HPLC

7.1. PRIN INTRODUCERE ÎN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE ÎNALTĂ

PERFORMANŢĂ

Prin cromatografie se înţelege procedeul de separare a două sau mai

multor substanţe pe baza afinităţilor lor diferite faţă de o fază staţionară şi o

fază mobilă care este în mişcare în raport cu faza staţionară. Figura 8.1.

ilustrează clasica schemă a separării cromatografice a doi soluţi pe o coloană

împachetată cu un adsorbent solid, prin care circulă un solvent. Solutul A are o

afinitate relativă mai mare faţă de materialul fazei staţionare decât solutul A. Ca

urmare solutul B este eluat din coloană mai încet decât solutul A, rezultând

separarea lor.

Cromatografia de lichide (LC) este cea mai veche şi probabil cea mai

puternică formă de cromatografie. Cromatografia, ca tehnică de separare, a fost

Cap. VII. – Introducere în Cromatografia de Lichide de Înaltă Performanţă

descoperită şi denumită astfel de Tswett în 1903 [65, 66]. De atunci, dezvoltarea

tehnicii cromatografice s-a realizat destul de încet şi numai în ultimii ani a

cunoscut o dezvoltare foarte rapidă.

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă se bazează pe dezvoltarea

câtorva domenii din cadrul LC: aparatura, coloane speciale şi materiale de

umplere (suporturi cromatografice), teoria procesului cromatografic, etc. Un rol

important l-a jucat realizarea unor echipamente ce pot realiza presiuni ridicate,

volume-moarte (dead-volume) reduse şi detectoare foarte sensibile. La acestea

se adaugă realizarea unor suporturi cromatografice speciale, care au permis

separări cromatografice rapide, reproductibile şi de mare performanţă. Putem

considera că începuturile cromatografiei de lichide moderne au avut loc pe la

sfârşitul anilor ‘50, când Spackman, Stein [67] şi Moore [68] au introdus analiza

automată a amestecurilor de aminoacizi. Aceasta a fost urmată de lucrările de

pionierat ale lui Hamilton [69] şi Giddings [70] în fundamentarea teoretică a

HPLC, cât şi de lucrările HPLC de schimb-ionic ale lui Scott şi de permeaţie în

gel ale lui J.C. Moore [68]. Din 1969 lucrările publicate referitoare la HPLC s-

au înmulţit enorm de mult, orice cuantificare fiind subevaluată. Tehnica şi teoria

HPLC au ajuns astăzi la maturitate, deşi există încă multe porţi deschise spre

perfecţionarea lor.


HPLC are foarte multe aplicaţii, în diferite domenii:

Industria farmaceutică: controlul calităţii medicamentelor; analize de me-

dicamente şi metaboliţi

Cercetarea medicală clinică: dozare de medicamente şi metaboliţi

Industria alimentară: dozare de aditivi, pesticide şi alte substanţe toxice

contaminante

Toxicologie: dozare de medicamente (droguri) şi metaboliţi

Protecţia mediului: dozare de pesticide, clorofenoli, hidrocarburi aromatice

policiclice cât şi a altor poluanţi

Biochimie: elucidarea structurii proteinelor cât şi a altor substanţe de interes

biochimic

Petrochimie: analiza unor compuşi specifici

Figura 7.1. Ilustrare a separării cromatografice: (a) amestecul de soluţi A şi B sunt adăugaţi la capătul superior al coloanei cromatografice ; (b) după ce faza mobilă (solventul) a percolat coloana pentru câtva timp, soluţii A şi B sunt separaţi în coloană; (c) solutul A eluează din coloană; (d) solutul B eluează din coloană, separarea fiind încheiată cu succes.


Industria polimerilor: analiza monomerilor, aditivilor şi a altor compuşi

specifici.

la care se adaugă şi domeniul foarte nou al sistematicii biochimice.

