniL destinate direct consumului uman 9+
JgHIg
1aste fKinoase 9+ JgHIg
1ine, biscuii, snacIs 9++ JgHIg
-ereale procesate pentru copii *++ JgHIg
1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule N 9++ Jm 9+ JgHIg1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule O 9++ Jm 3*9+ JgHIg
earalenonK
-ereale neprocesate, altele porumb 3++ JgHIg
1orumb neprocesat *++ JgHIg
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
12/57
-ereale destinate direct consumului uman 9 JgHIg
1ine, biscuii, snacIs 9+ JgHIg
-ereale procesate pentru copii *+ JgHIg
1orumb neprocesat, cu excepia celui destinat procesKrii umede 9+JgHIg
1orumb destinat direct consumului uman, mKlai 3++ JgHIg
1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule N 9++ Jm *++ JgHIg
1roduse de la mKciniLul porumbului cu particule O 9++ Jm ++ JgHIg
2flatoxine
-ereale, produse cerealiere !3 * JgHIg)!3P!*P43P4* F JgHIg
1orumb dupK tratamente fizice !3 9 JgHIg)
!3P!*P43P4* 3+ JgHIg
-ereale procesate pentru copii !3 +,3 JgHIg
=umonisine
1orumb neprocesat, cu excepia celui destinat
procesKrii umede F+++ JgHIg
1orumb destinat direct consumului
uman 3+++ JgHIg
1roduse pentru mic de0un, snacIsuri
din porumb :++ JgHIg
1roduse pe bazK de porumb
pentru copii *++ JgHIgMKlai, germeni 3+++ JgHIg
1roduse de la mKciniLul porumbului
cu particule N 9++ Jm 3F++ JgHIg
1roduse de la mKciniLul porumbului
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
13/57
cu particule O 9++ Jm *+++ JgHIg
8e&nici rapide de determinare a micotoxinelor
-reLterea complexitKii analitice n industria alimentarK impune rezultate
rapide pentru fiecare contaminant individual.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
14/57
Monitorizarea coninutului de micotoxine (%5B, E2, 582# din gru Lipine cu coninut ridicat de fibre se va realiza folosind metoda imunologicaE;/S2.8estul E;/S2 se bazeazK pe reacia antigenanticorp. 2vanta0ul te&niciiderivK din caracterul extrem de selectiv al reaciei antigen anticorp ca Lidin posibilitatea de a folosi o mare varietate de 7marcatoriQ fapt ce permitesensibilizarea teoretic nelimitatK a determinKrii.
1rincipiul te&nicii E;/S2 pentru determinarea micotoxinelor'a# amestecare probK cu micotoxinKenzimK)
b# amestecare coninut cu anticorpii de fixare din godeu)c# legarea micotoxinelor de anticorpi)d# ndepKrtarea prin spKlare a materialului nelegat)
8E"B5;54/2;CM/BE xM21
8E"B5;54/2M/-R52RR2
15;/MER/ -CRE-CB52S8EREM5;E-C;2R2
8E"B5;54/2CB%E;5R
ET2BES-EB8E
ME85%2=;C5R5ME8R/-2
2B2;/2=;C5R/ME8R/-2
/MCB5%E8ERM/B2R/
!228E 1EMEM!R2BE
2B2;/2/MCB5;54/-2
E;/S2
MICOTOXINE
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
15/57
e# adKugare substrat pentru developarea culorii)f# adKugare soluie pentru stoparea reaciei.
CLASIFICAREA TEHNICILOR
CROMATOGRAFICES-au realizat numeroase variante ale metodei
cromatografce, dierind unele de altele n primul rnd prin
natura azei mobile, dar si a celei stationare. Astel se
distinge:
a. cromatografa de lichide (LC) cnd aza mobila este un
lichid in
cadrul careia se distinge:
-cromatografa de lichide pe coloana deschisa;
-cromatografa de lichide pe coloana inchisa;
b. cromatografa de gae (GC) cnd aza mobila este un
gaz;
c. cromatografa c! "!ide #!$racritice la care aza
mobila este un
lichid aat peste temperatura critica.
A. !n cadrul cromatografei i% lichide "LC) se disting mai
multe variante, n unctie de mecanismele de separare:
#. Cromatografa de ad#or&tie utilizata pentru separarea
substantelor organice cu molecule de dimensiuni mici si
medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina, olosindu-se, caaze mobile, dierite amestecuri de solventi organici.
$. Cromatografa io%ica "de schimb ionic%, care se petrece
pe o aza
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
16/57
stationara solida, poroasa, ormata din materiale specifce -
schimbatorii de ioni
- substante cu o retea solida anata, de natura organica sau
anorganica. &ele mai raspndite sunt rasinile schimbatoarede ioni.
'. Cromatografa de e'cl!i!%e #terica se desasoara pe
aze
stationare poroase dar cu porozitatea selectionata astel
nct sa corespunda dimensiunilor moleculelor supuse
separarii. ( parte dintre molecule intra prin pori, iar altelesunt e)cluse deplasndu-se practic neretinute odata cu aza
mobila. *ehnica se mai ntlneste si sub denumirea de
fltrare prin geluri sau permeatie prin geluri n unctie de
natura apoasa sau organica a azei mobile.
+. Cromatografa lichid-lichid (LLC%, n care aza
stationara este o
aza lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un
suport solid, ntr-o coloana. Aici suportul solid este inert ata
de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai
raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografa de
lichide.
. Cromatografa $e coloa%a de#chi#a #a!
cromatografa $la%ara
(C) aza mobila circula printr-un material poros dispus ntr-
un plan si ormnd un strat relativ subtire, dar de compozitie
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
17/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
18/57
stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv
1sitele moleculare2 "niste silicati naturali sau sintetici%
respective granulele de carbon poros. 3etoda este e)trem
de importanta pentru separarea gazelor permanente "&(,&($, ($, 4$, gaze nobile etc.%
CROMATOGRAFIA .E LICHI.E .E INALTAERFORMANTA (HLC)
Ge%eralitati&romatografa de lichide de nalta perormanta "567&%
acopera azi, n proportie apro)imativ 89, analiza
substantelor moleculare: organice, organometalice si
anorganice inclusiv compusii oarte polari sau labili termic
precum si compusii cu masa moleculara ridicata "naturali
sau sintetici%. e aceea, mpreuna cu cromatografa de gazeconstituie un punct de spriin important n analizele chimice
moderne. esi efcacitatea coloanelor nu o egaleaza nca pe
cea din /&, prin aptul ca se poate modifca, pe lnga aza
stationara, si aza mobila, cromatografa de lichide "7&% ace
posibile separari si analize uneori
imposibil de realizat prin alte tehnici. &uplaul cu
spectrometria de masa a transormat, n ultimul timp,
aceasta metoda n principalul miloc de analiza a compusilor
moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
19/57
pe care se spriina chimia sintetica actuala si pe care s-a
dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna.
3etoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi,
cromatografa pe coloana clasica, care servea n primul rnd
la izolarea preparativa a compusilor naturali. 6rin
introducerea pompelor si n consecinta, lucrndu-se la
presiuni tot mai ridicate "$atm%, dezvoltarea unor aze
stationare perormante, de dimensiuni tot mai mici "recent
constituite din granule de aze stationare serice, cu
diametre $-
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
20/57
automat, prin intermediul unui ventil cu b? pass. !n coloana
aata ntr-o etuva termostat, are loc separarea propriu-zisa.
@uentul coloanei intra ntr-un detector de unde
componentul, daca este separat complet, poate f colectat siizolat, cu autorul unui colector de ractiuni. Semnalul este
nregistrat fe cu un nregistrator, fe direct n memoria unui
calculator. !n esenta, un cromatogra analitic 567& are
structura din fg. unde nu s-a mai prezentat colectorul de
ractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se
poate observa asemanarea cu /& singura deosebire maoraconstituind-o sursa de eluent pompa.
Sol/e%t 0 om$a 0 I%1ector 0 Coloa%a 0 .etector 0
2%regi#trator
Schema &loc a !%!i cromatogra, HLC
&romatografa de lichide de inalta perormanta este olosita
pentru analiza substantelor moleculare: organice, organo-
metalice si anorganice inclusive compusii oarte polari sau
labili termic precum si compusii cu masa moleculara ridicata.
Aceasta metoda a acut posibile separari si analize uneori
imposibil de realizat prin alte metode. Bn cromatografa de
lichide de inalta perormanta detectorii sunt situati la iesireaeluentului din coloana cromatografca. Sistemul de detectie
trebuie:
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
21/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
22/57
- detectorii de uorescenta sunt olositi la identifcarea
substntelor care prezinta uorescenta sau pot f tranormati
in derivati ce prezinta aceasta proprietate;
- diodele Arra? sunt olosite in multe cazuri de identifcare.Cn alt criteriu de comparatie intre detectori este cel al
valorilor caracteristice ale domeniului liniar dinamic si al
sensitivitatii.
0iecare detector prezinta avantae si dezavantae iar pentru
alegerea celui mai potrivit detector necesar in identifcarea
subtantelor dintr-un amestec se vor tine cont de ele.
Stabilirea metodelor de determinare a concentra tiei de
micotoxine.
ri%ci$iile de /alidare a metodei HLC
AZE IN HPLC
Prepararea pr$ei
In3ec"area in c$l$ana
Eluarea cu fa4a !$ila
5e"ec"area c$!p$nen"il$r din pr$a
Iden"ificare si !asurare
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
23/57
A) Tato%ari
3) 4 $re$arari #ol!tii #ta%dard
- apa F substanta "concentratii medii si mici%
- parametrii 567& "conc, debit, detector, inectare%- coloana si aza mobila
- gradient de concentratie "cand e cazul%
5) 4 #ta&ilire $rofl de acti!%e al #!ta%tei
- substante izomere prezente in sistem concomitent
- substante rezultate prin degradare
- etaloane "izomeri, substante de degradare%
6) - co%cl!ii
- stabilire lungime de unda pentru analiza
- specifcitate ara intererente la G* "Getention *ime%
) St!dii i%termediare
- stabilitate 1on line2 " # $ ' #$ $+ ore% la dierente de
temperatura cuprinse intre &
- liniaritate solutii standard 8 conc. " ' conc. la limita minima%
C) 7alidare
3) S$ecifcitate
- teste in dieriti solventi "polari si nepolari cel putin %
- lipsa intererentelor la G*
5) artea E#e%tiala preparari solutiia% liniaritate din aza mobila se prepara 8 conc. "' la minim%
-# &$ &'-# &+-# & &> &H-#
&8
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
24/57
-$ &'-$ &+-$ &H-$
-' &'-' &+-' &H-'
-+ &'-+ &+-+ &H-+
- &'- &+- &H- L.. 8CA 8C 8CC
8C. dilutie +) a solutiei &8 se repeta in fecare zi
b% e)actitatea "acuratetea accurac?% E9
- la concentratii mici E9 : 5;9
- la concentratii mari E9 : 3
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
25/57
A Tato% a ri
a) se prepara solutii standard n mediu apos sau solvent
preselectat:- prepararea solutiilor de concentratii medii si mici utiliznd
substanta active si apa purifcata sau solvent pur;
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului 567&;
- se alege coloana cromatografca si aza mobila de lucru;
- eventual se stabileste gradientul de concentratie respectiv
etapele intermediare de spalare a coloanei cromatografce.
&) se prepara Jblanc2-uri de solutie n vederea eliminariiposibilelor intererente cu substantele active luate n lucru:
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului 567&;
- se eectueaza studii pe coloana cromatografca si aza mobila
aleasa;
- se eectueaza studii pentru alegerea gradientului de
concentratie si a
etapelor de spalare a sistemului.
c)se dopeaza matricea cu substante active la concentratii medii
si mici:
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului 567& astel nct
semnalele
de raspuns ale substantelor active respectiv ale componentelor
de degradare sa nu se suprapuna, pentru posibilitatea evaluarii
cantitative a substantelor active dopate;
- se eectueaza studii pe coloana cromatografca si aza mobila
aleasa;
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
26/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
27/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
28/57
dopate cu substante active, derivati sau alte substante etalon
"ST.% la 8 nivele de concentratie dierite "dintre care trei la valori
mici% c# c8. 6entru solutiile de concentratii c#, c', c+ si cH se
repeta determinarile de cte + ori pentru a avea date multiple laconcentratia minima-c# , medie-c+ si mare-cH, respectiv ale
controlului de calitate K&A-c', K&E-c+ si K&&-cH, si nu n ultimul
rnd se prepara o solutie K& prin dilutia de + ori a celei mai
concentrate valori c8 pentru care se eectueaza doua determinari.
6robele K& trebuie eectuate zilnic n solutii standard.
5 E'actitatea (ac!ratetea 4Accuracy) E9*se determina prin
calcule sitrebuie sa respecte conditia urmatoare:
- @9 L $9 pentru valorile celei mai mici concentratii;
- @9 L #9 pentru toate celelalte concentratii.
