GENETICA GENERALA

LUCRARI PRACTICE

CUPRINS

1. Ciclul celular mitotic

2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza 2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare 2.1.1. Metoda rapidă Feulgen de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n = 16) 2.1.2. Metoda rapidă de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n=16) în mitoză cu soluţie carmin-acetică 2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale 3. Meioza 4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza 4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante 5. Cariotip si idiograma 5.1. Definirea termenilor, nomenclatură 6. Ploidia la plante 7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante 8. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura 8.1. Studiul aberaţiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei la unele plante de cultură 9. Drosophila melanogaster – obiect de studiu in genetica 9.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster 8.1.1. Cromosomii uriaşi 8.1.2. Cromosomii somatici Bibliografie

1. Ciclul celular mitotic În diviziunea celulară se disting două categorii de evenimente: evenimente reproductive,

prin care sunt dublate structurile funcţionale ale celulei, esenţială fiind dublarea cromosomilor, şi evenimente distributive, prin care materialul rezultat în urma replicaţiei este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992).

Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvaţională, este modalitatea de diviziune celulară

prin care, dintr-o celulă somatică rezultă două celule fiice cu număr egal de cromosomi, atât între ele, cât şi cu celula mamă. Mitoza este diviziunea celulară care are loc în celule somatice şi asigură transmiterea fidelă a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi însă, diferite influenţe care adaugă aparentei stabilităţi a caracterelor, noi valenţe. Ciclul celular mitotic, la plante şi animale, cuprinde în principal următoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (şi a centrozomului la animale) şi deplasarea spre poli a cromosomilor fii, după care, urmează diviziunea citoplasmei. În procesul mitozei se organizează aparatul mitotic alcătuit din structuri

cromatice şi acromatice, care este complet în metafază. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare proteine specifice, a căror sinteză necesită un mare consum de energie.

Totalitatea proceselor prin care trece celula somatică de la formare şi până la scindarea ei în două celule fiice, cu număr de cromosomi egal cu numărul de cromosomi al celulei din care au provenit, alcătuiesc ciclul celular.

Ciclul mitotic (Fig.1) cuprinde: interfaza (perioada dintre două diviziuni succesive) şi cele patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise - profaza, metafaza, anafaza şi telofaza având o

durată variabilă, în funcţie de specie, tipul de celule, temperatură etc., de la câteva ore, la zeci şi sute de ore.

Interfaza Interfaza are cea mai mare durată în timp în ciclul mitotic şi este caracterizată de procese

de biosinteză. Durata interfazei este variabilă, de la câteva ore până la zile. La plante, la un ciclu tipic de 20-24 de ore, mitoza durează 70-110 minute (profaza = 30 - 45 min., metafaza = 5 - 10 min., anafaza = 15 - 20 min. şi telofaza = 20 - 30 min.) (Toma şi Niţă, 1995). La celula animală, un

ciclu tipic durează 18 - 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (în general variază cel mai mult), faza S (timpul necesar replicării genomului) durează 6 - 8 ore, iar faza G2 este, de regulă, cea mai scurtă (mai ales când mitozele se succed rapid). Mitoza, de obicei durează mai puţin de o oră (Lewin, 1994).

Cercetările microfotografice şi microradiografice au demonstrat că interfaza este foarte puţin activă din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activă din punct de vedere metabolic; cantitatea de ADN se dublează de la 2C la 4C. Pe baza acestor observaţii, Howard şi Pelc, în 1953 au împărţit interfaza în trei perioade:

- perioada G1 (engl. gap = gol) – perioadă presintetică, în care nu are loc sinteza de ADN,

ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sintetizează ARN (în special ARNm) şi proteine;

- perioada S (engl. synthesis = sinteză) – perioada de sinteză a ADN; până la sfârşitul fazei S toată cantitatea de ADN se replică (pe parcursul fazei S cantitatea totală de ADN creşte de la 2C la 4C). La sfârşitul acestei perioade, cromosomii sunt alcătuiţi din două cromatide foarte lungi şi subţiri;

- perioada G2 – perioadă postsintetică, când sinteza ADN se opreşte; are loc biosinteza proteinelor şi a ARN, care se desfăşoară şi în celelalte perioade ale interfazei. Celula conţine cromosomi bicromatidici.

Fig. 1. Ciclul celular mitotic (după Alberts şi colab., 1994)

Pe parcursul interfazei (Fig.2), cromosomii sunt hidrataţi, despiralizaţi şi nu se observă la

microscopul optic (Watson, 1974).

Fig. 2 Aspectul nucleului în interfază, în celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (după Hartl şi

Jones, 1998)

În afară de celulele la care ciclul mitotic se desfăşoară în mod normal, există celule în

repaus sau în perioada G0, asemănătoare fazei G1, dar diferită prin faptul că celulele nu pot intra în faza S. În faza G0 intră celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla în repaus în faza 4C (exemplu: celulele embrionare din seminţe), astfel încât, intră direct din G0 în G2; alteori, din G0 pot intra în G1 timpuriu (Lewin, 1994).

În explicarea cauzelor ce determină intrarea celulei în diviziune mitotică (trecerea din G2 în mitoză) există diferite ipoteze. Se pare că declanşarea mitozei este determinată de modificarea raportului nucleu / citoplasmă.

Profaza În profază au loc procesele: mărirea volumului nucleului, condensarea cromosomilor,

stabilirea polilor pentru diviziune, dezorganizarea membranei nucleare, dispariţia nucleolilor şi formarea fusului acromatic.

La începutul acestei faze, cromosomii se prezintă sub formă de filamente subţiri, lungi, alcătuind un spirem. În profaza timpurie (Fig.3) ei se dispun în tot spaţiul nuclear (în celulele vii se observă uşor, având indicele de refracţie 1,50 faţă de cel al carioplasmei de 1,37). În profaza târzie (Fig.4), gradul de spiralizare al cromosomilor creşte şi ei devin mai scurţi şi mai compacţi, apărând

formaţi din două cromatide, foarte apropiate între ele şi înfăşurate una în jurul celeilalte. La începutul profazei, are loc o primă spiralizare a cromosomilor denumită “spiralizarea mică”, ce se

realizează prin micşorarea numărului de spire şi mărirea diametrului lor. Spre sfârşitul profazei, are

diviziunea mitotică

interfaza

celule fiice

2cADN

2cADN

2cADN

4cADN

loc a doua spiralizare denumită “spiralizare somatică”, în care numărul de spire continuă să scadă,

ele apropiindu-se tot mai mult. În profază, distanţa dintre cromosomi creşte treptat şi are loc dezorganizarea nucleului şi a

membranei nucleare, dispariţia nucleolilor şi formarea fusului mitotic. Centriolii migrează spre polii celulei, plasându-se în două puncte opuse. Între centrioli se organizează fusul de diviziune (fus

acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alcătuit dintr-un număr mare de filamente, cu extremităţile inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu, cu ajutorul căruia se realizează distribuirea egală a cromosomilor în cele două celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de două tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiţionează structura fusului şi filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate şi pleacă de la centromerul fiecărui cromosom şi înaintează simultan, cu aceeaşi viteză, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 3 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază

timpurie (după Hartl şi Jones, 1998)

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază

târzie (după Hartl şi Jones, 1998)

Stadiul final al profazei – prometafaza, se caracterizează prin totala dezorganizare a

membranei nucleare, care se fragmentează în porţiuni relativ mari, ce păstrează infrastructura de membrană dublă şi rămân, în parte, în interiorul fusului de diviziune, participând mai târziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercită mişcări neregulate între polii celulei şi planul ecuatorial al acesteia.

Metafaza În această fază are loc desăvârşirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizaţi la maxim,

se dispun în placa ecuatorială metafazică (Fig.5). Mişcarea de dispunere a cromosomilor în placa

ecuatorială, la distanţă egală de polii fusului de diviziune prezintă trei componente: adunarea cromosomilor într-o poziţie de echilibru între cei doi poli, mişcare datorată

interacţiunii între polii fusului şi centromeri; orientarea cromosomilor în placa ecuatorială astfel ca, centromerii să fie situaţi în axul

longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral; distribuirea cromosomilor în placa metafazică se realizează în jurul unui fus central gol

(în secţiune transversală apare ca un halo), cromosomii fiind dispuşi la periferia fusului, cu braţele orientate în afară.

Morfologia cromosomilor se studiază în metafază, deoarece în această fază ei sunt condensaţi în cel mai înalt grad. Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide şi prezintă în lungul acestora, spre sfârşitul metafazei, o fisură longitudinală, care reprezintă spaţiul dintre cele două cromatide surori. La sfârşitul metafazei (Fig.6), cromatidele surori încep să se separe

(clivarea longitudinală), făcându-se trecerea spre anafază.

Fig. 5 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în

metafază timpurie (după Hartl şi Jones, 1998)

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în

metafază târzie(după Hartl şi Jones, 1998)

Anafaza Anafaza se caracterizează prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii şi

migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debutează în anafaza timpurie, când are loc clivarea centromerilor, cromatidele rămânând încă apropiate unele de altele. O dată terminată clivarea centromerilor, începe separarea cromatidelor în lungul fisurii longitudinale evidenţiate în metafază (Fig.7). După Lewin (1994), la celulele animale, în anafază, centromerul

este duplicat funcţional. Când şi acest proces se încheie, cromatidele fiice, fiecare cu câte un centromer propriu, încep migrarea spre poli (Fig.8), devenind cromosomi fii.

Se admite că mişcarea cromosomilor spre poli este o consecinţă a scurtării filamentelor fusoriale de sprijin, care leagă polii fusului (prin pierderea sau adiţia de tubulină din microtubuli). Alungirea determină stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat în mişcarea cromosomilor spre poli. Această mişcare este posibilă datorită existenţei în structura fusului mitotic a unor proteine de natură actinică. În cazul în care setul de cromosomi migrează aproape perfect sincron, se formează “placa anafazică” sau “dublul aster”. Chiar dacă mişcarea cromosomilor nu

este sincronă, ea nu începe decât după ce toţi cromosomii sunt plasaţi în placa ecuatorială. În celulele animale, de regulă, autosomii migrează concomitent, iar heterosomii au o viteză

de migrare diferită. În celulele plantelor, spre sfârşitul anafazei, fusul mitotic se măreşte în volum în regiunea ecuatorială şi ia formă de butoiaş, formând ulterior fragmoplastul.

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază

timpurie (după Hartl şi Jones, 1998)

Fig.8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază

târzie (după Hartl şi Jones, 1998)

Telofaza Telofaza este ultima fază a mitozei, caracterizată prin prezenţa fenomenelor opuse celor

din profază. Cromosomii suferă un proces de despiralizare şi revin la aspectul interfazic. Fragmentele de membrană nucleară migrează spre periferia fusului de diviziune; numărul lor creşte printr-o sinteză suplimentară. Aceste vezicule se agregă în jurul masei cromosomiale, se turtesc, înconjoară nucleul interfazic şi formează noua membrană nucleară. O parte din veziculele membranoase ajung la nivelul liniei de demarcaţie dintre cele două celule fiice. Are loc şi reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce îndeplinesc funcţia de organizatori nucleolari (Fig.9 şi Fig.10).

Fig.9 Celulă din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în telofază timpurie (după Hartl şi

Jones, 1998)

Fig.10 Aspect al nucleilor fii, aparţinând unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată

în telofază târzie (după Hartl şi Jones, 1998)

Citochineza În mod obişnuit, diviziunea nucleară este urmată de citochineză (plasmodiereză,

citodiereză sau plasmotomie). Citochineza poate avea loc centripet – la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra),

când membrana ce separă cele două celule fiice apare sub forma unui inel ce creşte centripetal, asemănător unei diafragme (Toma şi Niţă, 1995). La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. După Buvat, în zona ecuatorială a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercalează fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migrează în această regiune dinspre poli. Împreună cu elementele microtubulare, se formează o structură fibrilară. În jurul fibrelor microtubulare se aglomerează vezicule mici golgiene (Fig.11a,b). Veziculele se măresc, se contopesc şi vin în contact cu pereţii celulei mame, formând lamela mediană (Fig.11c). Celulele fiice formate, elaborează membrana primară, străbătută de plasmodesme (Fig.11d,e). La animale,

separarea celulelor fiice se face prin formarea unui inel contractil, deci prin ştrangulare(Fig.12 a, b).

Fig. 11 Formarea peretelui despărţitor, între celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (după De Robertis şi De Robertis,1983)

Fig.12 Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formării inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la organismele animale (după De Robertis şi De Robertis,1983)

În celulele normale, mitoza şi citochineza sunt riguros coordonate. Dacă are loc blocarea

citochinezei, mitoza se desfăşoară normal, producându-se o celulă binucleată. Odată cu replicarea cromosomilor, are loc şi replicarea organitelor citoplasmatice sau

separarea lor din celula mamă în celulele fiice, după care acestea îşi completează, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. În profază, reticulul endoplasmic este transformat într-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse în special în regiunile periferice ale citoplasmei. În metafază, mitocondriile se adună în jurul fusului; în anafază, ele se grupează în jurul regiunii ecuatoriale, odată cu separarea celulelor fiice având loc şi repartizarea acestora. În interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipică.

În diviziunea mitotică, metafaza şi anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, în timp ce profaza, uneori şi telofaza, sunt cele mai lungi. Desfăşurarea în timp a mitozei depinde şi de tipul celulei, vârstă, starea fiziologică, condiţii de mediu (mai ales temperatura). Mitoza poate fi blocată prin acţiunea şocurilor de temperatură, narcoticelor, otrăvurilor etc. (Raicu şi colab., 1973).

2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza

2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare

Cromosomii la plantele superioare se evidenţiază în celulele aflate în diviziune mitotică din

ţesuturile meristematice, din zonele de creştere ale organelor vegetative (apex radicular, apex caulinar), sau în celulele meristemoide din calus.

În lucrările practice de citogenetică vegetală se folosesc mai ales specii de plante cu cromosomi de dimensiuni mari şi în număr relativ mic. Pentru evidenţierea cromosomilor, în celulele aflate în diviziune mitotică, se folosesc ţesuturile meristematice din zona de creştere a rădăcinii de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16), secară – Secale cereale L. (2n = 14), bob – Vicia faba L. (2n = 12) etc.

Materialul biologic tipic, este reprezentat de ţesutul meristematic din apexul radicular al rădăcinii de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16).

Rădăcinile de ceapă se obţin după o perioadă de 2-3 zile de la punerea într-un pahar cu apă a bulbului de ceapă, astfel ca numai discul să pătrundă în lichid. La temperatura camerei, rădăcinile ating în 2-3 zile, lungimea de 10-15 mm şi pot fi detaşate (Fig.13).

a b c d e

b a

Fig. 13 Germinarea unui bulb de ceapă, în laborator

Pentru obţinerea rădăciniţelor embrionare, seminţele se pun la germinat pe hârtie de filtru,

umectată cu apă, în cutii Petri, la temperatura camerei. Germinarea seminţelor la unele specii de plante se face în nisip umed , în condiţii speciale. Recoltarea rădăcinilor se realizează când acestea ating lungimea de 10-15 mm. Momentul optim de recoltare – când un număr mare de celule se află în diviziune – se determină prin tatonare. Timpul optim de recoltare pe parcursul unei zile este între orele 7 - 10, funcţie de durata ciclului celular la specia respectivă.

2.1.1. Metoda rapidă Feulgen de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n = 16)

Metodele rapide de colorare sunt bazate pe hidroliza substanţelor pectice din pereţii celulari şi colorarea diferenţiată a constituenţilor celulari.

Principiul metodei:

În celulele în diviziune, doar ADN-ul cromosomial este colorat selectiv în roşu violaceu, de către o soluţie de fuxină bazică decolorată (reactiv Schiff). Metoda a fost elaborată de Feulgen şi Rossenbeck (1924) şi modificată de Tomasi (1936); se aplică pentru evidenţierea cromosomilor mitotici la diferite specii de plante (Tudose, 1967).

Materiale necesare: material biologic (rădăcini de ceapă de 1-1,5 cm); sticlărie (pahare Berzelius, flacoane, lame de microscop, lamele, pipete); instrumentar (pensete, lame, beţe de chibrit); aparatură (microscop optic, termostat, frigider); hârtie de filtru reactivi prefixatori: soluţie apoasă de colchicină (0,01 - 0,2%);

sau

apă rece la 2-4 C fixatori nucleari: alcool etilic absolut – acid acetic glacial (3 :1), sau; fixator Carnoy (6 părţi alcool etilic absolut : 3 părţi cloroform : 1 parte acid acetic

glacial), sau; fixator Battaglia (5 părţi alcool etilic absolut : 1 parte acid acetic glacial : 1 parte formol :

1 parte cloroform) coloranţi: reactiv Schiff - preparat după Darlington şi La Cour (1960) (cf. Tudose, 1967).

Soluţia folosită la colorare se recomandă să nu se arunce, deoarece poate fi folosită de nenumărate ori, până când capacitatea ei de colorare scade.

Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea este necesară pentru a inhiba formarea fusului de diviziune, determinând

acumularea de celule în metafază. Această etapă nu se recomandă să se execute când se urmăreşte observarea tuturor etapelor diviziunii. Prefixarea este absolut necesară însă, la

efectuarea preparatelor folosite pentru studierea cariotipului, realizând o scurtare prin spiralizare, a cromosomilor.

Materialul biologic (rădăcinile de ceapă de 1 - 1,5 cm lungime) se introduce în flacoane mici de sticlă, adăugându-se 2 - 3 ml de prefixator. După trecerea timpului necesar prefixării, prefixatorul se îndepărtează cu o pipetă sau prin decantare. Ca prefixatori se foloseste de exemplu, soluţie apoasă de colchicină 0,01-0,2% sau apă rece la 2 – 40C, 4 - 24 ore, la frigider. Pentru studiul cromosomilor în mitoză la ceapă, recomandăm prefixarea bulbilor de ceapă germinaţi, cu rădăcini de 1 - 1,5 cm, timp de 24 de ore la frigider (3-40C), sau prefixarea cu soluţie de colchicină, 0,2%, timp de 2 ore la temperatura camerei.

Fixarea Fixarea are rolul de a omorî celulele, în starea în care se află în acel moment şi de a

coagula constituenţii celulari, fără a modifica structura internă şi externă a celulelor. Prin fixare, biocoloizii celulei se coagulează, constituenţii celulari putându-se colora cu diferiţi coloranţi.

Fixarea se realizează prin adăugarea peste materialul biologic a 2-3 ml de fixator, după îndepărtarea substanţei de prefixare. La ceapă, se prelevează rădăcinile şi se plasează într-un flacon de sticlă, în vederea efectuării fixării cu fixator Battaglia, timp de 12 min., la temperatura camerei. În general, timpul de fixare variază în funcţie de soluţia de f ixare şi de consistenţa materialului fixat.

Dacă prelucrarea materialului biologic nu se continuă imediat, el se conservă la frigider (2 – 40C), în alcool etilic 70%.

Spălarea

Rolul spălării este de a îndepărta urmele de fixator. Spălarea se realizează cu soluţie de HCl 1N, la temperatura camerei, timp de 5 min. Din flacoane, se îndepărtează soluţia de fixare şi se adaugă soluţia de spălare.