Cromatografia tradiţională pe coloană (fie ea de orice tip - de adsorbţie,

partiţie sau de schimb ionic), în strat subţire şi pe hârtie, şi cromatografia de

lichide modernă sunt toate forme ale cromatografiei de lichide. Diferenţele

dintre toate aceste procedee se referă la detalii de echipament, material

cromatografic, tehnica de lucru, dar cromatografia de lichide modernă are câteva

avantaje majore faţă de celelalte tehnici menţionate: viteză sporită de separare,

posibilitatea de a separa amestecuri complexe, uşurinţă în executare, etc. Pentru

a aprecia mai bine avantajele cromatografiei de lichide moderne să facem două

comparaţii: între cromatografia de lichide şi cea de gaze şi între cromatografia

de lichide modernă şi cea tradiţională.

7.2. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE COMPARATĂ CU CROMATOGRAFIA

DE GAZE

Capacitatea excepţională a cromatografiei de gaze (GC) de a separa şi

analiza amestecuri foarte complexe este astăzi unanim recunoscută. Comparată

cu metodele cromatografice anterioare, GC realizează separări mult mai rapide

şi eficiente. Există sisteme cromatografice pentru GC total automatizate, la

preţuri acceptabile, cu performanţe excelente. Totuşi multe amestecuri nu pot fi

rezolvate de GC, fie din cauză că substanţele respective nu sunt volatile, fie că

sunt instabile termic şi se descompun în timpul cromatografierii. S-a estimat că

numai 10% din compuşii organici pot fi separaţi corespunzător cu ajutorul GC,

fără modificări chimice prealabile.


Cromatografia de lichide, pe de altă parte, nu cunoaşte limitări datorită

volatilităţii sau instabilităţii termice a probelor. Astfel, LC este ideală pentru

separări de macromolecule şi specii ionice (de interes biomedical), pentru

produşi naturali sensibili şi pentru o mare varietate de alte substanţe cu masă

moleculară mare, mai puţin stabili, cum ar fi: proteinele, aminoacizii, acizii

nucleici, polizaharidele, pigmenţii vegetali, lipidele polare, substanţele de interes

farmaceutic (hormoni, vitamine, antibiotice, etc.), coloranţii, surfactanţii,

medicamentele, pesticidele, etc.

Cromatografia de lichide are unele avantaje faţă de GC şi poate rezolva

(de cele mai multe ori) separări mai complexe deoarece:

În LC sunt utilizate două faze (una staţionară şi alta mobilă) cu selectivităţi

diferite faţă de moleculele supuse separării, faţă de doar una în GC.

Separarea cromatografică este rezultatul unor interacţii specifice între

moleculele probei cu fazele staţionară şi mobilă. Aceste interacţiuni sunt

absente în ce priveşte faza gazoasă mobilă a GC, dar sunt prezente în cazul

LC, furnizând astfel o variabilă în plus în ce priveşte controlul şi

îmbunătăţirea separării.

În LC există (cel puţin până acum) o mai mare varietate de suporturi

cromatografice;

În LC se utilizează temperaturi scăzute (cel mai adesea temperatura

ambiantă).

În LC se poate utiliza o mare varietate de detectoare: colorimetre (eventual

combinate cu reactoare unde se desfăşoară reacţii de formare a compuşilor

coloraţi), spectrofotometre în UV, fluorimetre, detectoare de conductivitate,

de refracţie, detectoare polarografice, detectoare radiometrice, etc. În

anumite cazuri de separări cromatografice în LC utilizarea unui detector

corespunzător elimină necesitatea unei separări complete.


Un mare avantaj al LC faţă de GC este faptul că după separarea

cromatografică substanţele pot fi uşor recuperate în eprubete separate, cu

ajutorul colectoarelor de fracţiuni. Trecerea de la LC analitică la cea

preparativă se face relativ uşor, recuperarea componentelor separate fiind

cantitativă. Există posibilitatea de recuperare a componentelor şi în GC, dar

procedeul este mult mai complicat şi cel mai adesea necantitativ.