'. &oefcientul de variatie "precizia-repetabilitatea Precision-
Repetability% &D9 se determina prin calcule si trebuie sa respecte
urmatoarele conditii:
- &D9 L $9 pentru valorile celei mai mici concentratii;
- &D9 L #9 pentru toate celelalte concentratii.
+. Gandamentul de e)tractie "Recovery, RE% M9 se determina la
solutiile
cu concentratiile c#, c', c+, si cH din solutiile standard.
C Re$rod!cti&ilitatea (Intermediate Precision) se
determina n
urmatoarele + zile consecutive, repetnd probele de la liniaritate
cu cele 8
concentratii c# c8 alese mai sus pentru care se calculeaza
e)actitatea "acuratetea%@9 si coefcientul de variatie "precizia%
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
29/57
&D9, respectnd criteriile precizate la paragraele
corespunzatoare.
. Sta&ilitatea (Stability)care se determina tinnd seama de
urmatoarele:#. stabilitatea Jon-line2 "intermediara% n autosamplerul
sistemului 567& pentru o durata care e)cede cu cel putin '9
timpul ma)im pentru derularea unei secvente complete.
$. stabilitatea la nghet-dezghet Jreeze-thaN2 pentru care se
eectueaza ' cicluri de temperatura.
'. stabilitatea de lunga durata pentru care se prepara solutii care
se vor stoca si analiza dupa #, $, ', + ... saptamni.E 2%tocmirea ra$ort!l!i /alidarii care trebuie sa contina
valorile nregistrate, modul de calcul al dieritelor caracteristici si
parametri, reprezentarile grafce si evaluarile si interpretarile
rezultatelor. 6entru ustifcarea concluziilor fnale ale raportului
trebuiesc ane)ate cromatogramele nregistrate cu numele
analistului care a eectuat validarea si a celor care au verifcat si
aprobat metoda.
efnirea s i determinarea parametrilor de
perorman ta ai metodei de studiu cu 567&
efnit ie: &aracteristicile si parametri de perormanta sunt
proprietati de baza ale metodelor analitice cu autorul carora se
demonstreaza ca metoda dezvoltata corespunde scopului propus.
&aracteristici de perormanta:
A S$ecifcitatea (S$ecifcit?)
Bnvestigatiile de selectivitate se eectueaza mpreuna cu cele
pentru curbele de calibrare care dau liniaritatea. 3edia naltimii
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
30/57
picurilor masurate pentru probele standard de calibrare la cea
mai mica concentratie de cuantifcare "7oNer 7imit o
Kuantifcation, LL8% se calculeaza si se compara cu posibilele
picuri endogene din Jblanc2-urile de matrici nedopate. &onditiade baza este ca n cromatogramele Jblanc2-urilor de matrici
nedopate sa nu e)iste picuri semnifcative la timpii de retentie ai
ma)imelor e)aminate. Dalorile sunt acceptabile doar daca
naltimea picului compusului endogen este mai mica dect $9
din naltimea picului substantei studiate la cea mai mica
concentratie "LL8%.
C!r&a de cali&rare (Li%earit?)6entru fecare dintre cele cinci nivele de concentratie alese se
prepara cte cinci probe "ST.% care se analizeaza ntr-o singura
serie. ierenta procentuala calculata ata de valoarea nominala
a concentratiei preparate se determina pentru fecare standard
ST. . &onditia de baza pentru ca modelul sa fe acceptat trebuie
sa respecte o valoare de cel putin ,== pentru coefcientul de
regresie "R5%, iar coefcientul de variatie "C79% trebuie sa fe
cuprins ntr-un domeniu de O$9 pentru cea mai mica
concentratie respectiv O#9 pentru toate celelalte concentratii
testate.
C reciia si Ac!ratetea (reci#io% a%d Acc!rac?)
Se analizeaza probele de control de calitate "Quality Control,
QC% ntr-o
singura serie de cte probe identice pentru fecare nivel de
concentratie ales si se compara cu valorile teoretice obtinute
pentru curba de calibrare. "determinari zilnice, intra-day assay%.
e asemenea, n fecare din cele cinci zile se mai eectueaza cte
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
31/57
o singura proba de control de calitate "8C% la fecare dintre
concentratiile alese si se compara cu valorile teoretice obtinute
pentru curba de calibrare "determinari n zile succesive, between-
days assay%. Se calculeaza concentratiile medii, deviatiilestandard relative "relative standard deviation, S.%, coefcientii de
variatie "coefcient o variation, C79% si dierentele valorilor
medii ata de cele nominale "E9% la toate nivele de concentratie.
&onditia de baza pentru acceptarea preciziei este ca deviatia
standard relative "S.% a probelor de control de calitate "8C% sa
nu depaseasca O#9 att n determinarile zilnice ct si n
determinarile n zile succesive. Bar conditia principala pentruacceptarea acuratetei este ca dierenta ntre media valorilor
masurate si a celor nominale sa nu depasesca O#9 nici n
determinarile zilnice, nici n determinarile n zile succesive.
D. Limita minima de cuantifcare (LLQ)
Se analizeaza probe identice la concentratia minima de
cuantifcare "LL8%, si se compara ata de valoarea teoretica din
curba de calibrare pentru determinarile n zile succesive. 7a
aceste concentratii se calculeaza dierenta dintre media valorilor
masurate si cele nominale "E9%, deviatia standard relativa "S.%
si coefcientul de variatie "C79%.
&onditia de baza pentru acceptarea preciziei este ca deviatia
standard relative "S.% a concentratiilor din probele masurate
"LL8% sa nu depaseasca O$9 nici n determinarile zilnice, nici n
determinarile n zile succesive. Bar conditia principala pentru
acceptarea acuratetei este ca dierenta ntre media valorilor
masurate ata de cele nominale sa nu depaseasca $9 nici n
determinarile zilnice nici n cele din zile succesive.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
32/57
E ro&ele de dil!tie (Sam$le .il!tio%)
!n fecare din cele zile de determinari se prepara o proba prin
diluarea de + ori cu Jblanc2 de matrice nedopata, a celei mai
concentrate alese pentru curba de calibrare c8, iar concentratiaprobelor diluate se determina prin comparatie cu valorile
determinarilor zilnice. &onditia de baza pentru ca rezultatul sa fe
acceptat este ca valoare dierentei medii masurate ata de cea
nominala sa nu depaseasca O#9.
F Sta&ilitatea (Sta&ilit?)