Hidroliza

Rolul hidrolizei este de a uşura colorarea, prin dizolvarea parţială a substanţelor pectice intercelulare, distrugerea parţială a pecto-celulozei parietale, precum şi uşurarea etalării celulelor între lamă şi lamelă.

După îndepărtarea soluţiei de fixare, sau a alcoolului, se realizează hidroliza la cald sau la rece. Hidroliza la cald se realizează la temperatura de 600C, prin adăugarea de 2 - 3 ml HCl 1N. Timpul este variabil, funcţie de duritatea ţesuturilor; se stabileşte prin tatonări (la ceapă, 7 - 8 min.). Hidroliza la rece se realizează prin adăugarea de soluţie HCl 50%, după îndepărtarea soluţiei de spălare. La ceapă, hidroliza se realizează timp de 10-15 min., la temperatura camerei.

Colorarea

După îndepărtarea soluţiei de hidroliză (cu ajutorul unei hârtii de filtru se îndepărtează urmele de soluţie de hidroliză), se adaugă 2-3 ml de reactiv Schiff, astfel încât rădăcinile să fie scufundate în colorant, iar colorantul să rămână incolor. După 15-20 de min., zona meristematică din vârful rădăcinii începe să se coloreze în roşu-violaceu, apoi în violet intens, deoarece aici se află celule în diviziune; restul rădăcinii, unde frecvenţa diviziunilor este scăzută, iar celulele sunt mari şi alungite, rămâne vizibil necolorată. Pentru o bună colorare sunt necesare 30 min. - 1 oră, la temperatura camerei. O colorare intensă, uniformă, se obţine dacă materialul introdus în colorant se păstrează la frigider, câteva ore. Pentru mărirea contrastului între cromosomi şi citoplasmă se recomandă menţinerea rădăcinilor scoase din colorant într-o soluţie de acid acetic 45%, timp de 10 - 15 min. sau în apă, timp de 30 de min., spălând astfel excesul de colorant. În cazul în care nu s-a realizat o colorare satisfăcătoare, intensificarea ei se realizează prin executarea preparatului într-o picătură de carmin acetic. În colorant, la frigider, materialul se poate păstra maxim 1-2 zile, după care se degradează, având loc şi colorarea citoplasmei.

Efectuarea preparatelor temporare rapide (tip squash)

Preparatele microscopice rapide se obţin prin etalarea vârfului colorat al rădăcinii (de preferinţă o porţiune de 1-2 mm), pe o lamă de microscop curată şi degresată (prin spălarea lamelor în amestecuri oxidante speciale folosite în lucrările de citologie, în alcool etilic 96%, sau în spirt sanitar, urmate de o bună ştergere cu o bucată de tifon, înaintea efectuării preparatului), într-o picătură de acid acetic 45%. În prealabil, vârful colorat al rădăcinii se poate trece printr-un cristalizor cu apă. Aşezând deasupra vârfului detaşat al rădăcinii o lamelă şi ţinând cu un deget o latură a lamelei, se etalează preparatul prin bătăi ritmice şi sistematice în lamelă, cu un băţ de chibrit, pentru dispunerea celulelor într-un singur strat şi dispersarea cromosomilor în celule. Eliminarea excesului de soluţie şi desăvârşirea dispersării celulelor şi a cromosomilor se

realizează cu ajutorul unei hârtii de filtru, apăsând cu degetul mare peste lamelă, fără a o mişca. Pentru a împiedica împrăştierea cromosomilor şi pentru o bună fixare a celulelor pe lamă, se recomandă ungerea acesteia înaintea executării preparatului cu albumină glicerinată. Lama unsă este trecută cu partea uscată deasupra unei flăcări, evitând coagularea albuminei glicerinate.

Cu cât etalarea se efectuează mai bine, cu atât preparatul este mai bun, prezentând cromosomii bine dispersaţi şi individualizaţi. Trebuie evitată deplasarea lamelei pe lamă în timpul etalării, fapt ce duce la rostogolirea celulelor şi la compromiterea parţială sau totală a preparatului. După etalare, între lamă şi lamelă, trebuie să se observe cu ochiul liber un strat foarte fin de material celular colorat în violet.

Preparatele astfel obţinute, se pot observa la microscop imediat după efectuare, timp de câteva ore, deoarece la lumină şi la temperatura camerei, colorantul va dispersa în citoplasmă.

Efectuarea preparatelor semipermanente

Pentru studiul preparatelor şi în ziua următoare, acestea se efectuează semipermanent, pentru a evita evaporarea acidului acetic 45%, ceea ce ar duce la deshidratarea celulelor. Astfel de preparate se realizează prin parafinarea marginilor lamelei, sau prin adăugare de glicerină pe marginile acesteia, la contactul cu lama şi îndepărtarea excesului de glicerină cu ajutorul unei hârtii de filtru. Lamele semipermanente se pot păstra la frigider timp de 24 - 48 de ore. După o păstrare îndelungată, colorarea se intensifică, cuprinzând şi citoplasma.

Efectuarea preparatelor permanente prin includere în balsam de Canada

Preparatele microscopice pe care dorim să le păstrăm timp îndelungat, cu scopul de a servi drept model, sau ca dovadă a unei cercetări ştiinţifice, se montează în balsam de Canada (răşină miscibilă cu xilenul sau toluenul). În jurul lamelei se pune o picătură de alcool 96% şi cu ajutorul unei lame de ras, se desprinde cu atenţie lamela de pe lamă, printr-o mişcare de ridicare a lamelei. Materialul de studiu rămâne prins de lamă şi de lamelă. Atât lama, cât şi lamela, se trec prin două băi succesive de alcool etilic absolut sau alcool butilic şi două băi de xilen sau toluen, timp de 2-5 min., pentru fiecare baie.

Rolul alcoolului este acela de a deshidrata ţesuturile şi de a le spăla de acidul acetic; xilenul va înlocui apa din ţesuturi; de asemenea, balsamul de Canada este miscibil cu xilenul.

Lamele se introduc în pahare Borel sau orice alt tip de pahar, iar lamelele în capsule de sticlă sau porţelan, întotdeauna cu preparatul biologic plasat la faţa superioară. Pe lama umedă, în regiunea unde sunt celule, se pune o picătură de balsam de Canada, iar deasupra se aplică o lamelă curată şi degresată. Pe aceeaşi lamă, alături (în regiunea fără celule) se pune o altă picătură de balsam de Canada peste care se aşează lamela iniţială, cu faţa ce conţine celulele, în jos. Se îndepărtează excesul de balsam de Canada printr-o uşoară apăsare pe lamele, cu o bucată de hârtie de filtru, realizându-se astfel, şi prinderea lamelelor de lamă. Preparatul se usucă la termostat, la 400C, timp de câteva zile şi se etichetează (se notează specia şi ţesutul din care s-a efectuat preparatul, metoda de colorare, data, eventual numele persoanei care a efectuat preparatul etc.), putând fi păstrat apoi timp îndelungat.

Examinarea preparatelor la microscopul optic

Examinarea preparatelor se efectuează în lumină puternică, cu folosirea unui filtru verde, care măreşte contrastul între cromosomi şi citoplasmă. Se recomandă ca observarea să înceapă cu obiectivul 10x, apoi, se schimbă obiectivele 20x, 40x şi chiar 90x (cu imersie în ulei de cedru).

Deoarece reactivul Schiff colorează selectiv numai ADN-ul, la microscopul optic, se vor observa cromosomii coloraţi în roşu-violet; nucleolii, citoplasma şi organitele celulare rămânând incolore. Pereţii celulari nu se colorează, fiind greu vizibili, de culoare gălbuie; uneori se observă doar cromosomii celulelor în diviziune şi nucleii celulelor în interfază. Pentru a delimita celulele, se poate realiza o uşoară colorare a citoplasmei, cu o soluţie alcoolică foarte slabă de verde de metil. Această colorare se realizează înaintea efectuării preparatului permanent, prin trecerea lamei şi a lamelei pentru un timp foarte scurt (câteva secunde), prin soluţie alcoolică de verde de metil. Astfel, citoplasma se colorează în verde deschis şi celulele pot fi uşor delimitate, iar cromosomii se observă mai bine, datorită contrastului de culoare.

La microscopul optic se vor observa celule în interfază cu nuclei mici, coloraţi în roşu-violet, cu nucleoli incolori, ce apar ca nişte corpusculi luminoşi de formă mai mult sau mai puţin rotundă. Se observă şi celule în diferite faze ale diviziunii mitotice:

celule în profază timpurie, când cromosomii încep să devină vizibili la microscopul optic şi au aspectul unor filamente fine şi subţiri; în profaza târzie, când cromosomii se

individualizează, fiind situaţi în nucleu. Spre sfârşitul profazei se dezorganizează membrana nucleară;

celule în metafază (fază cu frecvenţă ridicată în preparatele microscopice, în cazul în care s-a efectuat prefixarea); se pot număra şi observa morfologic cromosomii care au atins maximul spiralizării, fiind bine individualizaţi. La Allium cepa L. (2n = 16) se pot observa cu

uşurinţă şi se pot număra 16 cromosomi, de forma unor bastonaşe, cu capetele mai mult sau mai puţin îndoite. Prin studiu mai amănunţit cu obiectivul de imersie se poate observa morfologia fiecărui cromosom în parte, putându-se executa microfotografii;

celule în anafază – în anafază timpurie, cu cromosomii fii unicromatidici ce se deplasează spre polii celulei şi anafază târzie, cu cromosomii fii la cei doi poli ai celulei, sub formă de stea - diaster;

celule în telofază timpurie, când cromosomii fii au ajuns la polii celulei şi telofază târzie, caracterizată prin formarea nucleilor fii şi apariţia peretelui despărţitor (fragmoplastul).

2.1.2. Metoda rapidă de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n=16) în mitoză

cu soluţie carmin-acetică Metoda a fost elaborată în 1926 de către Belling (cf. Tudose, 1967)şi se bazează pe faptul

că acidul carminic (din colorantul natural carmin, extras din femelele homopterului Coccus cacti),

se comportă ca un colorant acid în soluţie alcalină şi se încarcă negativ, iar în soluţie acidă, ca un colorant bazic, încărcându-se pozitiv. Această metodă este des folosită în studiile de citogenetică vegetală, deoarece este uşor de efectuat, necesitând un timp scurt.

Materialul biologic, sticlăria, instrumentarul şi reactivii utilizaţi sunt identici cu cei folosiţi în cazul metodei Feulgen.

Colorantul utilizat este soluţia carmin acetică (55 cm3 apă distilată la 1000C, 45 cm3 acid acetic glacial şi 0,5 g carmin). Amestecul se pune într-un balon de sticlă, se agită şi se aşează în bain-marie, lăsându-se să fiarbă câteva minute. Se agită din nou şi se lasă să se răcească; se filtrează şi se adaugă câteva cristale de acetat de fier (cu rol de mordant), ce se dizolvă încet în soluţie, excesul depunându-se la baza vasului. Se păstrează la întuneric şi la rece (la frigider).

Etape de lucru: Prefixarea Prefixarea materialului biologic lipseşte, sau poate fi efectuată la fel ca la metoda Feulgen. Fixarea

Fixarea nu este necesară; se poate realiza în fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 2 - 12 ore, sau cu alt fixator. Dacă nu se continuă lucrul, materialul poate fi păstrat la rece, în fiole cu alcool 70%, bine închise.

Hidroliza şi colorarea

Hidroliza şi colorarea se efectuează simultan, în soluţia carmin-acetică. Într-o sticlă de ceas sau o capsulă de porţelan, se pun 3 - 5 cm3 colorant carmin acetic, peste materialul de studiat (rădăciniţe de 10 - 15 mm lungime). Pentru realizarea hidrolizei se adaugă câteva picături (10 - 15) de HCl 1N; se încălzeşte 20 - 25 min. la flacăra unei lămpi de spirt sau a unui bec de gaz, evitând fierberea şi agitând, până când materialul capătă culoarea roşu închis, devine moale şi se lasă la baza vasului.

Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele microscopice se realizează pe o lamă de microscop, într-o picătură de carmin acetic, în care se aşează vârful unei rădăciniţe. Pentru intensificarea culorii, se amestecă uşor colorantul cu ajutorul unei spatule metalice. Se aşează deasupra o lamelă, se etalează şi se îndepărtează excesul de colorant, în acelaşi mod ca la metoda Feulgen.

2.1.3. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale

Studiul cromosomilor la animale se poate realiza direct – în ţesuturile cu activitate mitotică intensă (ţesut hematopoetic, hepatic, splenic, gonadal, epiteliul cornean, ţesuturi embrionare sau de regenerare, cât şi indirect – în culturi de ţesuturi.

Metode pentru studiul cromosomilor în diferite ţesuturi provenite de la animale

adulte Studiul cromosomilor la peşti (Fam. Cyprinidae). Tehnica Ohno (1965)

Material biologic: splină, rinichi, gonade, branhii.

Reactivi: colchicină 0,5%, apă distilată, acid acetic 50%, HCl 1N, colorant Giemsa. Instrumentar: lame de microscop, lamele, seringă, foarfece, ac spatulat, pensete etc. Etape de lucru: Pretratament

Pretratamentul se realizează cu colchicină. Colchicina blochează celulele în diviziune în stadiul de metafază, prin inhibarea activităţii fusului nuclear, determinând acumularea în ţesuturile tratate a unui număr sporit de metafaze, cu cromosomii bine individualizaţi, liberi în citoplasmă.

Se injectează animalele adulte intramuscular (în musculatura dorsală) cu soluţie de colchicină 0,5%, în cantitate de 0,5-1 ml. (în funcţie de talie), cu două ore înainte de sacrificare.

Tratament Tratamentul se realizează cu soluţie hipotonică (hipotonă), ce determină o umflare şi o

fluidizare a citoplasmei celulare, permiţând astfel dispersarea cromosomilor, deci o etalare superioară.

După sacrificarea animalului se recoltează splina, rinichiul, gonadele şi branhiile, care se fragmentează în bucăţi de aproximativ 2 mm3. Hipotonia se realizează în apă distilată, la pH neutru, timp de 15 min., la temperatura camerei.

Fixare Fixarea are rolul de a omorî celulele, fără să altereze componentele celulare. Drept fixator

se foloseşte soluţia de acid acetic 50%, timp de 15-30 min., la temperatura camerei. Hidroliză Hidroliza se efectuează în scopul macerării ţesuturilor, în vederea facilitării pătrunderii

colorantului în nucleu; se realizează cu HCl 1N, la 600C, timp de 10-15 min. Colorare Colorarea se realizează cu soluţie Giemsa, în scopul obţinerii contrastului necesar

examinării microscopice a cromosomilor. Efectuare de preparate microscopice de tip squash

Pe o lamă de microscop, într-o picătură de acid acetic 45%, se plasează un fragment de ţesut, se acoperă cu lamela şi se etalează prin bătăi ritmice cu un băţ de chibrit.

Preparatele se pot realiza permanente în balsam de Canada, după tehnica descrisă. Studiul cromosomilor la amfibieni. Tehnica Spurway şi Callan (1960)

Această tehnică este utilizată pentru evidenţierea cromosomilor din celulele ţesutului gonadal (testicul), la diferite specii de Triturus.

Etape de lucru: Tratament

Pentru studiul cromosomilor metafazici este necesară înlocuirea tratamentului hipotonic cu o colchicinizare cu soluţie de colchicină 0,04% în apă distilată, timp de 30 min., la 370C.

Fixare

Ţesutul gonadal fragmentat se fixează 2-3 ore în fixator alcool acetic 3/1. Colorare Colorarea se realizează cu soluţie carmin acetică 2%, cu acetat de fier, timp de 10 min. Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele se efectuează prin tehnica squash. Se plasează o porţiune din ţesutul colorat pe lamă şi se acoperă cu lamela, apoi se presează uşor pentru etalare.

Efectuarea preparatelor permanente

Preparatul se introduce în acid acetic 10% pentru desprinderea lamelei şi se trece în alcool acetic 3/1, timp de câteva secunde. Ulterior se trec atât lama, cât şi lamela prin două băi de alcool şi două băi de xilol, apoi se montează preparatul în balsam de Canada.

Studiul cromosomilor la mamifere. Tehnica Fredga (1964) Material biologic: cornee de şobolan, şoarece, hamster, cobai. Hipotonia

Se asfixiază animalul (şobolan, şoarece, hamster, cobai) cu eter sau cloroform şi se extirpă globii oculari cu un foarfece fin şi o pensă curbă, evitând atingerea corneei. Globii oculari se plasează într-un vas cu soluţie hipotonă de citrat de sodiu 0,7% (în apă distilată), la 370C, timp de 30 min.

Fixarea

Fixarea materialului se realizează în soluţie de acid acetic 50% - 9 părţi şi o parte HCl 1N, 5 min.

Colorarea Colorarea se realizează în soluţie de orceină acetică 2%, 2 min. Efectuarea preparatelor microscopice

Globul ocular se plasează pe o lamă de microscop curată şi cu un ac spatulat se răzuie celulele din epiteliul cornean într-o picătură de colorant. Se acoperă cu lamela şi se presează cu grijă, realizându-se un preparat de tip squash.

3. Meioza

Este procesul complex de diviziune, în urma căruia rezultă celule-fiice cu număr de cromosomi redus la jumătate faţă de celula-mamă (de la care s-a pornit în diviziune). Termenul provine de la grecescul meiosis (reducere).

Ca rezultat al meiozei se formează gameţii la animale şi sporii la plante, acest tip de diviziune făcând trecerea de la un nucleu diploid (2n), la unul haploid (n), diplofaza fiind înlocuită cu haplofaza. Reducerea la jumătate a numărului de cromosomi în cursul meiozei, este un proces indispensabil, pentru că, prin unirea în procesul fecundaţiei a gameţilor paterni (cu n cromosomi), cu cei materni (tot cu n cromosomi), are loc, în zigot, restabilirea numărului iniţial (2n) de cromozomi, şi nu dublarea acestuia.

Deci, pentru toate organismele ce se înmulţesc pe cale sexuată, este obligatoriu procesul alternării fazelor ce se deosebesc după numărul de cromosomi (haplofaza şi diplofaza); ciclul de viaţă individual cuprinde ambele faze.

Meioza reprezintă un proces complex, ce implică desfăşurarea succesivă a două diviziuni. Cele două diviziuni, sunt precedate de o interfază premeiotică (identică cu interfaza mitotică) şi separate de o interfază meiotică scurtă, din care lipseşte perioada sintetică (replicarea ADN). Prima diviziune meiotică este denumită şi reducţională (heterotipică), iar a doua diviziune este denumită ecvaţională (homeotipică sau de maturaţie).