În ciuda avantajelor menţionate ale LC faţă de GC, aceasta din urmă este

aplicată cu prioritate dacă nu sunt de aşteptat probleme speciale în ceea ce

priveşte separarea componentelor amestecului de analizat. Separările prin GC

sunt în general mai rapide şi mai sensibile şi, cel mai adesea, mai puţin

costisitoare.

7.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE MODERNĂ COMPARATĂ CU CEA

TRADIŢIONALĂ

Să considerăm acum diferenţele dintre sistemul cromatografic tradiţional

şi cel modern:

În LC clasică, o coloană este, în general, utilizată o dată (în cel mai bun

caz de câteva zeci de ori) după care este golită şi reumplută (eventual materialul

de umplere este regenerat). Aceasta reprezintă o mare cheltuială atât de

manoperă cât şi de material. Aplicarea probei, pentru a se face corect, necesită o

mare pricepere din partea operatorului. Curgerea solventului (eluentului) prin

coloană se realizează prin cădere liberă (pe baza acceleraţiei gravitaţionale), sau

cu ajutorul unor pompe peristaltice. Separările cromatografice durează, în

varianta clasică, câteva ore (uneori câteva zile), fiind prin urmare procedee mari

consumatoare de timp şi de efort uman.

Variantele LC pe hârtie (paper chromatography = PC), apărută prin ani

‘40 şi a cromatografiei în strat subţire (thin-layer chromatography = TLC) din

anii ‘50 a simplificat într-o oarecare măsură multe din operaţiile necesare


executării cromatografiei. Astfel, realizarea stratului (patului) cromatografic în

TLC sau PC s-a simplificat mult şi a devenit mult mai ieftină. Hârtia

cromatografică sau plăcile gata turnate pentru TLC pot fi astăzi cumpărate la

preţuri acceptabile. Aplicarea probelor în aceste tehnici este mai puţin

pretenţioasă, existând de altfel şi dispozitive care ajută la realizarea acestei

operaţii. Curgerea solventului se realizează, cel mai adesea prin capilaritate,

hârtia sau placa cromatografică fiind introdusă într-un tanc cromatografic închis,

ce conţine o mică cantitate din solventul eluant. În acest fel, singura intervenţie a

operatorului constă în urmărirea frontului de solvent pentru a opri procesul

cromatografic la timpul dorit. Detectarea şi cuantificarea substanţelor separate se

realizează prin stropirea hârtiei sau plăcii uscate cu reactivi cromogenici

corespunzători, pentru a se crea spoturi colorate pentru fiecare component

separat.

Tehnica PC şi TLC a simplificat mult procesul cromatografic şi a redus

timpul de separare, care, în special în cazul TLC este de ordinul minutelor (30-

60 min.). Totuşi, anumite limitări, caracteristice metodelor cromatografice "pat-

deschis" (open-bed) s-au păstrat şi la aceste tehnici:

reproductibilitate redusă;

dificultate în realizarea determinărilor cantitative;

timpi de separare mai lungi şi rezoluţii mai scăzute decât în cazul GC;

capacitate limitată de realizare a separărilor preparative (de ordinul

miligramelor);

automatizare dificilă.

Cromatografia de lichide modernă utilizează coloane închise, care pot

fi refolosite de sute sau chiar de mii de ori, fără a periclita performanţele

separărilor. Cu toate că aceste coloane sunt foarte scumpe (de la 400 DM în sus),