0# Stabilitatea n autosampler "n!Line Stability, LS%
Se prepara cte 8 probe pentru doua concentratii dierite, aleseastel nct sa fe una aproape minima iar cealalta aproape
ma)ima n comparatie cu valorile concentratiilor alese pentru
curbele de calibrare. *oate probele se pastreaza la temperatura
din autosampler "cea aleasa pentru seria de determinari% si se
analizeaza dupa $, ', + ...#, ...$+, ...+8 ore, calculndu-se
valorile concentratiilor ata de curba de calibrare din prima zi.
&onditia de baza pentru acceptarea stabilitatii n autosampler
este ca nici una dintre valorile determinate dupa perioadele de
timp descrise mai sus, pentru toate probele de la ambele
concentratii alese sa nu depaseasca un domeniu de O#9 ata
de valoarea de reerinta.
0$ Stabilitaea de lunga durata "Lon"!#erm Stability, L#S%
Se prepara cte #> "sau un alt multiplu de +)% probe pentru cele
doua concentratii alese la stabilitatea n autosampler "descrisa
mai sus%. !n prima zi se analizeaza cte + perechi de probe pentru
ambele concentratii si se compara cu valorile obtinute pentru
curba de calibrare din ziua respectiva. Gestul probelor preparate
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
33/57
se pastreaza n aceleasi conditii n care se pastreaza si probele
matricilor prelevate si se analizeaza cromatografc dupa $, '
respectiv + "sau mai multe% saptamni. e fecare data se
masoara cte + probe din fecare concentratie si se compara cuvalorile obtinute pentru probele proaspat preparate "tot cte +% si
curbele de calibrare corespunzatoare zilei respective.
&oncentratiile se determina ata de curbele de calibrare din ziua
respectiva, att pentru probele depozitate ct si pentru cele
proaspete, apoi se compara valorile medii pentru ambele
categorii "resh si old%. &onditia ce baza pentru a considera
analitul stabil este ca dierenta dintre valorile medii din probelenghetate si pastrate ata de mediile celor proaspete sa nu
depaseasca O#9.
0' Stabilitatea la nghet-dezghet "$ree%e!#&a' Stability, $#S%
Se prepara cte + probe pentru cele doua concentratii alese "ca
mai sus la
stabilitatea n autosampler%, care vor f supuse unor cicluri
repetate de ' ori de nghet-dezghet n ' zile consecutive. upa
cel de-al treilea ciclu se analizeaza probele n comparatie cu
probe proaspat preparate n ziua respectiva "cu aceleasi
concentratii% si se determina valorile concentratiilor ata de curba
de calibrare din aceeasi zi. &onditia de baza pentru ca proba sa
fe considerata nealterata de procesele de nghet-dezghet este ca
dierenta dintre valorile medii ale probelor "FTS% ata de cele
proaspete sa fe cuprinsa ntr-un domeniu de O#9.
G Ra%dame%t!l de rec!$erare (Retrie/i%g EBcie%c?* RE)
Se prepara + probe dupa cum urmeaza, una pentru limita minima
de cuantifcare "77K%, iar celelalte trei pentru valorile
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
34/57
concentratiilor de control de calitate "K&%. Aceste probe se
prepara ntr-o zi a perioadei validare, astel nct se analizeaza si
se compara cu mediile valorilor a cte probe din cea mai mica
concentratie "77K% respectiv control de calitate "K&%. @fcienta secalculeaza prin raportarea mediei naltimii picurilor pentru valorile
preparate la concentratiile "77K, K&% ata de naltimile picurilor
probelor de reerinta preparate n supernatant.
.etermi%area ochrato'i%ei A di% ca,ea &oa&e$ri% metoda HLCRe4u!a"'
Scop.Talidarea metodei de determinare a oc&ratoxinei 2 prin cromatografie
de lic&ide de naltK performanK ("1;-# Li aplicarea acesteia pe probe decafea boabe prK0itK.
Material i metod.1robele de cafea, ac&iziioante din reeaua comercialK a
oraLului /aLi, au fost supuse extraciei cu un amestec -"5"' Ba"-5 (n
raport de :+'*+#. Extractele au fost purificate prin extracie n fazK solidK
(-3:# pentru reinerea oc&ratoxinei 2. Micotoxina a fost eluatK cu
cloroform) faza organicK a fost evaporatK la sec Li apoi, reziduul reluat cu +,?
ml fazK mobilK. Cn volum de *+ Jl a fost supus analizei "1;-. 2naliza sa
realizat pe un cromatograf de lic&ide tip "1 3+@+ Series //, ec&ipat cu o
coloanK cromatograficK tip Stable !ond S! -3: (39+ x F,? mm) 9 Jm#,
folosind ca fazK mobilK un amestec de acetonitril ' apK ' acid acetic (n raport
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
35/57
de @@ ' @@ ' *#. %etecia oc&ratoxinei 2 sa realizat n fluorescenK (UexV**:
nm Li UemVF* nm#.
Rezultate.Metoda "1;- a fost validatK.
din numKrul total de probe#, oc&ratoxina 2 a fost prezentK sub limita maximKadmisK de legislaia n vigoare (9 JgHIg cafea boabe prK0itK#, ntro singurK
probK concentraia oc&ratoxinei 2 a fost peste limita maximK admisK 2 iar n
F de probe (:9> din numKrul total probe# oc&ratoxina 2 nu a fost
identificatK prin metoda aplicatK.
Discuii.2ceastK lucrare contribuie la evaluarea prezenei oc&ratoxinei 2 n
produsele alimentare (cafea boabe# comercializate n Romnia Li atrageatenia asupra riscului consumului de alimente contaminate cu micotoxine.
In"r$ducere5c&ratoxina 2 (=igura nr. 3# este un metabolit toxic produs de specii din
genulAspergillus n zonele tropicale Li subtropicale Li de specii din genul
Penicillium n zonele temperate (3#. 5c&ratoxina 2 a fost izolatK pentru
prima datK din culturi de Aspergillus ochraceus de Tan der MerWe Li colab.n anul 3@?9 (*# n timp ce testau capacitatea toxigenK a unor tulpini de
micromicei izolate din diferite boabe de cereale Li legume.
=igura nr. 3 5c&ratoxina 2 structura c&imicK
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
36/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
37/57
E&"rac"ia $c6ra"$&inei A si purificarea e&"rac"ului
1robele de analizat (cafea boabe pra0ite vrac# au fost supuse extractiei in
vederea separarii oc&ratoxinei 2.