Schematic meioza poate fi redată astfel:

Prima diviziune meiotică Ca şi în cazul diviziunii mitotice, autoreplicarea ADN-ului precede meioza, astfel încât, la

începutul profazei, fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide surori (este bicromatidic). Profaza І Această etapă este împărţită în cinci stadii: leptoten, zigoten, pachiten, diploten şi

diachineză. Leptotenul (leptonemul) - de la grecescul lepto = subţire; tenuis = panglică. Materialul cromatic din interfază începe să se condenseze. Cromosomii sunt încă foarte

despiralizaţi şi se individualizează sub forma unor filamente lungi şi fine de cromatină. Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide surori unite la nivelul centromerului şi intim asociate, ceea ce conferă cromosomului un aspect monocromatidic. Cromosomii sunt ataşaţi cu ambele capete de învelişul nuclear, prin intermediul unor structuri specializate, numite plăci de ataşare.

n

n

n

n

n

n

2n

n

Diviziunea I Diviziunea II

Între leptoten şi zigoten, în mod frecvent, se observă un stadiu intermediar, în care filamentele cromatice se adună la un loc, formând un ghem compact (spirem).

Spre sfârşitul leptotenului, se observă tendinţa aşezării paralele a cromosomilor omologi.

Fig. 14 Zea mays L. profaza I - leptoten (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Zigotenul (zigonemul) – de la grecescul zygo = jug.

Acest stadiu se caracterizează prin conjugarea cromosomilor omologi (unul de origine maternă şi celălalt de origine paternă), proces denumit sinapsis (sinapsare). Sinapsisul începe

prin condensarea fiecărui cromosom în jurul unei structuri denumită element axial, care este aparent de natură proteică.

După aceea, elementele axiale ale cromosomilor corespunzători se dispun faţă în faţă, şi constituie elementele laterale ale unei structuri tripartite (complexul sinaptonemal), fiind separate

de un element central, cu care sunt conectate prin intermediul unor benzi proteice transversale, dispuse în mod similar treptelor unei scări.

Conjugarea cromosomilor omologi, ce formează bivalenţii, are loc treptat. Din punctul de iniţiere, conjugarea se extinde progresiv, cuprinzând integral cromosomii prealiniaţi într-o manieră “zipper - like” (engl. zipper = fermoar; like = ca şi). Când cei doi cromosomi nu sunt perfect omologi, conjugarea se produce numai între porţiunile omoloage. Conjugarea cromosomilor X şi Y, este posibilă datorită existenţei la cei doi cromosomi de sex a unei regiuni terminale omoloage. Se presupune că forţele care determină conjugarea sunt de natură electrostatică sau hidrodinamică.

În acest stadiu cromosomii sunt în număr diploid. La autopoliploizi (3x, 4x etc.) numărul cromosomilor împerecheaţi poate fi mai mare de doi. Deci, în loc de bivalenţi, vor fi multivalenţi (trivalenţi, tetravalenţi etc.).

Pachitenul (pachinemul) – de la grecescul pachy = gros În acest stadiu, continuă scurtarea şi îngroşarea cromosomilor ce formează bivalenţii.

Scurtarea este atât de intensă, încât devine evidentă structura dublu cromatidică a fiecărui cromosom. Astfel, cei doi omologi ai bivalentului formează o figură tetracromatidică, numită tetradă. Numărul tetradelor este egal cu jumătate din numărul diploid al cromosomilor.

Orice modificare în structura cromosomilor, care alterează omologia, poate fi eventual decelată prin analiza bivalenţilor în pachiten.

Spre sfârşitul pachitenului se observă încrucişarea reciprocă a celor doi cromosomi omologi din acelaşi bivalent. Are loc schimbul reciproc de segmente între cromosomii omologi, ca rezultat al crossing-overului (recombinarea intracromosomială).

Fig. 15 Zea mays L. profaza I - pachiten (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Diplotenul (diplonemul) – de la grecescul diplo = dublu Este stadiul în care, între cromosomii omologi încep să acţioneze forţe de respingere,

aceştia îndepărtându-se între ei, începând din zona centromerilor spre extremităţi. Omologii mai rămân încă uniţi în anumite puncte, denumite chiasme, considerate a reprezenta locul în care s-a

realizat schimbul fizic între cromosomi. Deşi încep să se formeze în pachiten, chiasmele devin vizibile numai după desinapsarea cromosomilor ce alcătuiesc bivalentul. S-a constatat absenţa

chiasmelor în regiunile heterocromatinice. Deci, aceste regiuni nu sunt antrenate în evenimente crosing-over.

Diachineza – în limba greacă dia = prin şi kinesis = mişcare. Cromosomii continuă contractarea, fiind uşor vizibili la microscop şi se detaşează de

membrana nucleară. Se remarcă fenomenul de terminalizare a chiasmelor (adică migrarea chiasmelor intercalare spre capetele cromosomilor), care face ca bivalenţii să capete de regulă forme inelare, omologii rămânând asociaţi prin capetele lor.

În cursul acestei faze, nucleolul şi membrana nucleară se dezintegrează şi cei doi centromeri ai fiecărei tetrade se ataşează de fibrele fusului nuclear, ce a apărut concomitent cu ruperea membranei nucleare.

Fig. 16 Zea mays L. profaza I - diploten (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Metafaza I

În această etapă a primei diviziuni, cromosomii ating maximum de scurtare şi îngroşare. Bivalenţii migrează spre placa metafazică şi se dispun într-un singur plan, perpendicular pe fibrele fusului. Sunt încă vizibile chiasmele terminale ale fiecărei tetrade. În cadrul fiecărei tetrade, centromerul unuia din cromosomii bivalenţi este orientat spre un pol, iar centromerul celuilalt cromosom al aceluiaşi bivalent, spre celălalt pol al fusului. Orientarea centromerilor cromosomilor de origine maternă ori paternă, către un pol sau celălalt este aleatorie (recombinare intercromosomială sau „dansul cromosomilor”). În această fază, cromosomii se colorează

intens, astfel încât pot fi uşor număraţi şi studiaţi din punct de vedere morfologic. Anafaza I

Omologii din cadrul fiecărei tetrade se separă, în urma disjuncţiei rezultând câte doi cromosomi univalenţi ce încep să migreze spre polii opuşi (în funcţie de orientarea centromerilor). Segregarea aleatorie a acestor cromosomi, stă la baza principiului mendelian al segregării independente a factorilor ereditari. Jumătatea de origine paternă a fiecărei tetrade va migra către unul sau celălalt pol (în mod aleatoriu), iar jumătatea de origine maternă va migra în fiecare caz către polul opus.

La sfârşitul anafazei I, la fiecare pol al fusului, se află câte un set haploid de cromosomi.

Fig. 17 Zea mays L. profaza I - diakineză (stânga) şi metafaza I (dreapta) (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Dacă nu a avut loc nici un crosing-over în profaza I, fiecare cromosom univalent va fi

alcătuit doar din cromatidele de origine maternă ori paternă.

Fig. 18 Zea mays L. - anafaza I (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Telofaza I Cromosomii univalenţi, ajunşi la cei doi poli, suferă procese inverse celor din profază (se

despiralizează). În jurul fiecărui set haploid de cromosomi, se formează membrana nucleară. În final, se formează cei doi nuclei, în fiecare aflându-se câte jumătate din cromosomii nucleului celulei iniţiale. Apoi, are loc divizarea citoplasmei şi apariţia a două celule (denumite celule în diadă) cu nuclei haploizi (n).

După telofaza I, urmează o scurtă interchineză, şi apoi începe a doua diviziune meiotică (diviziune de maturaţie). La majoritatea speciilor, telofaza I şi interchineza sunt foarte scurte. La unele specii aceste faze lipsesc. În această scurtă interfază, nu are loc replicarea ADN-ului.

Fig. 19 Zea mays L. telofaza I (stânga) şi profaza II (dreapta) (Mertens şi Hammersmith, 1998)

A doua diviziune meiotică A doua diviziune a meiozei (diviziunea de maturaţie), este de fapt o diviziune mitotică.

Prezentăm fazele pe scurt: Profaza a II a Lipseşte la organismele care nu au nici interchineză. Acolo unde este prezentă, are loc

simultan în cele două celule ale diadei. Deci, în fiecare din aceste două celule, cromosomii se spiralizează, se scurtează şi se individualizează. Sunt bicromatidici (univalenţi).

Se formează fusul de diviziune. Metafaza a II a

Cromosomii se inseră pe filamentele fusului de diviziune şi migrează în placa ecuatorială, dispunându-şi centromerii în acelaşi plan.

Fig. 20 Zea mays L. metafaza II (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Anafaza a II a Cromatidele surori ale fiecărui bivalent se separă şi se deplasează către polii opuşi ai

fusului. Telofaza a II a

Cromosomii ajunşi la polii fusului de diviziune se despiralizează. În final, dintr-o diadă “n” se formează o tetradă (patru celule) “n”.

În urma proceselor morfofiziologice, cele patru celule ale tetradei se transformă în gameţi.

Fig. 21 Zea mays L. anafaza II (stânga) şi telofaza II (dreapta) (Mertens şi Hammersmith, 1998)

Fig. 22 Zea mays L. - Citokineză şi formarea tetradei (Mertens şi Hammersmith, 1998)

A doua diviziune a meiozei, după mecanismul de desfăşurare este asemănătoare mitozei,

dar prezintă şi deosebiri. Diferenţa principală constă în faptul că, datorită crossing-overelor ce au loc în profaza I, cromatidele surori nu sunt identice. Cromosomii ce au participat la crosing-over sunt o combinaţie de informaţie genetică de origine maternă şi paternă. O altă deosebire este că, în mitoză unitatea funcţională este cromatida, iar în meioză unitatea funcţională este cromosomul (două cromatide).

4. Metode de studiu a cromosomilor in meioza

4.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante

Metoda de colorare rapidă carmin-acetică Această metodă a fost elaborată de Belling (1926) şi ea se bazează pe capacitatea

acidului carminic ca în soluţie alcalină să fie încărcat negativ şi să se comporte ca un colorant acid, iar în soluţie acidă să fie încărcat pozitiv şi să se comporte ca un colorant bazic. Colorantul carmin care se foloseşte în mod curent în citologie este preparat dintr-un extract al femelelor homopterului Coccus cacti. Acest colorant nu este pur din punct de vedere chimic, acidul carminic fiind însă

constituentul pe care se bazează activitatea sa. Pentru intensificarea capacităţii sale de colorare, în soluţia de carmin în acid acetic se adaugă acetat de fier.

Ca material biologic, se foloseşte secara – Secale cereale L. (2n=14). În general, la secară ca şi la alte cereale, meioza are loc în momentele când tinerele antere

şi-au pierdut transluciditatea. Spicele sunt recoltate în faza de “burduf” când au lungimea de 4-6 cm, fiind învelite în teaca ultimei frunze.

Pentru studiul cromosomilor sunt necesare următoarele operaţii: Etape de lucru Fixarea

Se face în fixator (soluţie alcool-acid acetic în proporţie de 3 :1), sau în soluţie Carnoy, în care anterele se lasă 24-48 de ore. Se pot conserva fie în fixator, fie în alcool de 700 (în fiole bine închise şi la rece 0-40C, materialul se poate păstra timp îndelungat. Operaţia fixării poate lipsi, după cum nici hidroliza nu este absolut necesară.

Colorarea şi efectuarea preparatelor microscopice

Se ia un spic, se prelevă florile din partea de mijloc şi se scot staminele (câte 3 stamine în fiecare floare). Fiecare stamină se plasează pe o lamă curată, într-o picătură de soluţie carmin acetică. Cu un ac spatulat se taie transversal la mijloc şi apoi se apasă încet pe cele două jumătăţi pentru a goli antera de conţinut, adică de celulele mamă ale granulelor de polen unde are loc meioza. Se îndepărtează resturile staminei cu o pensetă fină. Peste acest material se pune o lamelă curată şi uscată, (sau unsă cu albumină glicerinată şi trecută prin flacără), după care cu o

bucată de hârtie de filtru se apasă pe lamelă pentru a etala bine celulele şi pentru a îndepărta excesul de colorant.

Colorarea materialului are loc foarte repede, astfel că imediat poate începe observarea la microscop. Pentru intensificarea colorării, se poate încălzi lama câteva minute deasupra unei flăcări de la o lampă de spirt, evitând fierberea.

Pentru a evita evaporarea soluţiei, se parafinează marginile lamelei sau se pune soluţie de lipit cauciucul.

Examinând preparatul la microscop, pot fi întâlnite trei situaţii: 1. nu a început diviziunea, anterele fiind prea tinere – în acest caz, celulele mamă ale

granulelor de polen sunt în interfază. 2. a început diviziunea – se observă celule în diferite faze ale meiozei. 3. s-a terminat diviziunea - se vor observa grăuncioarele de polen care au formă

caracteristică. În general se consideră că staminele din aceeaşi floare se află în aceeaşi fază de diviziune.

Dacă la microscop nu am găsit diviziuni meiotice, se caută flori spre baza sau spre vârful spicului (înfloritul în cadrul unui spic începe mai întâi la mijlocul spicului şi se propagă apoi spre baza şi vârful spicului).

Pentru cercetare se recomandă folosirea metodei Feulgen pe care o vom descrie în continuare (cromosomii se colorează mai bine, contrastul este mai mare între cromosomi şi citoplasmă şi în general se obţin preparate mai bune).

Studiul cromosomilor în meioză prin metoda de colorare Feulgen Această metodă a fost elaborată de Feulgen şi Rossenbeck (1924) şi apoi modificată de

De Tomasi (1936). În celulele în diviziune numai cromatina cromosomilor se colorează efectiv în

roşu-violaceu de către fuxină, în timp ce acidul ribonucleic din nucleoli şi citoplasmă nu se colorează. Reacţia Feulgen pozitivă este considerată ca fiind un indice sigur al prezenţei acidului dezoxiribonucleic.

Pentru studiul meiozei prin metoda Feulgen se poate folosi ca material biologic secara – Secale cereale L. (2n=14).

În general meioza are loc în momentele când tinerele antere îşi pierd transluciditatea, acest moment coincizând la grâu şi la secară cu faza în care spicele sunt în burduf şi au o lungime de 3-6 cm. Pentru a repera momentul când are loc meioza folosim metoda rapidă carmin-acetică (descrisă anterior). În cazul în care la microscop am găsit diviziuni meiotice se fixează întregul spic.

Sunt necesare următoarele operaţii: Fixarea

Se realizează în soluţie alcool etilic absolut : acid acetic glacial (3:1). În momentul fixării se adaugă o picătură de soluţie de perclorură de fier la cca. 5 cm3 de fixator. Fixarea se efectuează în fiole de sticlă în care se pun 2-3 cm3 de fixator. În fixator anterele se lasă cel puţin o oră la temperatura camerei, sau cel mult 24-48 de ore în frigider, după care se trec în alcool absolut pentru o jumătate de oră, pentru îndepărtarea acidului acetic din ţesuturi. De aici materialul se trece în fiole cu alcool de 700 care se închid ermetic prin parafinare şi se pun în frigider la 0-40C, unde se pot păstra timp îndelungat. Dacă materialul se păstrează în alcool de 700 timp mai îndelungat, se poate renunţa la trecerea prin alcool absolut.

Hidroliza

Materialul se scoate din alcool 700 după ce a stat cel puţin o jumătate de oră şi se spală cu apă. În acest scop se îndepărtează alcoolul din fiole, se pune apă şi se agită anterele până ce cad la fund. Materialul se lasă în apă o jumătate de oră, după care se face hidroliza în acid clorhidric normal, la temperatura de 600C, timp de 12 min. la orz, 8-9 min. în cazul grâului etc.

Colorarea Se face în soluţie de fuxină bazică (reactivul Schiff) în care materialul se lasă cel puţin o

jumătate de oră. În colorant anterele pot rămâne câteva ore, timp în care se fac preparatele microscopice. Nu se recomandă ca materialul să rămână prea mult timp în colorant deoarece se reduce contrastul dintre culoarea cromosomilor şi a citoplasmei, iar preparatele au o ca litate mai slabă.

Efectuare preparatelor microscopice

Pe o lamă de microscop se pune o picătură de acid acetic 45% şi în aceasta se plasează o stamină. Cu un ac spatulat se taie transversal stamina în două jumătăţi. Se apasă uşor pe ele până ce ies celulele mame ale granulelor de polen şi apoi sacii polinici se îndepărtează. Peste material se pune o lamelă unsă cu albumină glicerinată şi trecută prin flacăra unei lămpi de spirt. Cu o bucată de hârtie de filtru se apasă pentru etalarea celulelor şi pentru îndepărtarea excesului de soluţie.

Pentru a păstra preparatele câteva zile se poate parafina marginea lamelei sau se poate pune soluţie de lipit cauciucul. Preparatele permanente se pot face prin montarea în euparal sau balsam de Canada.

5. Cariotip si idiograma

5.1. Definirea termenilor, nomenclatură

La conferinţa de la Denver (1960), termenul de cariotip a fost definit ca fiind “o aranjare sistematică a cromosomilor unei singure celule, preparaţi prin desenare sau fotografiere, în înţelesul lărgit conform căruia cromosomii unei singure celule pot reprezenta cromosomii unui individ sau chiar ai unei specii”, iar termenul de idiogramă ca “reprezentarea diagramatică a unui cariotip, care se bazează pe măsurători ale cromosomilor din câteva sau din mai multe celule”.

Cariotipul, reprezintă în esenţă, numărul, forma şi mărimea cromosomilor, este constant în

ontogenia şi chiar în filogenia unei specii, fiind tot mai des utilizat în taxonomie. Studiul cariotipului furnizează elemente pentru analiza procesului de speciaţie, pentru

cunoaşterea gradului de înrudire între specii etc. Pentru fiecare specie, există un cariotip standard. Eventualele rearanjamente

cromosomiale (eliminări de cromosomi, duplicaţii, translocaţii, deleţii etc.), se pot stabili prin

comparaţii cu cariotipul standard. Indivizii aceleiaşi populaţii care au o altă aranjare a genelor pe cromosomii omologi

(consecinţă a modificărilor structurale ale cromosomilor), sunt denumiţi heterocariotipici, antonimii lor fiind cei homocariotipici.

În funcţie de tipul cromosomilor pe care îi conţine, un cariotip poate fi simetric (toţi cromosomii sunt de acelaşi tip) sau asimetric. Cariotipul cu cromosomi uniformi, este considerat primitiv comparativ cu cel cu cromosomi neuniformi. Sensul evoluţiei cariotipului se consideră a fi acela al reducerii numărului de bază al cromosomilor şi asimetrizării lui (prin inversii, translocaţii, fuziuni centrice, etc.).

Metodologia elaborării unei analize cromosomiale Indiferent de materialul celular din care au fost preparaţi cromosomii, sau de provenienţa de

specie a acestora, pentru a obţine maximum de informaţii citogenetice este necesară adoptarea unui procedeu de lucru care conţine mai multe etape.

Stadiul de diviziune cel mai adecvat analizei cariotipului, este metafaza mitotică, când cromosomii prezintă maximum de condensare şi colorabilitate.