ţinând cont de faptul că perioada de viaţă este foarte lungă, practic utilizarea lor


este mai economică decât cea a coloanelor deschise (open-bed column). Cu toate

că şi coloanele HPLC se pot încărca individual de fiecare operator, cel mai

adesea, acestea se cumpără gata umplute, astfel că se poate elimina această

operaţie mare consumatoare de timp şi care necesită o mare pricepere din partea

operatorului. Injectarea probelor se realizează cu ajutorul unor dispozitive

speciale -valve de injecţie, bucle de injecţie - care fac ca operaţia să fie rapidă şi

foarte uşor de executat. Curgerea solvenului prin coloană se realizează cu

ajutorul unor pompe de mare presiune, motiv pentru care tehnica se mai

numeşte cromatografie de mare presiune (High Presure Liquid

Chromatography = HPLC). În funcţie de presiunea cu care este împinsă faza

mobilă în coloană, metodele cromatografice pot fi clasificate în cromatografie la

presiune redusă (sub 5 bari), la presiune moderată sau medie (5-50 bari) şi la

presiune înaltă (peste 50 bari). Curgerea solventului sub presiune are o serie de

avantaje: viteza de curgere este rapidă şi (aproape) perfect controlată, ceea ce

duce la reducerea dispersiei moleculare şi la o (aproape) perfectă reproduc-

tibilitate a separărilor cromatografice.

Detectarea şi cuantificarea substanţelor separate se realizează în mod

continuu cu ajutorul detectoarelor de diferite tipuri şi a integratoarelor-

înregistratoare ce fac parte componentă din sistemele cromatografice HPLC.

Aceste sisteme sunt (sau pot fi) complet automatizate: probele pot fi injectate

automat cu ajutorul injectoarelor automate, operaţiile executate de sistemul de

pompe, detectoare şi integratoare pot fi de asemenea controlate de către un

calculator, iar regăsirea substanţelor separate se poate realiza cantitativ cu

ajutorul colectoarelor de fracţiuni. Intervenţia manuală a operatorului este

minimă, în cel mai rău caz, reducându-se la efectuarea injectării probei în

coloană, el putând face alte operaţii în timp ce sistemul cromatografic lucrează.

Operaţiile fiind automatizate, performanţele cromatografice sunt excepţional de


ridicate, dacă le comparăm cu metodele de CL clasice, motiv pentru care metoda

se mai numeşte cromatografie de înaltă performanţă (High Performance

Liquid Chromatography = HPLC). În plus, ridicarea la scară, adică trecerea de

la cromatografia analitică la cea semi-preparativă şi preparativă se realizează

foarte uşor. Datorită curgerii solventului sub presiune, cu viteză mare, prin

stratul cromatografic, timpul de cromatografiere a fost mult redus, marea

majoritate a separărilor realizându-se în mai puţin de 20 minute. Pentru

realizarea diferitelor separări cromatografice, există o multitudine de suporturi

cromatografice, care fac posibile separări de mare fineţe - cum ar fi izomerii

optici. Marele "dezavantaj" al LC moderne (pe care de acum încolo o vom numi

simplu HPLC) constă în preţurile foarte ridicate ale aparaturii care trebuie să fie

de cea mai mare precizie, al materialului cromatografic care trebuie să fie de cea

mai bună calitate, al solvenţilor de eluţie care trebuie să fie ce cea mai mare

puritate, motiv pentru care iniţialele HPLC pot să însemne şi High Price Liquid

Chromatography.

Iată rezumativ câteva caracteristici tipice ale cromatografiei clasice (de

joasă presiune) şi ale cromatografiei moderne (HPLC)

Tabel 7.1. Caracteristici generale ale cromatografiei de lichide clasică şi ale

HPLC

Caracteristici LC clasică HPLC


Dimensiunea particulelor

Viteza de curgere

Presiunea de operare

Timpul de separare

Volumul probei

Rezoluţia

Neajunsuri

100-300 µm

10-30 ml cm-2 h-1

<5 bar

24 h, sau chiar mai

mult

Variabil (ml-litri)

Bună

Timp de procesare lung

3-10 µm

100-300 ml cm-2 h-1

>50 bar

0.1-3 h

Mic (µl-ml)

Poate fi excelentă

Cost ridicat al

aparaturii

7.4. ECHIPAMENTUL FOLOSIT ÎN CROMATOGRAFIA DE LICHIDE

Echipamentul necesar pentru LC poate fi asamblat din componente care

pot proveni de la diferiţi fabricanţi sau (cel mai bine) poate fi un sistem

cromatografic complet asamblat provenit de la un singur producător. Există

enorm de multe firme producătoare de sisteme cromatografice. Se poate pune

întrebarea: Care este cel mai bun sistem cromatografic ? Răspunsul, fără a fi

evaziv, este că nu există un echipament "cel mai bun" deoarece cerinţele pentru

un anume aparat depind de problemele specifice pe care acesta este chemat să le

rezolve. Tabelul 7.2. prezintă sumar unele dintre acestea.