2stfel, o cantitate de *+ grame proba maruntita se agita *+ minute cu unvolum de *+ ml amestec -"5" 'Ba"-5>(:+ '*+# dupa care se filtreaza
prin &artie de filtru cantitativa (F, 9#. =iltratul se trece prin coloana S1E
preconditionata prin spalare succesiva cu Fml metanol, respectiv cu F ml apa
purificata. 5c&ratoxina 2 este eluata de pe coloana cu un volum de ml
cloroform, cu o viteza de * mlHmin. =aza organica se evapora la sec ) reziduu
obtinut se reia cu un volum de +,? ml faza mobila si se supune analizei"1;- prin in0ectarea unui volum de *+ Jl in conditiile mentionate.
/n paralel, sau lucrat probe imbogatite cu cantitati cunoscute de
oc&ratoxina 2 pentru stabilirea randamentului de extractie.
2naliza "1;- sa realizat astfel ) un volum de *+ Jl proba (obtinuta prin
dizolvarea reziduului obtinut in urma prelucrarii probei intrun volum de +,?
ml faza mobila# a fost supus analizei pe un cromatograf de lic&ide tip "1
3+@+ Series //, ec&ipat cu o coloana cromatografica tip Stable !ond S!
-3:(39+xF,?mm )9Jm #, folosind o faza mobila un amestec de
acetonitril 'apa 'acid acetic(in raport de @@ '@@ '*#. %etectia oc&ratoxinei 2 s
a realizat in fluorescenta (UexV**:nm si UemVF*nm#
Re4ul"a"e si discu"ii
7pecifici"a"e 1entru determinarea specificitatii metodei au fost analizate probe
continand oc&ratoxina 2 si o proba continand faza mobile utilizata ca solvent
al probelor in0ectate. ;a timpul de retentie al oc&ratoxinei 2 nu sa obtinut
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
38/57
nici un semnal in cromatograma corespunzatoare fazei mobile, rezulta deci
faptul ca nu exista interferenti(:,@,3+#
Iden"ificarea picuril$r /dentificarea picului corespunzator oc&ratoxinei 2 se realizeaza in functie
de timpul de retentie. /n conditiile mentionate, timpul de retentie pentru
oc&ratoxina 2 este de @,9 min.
ig. nr.28Cr$!a"$gra!a pen"ru s$lu"ia s"andard de $c6ra"$&ina A
9alidarea !e"$dei de de"er!inare a $c6ra"$&inei A prin cr$!a"$grafie
de lic6ide de inal"a perf$r!an"a:HPLC;
1entru determinarea cantitativa a oc&ratoxinei 2, metoda de analiza prin"1;- prezentata a fost avalidata, urmarinduse urmatorii parametrii )
stabilitatea in timp asolutiei, linearitatea, limita de detectie si limita de
cuantificare, precizia sistemului, precizia metodei, exactitatea metodei.
7"aili"a"eas$lu"iei
1entru a determina stabilitatea solutiei de oc&ratoxina 2 a fost analizata oproba cu o concentratie de 3@,9ngHml oc&ratoxina 2 dupa ce a fost mentinuta
la temperatura camerei *, si 3+ zile. Rezultatele experimentale sunt
precizate in tabelul 3.
7TA
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
39/57
Nr. Ziua Arie pic 5a"e s"a"is"ice3 + ,: 2rie medieV*,F9
S%V 3,@RS% (>#V F,3*+
* * +,@ ,F 3+ 3,:
TA#
Lineari"a"ea=li!i"a de de"ec"ie si li!i"a de cuan"ificare
1entru studiul linearitatii au fost analizate sase serii de solutii, pentru
fiecare cromatograma a fost calculata aria picului corespunzator
oc&ratoxinei 2, iar valoarea ariei medie a fost reprezentata grafic functie deconcentratie. 1rin analiza statistica au fost calculate ecuatia dreptei de
regresie, coeficientul de corectie (r# si eroarea standard de regresie. =olosind
panta dreptei de regresie si eroarea standard a acestei drepte sau calculat
valorile limitei de detectie si a limitei de cuantificare.
/n tabelul nr * sunt prezentate ariile picurilor corespunzatoare oc&rtoxinei,
iar ia figura nr este reprezentata dreapta de calibrare a oc&ratoxinei 2.
Ariile picuril$r $c6ra"$&inei A $"inu"e in s"udiul lineari"a"ii !e"$deiOc6ra"$&ina A
:ng-!l;Arie pic Arie
!edieI II III I9 9 9I@,?9?*9 *+,+++ 3,3 39,@ 3,: 3:,3 3,: 3,3*3@,93*9 ,:++ *?, +,@ *9,F *?,* , *@,:
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
40/57
@,+?*9+ 9?,3++ 9,F F9,3 F,@ F*,? F:, F:,@:,3*9++ @9,+++ :?, @, :@, :9,: :+,? ::,F939?,*9++ 3,+ 3*,: 3?9,: 3?9, 3?F,9 39:, 3?,F+3*,9+++ ,:+ *:,9 3,@ +*,9 +?,: *3,9 *3,9+?*9,++++ ?*:,F+ ?3F,9+ ?3@,+ ?+*,3+ 99@,@+ ?33,9+ ?+?,+*
@,9+++ :@:,F @+F,* :@:,F @+9,F @+@, @3F,: @+9,*33*9+,+++ 3**,3 33@F,: 33??,9 33@*,? 3+F3,F 3*+*,* 333,?+TA
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
41/57
;ZV3+xSEV3+x3,**@F3FF??9V3*,3ngHml (*#
panta 3,+9+:+@9*:3
Preci4ie si e&ac"i"a"ea 1rima etapa in determinarea preciziei o reprezinta studiul sistemului.
2stfel, o solutie de concentratie de *+ngHml a fost analizata de cinci ori.
2riile picurile corespunzatoare oc&ratoxinei 2 pentru cele cinci determinari
sunt prezentate in tabelul nr .
Preci4ia sis"e!ului la de"er!inarea $c6ra"$&inei ANr. Arie pic 5a"e s"a"is"ice3 *?, 2rie medie V *?,3?
S% V *, 9FFRS% (># V :,?@3*
* +,F +,F *?,*9 3,:
TA# a fost calculata ca
fiind :,?@3*>. 1entru concentratii in proba de ordinul ng, valoarea este
buna, sistemul este precis.
1recizia si exactitatea metodei au fost determinate prin calcularea valorii
medii a determinari la trei concentratii deferite in 0urul valorii de interes
@,+?*9ngHml,3@,93*9ngHml si respectiv, @,?9?*9ngHml(concentratii
urmarita P9+>#.
/ntregul experiment a fost realizat in zile diferite, de alt analist, cu scopulde a obtine informatii despre robustetea metodei.