În continuare, vom prezenta pe scurt etapele de lucru necesare alcătuirii cariotipului. Etapa prelucrării microscopice A. Vizualizarea preparatelor microscopice. Căutarea metafazelor presupune baleierea

(mişcarea lamei microscopice în sens orizontal sau vertical), fără a omite nici o porţiune pe care se află celule. Are ca scop:

Alegerea metafazelor potrivite analizei citogenetice. Procentajul metafazelor apte

studiului citogenetic, este extrem de variabil, depinzând de materialul celular studiat, de tehnica de preparare a cromosomilor, de abilitatea şi experienţa examinatorului. Căutarea metafazelor trebuie făcută cu un obiectiv cât mai mic (maxim 10x). Se poate schimba obiectivul cu unul mai mare (20x sau 40x), pentru a rezolva anumite incertitudini. În alegerea metafazelor utilizabile sunt esenţiale două criterii: să nu existe suprapuneri de cromosomi, sau dacă sunt, numărul lor să fie mic şi să nu intereseze mai mult de doi cromosomi; cromosomii să nu fie împrăştiaţi pe o suprafaţă prea mare, iar dispunerea lor să păstreze o formă variabilă între un cerc şi un patrulater. Acest ultim criteriu, este deosebit de important, deoarece poate elimina metafazele sparte, cu cromosomi pierduţi, care la examenul ulterior pot să sugereze apariţia de complemente cromosomiale cu cromosomi lipsă.

B. Studiul microscopic al cromosomilor. Etapa observaţiei directe a cromosomilor,

urmăreşte obţinerea primelor rezultate citogenetice asupra materialului celular în studiu prin:

Numărătoarea de cromosomi, care prezintă o mare importanţă, fiind prima

caracteristică citogenetică a populaţiei celulare examinate. Această numărătoare se poate face direct în placa metafazică, delimitând eventual anumite regiuni, dar mai precisă este numărarea după fotografie. Mai demult, se număra după desen (se desenau schematic cromosomii pe o coală de hârtie, sau prin procedeul clasic , folosind camera clară).

Identificarea cromosomilor aparţinând la diferite grupe (de exemplu din grupele D şi G ale cariotipului uman, din grupele M sau S la Vicia faba, etc.

Pentru elaborarea unui cariotip, prima condiţie este identificarea morfologică a cromosomilor.

Metode de identificare a cromosomilor Procedeul cel mai larg folosit în studiul cromosomilor metafazici, este acela al

măsurătorilor. Se măsoară lungimea integrală a cromosomilor, lungimea braţelor cromosomiale, poziţia constricţiilor secundare în raport cu aceea a centromerului etc.

Dar aceste criterii nu permit întotdeauna o identificare precisă a cromosomilor. Dificultăţile ţin mai ales de existenţa unor fluctuaţii care pot masca considerabil diferenţele reale dintre cromosomi. La fluctuaţiile strict biologice se pot adăuga: imprecizia măsurătorilor (eroarea personală, eroarea optică), heteropicnoza unor regiuni cromosomiale sau a unor cromosomi întregi (cromosomii sexului de exemplu), gradul de întindere al regiunii centromerice, momentul metafazic pe baza căruia se efectuează analiza etc. Se ştie de exemplu că, maximum de contractare este atins de către cromosomii mai mari în stadiile mai avansate ale metafazei, în timp ce cromosomii mici ating acest nivel în stadii mai timpurii.

Deşi metoda analizei cromosomiale prin măsurători a fost contestată (Patau, 1965) ea a

rămas până în prezent una dintre metodele de bază pentru identificarea cromosomilor. În caracterizarea acestora, conferinţa de la Denver a adoptat următorii trei parametrii:

1. lungimea fiecărui cromosom, raportată la lungimea totală a unui complement haploid normal exprimată la 1000;

2. raportul braţelor cromosomiale exprimat prin raportul dintre braţul lung / braţul scurt; 3. indexul centromeric exprimat prin raportul dintre braţul scurt şi lungimea totală a

cromosomului, raportat la 100 (braţul scurt / cromosom înmulţit cu 100). În afara acestor parametrii, Patau, recomanda reprezentarea cromosomilor sub formă de

puncte într-un sistem de coordonate, în care, pe abscisă s-ar nota lungimea braţului lung, iar pe ordonată lungimea braţului scurt, ambele exprimate în procente din lungimea totală a complementului cromosomial haploid (cariogramă).

Pentru identificarea morfologică a cromosomilor, poziţia centromerului, una din caracteristicile cele mai constante ale cromosomului, poate fi exprimată prin relaţiile:

d = l-s; sau r = l/s în care l şi s reprezintă lungimea braţului lung şi respectiv a celui scurt al cromosomului, d

diferenţa între braţul lung şi scurt, iar r raportul dintre braţe.

Putem calcula lungimea braţului lung conform relaţiei: l = c(100-i)/100

în care c este lungimea cromosomului iar i, indexul centromeric. Poziţia centromerului,

determinată prin asemenea relaţii, este exprimată simbolic ca mai jos: Levan şi colab. (1964) au propus denumirea standardizată a cromosomilor în funcţie de

poziţia centromerului: Cromosomi metacentrici, cu centromerul situat în punctul median (M) sau în

regiunea mediană (m) şi cu un raport al braţelor 1,0-1,7 Cromosomi telocentrici, cu centromer terminal (T) Cromosomi acrocentrici, cu centromerul în regiunea terminală (t) Cromosomi submetacentrici şi subtelocentrici cu centromerul situat în regiunea

submediană şi respectiv subterminală (raportul braţelor 1,7-3,0 şi respectiv 3,0-7,0)

Nomenclatura cromosomilor pe baza poziţiei centromerului (după Levan şi colab., 1964)

Poziţia centromerului

Nomenclatura cromosomului

Index centromeric

Raportul braţelor

Echivalarea cu nomenclatura citogenetică

curentă

Median “sensu stricto”

Regiunea mediană

Submedian

Subterminal

Regiunea terminală

Terminal “sensu stricto”

M

m

sm

st

t

T

50,0

37,5

25,0

12,5

-

0,0

1,0

1,7

3,0

7,0

-

-

Metacentric

Submetacentric

Subtelocentric

Acrocentric

Telocentric

Constricţiile cromosomiale includ constricţiile primare sau centromerice şi constricţiile secundare. Constricţiile secundare, cuprind regiuni cromosomiale diferite ca structură şi funcţie, cum sunt regiunile organizatoare nucleolare (regiunile SAT), care delimitează sateliţii de restul cromosomului şi constricţiile localizate în general interstiţial pe braţele cromosomilor.

Identificarea aberaţiilor cromosomiale are loc în primul rând în această etapă.

Observaţiile privind prezenţa anumitor aberaţii cromosomiale se vor nota pe fotografia (desenul) mitozei examinate, precizând tipul de aberaţie, localizarea sa pe cromosom şi pe braţ etc. Atunci când se urmăreşte efectul citogenetic al unui agent fizic, chimic sau biologic (radiaţii ionizate, substanţe chimice mutagene, virusuri etc.), înregistrarea aberaţiilor cromosomiale reprezintă obiectivul central al analizei cromosomiale.

Etapa prelucrării fotografice Microfotografierea se desfăşoară în mai multe etape: O primă etapă este alegerea mitozelor pentru fotografiere (o dată cu studiul

microscopic al mitozelor). Se vor alege pentru fotografiat doar metafaze foarte clare (este de dorit ca numărul acestora să fie cât mai mare, minimum 10% din mitozele examinate).

A doua etapă, fotografierea mitozelor se face cu orice dispozitiv de microfotografie.

Se utilizează filme alb-negru cu granulaţie foarte fină, cu contrast scăzut spre mediu. Pentru obţinerea de fotografii corespunzătoare, calitatea superioară a microscopului este

decisivă, în special a lentilelor utilizate la ocular şi obiectiv. Pentru fotografiere se aleg doar metafazele extrem de clare. După aceea, cromosomii sunt decupaţi şi aranjaţi în cariotip.

Prepararea cariotipurilor Se recomandă ca alcătuirea cariotipului să se desfăşoare pe baza a cel puţin două copii

fotografice ale metafazei şi imaginii microscopice însăşi a metafazei, luată cu un obiectiv cu imersie. Înainte de a trece la decuparea propriu-zisă a cromosomilor, este indicat să se verifice încă o dată toate particularităţile metafazei respective, eventualele aberaţii, limitele cromosomilor, eventuale suprapuneri, etc. Decuparea cromosomilor se face cu atenţie, tăind cu foarfeca fiecare

cromosom în parte şi lăsând întotdeauna o margine albă în jurul imaginii fotografice negre. Cromosomii decupaţi se aşează pe o coală de carton, sau hârtie mai tare, albă, pe care urmează să fie aranjat şi lipit cariotipul. Pentru decuparea cromosomilor suprapuşi se taie un cromosom dintr-o copie şi al doilea cromosom din altă copie. În această situaţie, numai imaginea la microscop precizează limitele cromosomilor.

Aranjarea cromosomilor în cariotip, (cu excepţia studiilor ce urmăresc stabilirea

cariotipului unor specii nestudiate încă), trebuie să pornească de la cunoaşterea cariotipului normal al speciei.

Primul criteriu de aranjare a cromosomilor în cariotip este cel al lungimii, cromosomii fiind dispuşi în ordine descrescătoare. Se măsoară de obicei ambele cromatide (de-a lungul axelor lor individuale) şi se face o medie a rezultatelor. Regiunea centromerică se include în măsurătoare, iar sateliţii nu se măsoară.

Al doilea criteriu, este cel al dispunerii pe grupe morfologice. Cariotipurile normale au adesea perechile de cromosomi aranjate pe grupe morfologice, care se notează cu litere

majuscule în ordine alfabetică, sau cu cifre. Aceste grupe cuprind două sau mai multe perechi de cromosomi care se identifică greu sau deloc prin mijloace uzuale ale analizei citogenetice.

Al treilea criteriu folosit în aranjarea cromosomilor în cariotip, este acela al împerecherii cromosomilor omologi. Plecând de la premisa că omologia genetică corespunde unei omologii morfologice, cromosomii presupuşi omologi sunt dispuşi în perechi sau grupe în funcţie de gradul de gradul de poliploidie al celulei respective (diploid, triploid, tetraploid etc.).

Aranjarea cromosomilor pe perechi, notate de obicei cu numere în cadrul cariotipului normal, presupune folosirea a cel puţin doi parametrii de caracterizare a cromosomilor respectivi: lungimea şi raportul braţelor.

Împerecherea cromosomilor omologi, prin simpla observaţie vizuală, se poate realiza ţinându-se seama de anumite condiţii:

1. se pot împerechea cu mai multă precizie cromosomii dintr-o metafază mai puţin avansată, cu braţele puţin contractate;

2. pentru împerecherea cromosomilor din cadrul unei grupe morfologice primul criteriu luat în considerare este raportul braţelor şi nu cel al lungimii;

3. la cromosomii mici, împerecherea pe criteriul raportului braţelor este relativă, deoarece diferenţele dintre măsurători la acest indice sunt mici;

4. se va ţine cont de condiţiile în care fotografierea poate modifica realitatea microscopică, mărind anumiţi cromosomi sau micşorându-i pe alţii, în funcţie de gradul de expunere şi de copiere.

Cariotipul uman normal La Conferinţa de la Denver (1960), s-a căzut de acord asupra unui sistem standard de

nomenclatură a cromosomilor din cariotipul uman normal. Principiile enunţate la această conferinţă au fost confirmate şi dezvoltate la Conferinţa de la Londra (1963) şi cea de la Chicago (1966).

Cariotipul uman normal este reprezentat prin 7 grupe distincte de cromosomi autozomali,

aranjaţi în ordine descrescătoare a lungimii lor şi numerotaţi de la 1 la 22 cât şi o pereche de cromosomi sexuali (X şi Y). În cadrul aceluiaşi grup, cromosomii sunt aranjaţi după mărime. Identificarea cromosomilor din aceste grupe nu este foarte simplă. De exemplu, în grupa de cromosomi numerotaţi 6-12, incluzând şi cromosomul X, deosebirile dintre cromosomi sunt extrem de dificil de precizat. Se disting ceva mai uşor cromosomii 6 şi X de restul grupei. Pentru desemnarea grupelor cromosomiale se folosesc cifrele indicând extremele fiecărei grupe unite printr-o liniuţă sau litere de la A la G.

Conferinţa de Londra (1963) a considerat drept caracteristici importante ale cromosomilor constricţiile secundare şi modul diferenţiat de încorporare a timidinei marcate radioactiv demonstrabil prin autoradiografie.

Atât la Conferinţa de la Londra (1963), cât şi la cea de la Chicago (1966) s-a stabilit că

anumiţi cromosomi umani prezintă variaţii morfologice la indivizi normali fenotipic. Pentru descrierea complementului cromosomial Conferinţa de la Chicago (1966) propune

folosirea unor simboluri care permit o înţelegere uşoară, scrisă şi codificată, a acestora. Nomenclatura acestor simboluri este următoarea:

A-G grupurile de cromosomi

1-22 numerele autosomilor (sistemul Denver)

X, Y cromosomii sexuali

(/) separă linii celulare la descrierea mozaicismului

(+) sau (-) aşezat imediat după desemnarea numărului de autosomi sau a literei de grup, indică faptul că acel cromosom este în plus sau lipseşte; aşezat imediat după indicatorul de braţ sau de structură, semnalează că acel braţ sau acea structură este mai mare sau mai mică decât normal

(?) indică o identificare discutabilă a cromosomului sau structurii

Cromosomiale

Asterisc („) indică un cromosom sau o structură cromosomială explicată în text sau în notă de subsol

Ace acentric

Cen centromer

Dic dicentric

End endoduplicaţie

Ih constricţie secundară sau regiune necolorată (colorată negativ) izocromosom

Inv inversiune

inv (p + q - ) sau inv (p – q + ) inversiune pericentrică

Mar cromosom marcher

Mat origine maternă

P braţul scurt al cromosomului

Pat origine paternă

Q braţul lung al cromosomului

R cromosom inelar

S satelit

T translocaţie

Tri tricentric

simboluri repetate duplicare de structură cromosomială.

Raportul Conferinţei de la Chicago completează folosirea simbolurilor prezentate atât

pentru aberaţiile numerice, cât şi pentru cele structurale. Într-o descriere de cariotip, primul care trebuie înregistrat este numărul total de cromosomi,

inclusiv cromosomii sexuali, despărţiţi printr-o virgulă. Constituţia cromosomilor sexuali este indicată ulterior. De exemplu:

45,X 45 de cromosomi, un cromosom X; 47,XXY 47 de cromosomi, cromosomi sexuali XXY. Autosomii se specifică în cazul în care există o anomalie. Dacă există o aberaţie numerică

a autosomilor, litera grupului din care face parte autosomul extra sau lipsă este urmată de semnul (+) sau (-), aşezat după indicarea cromosomilor sexuali. De exemplu:

45, XX, C- 45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromosom lipsă în grupul C.

Atunci când cromosomul sau cromosomii lipsă sau suplimentari pot fi identificaţi cu siguranţă, se poate folosi numărul cromosomului:

45, XX, 16- 45 de cromosomi, doi cromosomi X, un cromosom numărul 16 absent.

Semnul (?) indică incertitudine. De exemplu: 45, XX, ? C- 45 de cromosomi, cromosomi sexuali XX, un cromosom lipsă, care face

parte probabil din grupul C. O celulă triploidă sau poliploidă este evidenţiată prin numărul de cromosomi şi prin alte

indicative. De exemplu: 69, XXY sau 70, XXY, G +. O metafază endoreduplicată poate fi indicată punând abrevierea “end” înaintea indicativului

cariotipului astfel: end 46, XX. Mozaicisme cromosomiale. Constituţia cromosomială a diferitelor linii celulare este

înregistrată în ordine numerică sau alfabetică, indiferent de frecvenţa tipurilor celulare la individul studiat. Indicarea cariotipului se separă printr-o diagonală (/). De exemplu:

45, X / 46, XY mozaicism cromosomial cu două tipuri celulare, unul cu 45 de cromosomi şi

un singur X, celălalt cu 46 de cromosomi şi cromosomi sexuali XY. Braţul scurt al unui cromosom este indicat prin litera “p”, braţul lung prin litera “q”, un satelit

prin litera “s”, o constricţie secundară prin litera “h”, iar centromerul prin abrevierea “cen”.

Creşterea în lungime a unui braţ cromosomial, se indică punând semnul (+), iar micşorarea lungimii, punând semnul (-) după indicativul braţului. De exemplu: 2p+; Gq-.

Pentru o modificare a unui braţ la un cromosom mediocentric (1, 3, 19 şi 20) se pune un semn de întrebare între indicativul cromosomului şi semnul + sau -. De exemplu, un cromosom nr.3 cu un braţ alungit va fi indicat astfel: 3?+.

Rezultatul unei inversiuni pericentrice se indică prin p+q- sau p-q+, care se închide în paranteză şi este precedat de abrevierea “inv”. De exemplu: inv (D p+q-).

O translocaţie este indicată prin litera “t”, urmată de paranteze care includ cromosomul interesat. De exemplu:

46, XY, t (Bp-;Dq+) o translocaţie reciprocă balansată între braţul scurt al unui cromosom B şi braţul lung al unui cromosom D

Translocaţiile care afectează un cromosom sexual şi un autozom, vor fi desemnate astfel: 46, X, t (Xq + ; 16p-) o translocaţie reciprocă între braţul lung al unui cromosom X şi braţul

scurt al unui cromosom 16 la o femelă. Separarea cromosomilor dintr-o paranteză prin punct şi virgulă (;), indică prezenţa a doi

cromosomi alteraţi structural şi balansarea translocaţiei. Într-o translocaţie de tip “fuziune centrică”, în care un singur cromosom translocat este prezent, semnul de punct şi virgulă se omite. De exemplu:

45, XX, D - ,G - , t (DqGq) + 45 de cromosomi, cromosomii sexuali XX, un cromosom este

absent din grupul D şi unul din grupul G, braţele lor lungi formând pin unire un cromosom translocat DG.

Dacă un anume cromosom a fost moştenit de la mamă sau de la tată, aceasta se poate nota prin abrevierile “mat” sau”pat”.

Structurile cromosomiale duplicate se indică prin repetarea indicativului. Izocromosomii se indică prin litera “i” aşezată după braţul cromosomial interesat. Cromosomii inelari se indică prin litera “r” aşezată după cromosomul afectat. În cazul celulelor cu complemente cromosomiale profund dezechilibrate şi anormale,

Conferinţa de la Chicago propune aplicarea următoarei convenţii în nomenclatura cariotipurilor:

numărul de cromosomi într-o celulă dată va include toate structurile cromosomiale centrice prezente în celulă, indiferent de numărul de centromeri. Cromosomii neidentificaţi, sunt indicaţi prin “mar” (marker). Fragmentele acentrice nu se include în număr, dar se vor indica prin abreviaţia “ace”. Cromosomii dicentrici şi tricentrici se vor număra ca unul singur şi se vor indica prin “dic” şi “tri”.

Pentru indicative care nu figurează în sistemul de nomenclatură propus de Conferinţa de la Chicago, se sugerează folosirea primelor trei litere mici, definite cu claritate şi aşezate imediat

înaintea sau după simbolul cromosomului sau al indicativului cromosomului la care se referă în paranteze.

Cariotipul la animale Cariotipul la hamsterul auriu Cariotipul la hamsterul auriu (Fig.23) (unul dintre animalele de laborator larg studiate în

laborator), a fost elaborat de mai multe grupe de cercetători (Ishihara şi colab., 1962, Lehman şi colab., 1963 şi Nachtigal, 1965).