Tabelul 7.2. Criterii pentru echipamentele HPLC


Performanţ

e

Cerinţe

Caracteristici ale

sistemului

Cerinţe ale echipamentului

Adaptabilit

ate

Utilizabil pentru probe din

diferite clase şi tipuri de

substanţe

Materiale cu mare rezistenţă

chimică

Diferite tipuri de detectoare

Viteză Coloane selective, cu

eficienţă mare

Viteză volumetrică sporită

a fazei mobile

Viteză mare de ieşire a da-

telor

Pompe de mare presiune

Detectoare şi tuburi de conec-

tare cu volume moarte foarte

reduse

Înregistratoare şi sisteme rapide

de prelucrare a datelor

Reproducti

bilitate

Controlul operaţional al

parametrilor

Controlul precis al:

- temperaturii coloanei

- temperaturii detectorului

- compoziţiei fazei mobile

(gradient)

- vitezei fazei mobile

- răspunsului detectorului

Senzitivitat

e

Detectoare cu răspuns

foarte rapid

Benzi înguste

Design atent al detectorului

Raport semnal/zgomot redus

Coloane eficiente


În figura 7.2. se prezintă schematic un sistem LC, cu componentele sale

de bază. La configuraţia de bază se pot adăuga diferite alte componente, utile

pentru anumite analize speciale sau deosebite.

Aşa cum s-a mai menţionat, iniţiale HPLC pot să semnifice şi high price

liquid chromatography deoarece echimapentele HPLC sunt foarte scumpe. Un

sistem cu configuraţie de bază, ca cel din fig. 7.2.. costă în jur de 20000 DM,

coloanele costă de la 400 DM în sus şi exemplele ar putea continua. Deoarece în

acest caz preţul este un factor limitativ, este important de ştiut care sunt cerinţele

unui bun sistem HPLC, căci deşi este recomandabilă achiziţionarea unui sistem

HPLC integrat, rezultate similare se pot obţine şi prin asamblarea de

componente provenind de la firme diferite şi care ar putea fi mai ieftine.

Urmărind fig. 7.2.. se constată că principial sistemul HPLC nu diferă de

un sistem cromatografic de joasă sau medie presiune, toate având practic aceeaşi

diagramă de curgere a fazei mobile şi componentelor probei: rezervorul de fază

mobilă → (sistemul de creare a gradientului) → pompa → (monitorul de

presiune) → injectorul → coloana → detectorul → colectorul (sistemul de

Fig. 7.2. Schema generală a unui sistem LC: 1 - rezervor de fază mobilă; 2- element de încălzire; 3 - agitator magnetic; 4 - pompe; 5- filtru; 6 - restrictor de pulsuri de presiune; 7 - pre-coloană (opţional); 8 - coloana analitică; 9 - sistem de injectare a probei; 10 - termostat (opţional); 11 - detector; 12 - integra-tor/înregistrator sau sistem de prelucrare a datelor


creare a gradientului şi monitorul de presiune au fost puse în paranteză deoarece

acestea pot fi încorporate în pompă).

7.5. DIFERITELE VARIANTE ALE CROMATOGRAFIEI DE LICHIDE

Retenţia moleculelor probei de către faza staţionară se poate realiza prin

patru mecanisme sau procese diferite. Bazate pe acestea există patru tipuri de

LC: lichid-lichid, lichid-solid, schimb ionic şi gel-cromatografie.