Ctilizand ecuatia curbei de calibrare si ariile picurilor au fost calculate
concentratiile pentru fiecare proba. 2 fost determinata regasirea ca procent
din valoarea concentratiei teoretice, regasirea medie si precizia metodei
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
42/57
exprimata prin deviatia stsndard relativa din regasirea calculata. 1entru
aceste doua grupuri de date (/ si //#, valorile obtinute sunt prezentate in
tabelul nr F
Preci4ia si e&ac"i"a"ea !e"$deiNr.
C$ncen"ra"iaTe$re"ica:ng-!l;
Arie pic C$ncen"ra"iacalcula"a:ng-!l;
Regasire:>;
/ // / // / //3
@,?9?*9*+,+ 3,3 33,@ @,+@ 3*+, @,3
* 3:,3 3,: 3+,+* ?,+* 3+*,? ?3,3 3,: 39,@ @,F ,@: @@, :3,F
3@,93*9,: *?, *F,? 3:,+* 3*?,3 @*,
9 *?,* *9,F 3,9? 3?,:3 :@,@ :?,3? , +,@ *F,3? *3,@ 3*, 33*,
@,+?*9
9?,3 9,F F9, F*,:? 33?,3 3+@,
: F*,? F,@ *,:3 ,F :F,+ @?,?@ F:, F9,3 :,F@ 9,3F @:,9 @+,+Media VMinim V
Maxim V%eviatia standard(S%# V
%eviatia standard relativa(RS%># V
@@,*>?3,?>3*?,3>3?,*+?
3?,@?*@> TA a deviatiei standard relative ceea ce demonstreaza
precizia metodei 'regasirea medie fiind de @@,*>(pe intervalul ?3,?3*?,3>#
ceea ce demonstreaza exactitatea metodei.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
43/57
Taloarea medie (3: valori si o precizie de @9>,valoarea t din Student fiind
de *,33#, intervalul de incredere pentru regasire este de :,*@339,++>.
Aplica"ie la de"er!inarea $c6ra"$&inei A din pr$e de cafea $aepra3i"a.
Metoda de analiza validata a oc&ratoxinei 2 prin "1;- a fost aplicata la
determinare oc&ratoxinei 2 din probe de cafea boabe.
1robele au fost procurate den reteaua comerciala a orasului /asi si anume
din unitati ce comercializeaza produse vrac. Sau analizat F+ de probe decafea boabe pra0ita, de diferite sorturi(-olumbia3+ probe, [acobs 3+ probe,
/ndonezia : probe, !raziliaF probe, Robusta* probe, /ndia3 proba, cafea
decofeinizata 9 probe#.
/n urma analizei prin "1;-, cromatogramele obtinute au fost prelucrate,
stabilinduse aria picurilor corespunzatoare oc&ratoxinei 2 si, folosind
ecuatia dreptei de regresie, sa calculat continutul in ic&ratoxina 2 pentru
probele de cafea(valori prezentate in tabelul nr 9#
C$n"inu"ul in $c6ra"$&ina A Nr. cr". Nr. pr$a 5enu!ire
pr$aOc6ra"$&ina A
:@g-g pr$a cafea$ae;
3 -afea /ndonezia +,* F -afea /ndonezia +,: 9 -afea /ndonezia 3,+?
F ? -afea /ndonezia +,999 3+ -afea -olumbia @,F? F+ -afea /ndia ,9
TA
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
44/57
%in analiza datelor obtinute in urma determinarii oc&ratoxinei 2 din cele F+
de probe de cafea boabe pra0ita, sa constatat ca intro singura proba (*,9>
din numarul total de probe# oc&ratoxina 2 este prezenta intro cantitae mai
mare decat limita maxima admisa de legislatia in vigoare (9JgHIg cafeaboabe pra0ita#(33# ' in 9 probe (*,9> din numarul total de probe# oc&ratoxina
2 se gaseste in concentratii sub limita maxima admisa, iar intrun numar de
F probe (:9> din numarul total de probe# oc&ratoxina 2 nu a fost
identificata prin metoda aplicata.
C$nclu4ii Metoda corespunde parametrilor de validare si a fost aplicata cu bune
rezultate la determinarea oc&ratoxinei 2 din probe de cafea boabe pra0ita.
2ceasta lucrare contribuie la evaluarea prezentei oc&ratoxinei 2 in
produsele alimentare ,cafea boabe vrac# comercializate in Romania.
2vand in vedere consumul crescut de cafea in randul populatiei adulte este
necesara adoptarea unor masuri in vederea prote0arii sanatatii
consumatorului, o masura importanta fiind evitarea comercializatii probelor
cu un nivel ridicat de contaminare cu oc&ratoxina 2.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
45/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
46/57
INCI5ENA DI TRAN7ER*L 5EOXINI9ALENOL*L*I
5IN *RAE FN 7ER LA O9INE
INTRO5*CERE
-ontaminarea cerealelor, cafelei, condimentelor, ara&idelor Li a produselor
derivate din acestea cu fusariotoxine a fost descrisK pe larg n literatura de
specialitate, datoritK implicaiilor acestora asupra sKnKtKii animale Li umane.
5mul este expus acestor riscuri att prin consumul de produse vegetale
contaminate, ct Li prin consumul unor produse provenite de la animale care
au consumat &ranK contaminatK. %eoarece acest risc alimentar esteconsiderat o problema de sKnKtate publicK, se acordK o importanK din ce n
ce mai mareproblematicii cu privire la cKile de metabolizare a micotoxinelor
n organismul animal Li cel uman. %eoxinivalenolul este fusariotoxina cu cea
mai mare rKspndire n cereale Li n produsele derivate din acestea. 1rin
mecanisme ca inducerea apoptozei la celulele &ematopoetice Li imunitare,
alterarea imunoglobulinelor Li prin impactulasupra sintezei proteice,deoxinivalenolul are efect &ematotoxic, imunomodulator sau de inducere a
unei toxicitKi cutanate. ;a rumegatoare, deLi efectele
sunt mai puin toxice, studiile au asociat deoxinivalenolul cu reducerea
consumului de &ranK (8 r e & o l m, 3@:9# sau cu pierderea produciei de
lapte (A & i t l o W, 3@@3#. Rezultate Ltiinifice recente au demonstrat cK
administrarea deoxinivalenolului, la oaie, produce modificKri ale
parametrilor sangvini Li ale activitKii enzimelor &epatice (! u s u r i c u Li
a m f i e s c u, *++#. Mecanismele de transfer al fusariotoxinelor n
organismul animal Li uman rKmn nsK ncK neclare. " e d m a n (3@@#
considerK cK ratele de absorbie Li metabolizare diferite sunt datorate
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
47/57
sensibilitKii diferite a animalelor. 2li specialiLti (M e I 6, *++) - a v r e t,
*++?# au considerat cK fusariotoxinele sunt rapid absorbite n intestinul
subire Li se eliminK n primele *F de ore de la ingestie, urmatK de o excreie
n cantitKi mici. 8otuLi, n produsele animaliere se gKsesc urme alefusariotoxinelor Li a derivatelor lor. %e aici apare nevoia unor studii avansate
privind mecanismele implicate n metabolismul micotoxinelor Li a
neutralizKrii activitKii lor nainte de a evalua riscul asupra sKnKtKii omului.