Complementul cromosomial al celulelor somatice este constituit din 44 de cromosomi (21 de perechi de autosomi şi 2 cromosomi sexuali heteromorfi, X şi Y). Cromosomii autosomali se distribuie în cinci grupe morfologice, notate cu primele litere ale alfabetului. Perechile de autosomi se numerotează de la 1 la 21. Cromosomul X este caracteristic şi uşor de recunoscut.

Grupa A (prima grupă), cuprinde perechile 1-4. Prima pereche (A1) este mai mare sau de aceeaşi mărime cu perechea a doua (A2) fiind de asemenea mai submetacentrică. Celelalte perechi se dispun în ordinea descrescătoare a raportului braţelor.

Grupa B cuprinde perechile 5-10. Perechile 5 şi 10 reprezintă cromosomi metacentrici, uşor de identificată. Perechea B6 este formată din subtelocentrici, cu un raport mare al braţelor şi se poate relativ uşor identifica. Perechile B7-B9 se dispun în ordinea descrescătoare a raportului braţelor cromosomiale.

Grupa C cuprinde perechile 11-15. Prima pereche a acestei grupe, se poate uşor identifica, fiind vorba de cromosomi subtelocentrici. Ultima pereche a grupei se identifică mai greu (constituind cei mai mici submetacentrici). În cadrul acestei grupe, perechile 13 şi 14 se deosebesc greu, fiind cromosomi submetacentrici asemănători.

Grupa D cuprinde 4 perechi de cromosomi subtelocentrici asemănători între ei, dar

deosebiţi uşor de toţi ceilalţi. Grupa E este constituită dintr-o singură pereche de cromosomi metacentrici mici, iar grupa

F din perechea 21 de cromosomi subtelocentrici.

Fig. 23 Cariotipul (sus) şi metafaza care a stat la baza întocmirii acestuia (jos), la Mesocricetus auratus (2n = 44)

(Raicu şi Nachtigal, 1969)

Cariotipul la unele plante de cultură Metodele de alcătuire a cariotipului sunt relativ diferite în funcţie de specie şi de autori.

Prezentăm în cele ce urmează cariotipurile la câteva specii de plante cultivate. Cariotipul şi idiograma la Allium cepa L. (2n=16) Conform studiilor noastre (utilizând o prefixare a rădăcinilor, timp de 2 ore la temperatura

camerei, cu o soluţie de colchicină 0,2%; după prefixare, prelucrarea materialului s-a realizat după metoda Feulgen), raportând datele obţinute la nomenclatura după Levan şi colab., 1964, am realizat cariotipul şi idiograma la Allium cepa L. (2n = 16) (Fig. 25). Utilizând sistemul de stabilire a tipurilor de cromosomi după Levan şi colab. (1964), am încadrat cele opt perechi de cromosomi

de la ceapă în două grupe: cromosomi metacentrici – mediani în sens strict – M (perechea VII) - în regiune

mediană – m (per. I, II, III, IV, V, VIII); cromosomi subtelocentrici – cu satelit, la nivelul braţului scurt (perechea VI).

Perechile de cromosomi omologi au fost numerotate de la I la VIII în ordinea descrescătoare a lungimii totale.

Fig.25 Metafază, cariotip (sus) şi idiograma (jos) la Allium cepa L. (original)

Cariotipul şi idiograma la Secale cereale L. (2n = 14)

Secara, ca şi ceapa, este un material mult folosit în cercetările de citogenetică vegetală. Ca atare, descrierea cromosomilor mitotici la secară a fost realizată de mulţi cercetători; caracteristicile cromosomilor de secară studiaţi de diferiţi autori prezintă diferenţe datorate probabil polimorfismului cromosomial al acestei specii, precum şi metodelor de lucru. Diferenţele între autori apar şi datorită sistemului diferit de clasificare a cromosomilor.

Tudose (1970), utilizând prefixarea cu soluţie de colchicină 0,2% şi colorarea prin metoda Feulgen, grupează cromosomii la Secale cereale L. (2n = 14), în patru tipuri morfologice (Fig. 26):

Tipul A – două perechi de cromosomi (II şi III), cu centromer median; Tipul B – două perechi de cromosomi (I şi VI), cu centromer submedian; Tipul C – o pereche de cromosomi (VIII), cu centromer submedian şi sateliţi mari,

constricţia secundară fiind uşor de evidenţiat, în regiunea ei formându-se nucleul; Tipul D – două perechi de cromosomi (IV şi V) cu centromer submedian, pe braţul

scurt cu o constricţie secundară şi sateliţi mici care pot fi puşi în evidenţă numai folosind tratamente speciale (temperaturi scăzute 0°C, timp de 24-48 ore), ei apărând ca urmare a evidenţierii zonelor heterocromatice.

Caracteristicile cantitative ale cromosomilor la Secale cereale L. (după I.Gh.Tudose, 1970)

Perechea de

cromosomi

Poziţia

centromerului

Braţ lung

( m)

Braţ scurt

( m)

Suma

braţelor

Lungimea totală a

cromosomului

xsx

Indicele

braţelor

I Submediană 7,38 4,57 11,95 12,55 0,12 1,61

II Mediană 5,88 5,22 11,10 11,74 0,10 1,12

III Mediană 5,72 5,19 10,91 11,55 0,09 1,10

IV* Submediană 5,98 3,97 9,95 11,48 0,12 1,50

V* Submediană 5,87 3,76 9,63 10,96 0,10 1,54

VI Submediană 5,75 3,57 9,32 9,95 0,11 1,60

VII* Submediană 6,05 2,98 9,03 11,34 0,12 2,03

cromosomi cu satelit, pe braţul scurt.

I II III IV V VI VII VIII

10

Fig.26 Cariotip (sus) şi idiogramă (jos la Secale cereale (2n = 14) (Tudose, 1970)

6. Ploidia la plante

În celulele plantelor superioare se găseşte un număr dublu de cromosomi 2n (celule diploide), faţă de n cromosomi în spori şi gameţi (celule haploide). Datorită unor dereglări ale

diviziunii celulare, produse ca urmare a acţiunii diferiţilor factori mutageni naturali sau artificiali – de exemplu, colchicina – numărul de cromosomi din celule se poate modifica.

Poliploidia constă în multiplicarea numărului de cromosomi din celulele somatice faţă de numărul de bază.

Numărul de bază sau numărul fundamental (numărul de origine), notat cu x, reprezintă setul haploid, cu cel mai mic număr de cromosomi al numărului somatic diploid de cromosomi ai unei specii.

În anul 1916, Winkler introduce noţiunea de genom (numărul de cromosomi din garnitura de bază x, diferenţiaţi morfologic şi genetic) şi defineşte poliploidia ca fenomenul de multiplicare a numărului de cromosomi (Anghel şi Ignat, 1974).

După numărul de garnituri de cromosomi în celulele somatice ale plantelor, acestea pot fi: haploide (x), diploide (2x), triploide (3x), tetraploide (4x), pentaploide (5x) etc. Gradul de ploidie (P) al unei specii se apreciază din relaţia 2n/x. De exemplu, aplicând această relaţie, se poate afla gradul de ploidie la speciile:

Secale cereale L. - secara diploidă (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2. - secara tetraploidă (4x)are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4. Triticum monococcum – grâul diploid (2x) are 2n=14; n=7; x=7, deci P=2n/x=2. Triticum durum - grâul tetraploid (4x) are 2n=28; n=14; x=7, deci P=2n/x=4. Triticum aestivum - grâul hexaploid (6x) are 2n=42; n=21; x=7, deci P=2n/x=6.

Prin cercetări de citogenetică s-a constatat că, la plante, în cadrul aceluiaşi gen numărul de cromosomi este, de obicei, un multiplu al numărului de bază x. În cadrul unor genuri există mai multe specii cu diferite grade de ploidie, constituind serii (şiruri) poliploide, ca în cazul genului Triticum.

În cadrul genului Rosa, se întâlnesc specii cu 2n=14; 21; 28; 35; 42; 56 de cromosomi. În natură s-au descoperit o serie de astfel de genuri, ca: genul Chrysantemum cu x=9 - cu specii 2n=18 (2x); 36 (4x); 54 (6x); 72 (8x) şi 90 (10x) cromosomi; genul Solanum cu x=12 - cu specii 2n=24 (2x); 36 (3x); 48 (4x); 60 (5x); 72 (6x); 96 (8x); 108 (9x); 120 (10x) şi 144 (12x).

Seriile poliploide, în funcţie de numărul par sau impar de garnituri cromosomiale sau genomuri, pot fi clasificate în:

- artioploide (artiopoliploide), cu număr par de genomuri (4x, 6x, 8x etc.); - perisoploide (perisopoliploide), cu număr impar de genomuri (3x, 5x, 7x, 9x etc.), de obicei

sterile. Primele organisme poliploide au apărut după apariţia procesului sexual, respectiv a fecundării,

prin care, organismele nou formate dobândesc un număr dublu de cromosomi (2n), faţă de cel al gameţilor (n) (Tudose, 1967).

După originea cromosomilor, Kihara şi Ono (1926), clasifică pentru prima dată fenomenul de

poliploidie în: 1. Autopoliploidie (autoploidie) - multiplicarea numărului propriu de genomuri sau de seturi

(garnituri) cromosomiale. Forme autopoliploide se cunosc la Secale cereale, Beta vulgaris, Trifolium pratensis etc.

Poliploidia este întotdeauna însoţită de importante modificări morfo-fiziologice. Creşterea

numărului de cromosomi determină mărirea nucleului, a celulei, a ţesutului şi organului şi / sau a organismului, ajungându-se astfel la gigantism.Se pare că fiecărui gen de organisme îi este caracteristic un nivel optim al efectului pozitiv al poliploidizării, nivel care dacă este depăşit, poate determina efecte negative (Coman, 1991).

La plante, care se înmulţesc şi vegetativ, poliploidia s-a dovedit a fi avantajoasă. La Angiosperme 64% din genurile actuale posedă serii poliploide naturale. Pentru speciile ce se

înmulţesc exclusiv pe cale sexuată, poliploidia este dezavantajoasă determinând dereglarea meiozei şi scăderea fertilităţii. Poliploidia este prezentă şi în grupul Gimnospermelor şi al Pteridofitelor, dar

în procente mai mici. Prezenţa poliploidiei în regnul vegetal este mult mai mare decât în cadrul regnului animal (Coman, 1991).

Poliploidia este foarte răspândită în special în special în regiunile cu climat mai aspru: regiuni nordice, montane, deşerturi. Un procent ridicat de specii poliploide se întâlneşte în flora Saharei, în regiunile de ţărm ale Japoniei, unde se întâlnesc variaţii mari de temperatură, în regiunile sărăturoase etc. Este interesant de remarcat că procesul de apariţie al autopoliploidiei este mai intens la plantele cultivate, deoarece acestea sunt puse în condiţii foarte variate de mediu, fapt care măreşte posibilitatea de apariţie a plantelor poliploide (Anghel şi Ignat, 1974).

2. Allopoliploidie (amfipoliploidie) - multiplicarea numărului de genoame prin hibridare

interspecifică şi însumarea lor la hibrid, urmată de dublarea numărului diploid de cromosomi. De exemplu, la grâu s-a demonstrat că formele diploide au genomul A provenit de la

specia Triticum monococcum; formele tetraploide au genomul AB, cu genomul B provenit de la specia Aegilops speltoides; formele hexaploide au genomul ABD, cu genomul D provenit de la specia Aegilops squarrosa.

În afară de Triticum aestivum (2n=42) se cunosc în natură mai multe specii amfiploide: Gossypium hirsutum (2n=52), provenit din hibridarea speciilor Gossypium arboreum (2n=26) cu Gossypium raimondii (2n=26); Nicotiana tabacum (2n=42) provenită din încrucişarea speciilor Nicotiana silvestris (2n=24) cu Nicotiana tomentosiformis (2n=24) etc.

Pseudopoliploidia - multiplicarea numărului de cromosomi are loc prin fragmentarea cromosomilor cu centromeri multipli sau difuzi, fără a avea loc o mărire corespunzătoare a cantităţii de ADN.

Pseudopoliploidia poate fi evidenţiată prin măsurarea lungimii cromosomilor, atunci când fragmentarea lor este transversală; prin studiul citofotometric al cantităţii de ADN din celule sau prin studiul comportării cromosomilor în profaza sau metafaza diviziunii mitotice reducţionale.

Pseudopoliploidia a fost observată la speciile câtorva genuri de plante (Carex) sau animale (Ascaris) etc.

Metode pentru inducerea autopoliploidiei la plante În general, pentru ploidizare se folosesc specii de plante ce prezintă un număr redus de

cromosomi în celulele somatice, plante alogame, plante cultivate pentru organele lor vegetative etc. Obţinerea autotetraploizilor se poate realiza prin distrugerea fusului de diviziune sau oprirea

plasmodierezei din timpul diviziunii celulare. În acest scop se folosesc mai multe metode: a. Metoda centrifugării, elaborată de Kostoff (1937) constă în centrifugarea plantelor cu

ţesuturi meristematice, în vederea distrugerii fusului de diviziune şi formarea celulelor cu număr dublu de cromosomi. Metoda este greoaie şi prezintă o serie de dezavantaje. Astfel, numai o mică parte din celulele meristematice devin poliploide, ele fiind de obicei eliminate ulterior, deoarece viteza lor de diviziune este mai mică decât a majorităţii celulelor diploide.

b. Metoda şocurilor de temperatură, elaborată de Randolph (1932) se bazează pe influenţa

şocurilor de temperatură ridicată asupra primelor mitoze ale zigotului. Astfel, un şoc de temperatură de 43-45, timp de 24 de ore, asupra zigotului la Zea mays produce 5% plante poliploide.

c. Metoda poliembrioniei, bazată pe observaţiile lui Muntzing (1938) conform cărora la

majoritatea plantelor superioare se află un procent redus de seminţe cu doi sau mai mulţi embrioni (la Gramineae, aproximativ 0,007-0,15%), dintre care o parte (5%) au un număr diferit de cromosomi.

d. Metoda acţionării cu insecte parazite asupra vârfurilor de creştere ale plantelor,

bazată pe observaţia că galele prezintă celule poliploide. Metoda este dificilă, obţinându-se un procent mic de plante poliploide.

e. Metoda regenerării, elaborată de Winkler (1916) şi Joergensen (1928), se bazează pe

observaţia că o parte din lăstarii proveniţi din rănirea calusului format în urma tăierii altoiului de la locul

de altoire, sunt poliploizi. Metoda se utilizează la speciile care se pretează la altoire (din genurile Solanum, Nicotiana etc.).

f. Metoda iradierii, utilizată în vederea distrugerii fusului de diviziune, urmată de formarea gameţilor diploizi sau a celulelor somatice poliploide (prin autopoliploidie), precum şi fragmentarea cromosomilor. Astfel, în mod experimental, în urma iradierii cu radiaţii gamma a seminţelor uscate de Lactuca sativa soiul "Polul Nord" (2n=18) s-au obţinut celule somatice tetraploide (2n=36) şi octoploide (2n=72). Celulele tetraploide au fost obţinute printr-un proces de autopoliploidie, în urma distrugerii fusului de diviziune, iar celulele octoploide datorită fenomenului de pseudoautopoliploidie, prin fragmentarea ulterioară a tuturor cromosomilor unei celule autotetraploide.

g. Acţiunea substanţelor de tipul paradiclorbenzenului împiedică plasmodiereza, rezultând celule cu două sau mai multe nuclee ce pot fuziona ulterior.

h. Metoda colchicinizării, bazată pe proprietatea colchicinei şi a altor substanţe (acenaften,

feniluretan etc.) de a inhiba sau e a distruge fusul de diviziune, rezultând, în urma diviziunilor, celule al căror nucleu de restituţie are număr dublu de cromosomi.

Descoperirea în 1937 de către Blakeslee şi Avery a efectului poliploidizant al colchicinei asupra plantelor a deschis noi perspective de obţinere experimentală a poliploizilor (Anghel şi Igat, 1974).

Colchicinizarea se efectuează cu o soluţie de 0,05 -1% colchicină în care se introduc seminţe negerminate, seminţe germinate sau plantule. Soluţia de colchicină poate fi aplicată şi pe vârfurile de creştere: direct (Bragdo, 1955 - la secară; Sears, 1941 - la grâu; Mihăilescu şi Raicu, 1968 - la orz; Raicu şi Anghel, 1966 - la Citrullus vulgare) sau în amestec cu agar-agar (Swaminathan, 1951 - la cartof), sau ca pastă de lanolină-cu acid indolil-3-acetic (Howard şi Swaminathan, 1953 - la

Solanum demissum), în vederea împiedicării evaporării ei rapide. La pomi şi viţă de vie se tratează mugurii cu soluţie de colchicină. Timpul de acţiune şi concentraţia diferă de la o specie la alta. Soluţia de colchicină se consideră cu acţiune optimă atunci când: o parte din plante pier, o parte din plantele tratate devin mixoploide (cu celulele în diferite grade de ploidie) datorită unei colchicinizări parţiale, iar o parte din plante devin autotetraploide.

7. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante

Pentru depistarea organismelor poliploide naturale din cadrul populaţiei unei specii sau pentru evidenţierea speciilor poliploide ale unui gen, ca şi pentru determinarea indivizilor poliploizi produşi pe cale artificială în vederea separării lor dintr-un amestec, au fost elaborate o serie de metode directe şi indirecte.

Metodele directe sunt metodele prin care se determină cu precizie gradul de ploidie. Prin cercetări de citogenetică s-a constatat că, la plante, în cadrul aceluiaşi gen numărul de cromosomi este, de obicei, un multiplu al numărului de bază x.

Metodele indirecte sunt metodele bazate pe corelaţia existentă între gradul de ploidie şi

anumite caracteristici macroscopice şi microscopice ale plantelor. Deşi aceste metode nu sunt atât de precise ca metodele directe, ele se pot utiliza cu succes, în special pentru deosebirea plantelor poliploide de cele diploide de la care au provenit, în general pentru trierea materialului biologic.

Metode directe de determinare a gradului de ploidie la plante Pentru evidenţierea cromosomilor în diviziune mitotică şi meiotică la plante au fost descrise în

capitolele anterioare o serie de metode. Ca exemplu de determinare a numărului de cromosomi la o serie poliploidă naturală s-a ales seria amfiploidă a genului Triticum, în cadrul căreia există specii diploide, tetraploide şi hexaploide.

Metoda Feulgen pentru evidenţierea şi numărarea cromosomilor în diviziune mitotică

la Triticum monococcum, Triticum dicoccum şi Triticum aestivum

Studiul cromosomilor se realizează în diviziunea mitotică a celulelor meristematice din apexul radicular, la cele trei specii de grâu.

Etape de lucru: Germinarea

Se pun la germinat cariopse din cele trei specii de Triticum în cutii Petri, pe hârtie de filtru umectata cu apă, la temperatura camerei(se recomandă plasarea hârtiei de filtru şi pe capacul cutiilor Petri pentru crearea unei atmosfere umede şi pentru împiedicarea pătrunderii luminii puternice).