(1) Cromatografia lichid-lichid (sau cromatografia de partiţie) implică

existenţa unei faze staţionare lichide a cărei compoziţie este diferită de cea a

fazei staţionare mobile. Moleculele probei se distribuie între faza staţionară

(lichidă) şi faza mobilă (bineînţeles, lichidă şi ea) în funcţie de coeficientul de

partiţie al probei respective faţă de cele două lichide. Faza staţionară şi cea

mobilă pot fi două lichide nemiscibile, sau faza staţionară poate fi legată chimic

pe particulele de gel ce formează suportul cromatografic.

(2) Cromatografia lichid-solid (sau cromatografia de adsorbţie)

implică umplerea coloanei cu particule ce au o mare suprafaţă. Moleculele

probei vor fi reţinute prin atracţia reciprocă cu situsuri active de pe suprafaţa

particulelor de gel.

(3) În cromatografia de schimb ionic coloana se umple cu particule de

gel ce prezintă fixate pe suprafaţa lor grupări ionice (pozitive sau negative)

împreună cu contraionii de sarcină opusă. De exemplu, particulele de gel pot

avea fixate pe ele grupări –SO3–, contraionul fiind Na+. Contraionul este, de

asemenea, prezent şi în faza mobilă (sub formă de sare NaCl). Moleculele

probei, care la rândul lor prezintă o anumită sarcină globală pozitivă sau

negativă (fie în exemplu nostru P+), vor face schimb ionic cu contraionii de pe

faza staţionară: P+ + SO3–Na+ → Na+ + SO3

–P+. Deci ionii de sodiu vor fi

înlocuiţi cu moleculele ionice ale probei. Cu cât sarcina globală a acestora este


mai mare, cu atât retenţia va fi mai puternică şi deci timpul de retenţie mai lung.

Moleculele probei care au aceeaşi sarcină globală cu cea a sarcinilor fixate pe

particulele de gel (minus în cazul de faţă) nu vor fi reţinute de loc de materialul

de umplere al coloanei şi vor migra odată cu faza mobilă.

(4) În gel-cromatografie (sau cromatografie de excludere moleculară,

cromatografie de gel-filtrare) perlele de gel ce umplu coloana prezintă pori de

diferite dimensiuni. Moleculele probei ce prezintă dimensiuni mai mari decât

porii nu vor putea intra în aceştia şi vor migra odată cu faza mobilă. Moleculele

mai mici decât porii, vor pătrunde în aceştia, vor parcurge un drum mai lung

(intrare şi ieşire din pori), motiv pentru care vor fi eluate mai târziu decât

moleculele mari. În mod normal, se caută ca între moleculele probei şi cele două

faze să nu existe nici un fel de interacţii, singurul criteriu al separării fiind

dimensiunea moleculară.

7.6. CROMATOGRAFIA LICHID-LICHID ÎN FAZĂ INVERSATĂ

Dintre toate tehnicile HPLC, RP-HPLC este cea mai utilizată. Cel puţin

60% din separările analitice se realizează prin această tehnică. Termenul de fază

inversată a fost utilizat prima dată de Howard şi Martin [71] care au realizat o

LLC (Liquid liquid chromatography) folosind ca fază staţionară uleiul de

parafină şi n-octanul cu eluenţi apoşi. Într-un astfel de sistem de partiţie,

metodologia convenţională, care utiliza o fază staţionară, polară şi o fază

mobilă, mai puţin polară a fost inversată, faza mobilă devenind mai polară decât

cea staţionară.

RPC (Reversed phase chromatography) diferă de majoritatea celorlalte

tehnici cromatografice în care forţele atractive dintre faza staţionară şi faza

mobilă sunt dominante. În RPC, faza staţionară este, în general, de natură

hidrocarbonată, inertă, şi singurele interacţii cu solutul sunt cele hidrofobe,

selectivitatea fiind dominată de efectele solventului. Faza mobilă, în RPC, este


formată fie din apă (singură), fie din apă plus un modificator organic, fie dintr-

un solvent neapos. Aceste faze mobile diferite au dus la utilizarea de diferite

acronime pentru variantele RPC: PARP = plain aqueous reverse phase; MARP

= mixed aqueous RP; NARP = non-aqueous RP.