%eoarece cantitatea de deoxinivalenol prezentK n sngele Li esuturile de
origine animalK n urma intoxicaiei cu fusariotoxine este foarte micK, de
ordinal ppm, se impune folosirea unor metode de analizK adecvatK, cu limitede detecie n acest interval. %eLi pentru analiza deoxinivalenolului se
folosesc n general metode gaz cromatografice, Li metoda cromatografiei de
lic&ide de naltK performanK ("1;-# oferK performane analitice similare,
cu condiia unei purificKri riguroase a probei. 5biectivul acestui studiu a fost
acela de a determina incidena contaminKrii cu deoxinivalenol a fura0elor
administrate animalelor din loturile experimentale ale laboratorului Li
determinarea gradului de transmitere a acestuia n snge la ovine n
condiiile unei intoxicaii acute sau cronice.
MATERIAL*L DI METO5A 5E CERCETARE
Me"$de de anali4#
Experienele sau desfKLurat la /.-.%.-.5.-. 1alas-onstana, n perioada
*++*++:, n baza unui proiect -EE, finanat de la buget iar instituiaconducKtoare, care a Li asigurat fura0ul contaminat, a fost /.B.-.%.2.
=undulea. =ura0ul a fost contaminat artificial prin in0ectarea fnului de
lucernK sub formK de baloi nfoliai cu filtratul de culturK al cipercii
Fusarium medicaginis (un litru de filtratH balot de *+ Ig#, iar fura0ul de
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
48/57
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
49/57
folosii pentru extracie Li ca fazK mobilK (apa distilatK, metanol, acetonitril#
au puritate grad "1;-. Enzima folositK n procesul de extracie a
deoxinivalenolului din ser este glucuronidaza arilsulfataza extrasK din
)eli* pomatia. 1entru determinarea micotoxinei din fura0e Li ser prin te&nicaE;/S2 sau
folosit truse %5B R/%2S-REEB.
Me"$da HPLC pen"ru de"er!inarea de$&ini%alen$lului din c$ncen"ra"ul
de cereale
E&"racGia micotoxinei sa efectuat prin omogenizarea a *9 g amesteccontaminat mKcinat n *++ ml apK distilatK Li agitare timp de + min. la
temperature camerei. /mediat dupK terminarea agitKrii, cel puin *+ ml din
extract sa filtrate prin &rtie de filtru A&atman nr. 33. 1entru purificarea
probelor sau folosit coloane de imunoafinitate %5B1RE1. Sa utilizat
procesul de 7bacIflus&ingQ (inversarea fluxului eluanilor pentru completa
denaturare a anticorpilor# de ori Li apoi sa trecut aer prin coloanK. 1roba
purificatK, recuperatK n metanol, a fost evaporatK la sec sub un current de
azot. Clterior aceasta a fost reluatK n 3,+ ml fazK mobilK Li amestecatK
viguros timp de + sec. folosind un vortex. 2ceastK etapK are rolul att de a
concentra proba, innd cont de cantitKile mici de analit, ct Li pentru a
obine rezultate reproductibile, prin reluarea ntrun volum fix de fazK
mobilK. %in probK sa in0ectat n sistemul "1;- un volum de 3++l.
C$ndiGii cr$!a"$grafice=aza mobilK a fost constituitK dintrun amestec apK ' metanol ' acetonitril (@F
' ' vHvHv#) eluia sa realizat timp de 39 minute la un debit de 3,+ mlHmin.
la temperatura coloanei de +o-.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
50/57
Preg#"irea s"andardel$r 'i preg#"irea curei s"andard. 1udra cristalinK de
%5B se reconstituie cu 3+ ml acetonitril 3++> pentru a obine o soluie stoc
cu concentraia de 3++gHml %5B. %in aceasta sau preparat soluii seriate
n faza mobilK (3+gHml, 9gHml, *gHml, 3gHml, +,9 gHml# Li sain0ectat 3++l din fiecare soluie seriatK de standard n sistemul "1;-.
Me"$da HPLC pen"ru de"er!inarea de$&ini%alen$lului din serul $%in
Extracia deoxinivalenolului din probele de ser sa fKcut dupK metoda
descrisK de ; a n g (*++?#. 1robe de *,+ ml de ser au fost incubate peste
noapte,la temperatura camerei, cu cte ,+ ml tampon fosfat (p" ?,:# Li :+Jl glucuronidaza arilsulfataza extrasK din)eli* pomatia. -ei 9,+ ml de
ser, incubai, au fost purificai ulterior prin coloane de imunoafinitate
%5B1RE1.1rincipiul de purificare este acelaLi ca pentru probele de cereale,
diferK doarsolvenii folosii. -oloanele de imunoafinitate au fost spKlate o
datK cu 3F,+ ml1!S Li de douK ori cu cte *,+ ml apK distilatK. Eluia sa
fKcut cu *,+ x *,+ ml metanol. 1robele obinute sau concentrat la sec sub
azot Li au fost reconstituiten 39+ Jl faza mobilK (aceeaLi ca pentru probele
de cereale#, n vederea analizei"1;-. -ondiiile cromatografice au rKmas
aceleaLi' sa in0ectat cte 3++ Jl din fiecare probK) debitul a fost de 3,+
mlHmin. Eluia sa realizat timp de 39 minute, iar deoxinivalenolul a fost
detectat la *3: nm.
REZ*LTATE DI 5I7C*II1. In"$&icaGia cr$nic#
Re4ul"a"ele de"er!in#ril$r c$ncen"raGiei de 5ON din pr$ele de fura3e.
2naliza serului sangvin poate da informaii preioase privind expunerea la
diferite concentraii de micotoxine. 1robele biologice, de genul serului, sunt
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
51/57
matrici complexe, n care un numKr mare de produLi pot interfera n analiza
micotoxinelor Li prezintK avanta0ul cK pot fi colectate fKrK mari eforturi.