Germinarea se realizează în timp relativ scurt, în 2-3 zile rădăciniţele atingând dimensiunea de 10-15 mm.

Prefixare Rădăciniţele se prelevă, realizându-se prefixarea în fiole de sticlă, în soluţie de colchicină

0,2%, timp de 2 ore, la temperatura camerei. Se poate realiza şi o prefixare a cariopselor cu

rădăciniţe (plasate în cutii Petri) la temperaturi scăzute (0-4 C), timp de 12-24 de ore. Prefixarea este necesara deoarece, cele trei specii de Triticum, în special Triticum

aestivum, prezintă un număr relativ mare de cromosomi, cromosomi relativ lungi. Ca urmare a prefixarii se produce o scurtare apreciabilă a cromosomilor, o individualizare şi colorare intensă, astfel încât cromosomii se pot observa şi număra uşor.

Fixarea Fixarea rădăciniţelor se realizează în fixator Battaglia, la temperatura camerei, timp de 20-25

de minute. Spălarea

Spălarea rădăciniţelor de urmele de fixator se realizează în HCl 1N, timp de 5 minute, la temperatura camerei; se îndepărtează soluţia de fixare şi se adaugă soluţia de spălare.

Hidroliza

Hidroliza se efectuează în soluţie de HCl 50%, timp de 25-30 de minute, la temperatura camerei.

Colorarea

După îndepărtarea soluţiei de hidroliză se efectuează colorarea cu fuxină bazică decolorată (reactiv Schiff), la temperatura camerei, timp de 15-30 de minute, până când vârfurile rădăciniţelor prezintă culoarea roşu-violet închis.

Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele microscopice se realizează pe o lamă de microscop curată şi uscată, într-o picătură de acid acetic 45%. Se procedează ca la metoda Feulgen pentru studiul cromosomilor în mitoză la ceapă, dar se recomandă realizarea unei cât mai bune etalări pentru dispersarea cromosomilor, în vederea observării lor individuale şi a numărării cu uşurinţă.

Studiul preparatelor la microscop

Preparatele se studiază la microscop, la un obiectiv cu putere de mărire ridicată, în lumină puternică, utilizând un filtru verde care măreşte contrastul între cromosomi şi citoplasmă. Se studiază doar metafazele, când cromosomii sunt spiralizaţi şi contractaţi, sunt puternic coloraţi şi datorită dispersării prin etalare, se observă individual şi pot fi uşor număraţi.

Pe cele mai bune preparate se pot observa şi număra pentru Triticum monococcum 14 cromosomi, pentru Triticum dicoccum 28 de cromosomi şi pentru Triticum aestivum 42 de cromosomi. Morfologia cromosomilor poate fi studiată folosind obiectivul de imersie. Atunci când dorim să efectuăm cariotipul şi idiograma speciilor studiate se efectuează microfotografii, se decupează cromosomii şi se aşează în ordinea descrescândă a lungimii lor, luându-se în consideraţie poziţia centromerului, a constricţiilor secundare etc.

Astfel se constată originea hexaploidă a speciei Triticum aestivum (2n=6x=42), precum şi tetraploidia speciei Triticum dicoccum (2n=4x=28) şi diploidia speciei Triticum monococcum (2n=2x=14).

Efectuarea preparatelor semipermanente şi permanente

Cele mai reuşite preparate, pe care se pot uşor număra cromosomii se pot efectua semipermanent sau permanent, după metodele descrise anterior. Preparatele permanente pot servi drept model.

Metode indirecte de determinare a gradului de ploidie la plante Metodele indirecte de determinare a gradului de ploidie la plante sunt mai puţin precise în

comparaţie cu metodele directe, dar sunt mai rapide şi mai puţin costisitoare, folosindu-se cu succes în staţiunile de ameliorare a plantelor de cultură pentru a tria plantele poliploide dintr-un amestec sau pentru a separa plantele tetraploide de cele diploide, obţinute ca urmare a tratamentului cu colchicină.

Aceste metode se bazează, în esenţă, pe corelaţia dintre gradul de ploidie al plantelor şi diferite caractere morfologice macroscopice şi microscopice ale plantelor.

Metoda determinării gradului de ploidie la plante prin examinarea unor caractere

morfologice macroscopice Primii cercetători ai fenomenului de poliploidie au remarcat existenţa unei corelaţii între

numărul de garnituri cromosomiale şi unele caractere morfologice macroscopice. Modificările de ordin morfologic afectează diverse organe sau planta în întregime; ele sunt într-o anumită măsură diferite la diferitele specii de plante, dar unele prezintă un caracter general.

Metode de determinare a gradului de ploidie la plante prin examinarea unor caractere

microscopice Aceste metode se bazează pe corelaţia existentă la plante între numărul garniturilor

cromosomiale şi unele caractere microscopice, cum ar fi: mărimea şi densitatea stomatelor, numărul de cloroplaste din celulele stomatelor, numărul cromocentrilor nucleolari, diametrul grăuncioarelor de polen, numărul de pori germinativi ai grăuncioarelor de polen etc.

A. Metoda examinării stomatelor a. Determinarea mărimii stomatelor

De regulă, se studiază lungimea stomatelor, care este mai constantă decât lăţimea, care variază cu gradul de deschidere al ostiolei. Astfel, s-a constatat o corelaţie pozitivă între lungimea stomatelor şi numărul de garnituri cromosomiale din celule la speciile diploide, triploide şi tetraploide.

Prin studiul comparativ al dimensiunii stomatelor la plantele 2x şi 4x, aparţinând la 9 specii diferite Raicu şi colab., în 1965, au constatat că la formele tetraploide lungimea stomatelor este cu

29,2-85,7% mai mare decât la speciile diploide, diferenţele fiind în toate cazurile semnificative. Mod de lucru: Se aleg frunze de Triticum monococcum L. (2n=2x=14) şi Triticum aestivum L.

(2n=6x=42); se desprinde cu o lamă de bărbierit o porţiune de câţiva mm. de epidermă inferioară şi

se plasează pe lamă într-o picătură de apă; se studiază la microscop, determinându-se lungimea stomatelor.

Se calculează media şi abaterea standard a mediei la cel puţin 100 de stomate; valorile sunt exprimate în microni.

Amplitudinea variaţiei lungimii stomatelor la formele poliploide este mai mare decât la formele diploide, recomandându-se ca numărul măsurătorilor efectuate sa fie suficient de mare (peste 100).

b. Determinarea densităţii stomatelor pe unitatea de suprafaţă foliară

Densitatea stomatelor pe unitatea de suprafaţă foliară este invers proporţională cu gradul de ploidie, fiind mai mică la formele poliploide, datorită faptului că celulele, respectiv stomatele plantelor poliploide au dimensiuni superioare diploizilor. S-a constatat că valorile relative ale frecvenţei stomatelor la poliploizi nu reprezintă decât 31,5-71,8% din valoarea de 100% la diploizi.

Mod de lucru: Se aleg frunze de sfeclă de zahăr - Beta vulgaris (2x, 3x şi 4x); se desprinde cu o lamă de

bărbierit o porţiune de câţiva mm. de epidermă inferioară şi se plasează pe o lamă de microscop într-o picătură de apă; se studiază la microscop, determinându-se densitatea stomatelor. Pentru calcularea densităţii stomatelor se notează numărul de stomate din aproximativ 100 de câmpuri microscopice, calculându-se apoi media şi eroarea ei. se calculează suprafaţa câmpului microscopic după formula r2 şi se raportează, utilizând regula de trei simple, numărul de stomate la unitatea de suprafaţă folosită (1mm2).

c. Stabilirea numărului de cloroplaste din celulele stomatelor Mochizuki şi Sueoka, în 1955, au demonstrat existenţa unei corelaţii directe între numărul

de cloroplaste din celulele stomatelor şi gradul de ploidie al plantelor. Cercetările au arătat că numărul de cloroplaste din stomate variază puţin faţă de condiţiile de mediu; la sfecla de zahăr numărul este identic în diferite porţiuni ale frunzei (bază, mijloc sau vârf), precum şi pe cele două feţe ale frunzei. În schimb, numărul de cloroplaste variază cu vârsta ontogenetică a plantelor.

Materiale necesare:

- lame de microscop, lamele, hârtie de filtru, lame de bărbierit, pensete Reactivi:

- soluţie I în KI – 1g. iod metalic, 2g. KI la 30 cc apă distilată - fixator alcool - acid acetic (3/1) Mod de lucru: Alegerea plantelor

Pentru studiul cloroplastelor se aleg plante tinere de sfeclă de zahăr, aflate în aceeaşi fază de vegetaţie (3-4 frunze). Se recomandă ca recoltarea frunzelor să se efectueze dimineaţa, la o oră după răsăritul soarelui, atunci când frunzele sunt turgescente şi conţin maximum de clorofilă; excesul de lumină şi căldură provoacă închiderea stomatelor.

Numărarea cloroplastelor din cele două celule ale unei stomate poate fi efectuată la frunzele proaspete sau la frunzele conservate.

Conservarea materialului

Conservarea se realizează în fixator alcool - acid acetic (3/1), materialul putând fi păstrat timp de 2 - 4 ani de la recoltare.

Efectuarea preparatelor microscopice Numărarea cloroplastelor se poate efectua direct, cu ajutorul microscopului cu contrast de

fază, tehnică ce nu dă rezultate precise. De aceea, se recomandă evidenţierea cloroplastelor prin colorare cu o soluţie de I în KI.

Cu ajutorul unei pensete cu vârfurile ascuţite, cu un bisturiu, ac spatulat sau cu o lamă de bărbierit, se desprinde o porţiune de epidermă inferioară, de aproximativ 0,5 - 1 cm2, şi se plasează pe o lamă de microscop, într-o picătură de iod în iodură de potasiu. Se acoperă preparatul cu o lamelă, evitându-se formarea bulelor de aer între lamă şi lamelă. Colorarea se realizează aproape instantaneu, dar se recomandă o perioadă de 3-4 minute pentru colorarea intensă a cloroplastelor. Cu o bucată de hârtie de filtru se îndepărtează excesul de substanţă; nu se recomandă etalarea.

Examinarea preparatelor la microscop

Preparatele se studiază imediat după realizare la microscopul optic, în lumină puternică, cu obiective mai mici (până la 40x) deoarece stomatele sunt mari, cloroplastele sunt evidente, se colorează bine şi pot fi observate şi numărate cu uşurinţă.

În cazul în care colorarea s-a efectuat cu iod în iodură de potasiu pe material proaspăt, cloroplastele se colorează în bleu, datorită conţinutului în amidon. Când materialul este conservat, amidonul se degradează şi cloroplastele se colorează în brun închis. Celelalte elemente celulare apar colorate în galben deschis.

La microscop se observă celulele epidermice cu pereţi sinuoşi şi stomatele reniforme; se numără cloroplastele din cele două celule stomatice, la minim 25-30 stomate, calculându-se media şi abaterea ei.

În cazul acestei metode, corelaţia existentă între gradul de ploidie la sfecla de zahăr şi numărul de cloroplaste din cele două celule ale unei stomate este următoarea:

Beta vulgaris L. 2n=18 (n=9, x=9), forma diploidă (2x), 18 cromosomi într-o celulă somatică =

18 cloroplaste (în medie) în cele două celule ale unei stomate. Beta vulgaris L. 2n=27 (x=9), forma triploidă (3x), 27 de cromosomi într-o celulă somatică =

27 cloroplaste (în medie) în cele două celule ale unei stomate. Beta vulgaris L. 2n=36 (n=18, x=9), forma tetraploidă (4x), 36 de cromosomi într-o celulă

somatică = 36 cloroplaste (în medie) în cele două celule ale unei stomate. Subliniem faptul că, la microscop, se pot observa la formele 2x de sfeclă de zahăr câte 9

cloroplaste în fiecare celulă stomatică, cât şi celule care au repartizate cloroplastele în mod inegal în cele două celule stomatice; se întâlnesc adesea şi celule stomatice cu un număr mai mic de cloroplaste. Întotdeauna pentru formele diploide (2n=18) se obţine o medie a numărului de cloroplaste mai mică de 18 şi foarte rar mult apropiată de 18. Atunci când media numărului de cloroplaste nu depăşeşte 18, se consideră că forma respectivă este diploidă.

Când numărul mediu de cloroplaste este mai mic sau egal cu 27, forma respectivă este triploidă, iar când numărul mediu de cloroplaste este mai mic sau egal cu 36 este o formă de sfeclă de zahăr tetraploidă.

Această metodă se foloseşte cu succes la trierea materialului la sfecla de zahăr, în vederea separării formelor triploide şi tetraploide de cele diploide, dintr-un amestec.

Preparatele microscopice (Fig. 32) se studiază imediat după realizare şi se pot efectua

microfotografii. Preparatele se pot păstra doar un timp scurt, prin efectuarea lor semipermanente.

Fig. 32 Imaginea microscopică a unei stomate şi a cloroplastelor la Beta vulgaris (coloraţie cu iod în iodură de

potasiu, 40x) (original)

B. Metoda evidenţierii cromocentrilor nucleolari Metoda a fost elaborată de Reitberger, în 1956, pe baza cercetărilor sale la Beta vulgaris L.,

şi se bazează pe corelaţia între numărul de cromocentri nucleolari şi gradul de ploidie al plantelor. La sfecla de zahăr fiecare garnitură de cromosomi prezintă un cromosom cu satelit (heterocromatic). Constricţia secundară este organizatoare nucleolară, astfel că, la nivelul său se formează un nucleol. În telofază, partea heterocromatică reprezentată de satelit rămâne ataşată de nucleol; formând un cromocentru, care poate fi evidenţiat prin colorare cu coloranţi specifici nucleului, nu numai în timpul diviziunii celulare, ci şi în interfază.

Metoda elaborată de Reitberger se bazează tocmai pe capacitatea cromocentrilor de a se

colora în interfază şi pe existenţa unui cromocentru pentru fiecare garnitură de cromosomi; mărirea numărului de garnituri cromosomiale implică mărirea numărului de cromocentri nucleolari.

Astfel, formele diploide (2x) prezintă doi cromocentri, formele triploide (3x) – trei cromocentri şi formele tetraploide (4x) – patru cromocentri nucleolari. Cromocentrii se află de obicei grupaţi în jurul unui singur nucleol; uneori, însă, sunt mai mulţi nucleoli în jurul cărora se grupează cromocentrii (Fig. 33).

Fig. 33 Schema distribuţiei cromocentrilor nucleolari la nivelul nucleului, la Beta vulgaris L. (original)

Cercetările lui Reitberger au arătat că, la plantele diploide, cei doi cromocentri sunt aşezaţi

în jurul unui singur nucleol, întâlnindu-se mai rar situaţia când ei sunt plasaţi pe câte un nucleol; la fel şi pentru plantele triploide, unde se întâlnesc frecvent celule cu trei cromocentri plasaţi pe un nucleol, mai rar fiind grupaţi pe doi sau pe trei nucleoli; la plantele tetraploide, în majoritatea cazurilor cei patru cromocentri sunt plasaţi pe un singur nucleol, mai rar pe doi, pe trei sau patru nucleoli. În general, cromocentrii se dispun simetric în jurul nucleolului, al cărui volum este în raport direct cu numărul de cromocentri; astfel, nucleolul cu patru cromocentri are un volum mai mare faţă de nucleolul cu trei, doi sau un cromocentru.

Mod de lucru: Alegerea materialului Se utilizează frunze de 4-5 cm. lungime, recoltate de la plante de sfeclă de zahăr – Beta

vulgaris L., în vârstă de 2 luni, provenite din seminţe. Fixarea

Fixarea frunzelor se realizează în fixatorul alcool-acid acetic (3/1), în care materialul se poate păstra timp îndelungat.

Colorarea Colorarea se realizează în soluţie carmin-acetică, timp de 15 min. Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatul se realizează pe o lamă de microscop, în 1-2 picături de carmin acetic. Cu ajutorul unei lame de bărbierit, se desprinde o porţiune (de 0,5-1 cm.2) din epiderma inferioară a unei frunze şi se plasează pe o lamă de microscop, în 1-2 picături de carmin-acetic. Se agită colorantul cu un ac spatulat în vederea unei mai bune colorări. Colorarea se realizează la temperatura camerei, timp de 15-20 de minute (eventual, lama poate fi încălzită 10-15 min. la flacăra unei spirtiere, evitând fierberea şi adăugând noi picături de colorant). Se acoperă preparatul cu lamela, fără a realiza etalarea, ce poate duce la deplasarea cromocentrilor.

Examinarea preparatelor la microscop Preparatele se studiază la microscop, în lumină puternică, cu filtru verde. Studiul se

realizează în nucleele celulelor epidermei inferioare, colorate în roşu carmin, nucleolii rămânând slab coloraţi. Cromocentrii se observă ca nişte corpusculi mici, de formă sferică, plasaţi la periferia nucleolului sau a nucleolilor, coloraţi în roşu intens spre negru, mai intens în comparaţie cu nucleul şi foarte intens faţă de nucleol. Prin mişcarea fină a şurubului micrometric, cromocentrii pot fi observaţi cu uşurinţă. Prin observarea câtorva celule se poate constata gradul de ploidie.

La Beta vulgaris L. 2n=18 (n=9, x=9), forma diploidă (2x), 18 cromosomi într-o celulă somatică (două garnituri cromosomiale) = 2 cromocentri nucleolari.

Beta vulgaris L. 2n=27 (x=9), forma triploidă (3x), 27 de cromosomi într-o celulă somatică (3

garnituri cromosomiale) = 3 cromocentri nucleolari. Beta vulgaris L. 2n=36 (n=18, x=9), forma tetraploidă (4x), 36 de cromosomi într-o celulă

somatică (4 garnituri cromosomiale) = 4 cromocentri nucleolari. Cercetările au arătat că, la plantele 2x, cromocentrii sunt mult mai vizibili la microscopul

optic, în comparaţie cu cei de la plantele 3x şi 4x. S-a constatat că, pentru plantele virozate şi bolnave, utilizarea acestei metode dă rezultate eronate; în acest caz se recomandă folosirea metodei determinării numărului de cloroplaste din celulele stomatelor.

Preparatele microscopice nu se pot efectua permanent, astfel încât se recomandă studierea lor imediat după realizare şi efectuarea de microfotografii. Preparatele se pot efectua semipermanente şi vor fi examinate a doua zi.

C. Metoda examinării grăuncioarelor de polen Metoda vizează două aspecte morfologice ale grăuncioarelor de polen (diametrul şi

numărul de pori germinativi) cu ajutorul cărora se poate aprecia gradul de ploidie la unele plante.

8. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura

Anomaliile de structură sunt evidenţiate de modificările morfologiei cromosomilor, însoţite de modificări cantitative ale materialului genetic sau de modificări ale poziţiilor genelor în cromosomi. Ele apar fie ca urmare a lezionării cromosomului în faza G1 prereplicativă a ciclului celular (aberaţii de tip cromosomial), fie în urma lezionării cromatidelor surori în faza S şi G2 (aberaţii de tip cromatidic). Anomalii structurale ale cromosomilor şi cauzele lor [Socaciu, 1996].