În RPC, faza staţionară este, în mod uzual, formată dintr-o matrice din

particule sferice de silicagel pe care s-au imobilizat covalent liganzi n-octadecil.

Alţi liganzi mult utilizaţi sunt n-octil şi fenil. Pentru separări analitice, diametrul

sferelor de silicagel este mai mic de 25 µm. Fazele staţionare sunt, de obicei,

împachetate în coloane de oţel inoxidabil, cu diametrul de 4-5 mm şi lungimea

de 50-300 mm. Tendinţa actuală este de a se folosi coloane cu diametre mai mici

de 4 mm (4 - 1 mm)(norow bore column) împachetate cu sfere cu diametre mai

mici de 5 µm. Cele mai utilizate faze mobile sunt soluţiile apoase (tamponate)

în amestec cu diferite procente de metanol şi/sau acetonitril. Fazele mobile sunt

pompate la viteze volumetrice între 0,5 şi 2 mL·min–1.

Popularitatea RPC este de înţeles având în vedere numeroasele avantaje şi

marele său potenţial. Cel mai mare avantaj al RPC este stabilitatea şi inerţia

fazei staţionare, care permite utilizarea unei game largi de solvenţi: adăugarea de

săruri, modificarea pH-ului şi a temperaturii, etc.

7.6.1 FAZELE STAŢIONARE UTILIZATE ÎN CROMATOGRAFIA ÎN FAZĂ

INVERSATĂ

Cele mai comune faze staţionare utilizate în RPC sunt cele ce conţin

grupări octadecilsilan (ODS sau C18) legate covalent de matricea de silicagel.

Aşa cum s-a amintit deja, destul de utilizate sunt şi suporturile ce prezintă

liganzi octil sau fenil. Ca matrice, pe lângă silicagel se mai utilizează kieselguhr-

ul, alcoolul polivinilic (PVA), sticla, oxizi metalici, etc. Diametrul perlelor

utilizate ca matrice variază între 3 şi 10 µm.


Modificarea gelurilor de silice se realizează prin fixarea pe suprafaţa lor a

unor grupări cu caracter hidrofob. Ca o regulă generală, gruparea hidrofobă se

leagă de silicagel printr-o legătură siloxan stabilă. Ea este formată în reacţia

dintre alchil (aril) clorosilan (agentul modificator) cu grupările silanol de pe

suprafaţa silica-gelului. Grupările hidrofobe ataşate matricei de silicagel pot fi

de tipul etil (C2H5), octyl (C8H17), octadecil (C18H37) şi fenil (C6H5). În loc

de monoclorsilani se pot utiliza pentru modificarea silica-gelului şi di- şi

triclorsilani, ultimul fiind cel mai eficient.

Împiedicările sterice fac ca modificarea suprafeţei matricei, prin reacţiile

cu clor-silani să nu depăşească 40% din aria sa. În general, densitatea grupărilor

hidrofobe este în jur de 2,9 - 3,4 µmoli·m–2, în timp ce densitatea grupărilor

silanol iniţial prezente este de 8-9 µmoli·m–2.

Grupările silanol neprotejate pot duce la adsorbţii necontrolabile ale

proteinelor sau ale unor molecule mici (în aşa numita cromatografie "perechi

ionice" - ion-pair chromatogrphy - ionii pot fi adsorbiţi) ducând la o descreştere

a puterii de rezoluţie şi la nereproductibilitatea procesului cromatografic. Pentru

a evita aceste fenomene negative, silica gelul este tratat cu modificatori

hidrofobi cu masă moleculară mică, cum ar fi trimetil-clor-silanul.