Metoda "1;- pentru determinarea micotoxinei %5B din diferite matrice
este o metodK cantitativK, de referinK, care conferK o acuratee sporitKanalizelor, nsK necesitK o purificare riguroasK a probelor. 1urificarea se
poate face
prin mai multe metode, nsK metoda cea mai folositK n prezent este
purificarea prin coloane de imunoafinitate (/2-# (G r s I a Li A e l z i g,
*++3#. 1rin purificarea probelor cu a0utorul coloanelor de imunoafinitate se
mbunKtKesc att selectivitatea, ct Li sensibilitatea metodei. 2cest lucrupermite o mai bunK detecie a micotoxinei, c&iar Li atunci cnd aceasta se
aflK n cantitKi foarte mici, de genul probelor de ser, Li eliminK interferenele
legate de produLii acetilai ai deoxinivalenolului (2c%5B Li 392c%5B#.
-oloanele de imunoafinitate conin un anticorp monoclonal specific pentru
%5B care poate purifica %5Bul din probe. %5Bul prezent n probK se
leagK de anticorpul din coloanK, care este apoi spalatK pentru ndepartarea
interferenelor) toxina este eliberatK ulterior prin eluare cu metanol. %eLi
extracia din cereale sau alte produse derivate este mai eficientK n cazul
folosirii unui amestec de apK Li acetonitril (! e n n e t t Li G l i c &, *++) G r
s I a Li A e l z i g, *++3#, n cazul nostru extracia deoxinivalenolului din
probele de amestec de fura0 sa fKcut numai n apK datoritK purificKrii
ulterioare a extractelor prin coloane de imunoafinitate.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
52/57
datelor -&romeleon (%ionex#. -urba de calibrare pentru detecia
deoxinivalenolului din fura0e (figura 3# este dreaptK Li porneLte din origine)
coeficientul de linearitate obinut a fost de +,@@?.
Fig. +]-urba de calibrare pentru deoxinivalenol
(-alibration curve of t&e deox6nivalenol#
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
53/57
Fig. 2]-romatograma %5B fura0 contaminat(%5B c&romatogram contaminated forage#
-oncentraia medie nregistratK a fost de F3,9F microgrameHIg, cu variaii
cuprinse ntre F3,33 Li F3,:? microgrameHIg (tabelul 3#, n amestecul 3
("1;-# Li ,F9 mg, cu limite ntre ,33,9 n amestecul * (E;/S2#) ;%
fiind de 3:,9 mg.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
54/57
Tabelul 1
C$ncen"raGie de 5ON nregis"ra"# n pr$ele de fura3e
(%5B concentration from t&e forage samples#
Nr.
Cr".
C$ncen"ra"ie 5ON
A!es"ec 1 : HPLC;@g-g
A!es"ec 2 : ELI7A;@g-g
1. F3,:? ,332. F3,9* ,*3. F3,?: ,9*?. F3,33 ,?9B. F3,9? ,9
Medie F3,99 ,F9
1robele de fura0 administrate n cazul intoxicaiei acute au avut o
concentraie medie de %5B, analizatK prin te&nica E;/S2, de ,F9 mgHIg
(tabelul 3#. -oncentraia de %5B nu depKLeste norma legalK admisK (3*9+
gHIg pentru cereale neprocesate# stabilite de -omisia CE (-omisia -odex
2limentarius# (tabelul *# pentru gradul de contaminare cu deoxinivalenol n
cazul amestecului utilizat n inducereea intoxicaiei cronice, dar l depKLeLte
n cazul fura0elor administrate n intoxicaia acutK.
Tabelul 2
Li!i"ele !a&i!e s"aili"e de *niunea Eur$pean# pri%ind c$ncen"raGia 5ON
din diferi"e !a"rice
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
55/57
(Maxim limits fixed b6 t&e European Cnion regarding %5B concentrations in different
matrices
Pr$dus Ni%el !a&i!
:@g-g;
-ereale neprocesate, altele decat graul, ovaz si porumb 3*9+4rau, ovaz, porumb neprocesate 39+1orumb neprocesat 39+=aina de cereale incluzand si malai 9+1aine, biscuiti, cereale pentru mic de0un 9++1aste fainoase 9+-ereale procesate pentru &rana sugarilor si copiilor mici *++
Re4ul"a"ele de"er!in#ril$r c$ncen"raGiei de 5ON din pr$ele de ser
1entru extracia deoxinivalenolului din ser sau incubat mai nti probele cu
enzimaglucuronidaza arilsulfataza extrasK din)eli* pomatia, deoarece la
rumegKtoare principalul metabolit n plasmK este con0ugatul glucuronidat (1
r e l u s I 6 Li colab., 3@:?, 3@:, 3@@#. 1rezena metaboliilor glucuronidai
a fost pusK n evidenK prin creLterea ratei de recuperare a %5B dupK
tratamentul cu glucuronidaza arilsulfataza. Studiile au aratat cK dupK
administrarea oralK a deoxinivalenolului proporia de %5B glucuronidcon0ugat n plasmK este de > (1 r e l u s I 6 Li colab., 3@:?#. %eLi studiile
aratK cK glucuronid %5B este mai puin toxic, timpul sKu de in0umKtKire
este mai mare comparativ cu cel al %5Bului liber. 2naliza cromatograficK a
tuturor probelor de ser recoltate de la animalele supuse intoxicaiei cronice a
condus la obinerea unor rezultate nesemnificative de intoxicare, la toate
animalele din experienK, care ar putea fi explicate prin cantitatea micK
ingeratK, sub limita dozei zilnice tolerate (8%/#) menionKm cK pentru %5B
doza minimK este de 3,+ JgHIg greutate corporalK. Este important sK luKm n
calcul Li faptul cK rumegatoarele, comparativ cu animalele monogastrice,
sunt mai rezistente la aciunea ma0oritaii micotoxinelor, fapt datorat
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
56/57
probabil, unei detoxificKri la nivel ruminal.
-
8/10/2019 Analiza Hplc a Micotoxinelor
57/57
2bsena deoxinivalenolului din probele de ser semnificK faptul cK la
aceastK concentraie, acesta este fie eliminat rapid, fie transformat n ali
produLi de metabolism.
2dministrarea unui fura0 cu o cantitate de %5B crescutK (,F9 mgHIg# acondus la trecerea acestuia n snge n proporie de 9+>, prezena
micotoxinei n ser avnd valoarea medie de ,3 JgHl.
;a rumegKtoare sau realizat mai puine studii cu privire la efectul
tricotecenelor, iar rezultatele sunt destul de contradictorii. -a urmare,
studiile ulterioare trebuie sK determine dacK la alte concentraii de %5B are
loc transmiterea acestuia n ser.