Anomalia Cauza

A. Aberaţii de tip cromosomial Lezionarea cromosomilor în faza G1

I. Intracromosomiale

1. Deleţii de fragmente acentrice deleţii cromosomiale terminale sau intercalare

2. Inele acentrice deleţii ale cromatidelor (asocieri interbraţe)

3. Cromosomi inelari deleţii ale ambelor braţe ale cromosomilor şi unirea capetelor

4. Inversii pericentrice şi paracentrice răsuciri de 180o ale segmentelor între două

puncte de deleţie

5. Translocaţia intracromosomială dislocare prin deleţie a unui fragment şi fixare pe

celălalt braţ al cromosomului

6. Discontinuităţi cromosomiale lipsa materialului genetic (AND) pe porţiunile

afectate

7. Izocromosomi (cromosomi metacentrici clivaj intercromatidic transversal la nivelul

neomologi) centromerului

II: Intercromosomiale simetrice sau asimetrice

1. Translocaţii reciproce schimb de segmente acentrice distale din doi cromosomi neomologi

2. Fuziuni centrice intercromosomiale (translocaţie robertsoniană)

fuziunea a doi cromosomi neomologi acentrici

3. Cromosomi policentrici fuziune de fragmente centrice după o deleţie terminală

4. Cromosomi duplicaţi fixare pe cromosom a unui fragment acentric,

dislocat prin deleţie de la un cromosom omolog

B. Aberaţii de tip cromatidic Lezionarea cromatidelor surori

1. Fragmente izolate lezionarea unei cromatide

2. Translocaţia intracromatidică (inversie pericentrică)

dislocare de fragmente de la fiecare braţ al cromatidei şi sudare la braţe diferite

3. Ruptura cromosomială separarea unui fragment cromatidic de restul cromosomilor

4. Lacuna cromosomială ruptură cromatidică neexteriorizată în metafază

datorită plierii cromatinei

Fig. 34 Principalele tipuri de aberaţii cromosomiale (modificat după Scott şi colab., 1983 şi Gavrilă,1986)

8.1. Studiul aberaţiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei la unele plante de cultură

Ca rezultat al deleţiilor cromosomiale apar în ana-telofaza mitozei aberaţii cromosomiale, vizibile la microscopul optic (colorând materialul biologic mutagenizat cu un colorant specific nuclear), de tipul:

- fragmente acentrice (lipsite de centromer) - nu migrează spre poli, se pierd în cursul diviziunilor succesive, fiind metabolizate. Se produce astfel un dezechilibru în doza genelor, ceea

Tipul de aberaţie Tipul de aberaţieDiagrama Diagrama

1. Gap sau lacună cromosomică

2. Deleţie cromosomială - fragment

3. Cromosom dicentric

şi frgament

4. Cromosom inelar

şi fragment

5. Inel acentric

6. Gap sau lacună cromatidică

7. Deleţie cromatidică

fragment cromatidic

8. Deleţie izocromatidică

9. Schimb intercromosomial asimetric

10. Schim intercromosomial simetric

11. Schimb intracromosomial asimetric

12. Schimb intracromosomial simetric

13. Deleţie interstiţială

(la nivelul unei cromatide)

14. Schimburi

izocromatidice/cromatidice

a. Cromosom dicentric

triradial şi fragment

b. Cromosom

monocentric triradial

15. Izocromosomi

ce, în general conduce la moartea celulei respective. - fragmente centrice (cromosomi inelari, inele centrice) - formate în urma a două deleţii

terminale la nivelul unui cromosom, ca urmare a reunirii capetelor fără telomeri. Fragmentele centrice, deoarece posedă centromerul cromosomului, pot participa la diviziune.

- inele acentrice - rezultate în urma reunirii capetelor unor fragmente acentrice mari, în cazul în care deleţia a fost produsă în aşa fel încât nici un capăt al fragmentului nu posedă telomer.

- punţi (cromosomi dicentrici sau policentrici)- de regulă sunt rezultatul reunirii a doi cromosomi ce au suferit deleţii terminale. Respectivii cromosomi formează una sau mai multe punţi, vizibile între cele două mase cromatidice separate la polii celulei.

- micronuclee Există şi alte tipuri de aberaţii ce se pot evidenţia în ana-telofaza mitozei, la microscopul

optic: - cromosomi retardartari - sunt cromosomi la care centromerul şi-a pierdut capacitatea de

cuplare la fibra fusorială. Ei nu pot participa la diviziune, nu pot migra spre polii celulei, dezechilibrând repartiţia cromosomilor între cele două celule fiice.

- ana-telofaze tripolare, tetrapolare, multipolare - provocate de formarea defectuoasă a fusului de diviziune. Apar fusuri de diviziune cu 3, 4 sau mai mulţi poli. Cromatidele cromosomilor, după clivare, migrează în 3, 4 sau mai multe direcţii, ceea ce va conduce la repartizarea inegală a cromatidelor între celulele fiice rezultate.

Frecvent, multe dintre aberaţiile cromosomiale descrise se pot asocia. Cele mai frecvente asocieri sunt de tipul: punţi + fragmente, punţi + cromosomi retardatari, punţi + micronuclee etc.

Material biologic: - cariopse de grâu – Triticum aestivum L.(2n=42) - boabe de bob – Vicia faba L. (2n=12) Reactivi:

- soluţii de cafeină de diferite concentraţii (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%) - soluţii de nicotină de diferite concentraţii (0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%) - apă distilată - fixator (alcool-acid acetic 3/1 sau Battaglia) - HCl 1N - HCl 50% - acid acetic 45% - reactiv Schiff Instrumentar, sticlărie:

- cutii Petri - hârtie de filtru - pensete - lame - lame şi lamele pentru microscop Mod de lucru: 1. Germinarea

- în cutii Petri tapetate cu hârtie de filtru, umectată cu apă distilată. Germinarea se va desfăşura la întuneric, la 23-240C, până în momentul în care rădăciniţele vor avea cca. 10 mm lungime.

2. Tratamentul mutagen

- prin imersia materialului în soluţiile de mutagen, timp de expunere 3 ore. 3. Spălare

-în apă distilată, de trei ori, câte 10 minute 4. Fixarea -detaşarea rădăciniţelor de pe cariopse şi fixare în fixator Battaglia pentru 25 minute, la

temperatura camerei 5. Spălare

- cu HCl 1N timp de 5 minute, la temperatura camerei 6. Hidroliză

- cu HCl 50%, cca. 30 minute, la temperatura camerei 7. Colorare

- cu reactiv Schiff, 15-30 minute, la temperatura camerei 8. Efectuarea preparatelor microscopice

- radăciniţa la bob, sau rădăciniţele unei cariopse de grâu se plasează pe o lamă de microscop, într-o picătură de acid acetic 45%. Preparatul microscopic se realizează prin tehnica squash

9. Studiul preparatelor - se studiază ana-telofazele normale şi aberante, notâdu-se tipurile de aberaţii şi numărul

aberaţiilor cromosomiale 10. Efectuarea preparatelor permanente

- dacă materialul prezintă frecvente aberaţii, preparatele respective se efectuează permanent.

În Fig. 35 – 38 sunt prezentate aspecte ale aberaţiilor cromosomiale în ana-telofaza mitozei

la bob, induse prin tratamente cu mutageni chimici.

Fig. 35 Ana-telofază cu punte la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 36 Ana-telofază cu punte şi fragment la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 37 Ana-telofază cu punţi la Vicia faba (40x) (original)

Fig. 38 Interfază cu micronucleu la Vicia faba (40x) (original)

9. Drosophila melanogaster – obiect de studiu in genetica

Utilizarea musculiţei de oţet (Drosophila melanogaster) drept obiect de studiu în genetică se datorează câtorva avantaje pe care această insectă le oferă cercetătorilor:

creştere relativ uşoară în laborator, pe o largă varietate de medii simple;

timpul scurt necesar obţinerii unei noi generaţii - 9-11 zile la 25oC; prolificitate mare (câteva sute de descendenţi dintr-un singur cuplu de adulţi); dimensiuni reduse; caractere de sex bine definite, uşor de recunoscut; numărul mic de cromosomi (2n=8), cu morfologie caracteristică;

prezenţa în celulele glandelor salivare de la larve a cromosomilor uriaşi. Ciclul vital Succesiunea rapidă a generaţiilor precum şi marea prolificitate a unui organism reprezintă

caracteristici atractive în studiile de genetică. Ciclul vital la Drosophila melanogaster (Ord. Diptera, Fam. Drosophilidae) cuprinde patru stadii (Fig. 39):

ou; larvă; pupă; adult.

Fig.39 Etapele de dezvoltare la Drosophila melanogaster (ou - pupă)

Timpul necesar parcurgerii acestor stadii depinde de temperatura la care musculiţele sunt

menţinute. La 250C, ciclul vital se poate derula complet în circa 10 zile, în schimb, la 200C se poate prelungi la 15 zile.

Cercetările au demonstrat că expunerea culturilor de Drosophila melanogaster la temperaturi ridicate (cca. 300C), determină sterilitate, în special în rândurile masculilor şi moartea culturii respective, iar temperaturile scăzute (de exemplu, 100C) prelungesc foarte mult ciclul vital (cca. 57 zile) şi reduc viabilitatea.

Optimul de temperatură pentru creşterea musculiţelor de oţet în laborator este deci, 250C. Oul Femele adulte de Drosophila melanogaster încep să depună ouă la circa două zile după

ieşirea din pupă, în cazul în care au avut la dispoziţie parteneri pentru împerechere. Fiecare ou are lungimea de aprox. 0,5 mm, este ovoidal şi de culoare albă. Pe faţa anterodorsală prezintă două expansiuni, cu regiunile distale lăţite, sub formă de linguriţă. Aceste structuri au rol în ataşarea oului de suprafaţa pe care este depus, împiedicând, de asemenea, scufundarea acestuia în mediu.

Dezvoltarea embrionară se realizează foarte rapid, după o zi la 250C, de la momentul depunerii, din ou ieşind o larvă.

Larva

Larvele de Drosophila melanogaster au culoarea albă şi sunt segmentate. Mandibulele, de culoare neagră, sunt bine vizibile în regiunea cefalică. Larvele sunt lipsite de orice fel de apendici locomotori, deplasarea realizându-se prin târâre.

Stadiul larvar este caracterizat de o hrănire şi creştere deosebit de intensă. Acest stadiu se subîmparte în trei periode, separate prin etape de năpârlire. Fiecare năpârlire conduce la înlocuirea completă a tegumentului şi armăturii bucale, fenomenul stând la baza creşterii larvei. Cea de-a treia perioadă (consecutivă celei de-a doua năpârliri) se finalizează cu împuparea. Cu

puţin timp înaintea declanşării acestui proces, larvele încetează să se mai hrănească şi caută suprafeţe relativ uscate (de exemplu, pereţii vasului de cultură) de care se fixează.

Stadiul larvar durează (incluzând năpârlirile), 4-5 zile la 250C. In momentul declanşării procesului de împupare, larvele au o lungime de aprox. 4,5 mm.

ou larvă larvă larvă pupă (stadiul I) (stadiul II) (stadiul III)

Pupa

Pupa reprezintă stadiul de reorganizare morfo-fiziologică din ciclul vital de la Drosophila melanogaster. In această etapă, cele mai multe structuri larvare sunt distruse, iar structurile caracteristice adultului se dezvoltă pe seama ţesutului embrionar denumit disc imaginal. Aceste

ţesuturi există la nivelul larvei, dar de la formarea lor, în embriogeneză, rămân în stadiu dormind, până în faza de pupă.

Larvele împupează în ultimul lor tegument, care iniţial moale şi de culoare albă, se întăreşte şi se brunifică progresiv. Transformările care se petrec în interiorul pupei (deosebit de complexe, făcând obiectul unei ramuri speciale a geneticii - genetica dezvoltării), conduc la apariţia structurilor caracteristice adultului (imago).

Stadiul pupal durează circa 4 zile la 250C, iar la finele acestuia, din pupă va emerge un adult.

Adultul Adulţii reprezintă stadiul reproductiv din ciclul vital la Drosophila melanogaster (Fig. 40).

Adulţii se eliberează din pupe forţând regiunea anterioară a acestora. Iniţial, orice musculiţă ieşită din pupă are corpul foarte alungit, de culoare deschisă şi aripile pliate (împachetate). După circa o oră, aripile se extind la dimensiunea lor normală, iar corpul dobândeşte formele şi culoarea caracteristică adultului.

Musculiţele adulte se pot împerechea la aproximativ 6 ore de la ieşirea din pupă. Sperma este depozitată în spermateca şi receptaculele ventrale ale femelei, fiind gradual eliberată în oviduct, pe măsura producerii ouălelor şi trecerii acestora prin oviduct spre vagin. Femele depun astfel, câteva zile, câte 50-75 ouă pe zi. Producţia de ouă va descreşte apoi în timp, până la dispariţia sa totală.

Durata de viaţă a unui adult de Drosophila melanogaster, la 250C, este de aprox. 37 zile.

Fig. 40 Adulţi de Drosophila melanogaster (stânga – mascul şi dreapta – femelă)

Creşterea musculiţelor de oţet în laborator Medii

Drosophila melanogaster (2n = 8) este frecvent întâlnită în natură pe fructe şi legume care au început să fermenteze (struguri, pere, prune, banane, roşii, etc.).

Pentru creşterea în laborator a acestei insecte, în mediul de cultură sunt absolut necesare două componente principale: zahărul şi drojdia de bere care realizează fermentaţia. In laborator,

creşterea se realizează pe medii sintetice din compoziţia cărora nu trebuie să lipsească cele două componente menţionate.

Mediul cu gris

Compoziţia acestui mediu este:

Griş 50 g Zahăr 50 g Agar fibră 10 g Drojdie de bere 15 g Apă de robinet 1000 ml Acid propionic 5 ml

Intr-un vas smălţuit în care se află 2/3 din cantitatea de apă, se dizolvă prin fierbere agarul,

apoi se adaugă drojdia, continuându-se fierberea, 45 minute, până la obţinerea unei suspensii. In restul de 1/3 apă se pune grişul şi zahărul şi se adaugă suspensiei de agar cu drojdie. Fierberea va fi continuată încă 15 minute, până la obţinerea unui mediu de consistenţa mierei de albine. Se lasă câteva minute să se răcească şi se distribuie, ca şi în cazul mediului cu făină de porumb în vase de cultură.

Similar, se pot pregăti medii în care grişul sau mălaiul să fie înlocuit de făina de grâu, melasă, uruială de ovăz.

Mediul de banane Larg utilizat în ţările unde aceste fructe se găsesc din abundenţă, sau au un preţ redus,

mediul de banane este cel mai simplu mediu de cultură pentru Drosophila melanogaster. Acest mediu se prepară introducând un fragment de banană bine coaptă, în vasul de cultură, după ce, în prealabil, banana fusese imersionată într-o suspensie de drojdie de bere.

Mediul de banane are însă şi un dezavantaj - se înmoaie foarte repede la căldură, ceea ce face dificilă scoaterea insectelor din vas, în momentul eclozării, acestea scufundându-se în mediu. In locul bananelor se pot folosi şi alte fructe - fragmente de pere, prune, struguri, imersionate în suspensie de drojdie de bere.

Din cele prezentate, putem concluziona că un mediu de cultură pentru Drosophila melanogaster, pentru a putea fi folosit cu bune rezultate, trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

să fie consistent, pentru a nu permite scufundarea adulţilor; să conţină suficient zahăr, necesar hrănirii larvelor şi adulţilor, cât şi pentru

declanşarea înmulţirii drojdiilor care să producă fermentaţia. Mediul astfel pregătit poate fi folosit imediat, sau poate fi păstrat câteva zile la frigider

(+40C). Dacă mediul oferă condiţii optime de dezvoltare, larvele ieşite din ouă vor fi în număr mare

şi foarte active, vorace, brăzdând mediul în toate direcţiile. Tehnici de manipulare în laborator, la Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster este o insectă de dimensiuni destul de mici pentru a putea fi

manipulată cu uşurinţă în condiţii de laborator, dar pentru aceste manevre este nevoie de: utilizarea unei lupe sau a unui stereomicroscop pentru observaţii; eterizarea musculiţelor, pentru ca acestea să poată fi examinate. Echipamentul necesar pentru cercetările în laborator efectuate pe Drosophila

melanogaster cuprinde: lupă binoculară (stereomicroscop) cu sursă de lumină; flacoane de eterizare; cutii Petri tapetate cu hârtie de filtru pentru re-eterizarea musculiţelor ce se trezesc

în timpul examinării; plăci de sticlă în două culori (alb-negru) pe care vor fi plasate musculiţele, pentru

efectuarea observaţiilor; pensule de dimensiuni mici, din păr moale; ace de disecţie (ace entomologice). Eterizarea

Musculiţele trebuie eterizate pentru a fi menţinute inactive, în vederea examinării sau transferării în vase de cultură. Eterizatorul constă într-un flacon ce conţine un tampon de vată, care va fi umezit cu eter etilic. Este necesară şi o pâlnie metalică, închisă la extremitatea mai mică cu o plasă fină de sârmă, iar extremitatea opusă cu deschiderea de un diametru cu puţin superior celui al vasului de cultură. Vasul de cultură va fi răsturnat în pâlnie, capătul închis cu plasă a acesteia fiind introdus în eterizator. După introducerea adulţilor în pâlnie, deschiderea acesteia va fi imediat acoperită cu un tifon, sau o placă Petri. Ansamblul va fi ulterior agitat uşor, musculiţele fiind astfel menţinute în partea de jos a pâlniei, în atmosfera saturată cu vapori de eter. In mai puţin de 1 minut insectele vor fi eterizate, putând fi răsturnate pe placa de observaţie.

Precauţii:

vata din flaconul eterizatorului nu va fi prea îmbibată în eter şi în nici un caz în flacon nu trebuie să fie eter lichid, deoarece prin manevrele care se execută, eterul poate ajunge pe corpul insectelor, provocându-le arsuri;

expunerea la eter nu trebuie să fie îndelungată, deoarece poate duce la omorârea musculiţelor;

toate manevrele trebuie făcute cu delicateţe, insectele fiind extrem de fragile; eterul etilic este un compus toxic. Se va evita pe cât posibil inhalarea lui directă şi

expunerea prelungită. Re-eterizarea

In cazul în care, pe parcursul observaţiilor, musculiţele încep să se trezească, deasupra lor se aşează o placă Petri tapetată cu hârtie de filtru, stropită cu eter. Placa se lasă câteva zeci de secunde, pe parcursul cărora musculiţele vor fi re-eterizate.

Atenţie! Manevra nu poate fi repetată de prea multe ori pentru că omoară insectele. Identificarea sexului la adulţii de Drosophila melanogaster

Masculii şi femelele de Drosophila melanogaster se diferenţiază printr-o serie de caractere morfologice, relativ uşor de recunoscut, caractere care se generează dimorfismul sexual.

În cazul efectuării încrucişărilor de analiză genetică, recunoaşterea sexului este vitală, deoarece, în cele mai multe dintre aceste încrucişări, femelele genitoare trebuie să nu se fi împerecheat în prealabil, deci, trebuie să fie virgine. Această stare a femelelor se păstrează maxim 12 ore de la ieşirea din pupă, astfel încât, atunci când intenţionăm efectuarea de încrucişări, este important să separăm indivizii conform sexului lor.