Grupările ionice ale solutului, cum ar fi cele prezente pe suprafaţa

proteinelor, sunt puternic hidratate şi interferă cu liganzii hidrofobi. Prin

alegerea convenabilă a pH-ului aceste grupări ionizate pot fi aduse într-o formă

neionică, astfel încât interacţiile hidrofobe să crească. La modificările pH-ului

mediului, trebuie ţinut cont de faptul că matricea de silicagel este stabilă pe

domeniul de pH 2 - 7,5 şi se solubilizează treptat la valori alcaline ale pH-ului.


7.6.2 PARAMETRI CE AFECTEAZĂ RETENŢIA CROMATOGRAFICĂ

Modificatorii organici. Eluţia in RP-HPLC este efectuată datorită

prezenţei sau creşterii gradate a concentraţiei unui solvent organic în eluent.

Solventul se numeşte, în acest caz, modificator organic. Importanţa teoriei

solvofobice constă în faptul că permite prezicerea caracteristicilor de retenţie a

soluţilor. Aceasta poate fi clar demonstrată prin efectele modificatorilor organici

introduşi în faza mobilă asupra retenţiei soluţilor.

Temperatura. Odată cu creşterea temperaturii scad timpii de retenţie şi

deci se măreşte viteza de cromatografiere. Ca regulă generală, o creştere cu 10ºC

duce la o reducere a factorului de capacitate de două ori. Prin creşterea

temperaturii se scade viscozitatea solvenţilor organici şi deci se poate mări

viteza de eluare.

Adăugarea de săruri în faza mobilă duce la modificarea factorului de

capacitate. Pentru un solut neutru, logaritmul factorului de capacitate va creşte

linear cu concentraţia sărurilor. Aceasta este o consecinţă a creşterii lineare a

tensiuni de suprafaţă.

pH-ul. Pentru compuşii care ionizează când pH-ul fazei mobile se apropie

de pKa-ul solutului se observă schimbări majore în ce priveşte factorul de

capacitate şi selectivitatea.

Tampoanele. Aşa cum s-a amintit deja, supresia ionică este o tehnică utilă

pentru creşterea factorilor de capacitate a soluţilor. Gradul de ionizare al

soluţilor poate varia cu concentraţia solutului în absenţa unui tampon, pe măsură

ce un solut eluează din coloană, concentraţia sa în bandă variază şi la fel şi

gradul de ionizare. Astfel de schimbări în ionizare pot duce la apariţia cozilor

sau a eluţiilor întârziate (cozi inversate). Astfel de probleme pot fi corectate prin

tamponarea corectă a fazelor mobile.


Pe lângă faptul că menţine constat pH-ul fazei mobile, tamponul mai

trebuie să îndeplinească anumite cerinţe cromatografice:

Să fie transparent optic, pentru a permite utilizarea detectoarelor UV-VIS. De

exemplu, acetatul, în comun cu alţi acizi carboxilici, nu poate fi folosit sub

235 nm, unde începe să devină opac optic;

Componentele tamponului nu trebuie să precipite în prezenţa modificatorilor

organici;

Lungimea lanţurilor liganzilor hidrofobi. Cu toate că există suporturi

cromatografice cu liganzi hidrocarbonaţi imobilizaţi a căror lungime variază de

la 2 la 18 atomi de carbon, totuşi cel mai comod este a se modifica compoziţia

fazei mobile, care de altfel constituie şi factorul dominant în determinarea

rezoluţiei. În ce priveşte efectul lungimii lanţului hidrocarbonat utilizat ca ligand

hidrofob, pe măsură ce numărul atomilor de carbon creşte şi retenţia soluţilor.

Retenţia depinde şi de densitatea acestor liganzi, astfel că putem spune că

retenţia soluţilor pe astfel de suporturi cromatografice creşte odată cu conţinutul

de carbon al fazei staţionare.

Referat realizat de http://www.referate-online.org

HPLC

Documents

Transcript of HPLC