Identificarea sexului adulţilor are la bază următoarele criterii: 1] pieptenele sexual. Este o formaţiune întâlnită doar la mascul, care constă dintr-un

mănunchi de perişori (cca.10) chitinoşi, de culoare neagră, reuniţi, plasaţi în apropierea încheieturilor tarsale, pe prima pereche de picioare. Structura poate fi vizualizată din stadiul pupal, cu puţin înainte de ieşirea adultului din pupă, peretele acesteia devenind în acel moment transparent (Fig. 41).

Fig. 41 Identificarea sexului la Drosophila melanogaster pe baza prezenţei pieptenului sexual la mascul

2] abdomenul. Femelele au abdomenul format din 7 segmente vizibile, alungite posterior, în

timp ce masculii posedă doar 5 segmente, ultimul fiind rotunjit. La masculi, ultimele benzi întunecate ce separă segmentele abdominale fuzionează, astfel încât toţi masculii au regiunea teminală a abdomenului de culoare mai închisă decât restul corpului.

3] regiunea genitală. Armătura genitală a femelei include ovopozitorul şi este de culoare

deschisă, în timp ce piesele armăturii genitale a masculilor (inclusiv penisul) au culoare închisă. Simboluri utilizate în genetica la Drosophila melanogaster Tipul normal, aşa numit - sălbatic (wild type) la Drosophila melanogaster are caracterele

determinate de gene care se notează cu 2-3 litere provenite din denumirea în limba engleză a caracterului respectiv, cu indice "+".

In cazul mutantelor, acest indice lipseşte. Dacă mutaţia respectivă este recesivă faţă de tipul sălbatic, prescurtarea numele său se scrie cu literă mică, iar în cazul mutaţiilor dominante, cu literă mare.

O musculiţă poate să fie purtătoarea unei singure mutaţii, caz în care poartă denumirea de mutantă, sau a mai multor mutaţii, situaţie în care se numeşte linie mutantă. Mutaţiile morfologice la Drosophila melanogaster se clasifică în funcţie de organul afectat în mutaţii ale formei aripilor, culorii ochilor, corpului, formei perişorilor de pe corp, formei ochilor, etc.

Exemple: 1] Mutante: ochi de culoare albă - w (engl. white = alb); ochi de culoare normală, roşii - w+; aripi vestigiale, rudimentare - vg (engl.vestigial - vestigial); aripi întregi - vg+; ochi baraţi, mutaţie dominantă asupra tipului normal (apare prin reducerea

numărului de omatidii) - B (engl.Bar = bară); ochi întregi - B+; corp de culoare galbenă - y (engl.yellow = galben); corp de culoare cafenie, normal - y+

2] Linii mutante: w, vg - linie cu două caractere mutante, ochi de culoare albă, aripi vestigiale; Cy, L, Pm (Curly = creţ; Lobe = lobat; Plume = vineţiu, de culoarea prunelor) - linie

triplu mutantă, cu aripile curbate la capete, ochii reduşi dimensional, lobaţi şi de culoare vineţie; y, ct, v, f (yellow = galben; cut = retezat; vermillon = portocaliu aprins; forked =

măciucat) - linie cu patru caractere mutante - corp de culoare galbenă, aripi retezate la capete (tipul sălbatic are aripile rotunjite), ochii de culoare portocaliu aprins şi perişorii de pe corp măciucaţi.

9.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster

8.1.1. Cromosomii uriaşi

Unul dintre avantajele cele mai importante oferite de Drosophila melanogaster, ca obiect de studiu în genetică, este relativa uşurinţă în studiul cromosomilor acestei specii. Studiile asupra cromosomilor nu oferă doar informaţii legate de numărul acestora la diferite specii, ci şi posibilitatea elucidării cauzelor unor anormalităţi de ordin fizic sau mental (în cazul omului), care, aşa cum s-a dovedit, pot fi puse pe seama variaţiilor numerice sau anomaliilor structurale ale cromosomilor faţă de complementul cromosomial normal.

Deşi de multe ori, studiul cromosomilor se dovedeşte o întreprindere destul de dificilă, care solicită timp şi echipament specific, în cazul musculiţei de oţet, preparatele microscopice conţinând celule în care se pot observa cromosomii, sunt destul de uşor de realizat. Mai mult decât atât, la Drosophila melanogaster, la larve, în celulele glandelor salivare, există cromosomi de dimensiuni foarte mari, cu o structură aparte, care odată evidenţiaţi, oferă posibilitatea efectuării de studii amănunţite de structură precum şi de localizare a genelor în cromosomi (întocmirea hărţilor fizice). Aceşti cromosomi au primit denumirea de cromosomi uriaşi (Fig.42).

Fig. 42 Cromosomii uriaşi la Drosophila melanogaster, vedere de ansamblu

In celulele glandelor salivare de la larve (fenomenul este caracteristic şi altor specii de diptere), cromosomii omologi se află într-o stare de permanentă sinapsare. Celulele din aceste

ţesuturi nu se divid, crescând doar în dimensiuni pe parcursul stadiu lui larvar. Cu toate acestea, cromosomii lor suferă runde succesive de replicare. Procesul de replicare a cromosomilor, fără ca respectiva celulă să se dividă, poartă denumirea de endomitoză, cromosomii lor primind denumirea de cromosomi politenici (lat. tenuis = panglică; lat. poly = mai multe).

Dimensiunile foarte mari ale acestor cromosomi sunt completate şi de o aranjare foarte specială a lor. In preparatele microscopice, apar sub forma a 5 braţe foarte lungi şi unul extrem de scurt, unite la nivelul unei regiuni care se colorează cu coloranţi specifici pentru acizi nucleici, foarte intens, şi care a primit denumirea de cromocentru. Cromocentrul reprezintă regiunea centromerică a fiecărui cromosom, în timp ce braţele corespund după cum urmează: cele cinci braţe lungi reprezintă 3 perechi de cromosomi alungiţi, iar cel de-al şaselea braţ, scurt, perechea a IV-a de cromosomi.

Cromosomii perechii I (XX la femele) sunt strâns uniţi pe toată lungimea lor şi având centromerul plasat terminal, formează un unic braţ. La masculi, deoarece cei doi cromosomi ai perechii a-I-a (XY) nu sunt omologi şi nu pot sinapsa, braţul I este format de fapt doar din cromosomul X, cromosomul Y fiind inclus, alături de regiunile centromerice ale celorlalţi cromosomi, în cromocentru (Fig. 43).

Cromosomii perechii II, sinapsaţi pe toată lungimea lor, formează două braţe, II dreapta (engl. 2R) şi II stânga (engl. 2L), deoarece au centromerii plasaţi submetacentric (Fig. 44).

Cromosomii perechii III, de asemenea sinapsaţi pe toată lungimea lor, formează două braţe, III dreapta (engl. 2R) şi III stânga (engl. 2L), şi aceşti cromosomi fiind aproximativ submetacentrici (Fig.45).

Braţul scurt al cromosomilor uriaşi este format din cromosomii perechii a-IV-a, telocentrici, care în preparatele microscopice cu cromosomi somatici, apar punctiformi (Fig.46).

Fig. 43 Cromosomii perechii I (braţul 1)

Fig. 44 Cromosomii perechii II (braţul 2L – sus şi braţul 2R – jos)

Fig.45 Cromosomii perechii III (braţul 3L – sus şi braţul 3R – jos)

Fig. 46 Cromosomii perechii IV

Fiecare braţ al unui cromosom uriaş este deci format din doi cromosomi, omologi, unul de origine maternă şi altul de origine paternă. De obicei, cromosomii omologi care alcătuiesc braţele sunt foarte greu de identificat, datorită sinapsării lor extreme, dictată de omologia regiunilor corespunzătoare genelor de pe aceşti cromosomi (homozigoţie). In cazul în care organismul respectiv este heterozigot după o genă dată, la nivelul regiunii corespunzătoare genei respective, sinapsarea nu mai este atât de strânsă, se formează bucle, permiţând vizualizarea celor doi cromosomi ce alcătuiesc de fapt, braţul. Tot astfel de bucle apar şi în cazul în care la nivelul unor regiuni s-au produs inversii, translocaţii, deci mutaţii structural cromosomiale.

In lungul braţelor cromosomilor uriaşi, apar în urma aplicării unor metode specifice de colorare (cu coloranţi selectivi pentru ADN), benzi transversale care se colorează mai intens, alternând cu benzi mai slab colorate. Se consideră că regiunile mai intens colorate ar corespunde porţiunilor de cromatină cu o spiralizare mai intensă, în timp ce cele mai slab colorate, unor porţiuni în care cromatina este mai relaxată. Regiunile ar corespunde deci, heterocromatinei (cele mai

dense, care se colorează mai intens) şi eucromatinei (cele mai relaxate, mai slab colorabile). Dat fiind faptul că virtual fiecare cromatidă are aceeaşi dispoziţie a regiunilor eu- şi heterocromatice, iar la nivelul unui braţ, cei doi omologi s-au replicat de nenumărate ori, iar numărul de cromatide este foarte mare, alăturarea acestor regiuni conduce la apariţia benzilor. Au fost identificate peste 5000 de benzi. Stabilindu-se o corespondenţă între locii genelor şi distribuţia benzilor, a fost revizuită şi corectată harta genetică la Drosophila melanogaster, fiind întocmită şi harta fizică a cromosomilor uriaşi la această specie.

Lungimea totală a cromosomilor uriaşi este de 1180 , ei fiind de 157x mai lungi decât cromosomii somatici. Braţele au următoarele dimensiuni:

perechea I (XX) - 220

perechea II - 215 şi 245

perechea III - 210 şi 275

perechea IV - 15 Deci, cromosomii uriaşi au aceste dimensiuni din două motive: a] se replică normal, dar replicarea lor nefiind urmată de diviziunea celulei, cromatidele

surori rămân împreună, ceea ce conduce la îngroşarea lor; b] nu suferă procese de condensare pentru formarea structurii de tip cromosom metafazic,

celulele în care se găsesc aflându-se într-o continuă interfază, astfel încât lungimea lor este deosebit de mare, faţă de cromosomii somatici obişnuiţi.

Evidenţierea cromosomilor uriaşi la Drosophila melanogaster Material biologic larve aflate în stadiul III de creştere, bine dezvoltate, cu o lungime de cca. 4mm.

Numărul de larve din mediul de cultură în fiolele destinate pentru această lucrare nu trebuie să fie foarte mare, pentru a permite dezvoltarea viguroasă a larvelor.

de la larve se vor recolta glandele salivare. Recoltarea glandelor salivare

se plasează larva pe placa de sticlă pe care se efectuează observaţiile, în jumătatea neagră, în câteva picături de ser fiziologic, sau apă;

se aşează placa de observaţie la un stereomicroscop binocular şi se reglează imaginea, până la observarea clară a larvei;

cu un ac entomologic se fixează bine larva, fără a o înţepa, acul fiind plasat imediat sub regiunea armăturii bucale, uşor vizibile, de culoare neagră;

cu un al doilea ac de disecţie, plasat transversal peste corpul larvei, fără a o înţepa, aproximativ la mijlocul distanţei dintre cele două extremităţi, se efectuează o mişcare de întindere în direcţia axului longitudinal al corpului larvei;

această manevră, corect executată, va conduce la decapitarea larvei, de extremitatea cefalică rămânând ataşate şi glandele salivare, saciforme, de culoare alb argintie şi translucide. Resturile de tub digestiv, eventual antrenate, vor fi îndepărtate (Fig. 47).

Fig. 47 Larva de Drosophila melanogaster (disecţie) (1 – glande salivare; 2 – ganglioni nervoşi)

Colorarea materialului

glandele salivare se preiau cu acul de disecţie, fiind trecute pe o lamă curată şi bine degresată de microscop, într-o picătură de colorant carmin acetic, sau orceină 2%;

colorarea durează cca.3-5 minute. Materialul poate fi apoi, eventual, trecut pe o nouă lamă de microscop, într-o picătură de colorant proaspăt;

1 2

peste material se aşează o lamelă, peste aceasta o bucată de hârtie de filtru care va absorbi excesul de colorant şi se presează uşor cu degetul mare, sau se trece un rulou de cauciuc pe deasupra, ceea ce va permite etalarea uşoară (de tip squash). Sub nici o formă nu se va efectua o etalare energică, prin bătăi repetate în lamelă, care conduce inevitabil la fragmentarea cromosomilor şi compromiterea preparatului.

Observarea preparatelor la microscop metoda de coloraţie aplicată va conduce la evidenţierea cromosomilor uriaşi coloraţi

în roşu deschis, transversal pe braţele acestora apărând benzi de culoare roşu întunecat; distribuţia benzilor este constantă şi caracteristică fiecărui cromosom; observaţiile se efectuează de preferinţă, la obiectivul cu imersie, pentru observarea

cât mai multor detalii. 8.1.2. Cromosomii somatici

Cromosomii somatici pot fi evidenţiaţi la Drosophila melanogaster, în celulele neuroblastice din ganglionii nervoşi ai larvei aflate în stadiul III de dezvoltare.

Celulele din ţesutul nervos se divid mitotic normal, motiv pentru care, alături de celulele în interfază vom putea găsi şi celule aflate în diviziune. Vom căuta celule aflate în metafază, la care cromosomii sunt condensaţi, eliberaţi de sub membrana nucleară care s-a fragmentat la finele profazei şi dispuşi în regiunea ecuatorială a celulei. Pentru mai buna lor dispersare este recomandat ca în mediul de cultură în care se află larvele, să se adauge o soluţie de colchicină 0,04%, cu cca. 2 ore înainte de disecţia acestora. In acest fel, colchicina ingerată de larve, va produce blocarea formării fusului mitotic de diviziune, şi acumularea de metafaze cu cromosomii dispersaţi în celulă.

Numărul de cromosomilor la Drosophila melanogaster este 8. Femela are o pereche de cromosomi de sex omologi XX, în timp ce masculul are o pereche

de cromosomi neomologi, XY, aceşti cromosomi primind denumirea de perechea a-I-a. Determinismul cromosomial al sexelor la Drosophila melanogaster este identic celui uman. Aceşti cromosomi poartă denumirea de heterosomi, spre deosebire de ceilalţi cromosomi din complement – autosomii. Cromosomul X are forma unui baston, în timp ce cromosomul Y are

formă de baston frânt. Autosomii formează perechile II, III şi IV. Perechile a-II-a şi a-III-a, la ambele sexe, sunt

reprezentate de cromosomi cu forma literei “V”, cu braţe mai mult sau mai puţin egale (cromosomi submetacentrici), în timp ce cromosomii perechii IV sunt extrem de mici, punctiformi (Fig. 48).

Fig. 48 Cromosomii somatici la Drosophila melanogaster (2n = 8)

Materialul biologic , prelevarea sa şi colorarea sunt identice ca şi în cazul cromosomilor

uriaşi, dar la extremitatea cefalică detaşată de corpul larvei, în urma disecţiei, se află ataşaţi, împreună cu glandele salivare şi ganglionii nervoşi, care interesează în cazul studiului cromosomilor somatici. Aceştia sunt două structuri translucide, gri-albăstrui, plasate imediat deasupra glandelor salivare. Ganglionii se detaşează de restul materialului (de fapt, disecţia larvei se poate finaliza cu prelevarea atât a glandelor salivare, cât şi a ganglionilor cerebroizi) şi se trec pe o lamă de microscop, într-o picătură de orceină 2%, sau colorant carmin-acetic. După 2-3 minute, materialul se acoperă cu o lamelă şi se etalează uşor.

Observarea preparatelor la microscop Observaţiile se vor efectua cu obiectivul de imersie (90x) şi în lumină puternică (cu

condensorul ridicat) pentru vizualizarea cât mai bună a cromosomilor, care vor avea o coloraţie roşu închis.

Bibliografie Băra, I.I. 1999 Genetica, Ed. Corson, Iaşi Butnaru, Gallia 1985 Genetica, Ed. Institutului Agronomic, Timişoara Carr, D.H., Walker, J.E.

1961 Carbol – fuchsin, a dye for human chromosomes. Stain Technol., 36 : 233-236

Hartl, D.L., Jones, Elizabeth W.

1998 Genetics – Principles and Analysis, 4th edition, Jones and Bartlett

Publishers, Boston, London, Singapore Kao, K.N.

1975 A chromosomal staining method for cultured cells. In Plant Tissue Culture Methods (edited by O.L. Gamborg and L.R. Wetter), NRCC, Saskatoon, Saskatchewan, Canada : 63-64

Keller, W.A., Harvey, B.L., Kao, K.N., Miller, R.A., Gamborg, O.L.

1973 Determination of the frequency of interspecific protoplast fusion by differential staining. Colloq. Int. Cent. Natl. Rech. Sci., 212 : 455-463

Klug, S.W., Cummings, M.R. 2000 Concepts of Genetics, 6th edition, Prentice Hall International, Inc.,

USA Mertens, T.R., Hammersmith, R.L.

1998 Genetics – Laboratory Investigations, 11th edition, Prentice Hall

International, Inc., USA Miller, R.A., Gamborg, O.L., Keller, W.A., Kao, K.N.

1971 Fusion and division of nuclei in multinucleated soybean protoplasts. Can. J. Genet. Cytol., 13 : 347-353

Nicolae, I. 1978 Mutageneza experimentală, Ed. Ceres, Bucureşti Nikonorow, M. 1981 Pesticidele în lumina toxicologiei mediului, Ed. Ceres, Bucureşti

Raicu, P. 1997 Genetică generală şi umană, Ed. Humanitas, Bucureşti Snustad, P.D., Simmons M.J., Jenkins, J.B.

1997 Principles of Genetics, John Wiley & Sons, Inc., New York

Socaciu, Carmen 1996 Mutageneza chimică, Ed. Genesis, Cluj-Napoca Tudose, I. Gh., Cîmpeanu - Pricop Mirela - Mihaela, Maniu - Tudose Marilena

1991 Cytogenetic effects induced by nicotinic acid in Vicia faba L. (2n=12) and Triticum aestivum L. (2n=42). An. şt. Univ. ”Al. I. Cuza” Iasi, T XXXVII, s. II. a, Biologie vegetală: 23-25

Tudose, I. Gh., Megyeri, Cristina, Cîmpeanu - Pricop Mirela - Mihaela, Maniu - Tudose Marilena

1992 Cytogenetic action of a new biostimulator on rye - Secale cereale L. (2n=14). An. şt. Univ. ”Al. I. Cuza” Iasi, T XXXVIII, s.II.a, Biologie vegetala: 53-56

Tudose, I. Gh., Truţă, Elena, Cîmpeanu - Pricop Mirela - Mihaela

1994 Bandarea cromosomilor la plante si importanţa sa. Buletinul SNBC, a XII a Sesiune a SNBC, Tg.Mureş, 10-11 iunie, 30

Tudose, I.Gh. 1993 Genetica, vol.II, Ed. Univ. „Al.I.Cuza”, Iaşi Tudose, I.Gh. 1967 Genetica – Îndrumător de laborator, Lito, Ed. Univ. „Al.I.Cuza”, Iaşi